CN102369105A - 在材料中引入耐热和/或耐压生物 - Google Patents

在材料中引入耐热和/或耐压生物 Download PDF

Info

Publication number
CN102369105A
CN102369105A CN2009801373603A CN200980137360A CN102369105A CN 102369105 A CN102369105 A CN 102369105A CN 2009801373603 A CN2009801373603 A CN 2009801373603A CN 200980137360 A CN200980137360 A CN 200980137360A CN 102369105 A CN102369105 A CN 102369105A
Authority
CN
China
Prior art keywords
degrees centigrade
spore
microorganism
bacterial strain
bacillus
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN2009801373603A
Other languages
English (en)
Inventor
约翰·梅坦斯
琳达·比拉德贾尔
弗兰克·迪弗里吉尔
萨姆·维布鲁格赫
贝内迪克特·萨斯
菲利普·杜普雷兹
汤姆·安蒂耶朗
阿希娅·奥其琛
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Resilux NV
Original Assignee
Resilux NV
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Resilux NV filed Critical Resilux NV
Publication of CN102369105A publication Critical patent/CN102369105A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B29—WORKING OF PLASTICS; WORKING OF SUBSTANCES IN A PLASTIC STATE IN GENERAL
    • B29C—SHAPING OR JOINING OF PLASTICS; SHAPING OF MATERIAL IN A PLASTIC STATE, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; AFTER-TREATMENT OF THE SHAPED PRODUCTS, e.g. REPAIRING
    • B29C43/00—Compression moulding, i.e. applying external pressure to flow the moulding material; Apparatus therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
    • C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
    • C12N11/08—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a synthetic polymer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
    • C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
    • C12N11/08—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a synthetic polymer
    • C12N11/089—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a synthetic polymer obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds
    • C12N11/093—Polyurethanes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
    • C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
    • C12N11/08—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a synthetic polymer
    • C12N11/089—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a synthetic polymer obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds
    • C12N11/096—Polyesters; Polyamides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/07—Bacillus
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/8215—Microorganisms
    • Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
    • Y10S435/832—Bacillus
    • Y10S435/839—Bacillus subtilis

Landscapes

  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Mechanical Engineering (AREA)
  • Fodder In General (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
  • Environmental & Geological Engineering (AREA)
  • Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)

Abstract

本申请涉及用于生产在其中引入有活力微生物的材料的方法。更具体地，该材料是在高温和/或高压条件下生产的，并且在这些条件前或期间将微生物加入该材料中。还提供了在这些条件下保持有活力的微生物，并且这些微生物具有不同的应用，这依赖于材料的性质。

Description

在材料中引入耐热和/或耐压生物
技术领域
本申请涉及用于生产在其中引入有活力微生物的材料的方法。更具体地，该材料(例如聚合物、塑料、食品、药物制剂)是在高温和/或高压条件下(例如挤出、粒化)生产的，并且在这些条件前或期间将微生物加入该材料中。还提供了在这些条件下保持有活力的微生物，并且这些微生物具有不同的应用(例如作为益生菌，或建立氧气屏障)，通常依赖于材料的性质。
背景技术
早已认识到许多微生物的各种有益的性质。典型实例包括氧气消耗或吸收、辐射能吸收(例如UV吸收)或它们用作益生素。然而，在材料中引入微生物以能够将这些有益的性质整合在材料中不是简单的。实际上，许多材料比如聚合物、树脂、以及食品、动物饲料甚至药物制剂和药物是在高温、高压或者二者的条件下制备的。
例如永久的不能生物降解的聚合物的加工温度远远超过100摄氏度，即使在常压条件下，该温度也太高而难以引入活着的材料。在这个水平的温度下植入活着的活性的微生物同时这些生物不会死亡是不可能的。由此，即使在正常的环境温度下引入的生物通常能够实现有用的活性，但是如果在材料的生产期间不能实现引入活着的或有活力的生物，则也不可能获得任何益处。这不仅仅对聚合物和塑料来说是正确的，而且对于用于人和动物消费的材料(例如食品或药物)来说也是如此。尽管加工这些材料的温度可能不必然很高(尽管它们有可能是很高)，但这些材料常常经历高压加工如食品挤出、烹饪挤出、其他的挤压处理((例如如US 20050238721所述)、粒化、加压蒸煮、模塑、热成形等。这些高压加工常常结合高温(也许有干燥)，对于典型微生物的生存力是有害的。例如，Biourge和同事尝试在狗食品中加入芽胞杆菌菌株(CIP 5832)，并且得出结论挤出膨胀和干燥过程导致损失＞99％的孢子，芽孢杆菌CIP 5832不应该在挤出膨胀和干燥过程之前被加入饮食中(Biourge等，1998)。
在本领域中已经提出许多技术方案以绕过这个问题。一个策略是不使用微生物而是使用实现相同功能的化合物。例如，US专利5034252描述使用活化金属加入到塑料容器中，基于它的氧气阻隔性能。虽然这实现了相似的效果，但使用金属固有地比微生物面临更严重的生物降解性和环境问题。同时，这可能使得工艺更昂贵。另一策略是将高压的(和/或高温)步骤和在材料中混入微生物的步骤分开，通常是通过在挤出或粒料产物上施加细菌包覆层。在WO2007/60539，提供了用于制备动物饲料的方法，其中死的益生菌细菌被涂覆在挤出或者粒化的粒料，并且使用环境空气或者加热到不大于约100摄氏度的温度的空中干燥经过涂覆的粒料。WO2006/110407描述具有两个物理上明显不同的组分的宠物食品：第一个组分包括蛋白质源、脂肪源和碳水化合物源，其可以被至少部分挤出，第二个物理上明显不同的组分包括有活力的益生微生物。通过保持基料组分和微生物分离，这些应用由此固有地需要更多工序，使得这些方法复杂和昂贵。此外，这些方法仅微生物可以与材料隔开时适用(例如在材料之外)，而当活性应该包含于材料中而不是在材料上时，这些方法不适用。
在WO2006/024115已经提议在疏水聚合物中引入单细胞或多细胞生物，其用于高于100摄氏度的温度，但是仍然在标准压力条件下。然而因为这个申请不包含具有(单细胞或多细胞)生物的实施例，因此不清楚是否这样的生物当用于制备所描述疏水聚合物时仍然是有活力的。然而这是不大可能的，因为在这个条件下细胞中的水将开始沸腾。
综上所述，本领域已知材料加工(例如聚合物加工、食品加工)常常在高温下进行，在这些温度下细胞或生物不是有活力的。此外，材料加工常常包括在高压下工作，特别是如果材料需要塑模、粒化或挤出(例如还有聚合物加工、食品加工)。施加的压力也过高而难以确保(微)生物的生存力。此外为了使生物是有活力的，应当在加工材料中存在最低限度的水量。实际上，即使有报道生存力，其通常也被显著地降低。
由此，有益的是得到能够利用的方法，其容许在不同的材料中引入有活力的微生物，其中微生物在材料生产工艺期间施加的高压和/或高温条件过程中保持有活力的。这样，生产的材料可以引入微生物的有益性质。
发明内容
材料加工温度过于恶劣而不能将活着的或有活力的(微)生物引入材料中例如天然的或合成聚合物、树脂、食品、动物饲料和药物。对于材料加工期间施加的压力同样如此，例如在如挤出、粒化、加压蒸煮、热模塑、加压模制、注塑、热成形、浸渍、真空成形、起泡沫、热熔融等的工艺中。
令人惊讶地，人们发现可以使用特定的细菌(尤其是它们的孢子)，其能够在材料加工温度下生存而没有显著的生存力损失。此外，这些细菌可以在这些温度下被引入不同的材料，并且在引入材料时保持它们的性质。最值得注意地，这些特定的细菌抵抗显著高于在微生物处理时通常所设计的那些温度。然而这样的高温在材料加工领域是典型的(例如聚合物加工、食品加工，...)，典型地在100-350摄氏度的范围内，更特别地在120-300摄氏度的范围内，甚至更特别地在130-300摄氏度的范围内，最特别地在150-300摄氏度的范围内。根据具体的实施方式，温度范围的高端限制(例如为了提高活力)为220摄氏度，210摄氏度，200摄氏度或者甚至更特别地在150和200摄氏度之间。
进一步，可以使用特定的细菌(特别地它们的孢子)，其能够经受得住在材料加工期间施加的压力而没有生存力的显著的损失。在本文中同样，这些细菌可以在这些压力下被引入不同材料并且在引入材料时保持它们的性质。
由此，根据第一方面，本发明涉及鉴定和分离微生物，特别是形成孢子的生物，其能够抵抗高温同时保持有活力。由此，根据第二方面，本发明涉及鉴定和分离微生物，特别是形成孢子的生物，其能够抵抗高压同时保持有活力。根据特别的实施方案，生物(或它的孢子)能抵抗高温和高压(相继或者同时)同时保持有活力。
根据特别的实施方案，本发明涉及解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)菌株，其以No.ID9698保藏在比利时菌种中心(BCCM)，或一种芽胞杆菌菌株，其gyrA序列与以No.ID9698保藏于BCCM的解淀粉芽孢杆菌菌株的部分gyrA序列(SEQ ID NO：1)为至少70％同一。
根据另一方面，这里提供了用于生产在其中包含有活力的生物的材料的方法，其包括在100摄氏度和350摄氏度之间的温度下和/或在1.5和400bar之间的压力下混合下列：
-基料，其选自天然的或合成聚合物、树脂、食品、动物饲料和药物；和
-活的或有活力的微生物孢子，所述微生物的孢子在100摄氏度和350摄氏度之间的温度下和/或在1.5和400bar之间的压力下是有活力的。
根据特别的实施方案，微生物或其孢子在100摄氏度和350摄氏度之间的温度下以及在1.5和400bar之间的压力下是有活力的。根据特别的实施方案，在干燥条件下混合孢子。根据非常特别的实施方案，干燥条件意味着存在少于5000ppm水，例如可以将亲水聚合物在使用前干燥至＜5000ppm水。这特别地应用于非食品或非饲料材料，因为食品或饲料常常含水。在可选的特别的实施方案中，可以在湿条件下混合孢子，但是需要小心适应压力和温度以便在细胞内或细胞外不会达到水的沸点。关于水沸点和大气压之间的关系，本领域中有可利用的标准图。
在进一步特别的实施方案，在这些方法中所使用的微生物或其孢子属于解淀粉芽孢杆菌菌株，其以No.ID9698保藏在比利时菌种中心(BCCM)，或一种芽胞杆菌菌株，其gyrA序列与以No.ID9698保藏于BCCM的解淀粉芽孢杆菌菌株的部分gyrA序列(SEQ ID NO：1)为至少70％同一。
在一些实施方案中，天然的或合成聚合物在本申请的方法中用作基料材料。根据特别的实施方案，聚合物包括选自下列的至少一种单体：丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、丙烯酰胺、甲基丙烯酰胺、醇、胺、酸酐、环氧化物、苯乙烯、官能化乙烯基、官能化烯丙基、丙烯、丁二烯、乙烯、异氰酸酯、内酰胺、内酯、糖、葡萄糖和酯。
根据进一步的特别的实施方案，聚合物是极性聚合物。本领域可以获得极性值，例如从″The polymer handbook″(John Wiley and Sons)，并且极性值通常表达为Hildebrand参数。这些数值典型地在12(非极性)和44(极端极性)(MPa)1/2之间。为了本发明的目的，当其极性值为至少17，更特别至少18，甚至更特别至少19，更加特别至少20，最特别至少21(MPa)1/2时，聚合物可以称为极性。
根据可选的特别的实施方案，聚合物具有最小的吸水率值。根据下列测量这些数值：将颗粒形式的聚合物首先压成板并且在70摄氏度干燥。将预先干燥的聚合物板称重得到质量M1。然后，将板浸没在蒸馏水中预定时间并且在除去表面水之后再次称重。得到质量M2。作为时间函数，按照下式测定吸水率值：
wt％＝(M2-M1)*100/M1
优选各个测量做两次并且应该取平均值。根据特别的实施方案，吸水率应该为至少0.01，特别地至少0.02，更特别地至少0.1，最特别地至少0.2。根据更具体的实施方案、极性和吸水率值是组合的，例如聚合物具有至少17(MPA)1/2的极性值以及至少0.01的吸水率值，取决于期望的性质。提高吸水率表示聚合物随着时间的过去将吸收更多的水，提高极性值预示着聚合物链和极性溶剂即水之间的相互作用力更大。聚合物的极性取决于在给定溶剂中的溶解度，这又取决于化学结构、链支化的数量和结晶度。
根据非常特别的实施方案，聚合物是氧气可透过的。
根据具体的实施方案，(基料)材料并且由此也所得的产品，是用于人或动物消费的，微生物或其孢子是益生菌。
在这里公开的方法的具体实施方案中，进行附加步骤，其可以是选自挤出步骤、粒化步骤、加压蒸煮步骤、热模塑步骤、加压模制步骤、注射成型步骤、热成形步骤、浸渍步骤、真空成形步骤、起泡沫步骤或热熔融步骤。这个步骤可以是在混合期间或在混合之后进行。
根据进一步特别的实施方案，挤出步骤、粒化步骤、加压蒸煮步骤、热模塑步骤、加压模制步骤、注射成型步骤、热成形步骤、浸渍步骤、真空成形步骤、起泡沫步骤或热熔融步骤是在100摄氏度和350摄氏度之间的温度下和/或在1.5和400bar之间的压力下进行的。应该理解的是，用于该方法的温度与压力需要尽可能地适应以确保微生物的最大的生存力，同时仍能够根据需要控制基料材料。
根据进一步的方面本发明涉及在其中包含有活力的生物或其孢子的材料的方法，所述材料包括选自天然的或合成聚合物、树脂、食品、动物饲料和药物的基料以及所述材料的用途。在更具体的实施方案中，有活力的微生物是解淀粉芽孢杆菌菌株，其以No.ID9698保藏在比利时菌种中心(BCCM)，或一种芽胞杆菌菌株，其gyrA序列与以No.ID9698保藏于BCCM的解淀粉芽孢杆菌菌株的部分gyrA序列(SEQ ID NO：1)为至少70％同一。在另一具体的实施方案，基料是极性聚合物。
根据另一方面，本发明涉及使用活的或有活力的孢子的微生物用于生产在其中含有有活力的微生物的材料的用途，所述微生物的孢子在100摄氏度和350摄氏度之间的温度下和/或在1.5和400bar之间的压力下是有活力的。在更具体的实施方案中，活的或者有活力的孢子来自解淀粉芽孢杆菌菌株，其以No.ID9698保藏在比利时菌种中心(BCCM)，或一种芽胞杆菌菌株，其gyrA序列与以No.ID9698保藏于BCCM的解淀粉芽孢杆菌菌株的部分gyrA序列(SEQ ID NO：1)为至少70％同一。
附图说明
图1显示了不同微生物的耐干热性。1：菌株ID9698(鉴定为解淀粉芽孢杆菌菌株)；2：LMG 8197：枯草芽孢杆菌Spizizenii亚种，一种其gyrA序列显示出与SEQ ID NO：1具有＞70％序列同一性的细菌；3：
Figure BDA0000051829080000061
商购可得的具有活酵母(益生菌)(布拉酵母菌(Saccharomyces boulardii))的药物；4：
Figure BDA0000051829080000062
商购可得的具有活乳酸细菌(益生菌)(嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)NCFM和乳酸双岐杆菌(Bifidobacterium lactis)BI-07的1/1混合物)的药物。从左至右，柱表示不同的热处理。
在图2中，不同聚合物的吸水率表示为时间的函数：Prop(聚丙烯或PP)，PLA(聚乳酸)，PETg(聚对苯二甲酸乙二醇酯-1，4环己烷二甲醇)，PET(聚对苯二甲酸乙二醇酯)，PU(聚氨酯)。
图3还显示了不同聚合物的吸水率作为时间的函数。使用图2中相同的缩写。BioPETg是根据本文所描述的方法在其中引入解淀粉芽孢杆菌孢子混合物的PETg。
图4显示在暴露于100％湿度持续3天后，按照百分比的水含量。
图5显示了在100％氯仿中作为时间函数的孢子的存活率。
详细描述
定义
根据特别的实施方案和参考某些附图描述本发明，但是本发明不受限于此而是仅由权利要求书确定。权利要求中的任何参照标记都不认为会限制范围。所描述的附图仅仅是示意的并且是非限制性的。在附图中，一些元件的尺寸可以被放大，为了说明的目的，并不是按照比例绘制的。当术语″包括″用于本发明的说明书和权利要求时，它不排斥其它元件或步骤。当关于单数名词使用不定冠词或定冠词例如″一″或″一个″、″该″时，其涵盖了名词的复数形式，除非明确指出。
此外，术语第一、第二、第三等在该说明书和权利要求书中用于区别相似的元件而并非必然地为了描述连续的或按时间顺序。应将理解的是，所使用的术语在合适的情况下是可互换的，并且本文中所述的本发明的实施方案能够以不同于本文所描述或示出的其他顺序进行操作。
提供以下术语或定义是仅仅为了辅助理解本发明。除非明确说明，本文所使用的全部术语都具有本发明的本领域技术人员能够理解的相同含义。从业者特别地参考Sambrook等人，Molecular Cloning：A LaboratoryManual，第二版，Cold Spring Harbor Press，Plainsview，New York(1989)；和Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology(Supplement 47)，JohnWiley & Sons，New York(1999)，获得本领域的定义和术语。本文所提供的定义不应当认为具有的范围比本领域技术人员所理解的范围小。
如本文中使用的，″孢子″或者″内生孢子(endospore)″是由许多细菌产生的睡眠状态的、韧性和非繁殖的结构。孢子的主要作用是确保细菌通过环境应力周期存活。因此它们能够抵抗紫外线和γ辐射、脱水、溶菌酶、温度、饥饿和化学消毒剂。孢子通常发现在土壤和水中，它们在那里可以长时间存活。一些细菌改为产生外生孢子或包囊(cyst)、但是包囊形成方式和抵抗不利条件的程度不同于(内生)孢子。孢子比包囊抗性更强。
本申请中使用的″极性聚合物″是指使用溶解度参数分类为极性的聚合物。溶解度参数在本领域中是众所周知的并且包括例如Hansen参数和Hildebrand参数。Hildebrand参数是以单位(MJ/m3)1/2或MPa1/2表示的。Hildebrand溶解度参数(δ)提供了材料之间相互作用程度的数值估计，并且可以很好地显示出溶解性，特别地对于非极性的材料如许多聚合物。具有相似的δ值的材料可能是可混溶的。Hildebrand参数越高，聚合物的极性越强。对于本发明的目的，极性聚合物定义为Hildebrand参数为17以上，18以上，19以上或更特别地20或最特别的至少21(MPa)1/2以上。
本申请中使用的“益生菌”是指一种微生物，当其以适当的量给药时能够为宿主提供健康益处。
由此，根据第一方面，本发明涉及鉴定和分离微生物，特别是形成孢子的生物，其能够抵抗高温同时保持有活力。高温典型地是在100摄氏度至350摄氏度的范围内，更特别地更特别地在120摄氏度至350摄氏度、130摄氏度至350摄氏度、140摄氏度至350摄氏度、150摄氏度至350摄氏度、120摄氏度至300摄氏度、130摄氏度至300摄氏度、140摄氏度至300摄氏度、150摄氏度至300摄氏度的范围内。可替换的，高温可以定义为高于100摄氏度、110摄氏度、120摄氏度或130摄氏度，但不超过220摄氏度、210摄氏度、200摄氏度、190摄氏度、180摄氏度、170摄氏度、160摄氏度或150摄氏度的温度。根据特别的实施方案、微生物(或它们的孢子)当经受这些温度持续长时间时仍然保持有活力。这些微生物(孢子)可以经受得住上述范围温度的典型的时间周期包括高达30秒、高达45秒、高达1分钟、高达90秒、高达2分钟、高达150秒、高达3分钟、高达210秒、高达4分钟、高达270秒、高达5分钟、高达6分钟、高达7分钟、高达8分钟、高达9分钟、高达10分钟、高达15分钟、高达20分钟、高达25分钟、高达30分钟、高达45分钟、高达1小时、高达2小时、高达3小时、高达4小时、高达5小时、高达6小时、高达12小时、高达24小时、高达48小时、高达72小时或甚至更久。
由此，根据第二方面，本发明涉及鉴定和分离微生物，特别是形成孢子的生物，其能够抵抗高压同时保持有活力。高压典型地在下列范围内：1.5至400bar、2至400bar、3至400bar、4至400bar、5至400bar、10至400bar、20至400bar、25至400bar、30至400bar、40至400bar、50至400bar、75至400bar、100至400bar、150至400bar、200至400bar、250至400bar、300至400bar、1.5至350bar、2至350bar、3至350bar、4至350bar、5至350bar、10至350bar、20至350bar、25至350bar、30至350bar、40至350bar、50至350bar、75至350bar、100至350bar、150至350bar、200至350bar、250至350bar、300至350bar。有些时候，上限可以更低，例如压力高达250bar、高达200bar、高达150bar、高达100bar、高达50bar、高达40bar、高达30bar、高达25bar、高达20bar、高达10bar、高达5bar。1bar等于100kPa和0.98692个大气压。
根据特别的实施方案，上述微生物是解淀粉芽孢杆菌菌株，其以No.ID9698保藏在比利时菌种中心(BCCM)，或一种芽胞杆菌菌株，其gyrA序列与以No.ID9698保藏于BCCM的解淀粉芽孢杆菌菌株的部分gyrA序列(SEQ ID NO：1)为至少70％同一。根据进一步特别的实施方案、gyrA序列与SEQ ID NO：1为至少75％同一、至少80％同一、至少85％同一、至少87％同一、至少90％同一、至少91％同一、至少92％同一、至少93％同一、至少94％同一、至少95％同一、至少96％同一、至少97％同一、至少98％同一或者甚至至少99％同一。
序列同一性百分比是根据本领域已知的方法例如BLAST算法计算的。典型地使用以下术语描述两个或更多核酸或多核苷酸之间的序列关系：(a)″参照序列″、(b)″比较窗户″和(c)″序列同一性的百分比″。
(a)如本文中使用的，″参照序列″是确定的序列用作进行序列比较的基础。参照序列可以是指定序列的子集或整体；例如，全长gyrA序列的部分(如例如SEQ ID NO：1)，或完整的gyrA序列。
(b)如本文中使用的，″比较窗口″引用连续的和指定的部分多核苷酸序列，其中多核苷酸序列可以与参照序列比较，并且其中比较窗口中的多核苷酸序列部分与参照序列(其不包括添加或缺失)相比可以包含添加或缺失(即缺口)以实现两个序列的最佳的比对。通常，比较窗口为长度至少20个连续的核苷酸和任选地可以是长度30、40、50、100或以上连续的核苷酸。本领域技术人员能够理解为了避免由于在多核苷酸序列包含缺口而造成的与参照序列的高相似性，通常引入缺口罚分并且从匹配数目中减去。注意为了比对长度不同的序列，通常使用两条序列较短的测定比较窗口。
(c)如本文中使用的，″序列同一性百分比″是指通过在比较窗口比较两个最佳比对序列测定的数值，其中，比较窗口中的多核苷酸序列部分与参照序列(其不包括添加或缺失)相比可以包含添加或缺失(即缺口)以实现两个序列的最佳的比对。由测定两个序列中存在相同的核酸碱基的位置的数目以得到匹配位置的数目，然后将匹配的位置的数目出于比较窗口中位置的总数，接着讲所得到的结果乘以100计算得出百分比，从而得到了序列同一性的百分比。
比对用于比较的序列方法是众所周知的。可以通过进行BLAST确定(Basic Local Alignment Search Tool；Altschul，S.F.，et al.，(1993)J.MoI.Biol.215：403-410；see also，www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)以缺省参数检索与BLAST″GENEMBL″数据库中所包含的序列的同一性。使用BLASTN算法以缺省参数可以对序列分析与GENEMBL数据库中包含的所有公众可得到的DNA序列的同一性。
ID9698菌株特征为对特别高的耐高温性能，甚至对于上述提到的温度范围。根据特别的实施方案，高温是在干热处理期间。这些范围也是在材料加工期间所施加的温度的典型范围内，特别是在天然聚合物加工、合成聚合物加工、树脂加工、食品或饲料加工或药物组合物(药物)加工期间。微生物的孢子保留它们的生存力，即使经受这些温度持续在材料加工期间所施加的不同的时间，(其可以从约15秒至上述的时间范围)。
ID9698菌株特征还在于特别高的耐高压性能，甚至对于上述提到的范围。这些范围也是在材料加工期间所时间的典型压力范围值，特别是在天然聚合物加工、合成聚合物加工、树脂加工、食品或饲料加工或药物组合物(药物)加工期间，例如在诸如挤出、粒化、加压蒸煮、热模塑、加压模制、注射成型、热成形、浸渍、真空成形、起泡沫、热熔融等步骤期间。微生物的孢子保留它们的生存力，即使经受这些压力持续在材料加工期间所施加的不同的时间，(其可以从约15秒至上述的时间范围)。
材料加工可以包括高温步骤、高压的步骤，或者两者都有。如果材料加工方法中既有高温步骤也有高压步骤，则这些可以同时出现(材料同时受到高压和高温)、相继出现(高温步骤之后是高压步骤(尽管未必立即)，或反之亦然)。包括高压和高温步骤二者的材料加工的实例包括粒化(例如在70摄氏度和90摄氏度之间在1.5bar下)和挤出(例如在125摄氏度和150摄氏度之间在30-40bar下；用于食品或饲料产品，膏团典型地含200-300g水分/kg)。
根据进一步的方面，提供了使用如上所述耐热和/或耐压微生物生产材料的方法。所获得的材料引入至少一个新属性，其是引入微生物的直接结果。
因此，提供了用于生产在其中包含有活力的生物的材料的方法，其包括在100摄氏度和350摄氏度之间的温度下和/或在1.5和400bar之间的压力下混合下列：
-基料，其选自天然的或合成聚合物、树脂、食品、动物饲料和药物；和
-活的或有活力的微生物孢子，所述微生物的孢子在100摄氏度和350摄氏度之间的温度下和/或在1.5和400bar之间的压力下是有活力的。
根据特别的实施方案、该微生物是均匀地(均一地)分布在基料/加工材料中。
根据具体的实施方案，微生物或其孢子在100摄氏度和350摄氏度之间的温度下以及在1.5和350bar之间的压力下是有活力的。根据进一步具体的实施方案，仅仅在高温下发生混合基料和材料(即在100和350摄氏度之间，更特别地在100和220摄氏度之间，更特别地在110摄氏度和200摄氏度之间)。根据更加具体的实施方案，高温是在干热处理期间达到的。根据可选的具体的实施方案，混合基料和材料仅仅在高压下发生(即在1.5和400bar之间)。根据进一步可选的具体的实施方案，混合基料和材料在高温和高压下发生。
注意保持高温和/或高压的时间将取决于特定的处理，并且可以是显著不同的，典型地取决于基料的材料(其例如具有它特别的熔点和可塑性特性)。然而，取决于所处理的材料，本领域技术人员可以施加已知的处理并且将能够应用对于该加工期望的温度与压力，以及应该施加该温度或压力的时间的量。典型地、提高温度或压力(在100和350摄氏度之间或在1.5和400bar之间)持续至少2秒、至少5秒、至少10秒、至少20秒、至少30秒、至少40秒、至少50秒、至少一个分钟、至少70秒、至少80秒、至少90秒、至少100秒、至少110秒、至少2分钟、至少5分钟、至少10分钟。时间的最大长度也取决于处理，但通常典型地为高达30秒，高达45秒，高达1分钟，高达90秒，高达2分钟，高达150秒，高达3分钟，高达210秒，高达4分钟，高达270秒，高达5分钟，高达6分钟，高达7分钟，高达8分钟，高达9分钟，高达10分钟，高达15分钟，高达20分钟，高达25分钟，高达30分钟，高达45分钟，高达1小时，高达2小时，高达3小时，高达4小时，高达5小时，高达6小时，高达12小时，高达24小时，高达48小时，或高达72小时。
一些生物特别地适用于在本文中所述的方法中有生存力地引入到基料中。因此，在特别的实施方案中，设计微生物或其孢子属于解淀粉芽孢杆菌菌株，其以No.ID9698保藏在比利时菌种中心(BCCM)，或一种芽胞杆菌菌株，其gyrA序列与以No.ID9698保藏于BCCM的解淀粉芽孢杆菌菌株的部分gyrA序列(SEQ ID NO：1)为至少70％同一。
在工业制品的生产过程期间，如包装材料、纺织品纤维、颗粒等，微生物(特别是其孢子)和材料(例如聚合物、食品或饲料产品、药物组合物)在通常短时间内混合在一起，在这期间基料材料是液体的，由此温度高于它的熔点或加工温度。根据特别的实施方案，液体材料不沸腾，并且选择不到达水沸点的温度与压力条件。
引入的微生物典型地保持非活性的，只要条件(例如温度、压力、干旱)是不利的。然而，一旦生活条件变得有利，孢子会变成活性的、新陈代谢的细胞，具有有益的性质。有利的环境条件通常先于或符合开始与环境解释使用的产品，其就温度、压力和相对湿度而言适于生存。只要条件有利，生物学上活跃的形式将发挥它的预定作用。如果条件返回至应力状态，在活跃形式的微生物将恢复成孢子形式。在加工期间，细菌的非活跃形式被封装在连续相(定义为基料)中。优选地，该封装导致生物的均匀分布。这些生物可以具有多功能，下面提供一些可能的应用。
根据特别的实施方案，所使用的基料材料是天然的或合成聚合物。天然的聚合物包括例如纤维素及其他多糖。存在各式各样的合成聚合物，他们中的许多是非常重要的工业化合物(例如PET、PVC、PE、PU、PLA、PP、...)。根据具体的实施方案、该天然的或合成聚合物包括至少一种单体选自丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、丙烯酰胺、甲基丙烯酰胺、醇、胺、酸酐、环氧化物、苯乙烯、官能化乙烯基、官能化烯丙基、丙烯、丁二烯、乙烯、异氰酸酯、内酰胺、内酯、糖、葡萄糖和酯。引入的性质或生物将典型地取决于后续期望的用途类型而变化。特别地重要的应用领域是在食品包装领域，其采用所谓的氧气屏障，例如在多层的包装材料中用于食品如PET瓶子。这样的瓶子可以用于饮料如啤酒或果汁。在这种情况下基料材料是聚合物PET，而使用能抵抗生产过程高温的微生物。例如当包装填充饮料时，PET的内部环境变得水饱和的，从而微生物(或其孢子)被激活为形成呼吸细胞，其消耗在瓶子内部存在的全部氧气。这有益于防止氧化包装的内含物(例如食品或饮料)。此外，可以扩散通过壁的全部外部氧气被微生物捕获用于呼吸，得到有效的氧气屏障。
在另一实施方案中，提供二氧化碳屏障，在这种情况中，微生物消耗二氧化碳，或可替换的，产生在内含物中释放的二氧化碳或用作渗透屏障。注意，这些应用要求脱水/干燥的生物可以被复水。由此，用于这些应用的聚合物将能变得水饱和，即聚合物必须能够变得充分水合以便其中的孢子可以提高它们的含水率和恢复成代谢活性的生物。这可以通过使用极性聚合物获得。根据特别的实施方案，用作基料组分的聚合物是极性聚合物。可替换的，或另外地，使用具有充分高吸水率值的聚合物。根据特别的实施方案、聚合物的吸水率值为至少0.01；至少0.02；至少0.1或至少0.2。根据非常具体的实施方案，聚合物是极性聚合物具有充分高的吸水率值。
使用的另一个例子是用作UV阻断剂，其以上述例子相似的方式发挥作用。对于这样的情况，应当使用这样的微生物，其孢子非常强烈地阻断紫外线(典型地，这样的孢子含高浓度虾青素)。这个特征可被用于抗湿阻UV薄膜和聚合物遮盖物。
本发明方法的使用的另一实例是制备用于或动物消费的材料例如食品、动物饲料或狗粮、药物、药物制剂等典型地，引入的微生物将基于其在被摄取时对生物健康的有益的性质，即它是益生菌。
典型地，引入的微生物将基于其在被摄取时对生物健康的有益的性质，即它是益生菌。益生菌细菌或酒母培养被用来辅助身体自然存在的肠道菌群、微生物的生态学以重新建立他们自身。它们有时在一系列抗生素，或作为肠有关念珠菌病治疗的一部分之后被推荐。宣称益生菌巩固免疫系统以抗击变应性、过多的酒精摄入、应力、暴露至毒性物质和其它疾病。在此情形下，与我们身体合作很好的细菌的数目可能降低，甚至允许有害的竞争者存活，进而有损我们的健康。益生菌已经被证明是有益的例如管理乳糖不耐受、预防结肠癌、胆固醇降低、降低血压、改善免疫功能、防止感染、治疗Helicobacter pylori感染、减少抗生素相关腹泻、降低炎症、改善矿物吸收、预防在受力状态下有害的细菌滋长和改善过敏性肠综合征和溃疡性结肠炎症状。
根据特别的实施方案，(基料)材料是用于人或动物消费的，微生物或其孢子是益生菌。
例如微生物或它们的孢子可以作为粉末引入，或作为冻干粉末引入，如本领域技术人员所已知的。也可以设计其他形式，取决于基料材料或进行的方法的类型。
在材料加工期间，通常发生材料需要呈现某种形状的事情。食品、饲料和药物例如常常被挤出，动物饲料常常被粒化，聚合物可能被塑模为特定的形状。这些处理是本领域技术人员已知的。然而，现在典型地是在添加微生物之前进行(Biourge等，1998)，这里所提供的方法允许在这些处理步骤之前添加微生物，而生物仍保持有活力。这不仅仅更简单，而且更成本有效，而且具有额外的益处即微生物可以被均匀地引入到材料中。
因此，提供了一些方法，其中挤出步骤、粒化步骤、加压蒸煮步骤、热模塑步骤、加压模制步骤、注射成型步骤、热成形步骤、浸渍步骤、真空成形步骤、起泡沫步骤或热熔融步骤是在混合基料材料和微生物或其孢子的过程中或之后进行的。
根据进一步的具体实施方案中，挤出步骤、粒化步骤、加压蒸煮步骤、热模塑步骤、加压模制步骤、注射成型步骤、热成形步骤、浸渍步骤、真空成形步骤、起泡沫步骤或热熔融步骤是在100摄氏度和350摄氏度之间的温度下进行的。根据可选的具体的实施方案，挤出步骤、粒化步骤、加压蒸煮步骤、热模塑步骤、加压模制步骤、注射成型步骤、热成形步骤、浸渍步骤、真空成形步骤、起泡沫步骤或热熔融步骤是在1.5-400bar之间的压力下进行的。根据更进一步的可选的实施方案，挤出步骤、粒化步骤、加压蒸煮步骤、热模塑步骤、加压模制步骤、注射成型步骤、热成形步骤、浸渍步骤、真空成形步骤、起泡沫步骤或热熔融步骤是在100摄氏度和350摄氏度之间的温度下和在1.5和400bar之间的压力下进行的。(注意有可能材料在经受高温之前经受高压，或反之亦然，事实上，在该处理步骤过程中同时出现并不自动地意味温度与压力被同时提高，尽管这也是有可能的)。
根据进一步的方面，本发明涉及在其中包含有活力的生物的材料，所述材料包括选自天然的或合成聚合物、树脂、食品、动物饲料和药物的基料。更特别地通过如上所述本发明的方法获得材料。在具体的实施方案中，材料中有活力的微生物是如上所述耐热和/或耐压的生物。更具体的有活力的微生物是解淀粉芽孢杆菌菌株，其以No.ID9698保藏在比利时菌种中心(BCCM)，或一种芽胞杆菌菌株，其gyrA序列与以No.ID9698保藏于BCCM的解淀粉芽孢杆菌菌株的部分gyrA序列(SEQ ID NO：1)为至少70％同一。在另外的实施方案中，上述材料的基料是极性聚合物。
根据更具体的实施方案，材料是如上所述极性聚合物，其含有有活力的耐热和/或耐压的微生物，例如但不限于解淀粉芽孢杆菌菌株，其以No.ID9698保藏根据比利时菌种中心(BCCM)，或一种芽胞杆菌菌株，其gyrA序列与以No.ID9698保藏于BCCM的解淀粉芽孢杆菌菌株的部分gyrA序列(SEQ ID NO：1)为至少70％同一。
根据另一实施方案，本发明涉及其中包含有活力的需氧的耐热和/或耐压微生物的极性聚合物作为氧气屏障的用途。
根据另一方面，本发明涉及使用活的或有活力的孢子的微生物用于生产在其中含有有活力的微生物的材料的用途，所述微生物的孢子在100摄氏度和350摄氏度之间的温度下和/或在1.5和400bar之间的压力下是有活力的，更特别地在100摄氏度和220摄氏度之间的温度下和/或在1.5和50bar之间的压力下是有活力的。在更具体的实施方案中，活的或者有活力的孢子来自解淀粉芽孢杆菌菌株，其以No.ID9698保藏在比利时菌种中心(BCCM)，或一种芽胞杆菌菌株，其gyrA序列与以No.ID9698保藏于BCCM的解淀粉芽孢杆菌菌株的部分gyrA序列(SEQ ID NO：1)为至少70％同一。
应将理解的是，虽然本文已经就根据本发明的细胞和方法描述了特别的实施方案、具体的配置以及材料和/或分子，但可以在形式上和细节上进行各种变化或改变，而不会离开本发明的范围和精神。提供以下的例子以更好地说明特别的实施方案，并且他们不被认为限制本申请。本申请仅受限于权利要求。
实施例
实施例1.解淀粉芽孢杆菌的表征
微生物的培养
从原始材料能够分离四个不同的集落类型(ID9698 t1，ID9698 t2，ID9698 t3和ID9698 t4)，将其分别纯化和分析。原始材料是从Morocco的Biougra(Anti-Atlas的干旱地区)获得的，在这种区域有机会在暴露于光照的干燥有机基质上发现对夏天极端高温有抗性的孢子。
进行脂肪酸分析，并将所有四种培养物分配至组“芽孢杆菌和相关的分类单元”。随后，进行部分16S rDNA序列分析，并将所有四种培养物鉴定为属于枯草芽孢杆菌复合物。
使用部分gyrA序列分析进一步鉴定ID9698 t1
部分gyrA序列分析和系统发生学研究：在枯草芽孢杆菌复合物内物种间区分gyrA序列的适用性已经被Chun和Bae报道(Chun J.and Bae K.S.2000.Phylogenetic analysis of Bacillus subtilis and related taxa based onpartial gyrA gene sequences.Antonie van Leeuwenhoek 78：123-127)，并且已经得到成功证明。
通过PCR扩增gyrA基因，从在RAPD分析的框架中提取的DNA开始。使用96 PCR Clean-up Kit(Macherey-Nagel，
Figure BDA0000051829080000162
Germany)纯化PCR扩增的gyrA。
使用
Figure BDA0000051829080000163
Terminator Cycle Sequencing Kit(Applied Biosystems，Foster City，CA，USA)进行测序反应，并使用
Figure BDA0000051829080000164
XTerminatorTPurification Kit(Applied Biosystems，Foster City，CA，USA)进行纯化。使用ABI3130XL Genetic Analyzer(Applied Biosystems，Foster City，CA，USA)进行测序。选择引物具有部分重叠序列，确保高保真的组装数据。
通过使用程序AutoAssemblerTM(Applied Biosystems，Foster City，CA，USA)进行序列组装。
使用软件包BioNumerics(Applied Maths，Belgium)形成相似性矩阵，通过缺口罚分0％的同源性以及在去掉未知的碱基的计算，并且基于使用开口缺口罚分100％和单元缺口罚分0％的成对比对。
使用软件包BioNumerics(Applied Maths，Belgium)在引入保守序列之后进行系统发生学分析，这些保守序列与从国际核苷酸序列库EMBL A收集的小核糖体亚基序列一致。使用邻近连接法构建结果树。
结论
1.显然ID9698 t1的系统发生学位置是在枯草芽孢杆菌复合物。
2.发现与许多解淀粉芽孢杆菌菌株具有高gyrA序列相似性(95.9-99.7％)，证明了ID9698 t1属于该物种。
实施例2.微生物的干热抗性
材料和方法
测试的微生物
1.菌株ID9698(鉴定为解淀粉芽孢杆菌)
2.LMG 8197：枯草芽孢杆菌Spizizenii亚种，一种其gyrA序列显示出与SEQ ID NO：1具有＞70％序列同一性的细菌；
3：
Figure BDA0000051829080000171
商购可得的具有活酵母(益生菌)(布拉酵母菌(Saccharomyces boulardii))的药物；
4：商购可得的具有活乳酸细菌(益生菌)(嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)NCFM和乳酸双岐杆菌(Bifidobacterium lactis)BI-07的1/1混合物)的药物。
干热处理
将已知量的不同微生物粉末转移至直径8mm的玻璃试管(VWR，article212-0011)，并用适当的塑料盖封闭。试管盛满四分之一。将试管四分之三浸入温度为100±0.1摄氏度和110±0.1摄氏度的煎炸油，以及240±5摄氏度和280±5摄氏度的金属浴(仅针对芽孢杆菌)。浴的温度是由具有数据记录器的热偶控制的。
在所有处理中，温度也实施在四分之一充满砂子的试管中。从这些测量，似乎需要1分钟将样品加热到期望的温度。保持该温度持续额外的1分钟(处理2分钟)。仅将酵母样品在240摄氏度下浸入持续仅1分钟，因为2分钟是物理上不可行的(样品过多起泡沫)。同样，仅将芽孢杆菌样品在280摄氏度下处理1分钟。
在处理后，将1mlPPS加入到试管中，并将系列稀释液涂布在平板上。在30摄氏度温育48小时候，对所有平板进行计数。在30摄氏度温育额外1天不会得到额外的集落。对于所有芽孢杆菌菌株在″Fortified Nutrient Agar″(NA+)上进行温育，对于乳酸细菌在″Man，Rogosa and Sharp agar″(MRS)上进行温育，对于酵母在″Yeast Extract Glucose Chloramphenicol Agar″(YGC)上进行温育。
所有测量都进行两份，并将结果表达为log cfu/克粉末。
结果
根据显示在图1中的结果，似乎在100摄氏度和110摄氏度下，乳酸细菌已经显示降低±3.50log。在这些温度下，芽孢杆菌菌株降低为±1-1.5log单位，而对于酵母菌株则没有观察到降低(尽管集落形成能力一开始就比较低)。
在240摄氏度，酵母和乳酸细菌都显示出较小的生长率。然而这都是非常小的：在两种样品中，cfu数目绝对值从＞108cfu降低至10cfu。这种幸存者的小百分比可能完全是因为试管盖上的微生物。这部分样品没有浸没，因而没有在相同程度上被加热。
在第二种稍微不同设置的实验中，解淀粉芽孢杆菌菌株ID9698的干热抗性与酵母和乳酸细菌的干热抗性相比较。
材料和方法
测试的微生物
1.菌株ID9698(鉴定为解淀粉芽孢杆菌)
2.酵母：Bakery yeast Bruggeman instant(Algist Bruggeman，Ghent)(酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)
3.
Figure BDA0000051829080000181
商购可得的具有活乳酸细菌(益生菌)(嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)NCFM和乳酸双岐杆菌(Bifidobacterium lactis)BI-07的1/1混合物)的药物
干热处理
在热重力分析仪(TGA)中进行干热处理。处理温度从100摄氏度变化至240摄氏度，梯度为10摄氏度。
设置已知等份(大约15mg)的干粉(分别含有10,89log孢子/g解淀粉芽孢杆菌、10,17log cfu/g酵母或9,09log cfu/g乳酸细菌)，并经受处理温度，预热TGA和热处理2分钟。
将粉末转移至无菌eppendorf试管，并重悬浮于1ml无菌生理盐水(PPS)。之后，将适当的稀释液涂布在″Fortified Nutrient Agar″(NA+)上(对于解淀粉芽孢杆菌)，在″Man，Rogosa and Sharp agar″(MRS)上(对于乳酸细菌)，在″Yeast Extract Glucose Chloramphenicol Agar″(YGC)上(对于酵母)。在计数之前，将所有平板在30摄氏度下温育3天。
结果
这些结果显示测试的微生物在热稳定性方面有显著的区别。在130摄氏度的处理温度下，对于乳酸细菌出现了超过1log的降低(参见表1)。在相同的温度下，对于解淀粉芽孢杆菌和酵母则几乎没有观察到降低。
对于酵母，显著的降低发生在150摄氏度的处理温度(3,61log)，而对于解淀粉芽孢杆菌则直到180摄氏度都几乎没有降低(＜1log)。
表1 15mg干粉样品的降低(log cfu)
Figure BDA0000051829080000201
标注“＞”的结果是在检测限度以下。
在一组其他的可比较的实验中，使用较小的体积来评估酵母的干热抗性，从130摄氏度开始就已经观察到了集落生长率的显著降低(数据未显示)。
实施例3聚合物吸水率的分析
对于全部测试的聚合物，都能够观察到吸水率作为时间函数的增加(图2和3)。在图3中，PU显示出极端高的吸水率，这与其他三种聚合物相反。在这些测量中，PU在3天后达到平稳状态。对于PETg和BioPETg(即解淀粉芽孢杆菌孢子与PETg的混合物)，也观察到高吸收值。在图3中，可以清楚地观察到这两种聚合物的小差别。从第1天到第3天获得了BioPETg的平稳状态。从第4天，可以观察到提高。可以预期作为时间函数的PET的低吸水率。图4显示在暴露于100％湿度3天后，按照百分比的液体含量。
表2列出了对于一些聚合物的极性值和吸水率值。
表2
  聚合物   极性   吸水率
  PETg   -   0,296
  PET   21.9   0,188
  PU   22.9   1,232
  PLA   21.0   0,670
  PP   19.2   0,129
  PE   ±18   0,055
  HDPE   -   0,022
  PC   -   0,206
实施例4：在高温和高压引入聚酯之后存活的孢子的测定
介绍
在高温和高压下在聚酯中引入干燥的孢子材料。通过从聚酯提取孢子测定在引入处理之后孢子的存活率。通过铺平板技术量化活的孢子。
材料和方法
通过合适的发酵方法和下游处理产生干燥的孢子粉末。
在聚酯中引入干燥的孢子。作为聚酯的典型实例，使用PETG。以4w/w％浓度利用聚合物加压完成引入。在210摄氏度下，在10KN的压力下，对没有孢子的聚合物板(空白)进行加压5分钟。在两个空白聚合物板之间以恰当的浓度加压干燥粉末孢子粉末，以获得一个在其中引入孢子的新样品。在210摄氏度和29bar下进行处理5分钟。
将在其中引入孢子的0.02g聚合物板溶解在1/1的氯仿(CHCl3)/去离子水混合物中。这在超声波浴中进行10分钟。在溶解处理期间，孢子从聚合物中释放到氯仿级分中。由于剧烈搅拌，释放的孢子立刻转移到水级分中。
在溶解之后，在含有聚合物的氯仿级分以及含有孢子的水级分之间出现了相分离。通过在PPS中进行适当的十倍稀释并在营养琼脂培养基(NA)上涂布平板来测定在水中活的孢子的量。在计数之前，将NA板在30摄氏度温育48小时。
结果和结论
实验表明100％氯仿处理10分钟得到了孢子计数最大减少1.7log(图5)。
提取的孢子迅速地转移到水相，使得与氯仿的接触时间最小。由此可以预期该提取方法对孢子存活具有最小的影响。
从表3中的结果，能够看出选择的孢子经受得住高温和高压引入聚合物基料，进一步容许在引入之后使用这些生物。
表3在引入聚酯中后孢子的减少
Figure BDA0000051829080000221
实施例5材料性质对引入的生物氧气清除活性的影响
介绍
将干燥的孢子材料引入不同的聚合物材料。选择宽范围极性的聚合物(表2)。聚氨酯(PU)的极性大于聚乳酸(PLA)。
聚合物的极性对聚合物水分吸收有显著影响。聚合物极性越大，吸收的水越多。通过许多聚合物的吸水率数据证明这一点(表2)。
材料和方法
通过合适的发酵方法和下游处理产生干燥的孢子粉末。将干燥的孢子以4w/w％浓度引入到两个不同的聚合物(PU和PLA)。利用聚合物加压完成引入到聚合物基料中。
对于PU在130摄氏度将不含孢子(空白)的聚合物板加压5分钟，对于PLA为170摄氏度，压力为10kN。
将干燥的孢子粉末以恰当的浓度在两个空白聚合物板之间加压，使得孢子在聚合物基料中熔融混合获得一个新的混合样品。对于PU在130摄氏度温度下和对于PLA在170摄氏度下以及10kN下进行处理5分钟。
通过用氮气冲洗将顶部空间的氧气浓度设定为±5％。加入9ml无菌去离子水，以获得孢子萌发需要的高湿度。为了抑制消耗氧气的微生物在水中的生长，添加10mg/l氨苄青霉素，一种宽谱抗生素。通过将1.2g压制的样品置于密闭的顶部空间21ml的容器中，进行氧气吸收测量。利用非侵入的氧气测量仪设备Oxysense 210T测量顶部空间中的氧浓度。结果通过重复两次计算平均氧气吸收速度(OAR)(ml氧气/天)。数据在表4中给出。表4在PU和PLA中引入的孢子的氧气吸收速率
对于聚合物和PU(极性值高于20)，能够观察到优良的活性氧清除活性。在PU和PLA之间没有观察到氧气吸收速率的显著差别。
从该实验，可以得出结论当使用生物制剂(孢子)作为聚合物中活性氧清除剂时，可以根据我们确定的关于极性和吸水能力的标准来使用那些聚合物。
参考文献
Biourge V，Vallet C，Levesque A，Sergheraert R，Chevalier S，Roberton J-L The Use of Probiotics in theDiet of Dogs.J.Nutr.1998；128：2730S-2732S.
Figure IDA0000051829120000011

Claims (17)

1.一种解淀粉芽孢杆菌，所述解淀粉芽孢杆菌以No.ID9698保藏在比利时菌种中心(BCCM)，或一种芽胞杆菌菌株，所述芽胞杆菌菌株的gyrA序列与以No.ID9698保藏于BCCM的解淀粉芽孢杆菌菌株的部分gyrA序列(SEQ ID NO：1)为至少70％同一。
2.一种生产在其中包含有活力的生物的材料的方法，其包括在100摄氏度和220摄氏度之间的温度下和/或在1.5和50bar之间的压力下，混合下列：
-基料，其选自天然的或合成聚合物；和
-活的或有活力的微生物孢子，所述孢子在100摄氏度和220摄氏度之间的温度下和/或在1.5和50bar之间的压力下是有活力的。
3.根据权利要求2的方法，其中所述微生物或其孢子在100摄氏度和220摄氏度之间的温度下以及在1.5和50bar之间的压力下是有活力的。
4.根据权利要求2或3的方法，其中所述微生物或其孢子属于解淀粉芽孢杆菌，所述解淀粉芽孢杆菌以No.ID9698保藏在比利时菌种中心(BCCM)，或所述微生物或其孢子属于一种芽胞杆菌菌株，所述芽胞杆菌菌株的gyrA序列与以No.ID9698保藏于BCCM的解淀粉芽孢杆菌菌株的部分gyrA序列(SEQ ID NO：1)为至少70％同一。
5.根据权利要求2-4中任一项的方法，其中所述聚合物包括选自下列的至少一种单体：丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、丙烯酰胺、甲基丙烯酰胺、醇、胺、酸酐、环氧化物、苯乙烯、官能化乙烯基、官能化烯丙基、丙烯、丁二烯、乙烯、异氰酸酯、内酰胺、内酯、糖、葡萄糖和酯。
6.根据权利要求2-5中任一项的方法，其中所述聚合物是极性聚合物。
7.根据权利要求6的方法，其中所述聚合物具有至少20(MPa)1/2的极性。
8.根据权利要求2-7中任一项的方法，其中所述聚合物具有至少0.2的吸水率值。
9.根据权利要求2-8中任一项的方法，其中在所述混合期间或者之后进行挤出步骤、粒化步骤、加压蒸煮步骤、热模塑步骤、加压模制步骤、注射成型步骤、热成形步骤、浸渍步骤、真空成形步骤、起泡沫步骤或热熔融步骤。
10.根据权利要求9的方法，其中在100摄氏度和220摄氏度之间的温度下和/或在1.5和50bar之间的压力下进行所述挤出步骤、粒化步骤、加压蒸煮步骤、热模塑步骤、加压模制步骤、注射成型步骤、热成形步骤、浸渍步骤、真空成形步骤、起泡沫步骤或热熔融步骤。
11.根据权利要求2-10中任一项的方法，其中在干燥条件下实现高温。
12.一种具有有活力的微生物的材料，其可以根据权利要求2-11的方法获得。
13.根据权利要求12的材料，其中所述微生物的是好氧微生物。
14.根据权利要求12或13的材料，其中所述微生物是解淀粉芽孢杆菌菌株，所述解淀粉芽孢杆菌以No.ID9698保藏在比利时菌种中心(BCCM)，或一种芽胞杆菌菌株，所述芽胞杆菌菌株的gyrA序列与以No.ID9698保藏于BCCM的解淀粉芽孢杆菌菌株的部分gyrA序列(SEQ IDNO：1)为至少70％同一。
15.根据权利要求13或14的材料作为氧气屏障的用途。
16.活的或有活力的微生物孢子用于生产在其中含有有活力的微生物的材料的用途，所述微生物的孢子在100摄氏度和220摄氏度之间的温度下和/或在1.5和50bar之间的压力下是有活力的。
17.根据权利要求16的用途，其中所述孢子源自于解淀粉芽孢杆菌菌株，所述解淀粉芽孢杆菌以No.ID9698保藏在比利时菌种中心(BCCM)，或源自于一种芽胞杆菌菌株，所述芽胞杆菌菌株的gyrA序列与以No.ID9698保藏于BCCM的解淀粉芽孢杆菌菌株的部分gyrA序列(SEQ IDNO：1)为至少70％同一。
CN2009801373603A 2008-09-24 2009-09-24 在材料中引入耐热和/或耐压生物 Pending CN102369105A (zh)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US19415808P 2008-09-24 2008-09-24
US61/194,158 2008-09-24
EP09168652.7 2009-08-26
EP09168652 2009-08-26
PCT/EP2009/062389 WO2010034776A1 (en) 2008-09-24 2009-09-24 Incorporation of thermo-resistant and/or pressure-resistant organisms in materials

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN102369105A true CN102369105A (zh) 2012-03-07

Family

ID=41254669

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN2009801373603A Pending CN102369105A (zh) 2008-09-24 2009-09-24 在材料中引入耐热和/或耐压生物

Country Status (11)

Country Link
US (1) US11028454B2 (zh)
EP (2) EP3508342A1 (zh)
JP (1) JP2012503473A (zh)
KR (2) KR20110098996A (zh)
CN (1) CN102369105A (zh)
AU (2) AU2009295886A1 (zh)
BR (1) BRPI0913683A2 (zh)
CA (1) CA2738602A1 (zh)
EA (1) EA201100533A1 (zh)
MX (1) MX348019B (zh)
WO (1) WO2010034776A1 (zh)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107474426A (zh) * 2017-08-07 2017-12-15 佛山粤泓益生物科技有限公司 聚氯乙烯微生态农业塑料母料及由其制成的育秧盘
CN107474356A (zh) * 2017-08-07 2017-12-15 佛山粤泓益生物科技有限公司 聚乙烯微生态农业塑料母料及由其制成的育秧盘
CN117431192A (zh) * 2023-12-20 2024-01-23 航天神舟生物科技集团有限公司 一株解淀粉芽孢杆菌及其在行星保护领域中的应用

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2012145803A2 (en) * 2011-04-29 2012-11-01 Resilux N.V. Method for producing a polymer product from multidimensional aggregated components as barrier or carriers of living microbial cells and biological barriers in plastic and textile
EP2518138A1 (en) * 2011-04-29 2012-10-31 Resilux Method for producing a polymer product from polar lipids from archaea as carriers of living microbial cells and biological barriers in plastic and textile
BE1019981A5 (nl) * 2011-05-18 2013-03-05 Resilux Holle voorwerpen, i.h.b. kunststofvoorvormen, res.-behouders, met een barrierelaag en spuitgietwerkwijze, resp. inrichting voor het vervaardigen ervan.
US9476835B2 (en) 2012-04-13 2016-10-25 Empire Technology Development Llc Bioluminescent packaging
WO2014007822A1 (en) * 2012-07-05 2014-01-09 Empire Technology Development Llc Bioactive packaging
US20170224745A1 (en) * 2014-07-25 2017-08-10 The University Of Queensland Bacillus amyloliquefaciens probiotic compositions, methods of production, and methods of use
TWI599598B (zh) * 2016-11-24 2017-09-21 Biodegradable film material and method of making the same

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101023169A (zh) * 2004-09-03 2007-08-22 乐思乐可斯公司 制造疏水性聚合物的方法

Family Cites Families (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SE8702840D0 (sv) 1987-07-10 1987-07-10 Plm Ab Barrierforsterkning
SE460518B (sv) * 1988-02-17 1989-10-23 Diffchamb Ab Gelkropp innehaallande mikroorganismer foer steriliseringskontroll samt foerfarande foer att genomfoera en steriliseringskontroll
US6645506B1 (en) * 1997-04-18 2003-11-11 Ganeden Biotech, Inc. Topical compositions containing extracellular products of Pseudomonas lindbergii and Emu oil
US6423345B2 (en) * 1998-04-30 2002-07-23 Acusphere, Inc. Matrices formed of polymer and hydrophobic compounds for use in drug delivery
US6248321B1 (en) * 1999-01-14 2001-06-19 Her Majesty The Queen In Right Of Canada, As Represented By The Minister Of Natural Resources, Canadian Forestry Service Encapsulation of microparticles in teardrop shaped polymer capsules of cellular size
GB0005839D0 (en) * 2000-03-10 2000-05-03 Provita Eurotech Ltd Storage and delivery of micro-organisms
FR2806417B1 (fr) * 2000-03-16 2003-12-26 Lallemand Sa Particules enrobees contenant des microorganismes vivants, procede de production et application desdites particules dans les compositions pharmaceutiques, dietetiques ou alimentaires
JP2001300477A (ja) 2000-04-21 2001-10-30 Shinada Kikai Seisakusho:Kk 微生物製剤を利用して有機性廃棄物を高速安定分解する廃棄物処理方法
JP4092592B2 (ja) * 2001-02-21 2008-05-28 株式会社日立プラントテクノロジー 加熱担体及びその製造方法、並びに加熱担体を用いた環境浄化方法
JP2002274521A (ja) * 2001-03-16 2002-09-25 Yoshino Kogyosho Co Ltd 環境に優しいプラスチック容器
GB0205867D0 (en) * 2002-03-13 2002-04-24 Univ Nottingham Polymer composite loaded with functioning matter
US20040109853A1 (en) * 2002-09-09 2004-06-10 Reactive Surfaces, Ltd. Biological active coating components, coatings, and coated surfaces
KR100427600B1 (ko) * 2003-03-07 2004-04-28 (주)한국바이오케미칼 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 및 이를 포함하는 사료 첨가제
US20050238721A1 (en) 2004-04-07 2005-10-27 Acquarulo Lawrence A Jr One step compounding extrusion of drug filled polymers
US20060228448A1 (en) 2005-04-11 2006-10-12 The Iams Company Pet food compositions comprising two components
US8592343B2 (en) * 2005-09-09 2013-11-26 Embrapa And Universidade Federal Rural Do Rio De Janeiro Polymeric compositions containing rhizobium and/or plant growth-promoting rhizobacteria inoculant, use thereof and seeds treated with the compositions
WO2007060539A2 (en) 2005-11-28 2007-05-31 Jorrocks Pty Ltd. Methods for preparation of animal feeds
US20080057047A1 (en) * 2005-11-29 2008-03-06 Benedikt Sas Use of bacillus amyloliquefaciens PB6 for the prophylaxis or treatment of gastrointestinal and immuno-related diseases

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101023169A (zh) * 2004-09-03 2007-08-22 乐思乐可斯公司 制造疏水性聚合物的方法

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107474426A (zh) * 2017-08-07 2017-12-15 佛山粤泓益生物科技有限公司 聚氯乙烯微生态农业塑料母料及由其制成的育秧盘
CN107474356A (zh) * 2017-08-07 2017-12-15 佛山粤泓益生物科技有限公司 聚乙烯微生态农业塑料母料及由其制成的育秧盘
CN107474356B (zh) * 2017-08-07 2020-10-09 佛山粤泓益生物科技有限公司 聚乙烯微生态农业塑料母料及由其制成的育秧盘
CN107474426B (zh) * 2017-08-07 2020-11-06 佛山粤泓益生物科技有限公司 聚氯乙烯微生态农业塑料母料及由其制成的育秧盘
CN117431192A (zh) * 2023-12-20 2024-01-23 航天神舟生物科技集团有限公司 一株解淀粉芽孢杆菌及其在行星保护领域中的应用
CN117431192B (zh) * 2023-12-20 2024-04-23 航天神舟生物科技集团有限公司 一株解淀粉芽孢杆菌及其在行星保护领域中的应用

Also Published As

Publication number Publication date
EA201100533A1 (ru) 2011-10-31
AU2016200258B2 (en) 2017-08-31
EP2352641A1 (en) 2011-08-10
MX348019B (es) 2017-05-23
KR101764592B1 (ko) 2017-08-23
US11028454B2 (en) 2021-06-08
BRPI0913683A2 (pt) 2015-11-24
EP3508342A1 (en) 2019-07-10
AU2009295886A1 (en) 2010-04-01
KR20170017001A (ko) 2017-02-14
KR20110098996A (ko) 2011-09-05
CA2738602A1 (en) 2010-04-01
AU2016200258A1 (en) 2016-02-04
MX2011003048A (es) 2011-05-19
US20110217758A1 (en) 2011-09-08
WO2010034776A1 (en) 2010-04-01
JP2012503473A (ja) 2012-02-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN102369105A (zh) 在材料中引入耐热和/或耐压生物
Kosin et al. Microbial and processing criteria for production of probiotics: a review
De Bellis et al. Probiotic table olives: microbial populations adhering on olive surface in fermentation sets inoculated with the probiotic strain Lactobacillus paracasei IMPC2. 1 in an industrial plant
CN102191192B (zh) 一种动物双歧杆菌及其应用方法
Zapata et al. Antimicrobial activities of lactic acid bacteria strains isolated from Nile Tilapia intestine (Oreochromis niloticus)
TWI495722B (zh) 新穎雙叉桿菌屬細菌、含有其之飲食品、用於檢測或定量其之dna片段及引子之用途、與其檢測或定量方法
Zwielehner et al. DGGE and real‐time PCR analysis of lactic acid bacteria in bacterial communities of the phyllosphere of lettuce
Rezaei et al. Isolation of lactic acid probiotic strains from Iranian camel milk: technological and antioxidant properties
Dey et al. Isolation, identification and In vitro characterisation of probiotic yeast strains
CN107937316B (zh) 空间罗伊氏乳杆菌Fullarton-9-71及应用
CN107974424B (zh) 空间罗伊氏乳杆菌Fullarton-9-25及应用
Kumar Bajaj et al. Bioprospecting for functionally-proficient potential probiotics
CN101432006B (zh) 具有增强耐酸性的乳酸菌的方法和应用
CN107974425B (zh) 空间罗伊氏乳杆菌Fullarton-9-79及应用
CN103874428A (zh) 解木聚糖拟杆菌物种微生物
Thokchom et al. Microbial and chemical changes during preparation in the traditionally fermented soybean product Tungrymbai of ethnic tribes of Meghalaya
Lauková et al. Probiotic potential of enterococci isolated from canine feed
Prima et al. Antimicrobial potential of Limosilactobacillus Fermentum isolated from bilih fish (Mystacoleucus padangensis) of Singkarak lake, West Sumatera, Indonesia
KR101311989B1 (ko) 면역 조절 및 강화 효능을 갖는 락토바실러스 카제이 에이치와이7211를 유효성분으로 함유하는 제품
CN115066490B (zh) 新型双歧杆菌属细菌以及包含其的组合物
CN108094527A (zh) 空间罗伊氏乳杆菌Fullarton-9-87及应用
Surnis et al. Microencapsulation of Probiotics (Lactobacillus Casei and Bifidobacterium Longum) in Pineapple Jam by Spray Drying and its Comparitive Study
Aung et al. A comprehensive review on kombucha biofilms: A promising candidate for sustainable food product development
Venugopal et al. Check Chapter 1 updates for
Nguyen et al. Evolution of Kombucha Tea from Isolated Acetic Acid Bacteria, Lactic Acid Bacteria and Yeast in Single-and Mixed-Cultures: Characteristics, Bioactivities, Fermentation Performance and Kinetics

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C05 Deemed withdrawal (patent law before 1993)
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20120307