CN102352364A - 肺炎克雷伯氏菌nifH基因的克隆与表达方法 - Google Patents

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Abstract

肺炎克雷伯氏菌nifH基因的克隆与表达方法，它涉及nifH基因的克隆与表达方法。方法：提取肺炎克雷伯氏菌的基因组DNA；PCR扩增获得目的基因nifH，与载体连接，获得重组质粒pMD18-T-nifH；提取质粒，双酶切后构建重组质粒PET28a-nifH，再转化大肠杆菌，获得含有质粒PET28a-nifH的大肠杆菌；然后接种到含卡那霉素的LB液体培养基中培养，获得培养菌液；然后加入到含卡那霉素的LB液体培养基中培养，然后加IPTG培养，进行诱导表达；通过SDS-PAGE分析，发现有特异性条带出现即完成。本发明对开发人畜无毒、环保的杀白蚁生物药剂具有重要的理论意义和现实意义。

Description

肺炎克雷伯氏菌nifH基因的克隆与表达方法
技术领域
本发明涉及nifH基因的克隆与表达方法。
背景技术
白蚁Termite属于节肢动物门昆虫纲有翅亚纲等翅目的昆虫，是较为古老的社会性害虫。每年因白蚁危害建筑物和农作物所造成的经济损失达千亿美元以上。现有的杀灭白蚁的药剂均为化学药剂，故都有很大的毒副作用，造成严重的环境污染。利用生物技术开发具有高效、无毒、残效期长、对环境影响小的白蚁生物防治剂成为未来白蚁防治剂的主要方向。
Termite属于典型的寡氮营养型生物，其肠道固氮微生物的固氮作用是白蚁体内氮素的主要来源。目前，科学家已从白蚁科、鼻白蚁科、木白蚁科、原白蚁科的部分属中克隆得到了大量nifH基因序列。系统发育分析表明，同一属的白蚁肠道共生固氮菌nifH基因具有更近的亲缘关系，不同白蚁肠道共生固氮菌nifH基因多样性明显不同。虽然已知白蚁肠道nifH基因具有较高多样性，但仅有少量的nifH基因能够被优先转录并表达出来，大多数的nifH基因不能被表达。因此，在白蚁肠道内克隆和表达nifH基因，对于了解白蚁的固氮机制和白蚁的生物防治提供新的途径。
发明内容
本发明的目的是提供肺炎克雷伯氏菌nifH基因的克隆与表达方法。
肺炎克雷伯氏菌nifH基因的克隆与表达方法按以下步骤进行：
一、取3mL肺炎克雷伯氏菌HUB-IV-004的菌液，以12000r/min离心1min，弃去上清，然后按照TIANGEN公司的细菌基因组DNA提取试剂盒的操作方法提取基因组DNA；
二、以步骤一中提取的基因组DNA为模板进行PCR扩增，获得目的基因nifH，然后与pMD18-T载体连接，获得重组质粒pMD18-T-nifH；
三、按照TIANGEN质粒小提试剂盒的操作方法提取重组质粒pMD18-T-nifH和pET28a质粒，然后用EcoR I和Nde I分别对重组质粒pMD18-T-nifH和pET28a质粒进行双酶切，回收所需目的片段，连接并构建重组质粒PET28a-nifH，再转化大肠杆菌BL21，获得含有质粒PET28a-nifH的大肠杆菌；
四、将含有质粒PET28a-nifH的大肠杆菌接种到含卡那霉素的LB液体培养基中，在37℃、150r/min的条件下培养16h，获得培养菌液；
五、取200μL培养菌液加入到20mL含卡那霉素的LB液体培养基中，在37℃、150r/min的条件下培养3h，然后加IPTG(异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷)至终浓度为0.5mmol/L，在20℃、150r/min的条件下培养2h、3h、4h、5h、过夜，进行诱导表达；
六、诱导表达后的菌液通过SDS-PAGE分析，发现有特异性条带出现，即完成肺炎克雷伯氏菌nifH基因的克隆与表达；
其中步骤一中肺炎克雷伯氏菌HUB-IV-004，它为肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)HUB-IV-004，属于克雷伯菌属(Klebsiella)，它的保藏编号为CCTCC NO：M 2011312，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏地址为武汉市武汉大学，保藏日期为2011年9月15日；步骤二中PCR扩增所用引物p1的核苷酸序列为：5′-GAATTCTCAGGCCGCGTTTTCTTCAG-3′，引物p2的核苷酸序列为：5′-CATATGATGACCATGCGTCAATGCG-3′；步骤二中目的基因nifH的核苷酸序列如SEQID No.3所示；步骤四和五中含卡那霉素的LB液体培养基为相同的培养基，每1000mL由50μg的卡那霉素、10g的胰蛋白胨、5g的酵母浸粉、10gNaCl的和余量的水组成。
本发明利用从白蚁肠道内分离出的肺炎克雷伯氏菌HUB-IV-004研究基因nifH的克隆与表达，了解了白蚁的固氮机制，开发了可利用的固氮微生物资源及筛选，对开发人畜无毒、环保的杀白蚁生物药剂具有重要的理论意义和现实意义。
附图说明
图1为本发明中nifH基因PCR扩增产物电泳图，其中M泳道：DNA Marker DL2000，1泳道：HUB-IV-004nifH扩增片段；
图2为本发明中nifH基因在BL21中表达产物的SDS-PAGE分析的电泳图，其中M泳道：蛋白质分子质量标准；1-6泳道：IPTG诱导0h，1h，2h，3h，4h，16h的表达产物。
具体实施方式
本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。
具体实施方式一：本实施方式肺炎克雷伯氏菌nifH基因的克隆与表达方法按以下步骤进行：
一、取3mL肺炎克雷伯氏菌HUB-IV-004的菌液，以12000r/min离心1min，弃去上清，然后按照TIANGEN公司的细菌基因组DNA提取试剂盒的操作方法提取基因组DNA；
二、以步骤一中提取的基因组DNA为模板进行PCR扩增，获得目的基因nifH，然后与pMD18-T载体连接，获得重组质粒pMD18-T-nifH；
三、按照TIANGEN质粒小提试剂盒的操作方法提取重组质粒pMD18-T-nifH和pET28a质粒，然后用EcoR I和Nde I分别对重组质粒pMD18-T-nifH和pET28a质粒进行双酶切，回收所需目的片段，连接并构建重组质粒PET28a-nifH，再转化大肠杆菌BL21，获得含有质粒PET28a-nifH的大肠杆菌；
四、将含有质粒PET28a-nifH的大肠杆菌接种到含卡那霉素的LB液体培养基中，在37℃、150r/min的条件下培养16h，获得培养菌液；
五、取200μL培养菌液加入到20mL含卡那霉素的LB液体培养基中，在37℃、150r/min的条件下培养3h，然后加IPTG至终浓度为0.5mmol/L，在20℃、150r/min的条件下培养2h、3h、4h、5h、过夜，进行诱导表达；
六、诱导表达后的菌液通过SDS-PAGE分析，发现有特异性条带出现，即完成肺炎克雷伯氏菌nifH基因的克隆与表达；
其中步骤一中肺炎克雷伯氏菌HUB-IV-004，它为肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)HUB-IV-004，属于克雷伯菌属(Klebsiella)，它的保藏编号为CCTCC NO：M 2011312，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏地址为武汉市武汉大学，保藏日期为2011年9月15日；步骤二中PCR扩增所用引物p1的核苷酸序列为：5′-GAATTCTCAGGCCGCGTTTTCTTCAG-3′，引物p2的核苷酸序列为：5′-CATATGATGACCATGCGTCAATGCG-3′；步骤二中目的基因nifH的核苷酸序列如SEQID No.3所示；步骤四和五中含卡那霉素的LB液体培养基为相同的培养基，每1000mL由50μg的卡那霉素、10g的胰蛋白胨、5g的酵母浸粉、10gNaCl的和余量的水组成。
本实施方式步骤二中获得目的基因nifH：经1％琼脂糖凝胶电泳检验特异条带的大小，大小为882bp，条带清晰、完整，无DNA、RNA等污染，且此片段大小与预计的片段条带大小基本吻合(见图1)，其核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，其氨基酸序列如SEQ IDNo.4所示。
本实施方式步骤六中诱导表达后的菌液通过SDS-PAGE分析过程为：①、分别吸取诱导表达2h、3h、4h、5h、过夜的菌液10mL，4℃，12000r/min离心5min收集菌体，加入5mL PBS溶液12000r/min离心5min收集菌体，加入1mL PBS溶液，混匀，得菌体溶液；②、取13μL菌体溶液，加入7μL上样缓冲液，水浴煮沸5min，然后取10μL上样于12％SDS-PAGE凝胶，电泳完成后，凝胶在考马斯亮蓝染液中染色3h，再用脱色液脱色2-3次，直至背景透明，用凝胶成像仪分析系统进行扫描。
本实施方式步骤六中发现有特异性条带(即为目的蛋白)出现，纯化后经质谱分析表明，目的蛋白为固氮酶铁蛋白，对其进行纯化与鉴定：
(1)将有特异性条带(即为目的蛋白)从凝胶上切下，经胰蛋白酶消化，注入毛细管中，用0.1％(v/v)流速为5μL/min的乙酸洗脱5min；
(2)以PepMap100 C18柱为分离柱，采用梯度洗脱，进行蛋白质鉴定；先用97％的溶剂A及3％的溶剂B进行洗脱，再用40％的溶剂A及60％的溶剂B洗脱，流速为300nL/min，洗脱60min；溶剂A由0.1％(v/v)的乙酸、3％(v/v)乙腈和96.9％(v/v)H2O组成，溶剂B由0.1％(v/v)的乙酸、96.9％(v/v)乙腈和3％(v/v)H2O组成；
(3)采用飞行时间串联式质谱仪进行LC-MS/MS分析；聚焦电压和离子喷雾电压分别设定为275v和2600v；
(4)采用IDA模式进行分析；通过三个最活跃的离子碰撞诱导解离(CID)获得m/z400-1200的检测扫描；每一个IDA循环中检测和MS/MS质谱分析时间分别为1s和3s；
(5)数据库搜索：经过胶内酶解的肽段样品，使用QSTAR XL hybrid quadrupole(Q)TOFMS/MS系统进行nanoESI-MS/MS分析；所获得的PMF及蛋白质某些特征肽段的MS/MS数据，利用MASCOT搜索引擎对NCBI非冗余数据库(NCBInr)进行检索：肽质量容忍度为±0.3Da；半胱氨酸衍生化、天门冬酰胺和谷氨酰胺脱酰胺作用、甲硫氨酸氧化为可变修饰；最大可容忍一个胰蛋白酶位点漏切。
具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是步骤二中PCR扩增的反应体系如下：
PCR扩增条件为94℃预变性5min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，共35个循环；72℃终延伸10min；4℃保温。其它步骤及参数与具体实施方式一相同。
具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一不同的是步骤三中双酶切的体系如下：
Figure BDA0000100198020000051
其它步骤及参数与具体实施方式一相同。
具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一不同的是步骤三中连接的体系如下：
Figure BDA0000100198020000052
其它步骤及参数与具体实施方式一相同。
Figure IDA0000100198110000011
Figure IDA0000100198110000031

Claims (4)

1.肺炎克雷伯氏菌nifH基因的克隆与表达方法，其特征在于肺炎克雷伯氏菌nifH基因的克隆与表达方法按以下步骤进行：
一、取3mL肺炎克雷伯氏菌HUB-IV-004的菌液，以12000r/min离心1min，弃去上清，然后按照TIANGEN公司的细菌基因组DNA提取试剂盒的操作方法提取基因组DNA；
二、以步骤一中提取的基因组DNA为模板进行PCR扩增，获得目的基因nifH，然后与pMD18-T载体连接，获得重组质粒pMD18-T-nifH；
三、按照TIANGEN质粒小提试剂盒的操作方法提取重组质粒pMD18-T-nifH和pET28a质粒，然后用EcoR I和Nde I分别对重组质粒pMD18-T-nifH和pET28a质粒进行双酶切，回收所需目的片段，连接并构建重组质粒PET28a-nifH，再转化大肠杆菌BL21，获得含有质粒PET28a-nifH的大肠杆菌；
四、将含有质粒PET28a-nifH的大肠杆菌接种到含卡那霉素的LB液体培养基中，在37℃、150r/min的条件下培养16h，获得培养菌液；
五、取200μL培养菌液加入到20mL含卡那霉素的LB液体培养基中，在37℃、150r/min的条件下培养3h，然后加IPTG至终浓度为0.5mmol/L，在20℃、150r/min的条件下培养2h、3h、4h、5h、过夜，进行诱导表达；
六、诱导表达后的菌液通过SDS-PAGE分析，发现有特异性条带出现，即完成肺炎克雷伯氏菌nifH基因的克隆与表达；
其中步骤一中肺炎克雷伯氏菌HUB-IV-004，它为肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)HUB-IV-004，属于克雷伯菌属(Klebsiella)，它的保藏编号为CCTCC NO：M 2011312，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2011年9月15日；步骤二中PCR扩增所用引物p1的核苷酸序列为：5′-GAATTCTCAGGCCGCGTTTTCTTCAG-3′，引物p2的核苷酸序列为：5′-CATATGATGACCATGCGTCAATGCG-3′；步骤二中目的基因nifH的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；步骤四和五中含卡那霉素的LB液体培养基为相同的培养基，每1000mL由50μg的卡那霉素、10g的胰蛋白胨、5g的酵母浸粉、10gNaCl的和余量的水组成。
2.根据权利要求1所述的肺炎克雷伯氏菌nifH基因的克隆与表达方法，其特征在于步骤二中PCR扩增的反应体系如下：
Figure FDA0000100198010000011
Figure FDA0000100198010000021
PCR扩增条件为94℃预变性5min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，共35个循环；72℃终延伸10min；4℃保温。
3.根据权利要求1所述的肺炎克雷伯氏菌nifH基因的克隆与表达方法，其特征在于步骤三中双酶切的体系如下：
Figure FDA0000100198010000022
4.根据权利要求1所述的肺炎克雷伯氏菌nifH基因的克隆与表达方法，其特征在于步骤三中连接的体系如下：
Figure FDA0000100198010000023
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CN101469327A (zh) * 2007-12-25 2009-07-01 天津生物芯片技术有限责任公司 对肺炎克雷伯氏菌肺炎或臭鼻亚种特异的its序列及应用

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