CN102352364A - 肺炎克雷伯氏菌nifH基因的克隆与表达方法 - Google Patents

肺炎克雷伯氏菌nifH基因的克隆与表达方法 Download PDF

Info

Publication number
CN102352364A
CN102352364A CN201110318895XA CN201110318895A CN102352364A CN 102352364 A CN102352364 A CN 102352364A CN 201110318895X A CN201110318895X A CN 201110318895XA CN 201110318895 A CN201110318895 A CN 201110318895A CN 102352364 A CN102352364 A CN 102352364A
Authority
CN
China
Prior art keywords
nifh
cloning
gene
klebsiella
plasmid
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201110318895XA
Other languages
English (en)
Other versions
CN102352364B (zh
Inventor
赵凯
张小燕
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Heilongjiang University
Original Assignee
Heilongjiang University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Heilongjiang University filed Critical Heilongjiang University
Priority to CN 201110318895 priority Critical patent/CN102352364B/zh
Publication of CN102352364A publication Critical patent/CN102352364A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN102352364B publication Critical patent/CN102352364B/zh
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Landscapes

  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

肺炎克雷伯氏菌nifH基因的克隆与表达方法，它涉及nifH基因的克隆与表达方法。方法：提取肺炎克雷伯氏菌的基因组DNA；PCR扩增获得目的基因nifH，与载体连接，获得重组质粒pMD18-T-nifH；提取质粒，双酶切后构建重组质粒PET28a-nifH，再转化大肠杆菌，获得含有质粒PET28a-nifH的大肠杆菌；然后接种到含卡那霉素的LB液体培养基中培养，获得培养菌液；然后加入到含卡那霉素的LB液体培养基中培养，然后加IPTG培养，进行诱导表达；通过SDS-PAGE分析，发现有特异性条带出现即完成。本发明对开发人畜无毒、环保的杀白蚁生物药剂具有重要的理论意义和现实意义。

Description

肺炎克雷伯氏菌nifH基因的克隆与表达方法
技术领域
本发明涉及nifH基因的克隆与表达方法。
背景技术
白蚁Termite属于节肢动物门昆虫纲有翅亚纲等翅目的昆虫，是较为古老的社会性害虫。每年因白蚁危害建筑物和农作物所造成的经济损失达千亿美元以上。现有的杀灭白蚁的药剂均为化学药剂，故都有很大的毒副作用，造成严重的环境污染。利用生物技术开发具有高效、无毒、残效期长、对环境影响小的白蚁生物防治剂成为未来白蚁防治剂的主要方向。
Termite属于典型的寡氮营养型生物，其肠道固氮微生物的固氮作用是白蚁体内氮素的主要来源。目前，科学家已从白蚁科、鼻白蚁科、木白蚁科、原白蚁科的部分属中克隆得到了大量nifH基因序列。系统发育分析表明，同一属的白蚁肠道共生固氮菌nifH基因具有更近的亲缘关系，不同白蚁肠道共生固氮菌nifH基因多样性明显不同。虽然已知白蚁肠道nifH基因具有较高多样性，但仅有少量的nifH基因能够被优先转录并表达出来，大多数的nifH基因不能被表达。因此，在白蚁肠道内克隆和表达nifH基因，对于了解白蚁的固氮机制和白蚁的生物防治提供新的途径。
发明内容
本发明的目的是提供肺炎克雷伯氏菌nifH基因的克隆与表达方法。
肺炎克雷伯氏菌nifH基因的克隆与表达方法按以下步骤进行：
一、取3mL肺炎克雷伯氏菌HUB-IV-004的菌液，以12000r/min离心1min，弃去上清，然后按照TIANGEN公司的细菌基因组DNA提取试剂盒的操作方法提取基因组DNA；
二、以步骤一中提取的基因组DNA为模板进行PCR扩增，获得目的基因nifH，然后与pMD18-T载体连接，获得重组质粒pMD18-T-nifH；
三、按照TIANGEN质粒小提试剂盒的操作方法提取重组质粒pMD18-T-nifH和pET28a质粒，然后用EcoR I和Nde I分别对重组质粒pMD18-T-nifH和pET28a质粒进行双酶切，回收所需目的片段，连接并构建重组质粒PET28a-nifH，再转化大肠杆菌BL21，获得含有质粒PET28a-nifH的大肠杆菌；
四、将含有质粒PET28a-nifH的大肠杆菌接种到含卡那霉素的LB液体培养基中，在37℃、150r/min的条件下培养16h，获得培养菌液；
五、取200μL培养菌液加入到20mL含卡那霉素的LB液体培养基中，在37℃、150r/min的条件下培养3h，然后加IPTG(异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷)至终浓度为0.5mmol/L，在20℃、150r/min的条件下培养2h、3h、4h、5h、过夜，进行诱导表达；
六、诱导表达后的菌液通过SDS-PAGE分析，发现有特异性条带出现，即完成肺炎克雷伯氏菌nifH基因的克隆与表达；
其中步骤一中肺炎克雷伯氏菌HUB-IV-004，它为肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)HUB-IV-004，属于克雷伯菌属(Klebsiella)，它的保藏编号为CCTCC NO：M 2011312，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏地址为武汉市武汉大学，保藏日期为2011年9月15日；步骤二中PCR扩增所用引物p1的核苷酸序列为：5′-GAATTCTCAGGCCGCGTTTTCTTCAG-3′，引物p2的核苷酸序列为：5′-CATATGATGACCATGCGTCAATGCG-3′；步骤二中目的基因nifH的核苷酸序列如SEQID No.3所示；步骤四和五中含卡那霉素的LB液体培养基为相同的培养基，每1000mL由50μg的卡那霉素、10g的胰蛋白胨、5g的酵母浸粉、10gNaCl的和余量的水组成。
本发明利用从白蚁肠道内分离出的肺炎克雷伯氏菌HUB-IV-004研究基因nifH的克隆与表达，了解了白蚁的固氮机制，开发了可利用的固氮微生物资源及筛选，对开发人畜无毒、环保的杀白蚁生物药剂具有重要的理论意义和现实意义。
附图说明
图1为本发明中nifH基因PCR扩增产物电泳图，其中M泳道：DNA Marker DL2000，1泳道：HUB-IV-004nifH扩增片段；
图2为本发明中nifH基因在BL21中表达产物的SDS-PAGE分析的电泳图，其中M泳道：蛋白质分子质量标准；1-6泳道：IPTG诱导0h，1h，2h，3h，4h，16h的表达产物。
具体实施方式
本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。
具体实施方式一：本实施方式肺炎克雷伯氏菌nifH基因的克隆与表达方法按以下步骤进行：
一、取3mL肺炎克雷伯氏菌HUB-IV-004的菌液，以12000r/min离心1min，弃去上清，然后按照TIANGEN公司的细菌基因组DNA提取试剂盒的操作方法提取基因组DNA；
二、以步骤一中提取的基因组DNA为模板进行PCR扩增，获得目的基因nifH，然后与pMD18-T载体连接，获得重组质粒pMD18-T-nifH；
三、按照TIANGEN质粒小提试剂盒的操作方法提取重组质粒pMD18-T-nifH和pET28a质粒，然后用EcoR I和Nde I分别对重组质粒pMD18-T-nifH和pET28a质粒进行双酶切，回收所需目的片段，连接并构建重组质粒PET28a-nifH，再转化大肠杆菌BL21，获得含有质粒PET28a-nifH的大肠杆菌；
四、将含有质粒PET28a-nifH的大肠杆菌接种到含卡那霉素的LB液体培养基中，在37℃、150r/min的条件下培养16h，获得培养菌液；
五、取200μL培养菌液加入到20mL含卡那霉素的LB液体培养基中，在37℃、150r/min的条件下培养3h，然后加IPTG至终浓度为0.5mmol/L，在20℃、150r/min的条件下培养2h、3h、4h、5h、过夜，进行诱导表达；
六、诱导表达后的菌液通过SDS-PAGE分析，发现有特异性条带出现，即完成肺炎克雷伯氏菌nifH基因的克隆与表达；
其中步骤一中肺炎克雷伯氏菌HUB-IV-004，它为肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)HUB-IV-004，属于克雷伯菌属(Klebsiella)，它的保藏编号为CCTCC NO：M 2011312，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏地址为武汉市武汉大学，保藏日期为2011年9月15日；步骤二中PCR扩增所用引物p1的核苷酸序列为：5′-GAATTCTCAGGCCGCGTTTTCTTCAG-3′，引物p2的核苷酸序列为：5′-CATATGATGACCATGCGTCAATGCG-3′；步骤二中目的基因nifH的核苷酸序列如SEQID No.3所示；步骤四和五中含卡那霉素的LB液体培养基为相同的培养基，每1000mL由50μg的卡那霉素、10g的胰蛋白胨、5g的酵母浸粉、10gNaCl的和余量的水组成。
本实施方式步骤二中获得目的基因nifH：经1％琼脂糖凝胶电泳检验特异条带的大小，大小为882bp，条带清晰、完整，无DNA、RNA等污染，且此片段大小与预计的片段条带大小基本吻合(见图1)，其核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，其氨基酸序列如SEQ IDNo.4所示。
本实施方式步骤六中诱导表达后的菌液通过SDS-PAGE分析过程为：①、分别吸取诱导表达2h、3h、4h、5h、过夜的菌液10mL，4℃，12000r/min离心5min收集菌体，加入5mL PBS溶液12000r/min离心5min收集菌体，加入1mL PBS溶液，混匀，得菌体溶液；②、取13μL菌体溶液，加入7μL上样缓冲液，水浴煮沸5min，然后取10μL上样于12％SDS-PAGE凝胶，电泳完成后，凝胶在考马斯亮蓝染液中染色3h，再用脱色液脱色2-3次，直至背景透明，用凝胶成像仪分析系统进行扫描。
本实施方式步骤六中发现有特异性条带(即为目的蛋白)出现，纯化后经质谱分析表明，目的蛋白为固氮酶铁蛋白，对其进行纯化与鉴定：
(1)将有特异性条带(即为目的蛋白)从凝胶上切下，经胰蛋白酶消化，注入毛细管中，用0.1％(v/v)流速为5μL/min的乙酸洗脱5min；
(2)以PepMap100 C18柱为分离柱，采用梯度洗脱，进行蛋白质鉴定；先用97％的溶剂A及3％的溶剂B进行洗脱，再用40％的溶剂A及60％的溶剂B洗脱，流速为300nL/min，洗脱60min；溶剂A由0.1％(v/v)的乙酸、3％(v/v)乙腈和96.9％(v/v)H2O组成，溶剂B由0.1％(v/v)的乙酸、96.9％(v/v)乙腈和3％(v/v)H2O组成；
(3)采用飞行时间串联式质谱仪进行LC-MS/MS分析；聚焦电压和离子喷雾电压分别设定为275v和2600v；
(4)采用IDA模式进行分析；通过三个最活跃的离子碰撞诱导解离(CID)获得m/z400-1200的检测扫描；每一个IDA循环中检测和MS/MS质谱分析时间分别为1s和3s；
(5)数据库搜索：经过胶内酶解的肽段样品，使用QSTAR XL hybrid quadrupole(Q)TOFMS/MS系统进行nanoESI-MS/MS分析；所获得的PMF及蛋白质某些特征肽段的MS/MS数据，利用MASCOT搜索引擎对NCBI非冗余数据库(NCBInr)进行检索：肽质量容忍度为±0.3Da；半胱氨酸衍生化、天门冬酰胺和谷氨酰胺脱酰胺作用、甲硫氨酸氧化为可变修饰；最大可容忍一个胰蛋白酶位点漏切。
具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是步骤二中PCR扩增的反应体系如下：
PCR扩增条件为94℃预变性5min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，共35个循环；72℃终延伸10min；4℃保温。其它步骤及参数与具体实施方式一相同。
具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一不同的是步骤三中双酶切的体系如下：
Figure BDA0000100198020000051
其它步骤及参数与具体实施方式一相同。
具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一不同的是步骤三中连接的体系如下：
Figure BDA0000100198020000052
其它步骤及参数与具体实施方式一相同。
Figure IDA0000100198110000011
Figure IDA0000100198110000031

Claims (4)

1.肺炎克雷伯氏菌nifH基因的克隆与表达方法，其特征在于肺炎克雷伯氏菌nifH基因的克隆与表达方法按以下步骤进行：
一、取3mL肺炎克雷伯氏菌HUB-IV-004的菌液，以12000r/min离心1min，弃去上清，然后按照TIANGEN公司的细菌基因组DNA提取试剂盒的操作方法提取基因组DNA；
二、以步骤一中提取的基因组DNA为模板进行PCR扩增，获得目的基因nifH，然后与pMD18-T载体连接，获得重组质粒pMD18-T-nifH；
三、按照TIANGEN质粒小提试剂盒的操作方法提取重组质粒pMD18-T-nifH和pET28a质粒，然后用EcoR I和Nde I分别对重组质粒pMD18-T-nifH和pET28a质粒进行双酶切，回收所需目的片段，连接并构建重组质粒PET28a-nifH，再转化大肠杆菌BL21，获得含有质粒PET28a-nifH的大肠杆菌；
四、将含有质粒PET28a-nifH的大肠杆菌接种到含卡那霉素的LB液体培养基中，在37℃、150r/min的条件下培养16h，获得培养菌液；
五、取200μL培养菌液加入到20mL含卡那霉素的LB液体培养基中，在37℃、150r/min的条件下培养3h，然后加IPTG至终浓度为0.5mmol/L，在20℃、150r/min的条件下培养2h、3h、4h、5h、过夜，进行诱导表达；
六、诱导表达后的菌液通过SDS-PAGE分析，发现有特异性条带出现，即完成肺炎克雷伯氏菌nifH基因的克隆与表达；
其中步骤一中肺炎克雷伯氏菌HUB-IV-004，它为肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)HUB-IV-004，属于克雷伯菌属(Klebsiella)，它的保藏编号为CCTCC NO：M 2011312，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2011年9月15日；步骤二中PCR扩增所用引物p1的核苷酸序列为：5′-GAATTCTCAGGCCGCGTTTTCTTCAG-3′，引物p2的核苷酸序列为：5′-CATATGATGACCATGCGTCAATGCG-3′；步骤二中目的基因nifH的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；步骤四和五中含卡那霉素的LB液体培养基为相同的培养基，每1000mL由50μg的卡那霉素、10g的胰蛋白胨、5g的酵母浸粉、10gNaCl的和余量的水组成。
2.根据权利要求1所述的肺炎克雷伯氏菌nifH基因的克隆与表达方法，其特征在于步骤二中PCR扩增的反应体系如下：
Figure FDA0000100198010000011
Figure FDA0000100198010000021
PCR扩增条件为94℃预变性5min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，共35个循环；72℃终延伸10min；4℃保温。
3.根据权利要求1所述的肺炎克雷伯氏菌nifH基因的克隆与表达方法，其特征在于步骤三中双酶切的体系如下：
Figure FDA0000100198010000022
4.根据权利要求1所述的肺炎克雷伯氏菌nifH基因的克隆与表达方法，其特征在于步骤三中连接的体系如下：
Figure FDA0000100198010000023
CN 201110318895 2011-10-19 2011-10-19 肺炎克雷伯氏菌nifH基因的克隆与表达方法 Expired - Fee Related CN102352364B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN 201110318895 CN102352364B (zh) 2011-10-19 2011-10-19 肺炎克雷伯氏菌nifH基因的克隆与表达方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN 201110318895 CN102352364B (zh) 2011-10-19 2011-10-19 肺炎克雷伯氏菌nifH基因的克隆与表达方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN102352364A true CN102352364A (zh) 2012-02-15
CN102352364B CN102352364B (zh) 2013-01-09

Family

ID=45576002

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN 201110318895 Expired - Fee Related CN102352364B (zh) 2011-10-19 2011-10-19 肺炎克雷伯氏菌nifH基因的克隆与表达方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN102352364B (zh)

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101469327A (zh) * 2007-12-25 2009-07-01 天津生物芯片技术有限责任公司 对肺炎克雷伯氏菌肺炎或臭鼻亚种特异的its序列及应用

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101469327A (zh) * 2007-12-25 2009-07-01 天津生物芯片技术有限责任公司 对肺炎克雷伯氏菌肺炎或臭鼻亚种特异的its序列及应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DONG,Y.,ET AL.: "Klebsiella pneumoniae 342 dinitrogenase reductase (nifH) gene,", 《GENBANK：AY242355》, 9 April 2003 (2003-04-09), pages 1 *
杜馨: "黑胸散白蚁（Reticulitermes chinese Snyder）肠道内共生微生物固氮酶基因（nifH）的克隆与分析", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库 基础科学辑》, no. 10, 15 October 2008 (2008-10-15) *

Also Published As

Publication number Publication date
CN102352364B (zh) 2013-01-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
TWI609878B (zh) 抗黴漿菌之次單位疫苗
CN103467584B (zh) 一种原核基因工程杂合阳离子抗菌肽cc的获得及其发酵方法
CN103993090B (zh) 对普罗威登斯菌o31，o41，o42，o43和o50特异的核苷酸及其应用
CN102352364B (zh) 肺炎克雷伯氏菌nifH基因的克隆与表达方法
CN102965375B (zh) 增强外源蛋白表达的增强子样基因及其应用
Li et al. Proteomic and bioinformatic analysis of outer membrane proteins of the protobacterium Bartonella henselae (Bartonellaceae)
CN107841490B (zh) 双功能亚甲基四氢叶酸脱氢酶/环化酶及其多克隆抗体
CN111057775A (zh) 鉴定沙门氏菌属的特异性新分子靶标及其快速检测方法
CN105349561A (zh) 一种利用血红蛋白提高发酵细胞密度的方法
CN111926094B (zh) 一种气单胞菌属内不同物种的条形码鉴定引物、鉴定方法和试剂盒
CN107988193B (zh) 一种脲基甲酸水解酶及其制备方法
CN108251546A (zh) 一种植物乳杆菌内源性信号肽的预测方法及其应用
CN108949901B (zh) 一种快速鉴定窖泥中甲烷囊菌的酶切方法
CN114214351A (zh) 一种志贺氏菌多糖表达质粒及其用途
CN106435000A (zh) 一种无乳链球菌的恒温热隔绝式pcr检测方法
Guo et al. Klebsiella variicola, a nitrogen fixing activity endophytic bacterium isolated from the gut of Odontotermes formosanus
CN115851632B (zh) 一种漆酶突变体及其应用
Zeng Chen et al. Analysis of indigenous plasmids in Xanthomonas oryzae pv. oryzicola.
CN106434785B (zh) 2-n-庚基-4-羟基喹啉的制备方法
CN107987137B (zh) 一种abc转运蛋白及其制备方法
Wang et al. Research Article Construction and Application of MALDI-TOF Mass Spectrometry for the Detection of Haemophilus parasuis
CN105256028A (zh) 对柠檬酸杆菌017和o39特异的核苷酸及其应用
CN105821035A (zh) 利用微波炉-液氮快速提取细菌dna的方法
CN116064879A (zh) 一种快速检测单增李斯特菌的引物组、试剂盒及检测方法
CN111621581A (zh) 一种检测李斯特菌用标准化质粒冻干粉

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20130109

Termination date: 20151019

EXPY Termination of patent right or utility model