CN102350261B - 一种胞壁结合型生物破乳剂的提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于工业微生物技术领域，公开了一种胞壁结合型生物破乳剂的提取方法，该方法包括以下步骤：将产胞壁结合型生物破乳剂的破乳菌菌体干粉与碱液混合搅拌，经离心、中和、浓缩、透析除盐和冷冻干燥，得到胞壁结合型生物破乳剂。本发明的方法工艺简单、提取效率高，且能较大程度上保留提取物的功能活性，有利于生物破乳剂的纯化鉴定和生物破乳菌破乳机理进一步揭示，并能为生物破乳菌的培养和大规模工业化应用提供理论依据。
Description
技术领域
本发明属于工业微生物技术领域，涉及一种胞壁结合型生物破乳剂的提取方法。
背景技术
生物破乳剂是生物表面活性剂的一种，是一类能够使乳状液油水分离的新型破乳剂。与传统化学破乳剂相比，生物破乳剂具有高效低毒、可生物降解、在极端条件下发挥活性等优点，在原油开采、含油土壤修复等领域具有较大的应用前景。(Cairns，W.L.，Cooper，D.G.，Zajic，J.E.，Wood，J.M.，Kosaric，N.，1982.Characterization of Nocardia amarae as a Potent BiologicalCoalescing Agent of Water-Oil Emulsions.Appl.Environ.Microbiol.，43，362-366.)
目前发现的生物破乳剂多紧密结合于破乳菌株表面，难于提取因而不利于破乳活性物质的性质研究。因此，针对产胞壁结合型生物破乳剂的菌株，需要简捷、方便、高效的提取手段来得到其破乳活性物质，以便于对其进行纯化鉴定，进一步揭示生物破乳菌破乳机理，从而指导生物破乳菌的培养和大规模工业化应用。
目前大量应用于提取微生物胞壁结合物的方法是有机溶剂提取(Franzetti，A.，Bestetti，G.，Caredda，P.，La Colla，P.，Tamburini，E.，2008.Surface-active compounds and their role in theaccess to hydrocarbons in Gordonia strains.FEMS Microbiol.Ecol.，63，238-248.)，另外水提取法被广泛应用于植物提取(Geuenich，S.，Goffinet，C.，Venzke，S.，Nolkemper，S.，Baumann，I.，Plinkert，P.，Reichling，J.，Keppler，O.，2008.Aqueous extracts from peppermint，sage and lemonbalm leaves display potent anti-HIV-1 activity by increasing the virion density.Retrovirology，5，27.)，该法也可以借鉴用于微生物胞壁物质提取。但是这些方法应用于产胞壁结合型生物破乳剂的破乳菌时，普遍存在提取过程复杂、效率不高、提取产物破乳活性不好、提取不完全等问题。
发明内容
针对现有技术中提取效率低，提取不完全，提取产物破乳活性不好等问题，本发明的目的是提供一种胞壁结合型生物破乳剂的提取方法，该方法工艺简单、提取效率高，且能较大程度上保留提取物的功能活性。
本发明的技术方案如下：
本发明提供了一种胞壁结合型生物破乳剂的提取方法，该方法包括以下步骤：将产胞壁结合型生物破乳剂的破乳菌菌体干粉与碱液混合搅拌，经离心、中和、浓缩、透析除盐和冷冻干燥，得到胞壁结合型生物破乳剂。
所述的产胞壁结合型生物破乳剂的破乳菌选自产碱杆菌(Alcaligenes sp.)、诺卡氏菌(Nocardia sp.)、棒状杆菌(Corynebacterium sp.)、红球菌(Rhodococcus sp.)或微球菌(Micrococcus sp.)等菌种。
所述的产胞壁结合型生物破乳剂的破乳菌菌体干粉和碱液的料液比为5∶1～25∶1g/L。
所述的碱液是浓度为0.05-0.15mol/L的NaOH溶液。
所述的搅拌是在温度为25-45℃，转速为500-1000rpm的条件下，水浴磁力搅拌2-12h。
所述的离心其转速为10000-12000rpm，温度4-15℃，时间10-20min。
所述的中和是用6mol/L盐酸将离心后上清液pH值调至6.8-72。
所述的浓缩是在温度45-55℃的条件下，将中和后清液减压旋转蒸发至5-15mL。
所述的透析除盐包括以下步骤：将浓缩后液体使用100Da透析袋浸泡在蒸馏水中脱盐，涨袋后用聚乙二醇(PEG12000)浓缩脱水，如此反复，直至透析袋外部蒸馏水的盐度＜10mg/L。
所述的冷冻干燥是在-50℃下冷冻干燥24h。
本发明同现有技术相比，具有以下优点和有益效果：
1.本发明相对于其它提取方法，微生物破乳活性物质的提取率较高，提取率最高可达40％以上。
2.本发明对破乳活性物质提取较完全，残余菌体无破乳活性。
3.本发明提取的产物破乳效果好，提取产物投加量为1000mg/L时，破乳最高可达90％。
4.本发明采用碱液提取，工艺简单高效，成本较低。
5.本发明采用透析袋除盐，工艺简单有效。
6.本发明的方法破乳活性物质提取完全，有利于生物破乳剂的纯化鉴定和生物破乳菌破乳机理进一步揭示，并能为生物破乳菌的培养和大规模工业化应用提供理论依据。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明作进一步的说明。
本发明适用于胞壁结合型生物破乳剂的提取，特别适用于专利200710046963.5中所述的一株产胞壁结合型生物破乳剂的破乳菌：高效生物破乳菌产碱杆菌Alcaligenes sp.S-XJ-1(说明书第1页第28行)，以下将以此菌株为实施对象进行描述。
高效生物破乳菌产碱杆菌Alcaligenes sp.S-XJ-1取自克拉玛依油田某站采油井井口1m处长期受石油污染的土壤，于-4℃保存在斜面培养基上。将保藏菌种活化后接种至100mL肉汤培养基富集培养72h，再将10mL培养液接入100mL发酵培养基中培养7d。培养后将菌株的全培养液在10000rpm高速离心10分钟，获得湿菌，使用正己烷洗提离心三次，-50℃冷冻干燥24h得到菌体干粉，为本发明原料。
高效生物破乳菌产碱杆菌Alcaligenes sp.S-XJ-1所用的肉汤培养基(1L)组成为：牛肉膏5.0g，蛋白胨10.0g，NaCl 25g，pH＝7.0。发酵培养基(1L)组成为：NH4NO3 4.0g，K2HPO4 4.0g，KH2PO4 6.0g，MgSO4·7H2O 0.2g，微量元素溶液1mL，NaCl 25g。碳源为液体石蜡4％(V/V)。其中微量元素溶液(1L)包含CaCl2·2H2O 1000mg，FeSO4·7H2O 1000mg，EDTA 1400mg。用6mol/L HCl和6mol/L NaOH调节发酵培养基初始pH＝9.0。培养基使用前，使用高压蒸气灭菌，灭菌条件为：1×105Pa灭菌20min。培养条件为：35℃，130rpm。(陆丽君，黄翔峰，刘佳，等.一株高效生物表面活性剂产生菌的筛选鉴定及其性质研究.工业微生物，2008，38(5)：34-39.)
本发明中模型乳状液配制方法如下：用煤油和水配制油包水型(W/O)模型乳状液，在250mL高脚烧杯中，加入80mL溶有1.526g Span80和0.074g Tween80的煤油溶液，然后加入120mL蒸馏水，用高速搅拌乳化机搅拌3.5min，转速10000rpm。破乳试验用于验证提取物破乳活性。(黄翔峰，尚家佳，陆丽君，等.pH对破乳菌Alcaligenes sp.S-XJ-1破乳性能的影响.微生物学通报，2010，37(11)：1575-1580.)
实施例1
1.将培养得到的生物破乳菌产碱杆菌Alcaligenes sp.S-XJ-1菌体干粉0.5g和50mL 0.1mol/LNaOH溶液加入锥形瓶中(菌体干粉和碱液的料液比为10∶1g/L)，在35℃，转速900rpm的条件下水浴磁力搅拌10h。
2.对所得混合液进行离心分离，离心转速为12000rpm，温度15℃，时间10min，上清液备用，残余菌体冷冻干燥。
3.用6mol/L盐酸将上清液pH调至6.8-7.2，在50℃减压旋转蒸发浓缩至约10mL。蒸发后液体使用100Da透析袋浸泡在蒸馏水中脱盐，涨袋后用PEG12000浓缩脱水，如此反复，直至透析袋外部蒸馏水的盐度＜10mg/L。收集除盐后清液，在-50℃下冷冻干燥24h，得到提取的破乳活性物质固体，提取率43.6％。
4.称取一定量所得破乳物质，加水溶解配成10g/L溶液，pH调节至中性，取2mL加入破乳管，再加入18mL模型乳状液，剧烈震荡120下，放入35℃水浴锅48h，其破乳率可达90％。残菌进行相同破乳试验验证失去破乳活性。
实施例2
1.将培养得到的生物破乳菌产碱杆菌Alcaligenes sp.S-XJ-1菌体干粉0.5g和50mL 0.1mol/LNaOH溶液加入锥形瓶中(菌体干粉和碱液的料液比为10∶1g/L)，在35℃，转速900rpm的条件下水浴磁力搅拌4h。
2.对所得混合液进行离心分离，离心转速为12000rpm，温度15℃，时间10min，上清液备用，残余菌体冷冻干燥。
3.用6mol/L盐酸将上清液pH调至6.8-7.2，在50℃减压旋转蒸发浓缩至约10mL。蒸发后液体使用100Da透析袋浸泡在蒸馏水中脱盐，涨袋后用PEG12000浓缩脱水，如此反复，直至透析袋外部蒸馏水的盐度＜10mg/L。收集除盐后清液，在-50℃下冷冻干燥24h，得到提取的破乳活性物质固体，提取率38.2％。
4.称取一定量所得破乳物质，加水溶解配成10g/L溶液，pH调节至中性，取2mL加入破乳管，再加入18mL模型乳状液，剧烈震荡120下，放入35℃水浴锅48h，其破乳率可达88.5％。残菌进行相同破乳试验验证失去破乳活性。
实施例3
1.将培养得到的生物破乳菌产碱杆菌Alcaligenes sp.S-XJ-1菌体干粉0.5g和50ml 0.08mol/LNaOH溶液加入锥形瓶中(菌体干粉和碱液的料液比为10∶1g/L)，在35℃，转速900rpm的条件下水浴磁力搅拌6h。
2.对所得混合液进行离心分离，离心转速为12000rpm，温度15℃，时间10min，上清液备用，残余菌体冷冻干燥。
3.用6mol/L盐酸将上清液pH调至6.8-7.2，在50℃减压旋转蒸发浓缩至约10mL。蒸发后液体使用100Da透析袋浸泡在蒸馏水中脱盐，涨袋后用PEG12000浓缩脱水，如此反复，直至透析袋外部蒸馏水的盐度＜10mg/L。收集除盐后清液，在-50℃下冷冻干燥24h，得到提取的破乳活性物质固体，提取率37.2％。
4.称取一定量所得破乳物质，加水溶解配成10g/L溶液，pH调节至中性，取2mL加入破乳管，再加入18mL模型乳状液，剧烈震荡120下，放入35℃水浴锅48h，其破乳率可达82.5％。残菌进行相同破乳试验验证失去破乳活性。
上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和应用本发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于这里的实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。
Claims (4)
1.一种胞壁结合型生物破乳剂的提取方法，其特征在于：该方法包括以下步骤：将产胞壁结合型生物破乳剂的破乳菌菌体干粉与碱液混合搅拌，经离心、中和、浓缩、透析除盐和冷冻干燥，得到胞壁结合型生物破乳剂；
所述的产胞壁结合型生物破乳剂的破乳菌选自产碱杆菌、诺卡氏菌、棒状杆菌、红球菌或微球菌；
所述的产胞壁结合型生物破乳剂的破乳菌菌体干粉和碱液的料液比为5:1～25:1g/L；
所述的碱液是浓度为0.05-0.15mol/L的NaOH溶液；
所述的搅拌是在温度为25-45℃，转速为500-1000rpm的条件下，水浴磁力搅拌2-12h；
所述的透析除盐包括以下步骤：将浓缩后液体使用100Da透析袋浸泡在蒸馏水中脱盐，涨袋后用聚乙二醇浓缩脱水，如此反复，直至透析袋外部蒸馏水的盐度<10mg/L；
所述的冷冻干燥是在-50℃下冷冻干燥24h。
2.根据权利要求1所述的胞壁结合型生物破乳剂的提取方法，其特征在于：所述的离心其转速为10000-12000rpm，温度4-15℃，时间10-20min。
3.根据权利要求1所述的胞壁结合型生物破乳剂的提取方法，其特征在于：所述的中和是用6mol/L盐酸将离心后上清液pH值调至6.8-7.2。
4.根据权利要求1所述的胞壁结合型生物破乳剂的提取方法，其特征在于：所述的浓缩是在温度45-55℃的条件下，将中和后清液减压旋转蒸发至5-15mL。
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