CN102335594B - 一种带谷胱甘肽配体的亲和层析多孔介质的制备方法和应用 - Google Patents

一种带谷胱甘肽配体的亲和层析多孔介质的制备方法和应用 Download PDF

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本发明涉及一种带谷胱甘肽配体的亲和层析多孔介质的制备方法和应用。以配体谷胱甘肽为自由基转移剂，巧妙地合成带谷胱甘肽配体的亲和层析多孔介质，基体的制备、介质的加工赋形和配体的担载一步反应完成。采用价廉的基体材料，大幅降低了成本。所述的亲和层析多孔介质材料为开孔结构，孔径约100～200μm，配体谷胱甘肽的键合量可达75.3mg/g，键合效率高且纯度高，结果表明所述的亲和层析多孔介质具有很好的蛋白分离能力，谷胱甘肽-s-转移酶(GST)结合效率达1.5mg/g。用所制备的带谷胱甘肽配体的亲和层析多孔介质装填层析柱，可用于谷胱甘肽-s-转移酶或以谷胱甘肽-s-转移酶为标签的融合蛋白的分离纯化。

Description

一种带谷胱甘肽配体的亲和层析多孔介质的制备方法和应用
技术领域
本发明涉及一种带带谷胱甘肽(以下简称谷胱甘肽)配体的亲和层析多孔介质的制备方法和应用，属于生物医用高分子材料领域。 
技术背景
谷胱甘肽-s-转移酶(GST)是一种分子量约26000的蛋白质，因其水中溶解性能良好，在大肠杆菌中高水平表达且保持与谷胱甘肽特异性结合的酶活性等特点，被广泛应用于基因工程融合蛋白体系的标签蛋白。通过在亲和介质上固定谷胱甘肽分离破碎菌液中带有GST标签的蛋白，采用游离谷胱甘肽将其洗脱，而后切除GST标签可以获得目标蛋白。 
目前用于GST标签蛋白分离的亲和介质技术为少数公司垄断，通常采用琼脂糖凝胶微球作为基体，在其表面引入活性基团，再键合配体谷胱甘肽得到亲和层析介质。此种亲和层析介质制备过程复杂，价格昂贵。中国专利(CN1715403A)曾经尝试在商品化琼脂糖微球表面通过1，4-丁二醇二缩水甘油醚或环氧氯丙烷为交联剂，优化反应条件键合谷胱甘肽，希望得到与国外商品化产品性能相近的亲和层析介质。结果虽然这种材料价格有所降低，也有一定的分离作用，但是它制备过程仍然繁琐，需要多步反应并纯化才可键连上配体。另外凝胶微球形式的填料对填柱的技术要求都很高，如果在填柱过程中填料颗粒堆积不均匀或者有气泡产生就会影响分离效果，以上原因限制了此种分离材料的应用。 
也有文献[1]采用磁性微球技术，表面通过二硫键键合配体谷胱甘肽，用于GST标签蛋白分离。此种介质不需要使用分离柱，但超顺磁微球的制备和表面修饰本身有相当大的技术难度和相当高的制造成本，如做成产品售价将远高于琼脂糖凝胶微球，且分离时必须使用外加磁场，进一步增加了分离成本。磁性微球产品通常在毫克级，分离能力也受到限制，仅适用于微量多品种蛋白的分离纯化。 
所以，目前亲和层析介质已经成为限制基因工程产业化的巨大瓶颈，迫切需要制备方法简单、廉价、操作简单而高效的GST蛋白亲和层析介质。 
发明内容
为了解决已有技术存在的问题，本发明提出一种带谷胱甘肽的亲和层析多孔介质的制备方法和应用。 
本发明采用乳液模板法，以双键修饰的葡聚糖溶液为外部水相，以自由基引发剂的甲苯溶液为内部油相，以溶解在外水相中的谷胱甘肽(谷胱甘肽)为链转移剂，通过自由基聚合，一锅法合成带谷胱甘肽配体的亲和层析多孔介质。 
本发明提供的一种带谷胱甘肽配体的亲和层析多孔介质的制备方法，步骤如下： 
(1)配制谷胱甘肽的水溶液：称取谷胱甘肽，溶解在蒸馏水中，谷胱甘肽浓度为1％～2.5％(w/v)，加入谷胱甘肽摩尔量1.2-2倍的二硫苏糖醇(DTT)，机械搅拌反应1-2h； 
(2)配制双键修饰葡聚糖的乳液：称取双键修饰葡聚糖加入上述(1)制备的谷胱甘肽的水溶液中，谷胱甘肽的水溶液体积与双键修饰葡聚糖质量的比例为100mL∶20-30g，加入乳化剂，乳化剂质量与水相溶液体积比例为10-15g∶100mL，机械搅拌20min；使用的乳化剂是Triton X-405、吐温80、吐温40或Pluronic F-68； 
(3)配制偶氮二异丁腈(AIBN)的甲苯溶液，浓度为1-2％(w/v)； 
(4)油水乳液配制：搅拌下向双键修饰葡聚糖的乳液中滴加AIBN甲苯溶液，AIBN甲苯溶液总体积是双键修饰葡聚糖溶液体积的3至5倍，滴加完成后继续搅拌5min； 
(5)聚合固化：将上述反应混合物倒入模具内腔中，置于60-80℃烘箱中固化12-36h成型；所述的模具内腔的形状为圆柱体； 
(6)洗涤纯制：从模具中取出块状材料，先在25℃摇床中用二甲基亚砜(DMSO)振荡抽提甲苯，后用索氏提取器对水提取，除去有机溶剂及其他杂质，冷冻干燥，获得亲和层析多孔介质； 
所述的双键修饰的葡聚糖具有下列结构： 
Figure BDA0000068643390000031
其中，母体葡聚糖的数均分子量为4-50万，每100个糖环上双键的个数为20-30个。它的制备方法已由文献[2-5]给出。 
本发明的另一个目的是提供上述带谷胱甘肽配体的亲和层析多孔介质的一种应用，即用其装填层析柱，用于GST或以GST为标签的融合蛋白的分离纯化。 
使用本发明所制备的带谷胱甘肽配体的亲和层析多孔介质装填层析柱的方法，是将所制备的圆柱形多孔介质直接装入层析柱，用层析柱的流动相液体预浸溶胀，使其径向充满层析柱。 
有益效果：本发明涉及一种带谷胱甘肽配体的亲和层析多孔介质的制备方法和应用。以谷胱甘肽为亲和配体，以双键修饰的葡聚糖为起始材料，通过乳液模板法得到高内油相的水包油乳液，通过自由基反应交联外部水相中的葡聚糖做为骨架，巧妙地将配体还原型谷胱甘肽(谷胱甘肽)作为自由基转移剂，在交联过程中将谷胱甘肽键合在葡聚糖骨架上，通过洗涤，索氏提取去除内部油相、乳化剂和未反应原料，得到孔径约100～200μm，每克材料谷胱甘肽键合量高达75.3mg连续大孔块状材料。基体的制备、介质的加工赋形和配体的担载在一步反应中完成，大大简化了亲和层析多孔介质的制备步骤。采用价廉的基体材料，大幅降低了成本。与国内外已有产品相比具有制备方法简单，高效，廉价，可规模化生产的特点。所制备的带谷胱甘肽配体的亲和层析多孔介质装填层析柱，用于GST或以GST为标签的融合蛋白的分离纯化。结果表明所述的亲和层析多孔介质具有很好的蛋白分离能力，GST结合效率达1.5mg/g，洗脱后的蛋白质纯度较高。 
本发明所使用的双键修饰的葡聚糖通过300MHz1H NMR进行表征，测定葡聚糖糖环上双键修饰的比例。典型1HNMR谱见附图1。 
本发明所制备的亲和层析多孔介质采用下述的方法进行表征： 
(1)采用电感耦合等离子体原子发射光谱(ICP-AES)测定介质中的硫含量，计算谷胱甘肽键合量。相关数据列于表2，表3和表4。 
(2)通过场发射扫描电镜(ESEM)观察介质材料的微观形貌。典型照片见附图2。 
为了考察本发明所制备的亲和层析多孔介质用于GST蛋白纯化的可行性，在实验室采用基因工程技术专门制备了含GST的蛋白质混合物，并用本发明所制备的亲和层析多孔介质进行了实际的吸附和洗脱，其步骤和条件详见实施例5，结果见图3、图4和表5。 
附图说明
图1为双键修饰的葡聚糖的核磁谱图及其归属。通过对氢谱上双键上质子(δ5.63-5.74和δ6.05-6.15ppm)积分与端基上质子(δ4.60-4.82ppm)比较计算得到双键在葡聚糖上的取代度。 
图2为2-1的块状多孔材料扫描电镜图。图中可以看出材料为开孔结构，孔径约100～200μm，孔间都存在贯穿孔道，为蛋白溶液在内部自由流通，更好地与配体结合提供了条件。 
图3为2-4的块状多孔材料分离蛋白的动态过程图。将破碎细菌浸提液上清加入填充柱开始进入结合阶段，从图中可以看出，十分钟内，由于填充介质的结合和吸附，流出液中蛋白浓度显著下降，在之后半小时内蛋白浓度变化不大，说明材料有快速结合蛋白的能力。结合阶段结束后用缓冲液洗涤填料，进入洗涤阶段，洗除物理吸附的蛋白质，在流出液中可检测到。用去20ml洗涤液时蛋白浓度接近于零(0.011mg/mL)，说明吸附蛋白已经洗净。此时加入洗脱液，进入洗脱阶段，流出液中蛋白浓度增加，累计12h时蛋白浓度达到0.311mg/mL，计算出蛋白结合量为1.5mg/g。 
图4为2-4的块状多孔材料分离所得GST蛋白电泳图。通过与蛋白Marker比较可以看出破碎细菌浸提液上清中含有大量分子量为26kDa的GST蛋白，说明GST蛋白成功表达并且在细菌破碎过程中仍保持活性，未因变性而沉淀，同时破碎细菌浸提液上清中还含有大量杂蛋白。经过块状亲和层析介质分离后得到纯的分子量为26kDa的GST蛋白，这证明通过Bradford法测得的蛋白含量是纯 的GST蛋白含量而非其他杂蛋白。 
具体实施方法 
实施例1：配置谷胱甘肽的水溶液 
(1)配制谷胱甘肽的水溶液：按照表1中的谷胱甘肽浓度和二硫苏糖醇(DTT)与谷胱甘肽的比例，制备100mL谷胱甘肽水溶液，并加入配比量的DTT，室温机械搅反应时间如表1中所列，获得谷胱甘肽水溶液。 
表1  配置谷胱甘肽水溶液 
Figure BDA0000068643390000051
实施例2：乳液模板法合成带谷胱甘肽配体的亲和层析多孔介质 
配制双键修饰葡聚糖的乳液：取实施例1中配制的谷胱甘肽-1水溶液5mL，称取1.0g双键修饰的葡聚糖(分子量20万，100个糖环含23个双键)和0.5g乳化剂Triton X-405一起加入三口瓶中，以400rpm的速度机械搅拌20min； 
配制偶氮二异丁腈(AIBN)的甲苯溶液：将0.15g偶氮二异丁腈(AIBN)加入15ml甲苯中搅拌至溶解，浓度为1％(w/v)； 
油水乳液配制：搅拌下向三口瓶中的双键修饰葡聚糖的乳液滴加AIBN甲苯溶液，AIBN甲苯溶液总体积是双键修饰葡聚糖溶液体积的3倍，滴加完成后继续搅拌5min； 
聚合固化：将上述反应混合物倒入圆柱形模具内腔中，置于60℃烘箱中固化24h成型； 
洗涤纯制：从模具中取出成型的材料，先在25℃摇床中三天，每天换三次DMSO，37rpm，用二甲基亚砜(DMSO)振荡抽提甲苯；后用索氏提取器对水提取两天，除去有机溶剂及其他杂质，冷冻干燥，获得带谷胱甘肽配体的亲和层 析多孔介质。产物代号标号为2-1，测得谷胱甘肽含量为48.4mg/g。 
产物代号标号为2-2至2-4的带谷胱甘肽配体的亲和层析多孔介质，制备条件如表2所示，其余的同产物代号标号为2-1的带谷胱甘肽配体的亲和层析多孔介质制备方法。产物中谷胱甘肽含量如表2所示。 
表2.乳液模板法合成带谷胱甘肽配体的亲和层析多孔介质 
Figure BDA0000068643390000061
实施例3：乳液模板法合成带谷胱甘肽配体的亲和层析多孔介质 
配制双键修饰葡聚糖的乳液：取实施例1中新配制的谷胱甘肽-4水溶液20mL，称取4.0g双键修饰的葡聚糖(分子量50万，相对于糖环的双键摩尔含量为27％)和2.0g乳化剂吐温-80一起加入三口瓶中，以400rpm的速度机械搅拌溶解20min； 
配制偶氮二异丁腈(AIBN)的甲苯溶液：将0.6g偶氮二异丁腈(AIBN)加入60ml甲苯中搅拌至溶解，浓度为1％(w/v)； 
油水乳液配制：搅拌下向三口瓶中的双键修饰葡聚糖的乳液滴加AIBN甲苯溶液，AIBN甲苯溶液总体积是双键修饰葡聚糖溶液体积的3倍，滴加完成后继续搅拌5min； 
聚合固化：将上述反应混合物倒入圆柱形模具内腔中，置于70℃烘箱中固化12h成型； 
洗涤纯制：从模具中取出成型的材料，用二甲基亚砜(DMSO)振荡抽提甲苯，先在25℃摇床中三天，每天换三次DMSO，37rpm，后用索氏提取器对水提取两天，除去有机溶剂及其他杂质，冷冻干燥，获得带谷胱甘肽配体的亲和层析多孔介质。产物代号标号为3-1，测得谷胱甘肽含量为60.3mg/g。 
产物代号标号为3-2至3-4的带谷胱甘肽配体的亲和层析多孔介质，制备条 件如表3所示，其余的同产物代号标号为3-1的带谷胱甘肽配体的亲和层析多孔介质制备方法。产物中谷胱甘肽含量如表3所示。 
表3.乳液模板法合成带谷胱甘肽配体的亲和层析多孔介质 
Figure BDA0000068643390000071
实施例4：乳液模板法合成带谷胱甘肽配体的亲和层析多孔介质 
配制双键修饰葡聚糖的乳液：取实施例1中新配制的谷胱甘肽-2水溶液20mL，称取4.0g双键修饰的葡聚糖(分子量4万，相对于糖环的双键摩尔含量为26％)和2.0g乳化剂吐温-40一起加入三口瓶中，以400rpm的速度机械搅拌溶解20min； 
配制偶氮二异丁腈(AIBN)的甲苯溶液：将0.6g偶氮二异丁腈(AIBN)加入60ml甲苯中搅拌至溶解，浓度为1％(w/v)； 
油水乳液配制：搅拌下向三口瓶中的双键修饰葡聚糖的乳液滴加AIBN甲苯溶液，AIBN甲苯溶液总体积是双键修饰葡聚糖溶液体积的3倍，滴加完成后继续搅拌5min； 
聚合固化：将上述反应混合物倒入圆柱形模具内腔中，置于70℃烘箱中固化36h成型； 
洗涤纯制：从模具中取出成型的材料，用二甲基亚砜(DMSO)振荡抽提甲苯，先在25℃摇床中三天，每天换三次DMSO，37rpm，后用索氏提取器对水提取两天，除去有机溶剂及其他杂质，冷冻干燥，获得带谷胱甘肽配体的亲和层析多孔介质。产物代号标号为4-1，测得谷胱甘肽含量为35.6mg/g。 
产物代号标号为4-2至4-4的带谷胱甘肽配体的亲和层析多孔介质，制备条件如表4所示，其余的同产物代号标号为4-1的带谷胱甘肽配体的亲和层析多孔介质制备方法。产物中谷胱甘肽含量如表4所示。 
表4.乳液模板法合成带谷胱甘肽配体的亲和层析多孔介质 
Figure BDA0000068643390000081
实施例5：用带谷胱甘肽配体的亲和层析多孔介质填充亲和层析色谱柱用于从细菌破碎液中分离GST蛋白 
(1)细菌培养 
将pGEX-4T-1DNA转化的菌株挑单菌落加到1ml LBGA液体培养基中，150rpm，37℃摇菌3h，进行再活化。将活化好的转化菌株在200ml2×YTA培养基中扩大培养至OD＝0.6。加入乳糖同系物isopropyl-β-D-thiogalactoside(IPTG)至终浓度为1mM。在25℃条件下，90rpm摇菌过夜，以诱导表达GST。 
(2)细菌破碎 
以4,000×g转速4℃离心诱导表达的细菌悬液10min，将沉淀重悬于冰上预冷的结合缓冲液(Binding buffer，含140mM NaCl，2.7mM KCl，10mM Na2HPO4，1.8mM KH2PO4，pH 7.3)中，加溶菌酶至终浓度为100μg/ml，加17.4mg/ml蛋白酶抑制剂PMSF 20μl，在冰浴中超声破碎(300watt，2s/5s，1.5min)，在4℃条件下，12,000×g超速离心20min，取上清备用。 
(3)蛋白分离 
将块状亲和层析介质填入柱子中，用10倍柱体积结合缓冲液冲洗介质，平衡柱子。将破碎上清加入到已平衡好的柱中，循环上样，每隔10min取样通过Bradford法测蛋白浓度。上样完成后，用缓冲液洗涤去除非特异性吸附的蛋白。用新鲜配制的洗脱缓冲液(含50mM Tris-HCl，20mM谷胱甘肽，pH8.0)洗脱GST融合蛋白，循环洗脱，每隔一段时间取样测定蛋白浓度。 
图3以2-4的材料180mg为代表性的块状亲和层析介质，填充入直径为1.5cm的柱子，经过20ml的结合缓冲液的平衡，上样2ml的破碎上清，循环上样40min，用20ml缓冲液洗涤去除非特异性吸附的蛋白。用1ml新鲜配制的洗 脱缓冲液(含50mM Tris-HCl，20mM谷胱甘肽，pH8.0)洗脱GST融合蛋白，循环洗脱累计12h，每隔一段时间取样测定蛋白浓度，从而得到分离蛋白的动态过程图。 
表5给出了部分代表性材料的蛋白分离相关实验数据，包括填充量、上样上清液体积，洗涤去除非特异性吸附所用的缓冲液的体积，洗脱液所用体积和通过计算得到的每克蛋白结合GST蛋白的质量。 
图4给出了有代表性的块状亲和层析介质分离蛋白得到的分离产物的凝胶电泳图，可见获得的确实是目标蛋白，且纯度较高。 
表5.用块状多孔介质填充亲和层析色谱柱分离纯化GST蛋白的实验数据 
Figure BDA0000068643390000091
本发明涉及的参考文献： 
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[5]Lévesque SG and Shoichet MS，Biomaterials，2006，27，5277. 

Claims (2)

1.一种带谷胱甘肽配体的亲和层析多孔介质的制备方法，其特征在于步骤和条件如下：
(1) 配制谷胱甘肽的水溶液：称取谷胱甘肽，溶解在蒸馏水中，谷胱甘肽浓度为1%～2.5%(w/v)，加入谷胱甘肽摩尔量1.2-2倍的二硫苏糖醇（DTT），机械搅拌反应1-2h；
(2) 配制双键修饰葡聚糖的乳液：称取双键修饰葡聚糖加入上述（1）制备的谷胱甘肽的水溶液中，谷胱甘肽的水溶液体积与双键修饰葡聚糖质量的比例为100mL :20-30g，加入乳化剂，乳化剂质量与水相溶液体积比例为10-15g：100ml，机械搅拌20min；使用的乳化剂是Triton X-405、吐温80、吐温40或Pluronic F-68；
(3) 配制偶氮二异丁腈（AIBN）的甲苯溶液，浓度1-2%(w/v);
(4) 油水乳液配制：搅拌下向双键修饰葡聚糖的乳液中滴加AIBN甲苯溶液，AIBN甲苯溶液总体积是双键修饰葡聚糖的乳液体积的3至5倍，滴加完成后继续搅拌5min；
(5) 聚合固化：将上述反应混合物倒入模具内腔中，置于60-80℃烘箱中固化12-36h成型；所述的模具内腔的形状为圆柱体；
(6) 洗涤纯制：从模具中取出块状材料, 先在25℃摇床中用二甲基亚砜（DMSO）振荡抽提甲苯，后用索氏提取器对水提取，除去有机溶剂及其他杂质，冷冻干燥，获得亲和层析多孔介质；
所述的双键修饰的葡聚糖具有下列结构：
Figure FDA0000242664391
其中，母体葡聚糖的数均分子量为4-50万，每100个糖环上双键的个数为20-30个。
2.用权利要求1制备的带谷胱甘肽配体的亲和层析多孔介质的应用，其特征在于，其用于谷胱甘肽-s-转移酶或以谷胱甘肽-s-转移酶为标签的融合蛋白的分离纯化。
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