CN102333889A

CN102333889A - 基于基因表达特征的ⅱ型糖尿病的药物鉴别方案

Info

Publication number: CN102333889A
Application number: CN2010800091424A
Authority: CN
Inventors: K·瓦尔德; N·康斯坦托普洛斯; G·R·科利耶
Original assignee: Verva Pharmaceuticals Ltd
Current assignee: Verva Pharmaceuticals Ltd
Priority date: 2009-02-27
Filing date: 2010-02-25
Publication date: 2012-01-25
Also published as: NZ594086A; WO2010096875A1; EP2401401A1; EP2401401A4; JP2012518989A; AU2010217197A1; CA2753499A1; US20110318270A1

Abstract

本发明涉及药物鉴别与评价以及治疗最优化领域。更特别地，本发明提供一项用于鉴别能有效治疗肿瘤坏死因子α(TNFα)相关糖尿病或基于基因组或蛋白组表达的特征的糖尿病相关症状的化合物的技术。有关糖尿病及其相关症状的诊断和预后的技术也属于本发明的一部分。本发明还包含治疗干预的最优化。

Description

基于基因表达特征的Ⅱ型糖尿病的药物鉴别方案

技术领域

本发明涉及药物鉴别与评价以及治疗最优化领域。更特别地，本发明提供一项用于鉴别能有效治疗TNFα相关糖尿病或基于基因组或蛋白组表达的特征的糖尿病相关症状的化合物的方案(protocol)。有关糖尿病及其相关症状的诊断和预后的方案也属于本发明的一部分。本发明还包含治疗干预的最优化。

背景技术

本说明书引用的出版物书目明细以字母表顺序列于说明书末尾部分。

本说明书中所参考的任何先有技术并不是，也不应被认为是作为任何国家的公共常识或任何形式提示的先有技术。

基因表达特征(gene expression signature GES)和相应的蛋白组表达特征(Proteomic expression signature PES)提供协调表达的基因簇信息(Alizadeh et al.Nature 403：503-511，2000)并且可用于描述不同的生物学或生理学状态(van deVijver et al.N Engl J Med 347：1999-2009，2002)。基因表达特征在肿瘤生物学中的使用是辅助肿瘤分类、预后及患者的治疗干预应答(Cooper et al.Nat Clin PractUrol 4：677-687，2007；Nuyten and van de Vijver Semin Radiat Oncol 18：105-114，2008)。当基于单一基因表达的筛选方法用于鉴别可调节代谢基因靶标(例如PGC-1α)的药物时(Arany et al.Proc Natl Acad Sci USA 105：4721-4726，2008)，GES代表一组基因，其mRNA的表达有益于细胞对其环境的整体应答。因此，无论簇中的基因为何，同样可以获得GES。所以，这些基因虽然不会直接调节已改变的代谢状态，但却是上述代谢状态的典型标志。因此，设计有益试验时，则无需归因于基因的功能。

作为一种流行病，II型糖尿病(T2D)是全球范围内的重要健康问题。这类疾病的关键性特征是胰岛素耐受性。胰岛素耐受性的成因包含多种因素：循环系统中非酯化脂肪酸含量较高、所有潜在作用的慢性炎症、内质网和氧化应激(Mlinar，et al.Clin Chim Acta 375：20-35，2007)。促炎细胞因子，肿瘤坏死因子α(TNFα)与肥胖症及II型糖尿病中的胰岛素耐受性的发病倾向有关，提高自分泌及旁分泌中的TNFα的含量水平使得包含脂肪组织的多种组织中胰岛素敏感性降低(Hotamisligil，Nature 444：860-867，2006；Ruan and Lodish Cytokine Growth FactorRev 14：447-455，2003)。TNFα通过脂肪细胞分泌且能够通过多种机理(包含脂类分解和脂肪酸释放作用、减少胰岛素信号传递以及降低GLUT4水平)降低胰岛素敏感性，(Ruan and Lodish 2003 supra)。TNFα的活性由包含p38MAP和Jun-N-末端激酶的多种激酶、蛋白激酶C(PKC)、核因子κB(NFκB)活化作用和过氧化物酶增殖激活受体γ(PPATγ)下调作用所介导(Qi and Pekala Proc Soc Exp BiolMed 223：128-135，2000；Tang et al.Proc Natl Acad Sci USA 103：2087-2092，2006)。阿司匹林(ASA)和噻唑烷二酮类曲格列酮(TGZ)等药物可以提高体内胰岛素敏感性(Miles et al.Diabetes 46：1678-1683，1997；Yuan et al.Science 293：1673-1677，2001)；在体外，它们可以通过多种途径抵消TNFα的影响(Gao et al.J Biol Chem278：24944-24950，2003；Ohsumi et al.Endocrinology 135：2279-2282，1994；Peraldiand Spiegelman J Clin Invest 100：1863-1869，1997)。因此，能够在脂肪细胞中逆转TNFα作用效果的药物具有提高整体胰岛素敏感性的潜能。

由于社会上糖尿病发病率与日俱增，对鉴别用于治疗或缓解糖尿病症状，同时诊断和监测糖尿病及其相关症状(例如肥胖症、失明、肾病和/或心血管疾病)的药物存在迫切需要。

发明内容

根据本发明，使用基因组/蛋白组方法可以确证与糖尿病，如T2D(特别是TNFα相关胰岛素耐受T2D)相关的生物学或生理学状态。特别地，通过构建基因表达特征来反映与肿瘤坏死因子α(TNFα)相关的胰岛素耐受性或细胞敏感性状态，目的在于筛选胰岛素敏化剂以及鉴定或监测受试者体内TNFα相关II型糖尿病。在实施例中，由于TNFα使得胰岛素耐受性细胞中产生基因表达特征，随后使用ASA和TGZ进行后处理使得“胰岛素再敏化”。这个模型与人体患病后经诊断采用特定药物进行经典治疗的情况一致。联用ASA和TGZ确保在逆转胰岛素耐受性的过程中能够激活多重信号通路。使用基因表达分析法鉴定的GES包含两种或更多种的基因生物标记物PKM2、Skp1a、CD63、STEAP4、ACS1、CS和/或CLU，其表达在胰岛素耐受性状态对胰岛素再敏化状态中具有统计学意义上的差异。这些基因的mRNA表达是保证从化合物库中筛选出潜在的胰岛素敏化剂的基础。经GES鉴别的化合物及其药物类别在体内和体外实验中均被证实具有胰岛素敏化功能。这里所说的“GES”是指通过相应地蛋白组表达特征或PES来检测基因表达水平。蛋白检测试验用于检测PES。

因此，本发明提供了一种包含2个或更多，尤其是2至7个，基因生物标记物的平板，其用于产生与T2D中以及特别是TNFα相关T2D胰岛素敏感性或耐受性的生物学或生理学状态相关的GES(或相应地PES)。GES对于T2D的发病趋势或可能引发的与T2D相关的症状，例如肥胖症、失明、肾病和/或心血管疾病，特别是TNFα相关T2D等具有预测作用。一方面，本发明的2个或更多生物标记物的平板具有不同的表达方式，使得在TNFα相关T2D受试者中或将产生TNFα相关胰岛素耐受性的受试者中，PKM2、Skp1a、CD63、STEAP4和CLU的基因表达水平增加，ACS1和CS的水平降低。对诱导与胰岛素敏感性有关的GES(或相应的PES)的药物进行鉴别。

因此，本发明提供表征II型糖尿病或其症状的基因表达特征(gene expressionsignature，GES)或相应的蛋白组表达特征(PES)，所述GES或PES包含至少2种选自PKM2、Skp1a、CD63、STEAP4、ACS1(FACL2)、CS和CLU的基因或基因产品的表达水平。

通过检测基于含有2至7个基因的平板(penal)上的GES(或相应的PES)，对TNFα相关T2D及其发病倾向以及相关症状发病率的实施诊断和预后同样属于本发明的一部分。对TNFα相关T2D及其发病倾向以及相关症状发病率的诊断和预后的能力对于治疗和/或控制患者病情，例如医疗方案监控，具有重要意义。

本发明GES中涉及的基因或相应的蛋白指的是生物标记物。本发明涉及采自GES中2个或更多基因表达的共同信息，而不依赖于单一基因的表达。

所提及的“生物标记物”指的是TNFα相关T2D、糖尿病发病倾向、其相关症状发病率或TNFα相关T2D发病倾向的标记物。通过检测2至7个基因或其表达产物在平板上的表达水平来形成GES。在筛选基因的蛋白质产物时，发现了蛋白组表达特征或PES。因此，本发明包含基于2个或更多基因(PKM2、Skp1a、CD63、STEAP4、ACS1、CS和/或CLU)的与胰岛素耐受性或敏感性有关的GES或PES。所提及的“2个或更多”或“2至7个”包含2、3、4、5、6或7个上述基因。

所提及的“TNFα相关T2D”或“TNFα相关胰岛素耐受性或敏感性”或“TNFα相关胰岛素耐受性T2D”包含在T2D症状范围之内。

本发明进一步能够优化T2D的治疗干预，通过首先使受试者分组在一个基于GES或相应的PES的特定组中，然后选择并施用含有相同或相似GES/PES的药物。在一定时间内监控GES/PES且基于维持受试者GES/PES和已选药物GES/PES的相似性关联的原因，变化药物。

因此，本发明探究使受试者分组以便在治疗II型糖尿病时简化治疗干预的方法，所述方法包含：检测受试者的GES或相应的PES，该受试者包含选自PKM2、Skp1a1、CD63、ACS1(FACL2)、CS和CLU中的至少两种基因的表达水平的GES或相应的PES，以及使用用于使受试者分组的GES或PES相同或大体相似的GES或相应的PES来选择认作糖尿病症状逆转剂的药物。

本发明进一步提供治疗具有II型糖尿病或其症状的受试者的方法，所述方法包含：检测受试者的GES或相应的PES，该受试者包含选自PKM2、Skp1a1、CD63、ACS1(FACL2)、CS和CLU中的至少两种基因的表达水平的GES或相应的PES，以及通过使用与在所述受试者中检测到的GES或PES相同或相似的GES或相应的PES来使用认作糖尿病症状逆转剂的药物。

本发明的另一方面涉及治疗具有II型糖尿病或其症状的受试者的方法，所述方法包含：检测受试者的GES或相应的PES，该受试者包含选自PKM2、Skp1a1、CD63、ACS1(FACL2)、CS和CLU中的至少两种基因的表达水平的GES或相应的PES，以及通过使用与在所述受试者中检测到的GES或PES相同或相似的GES或相应的PES来使用认作糖尿病症状逆转剂的药物且在一定时间内监控GES或相应的PES并调节药物以使药物具有与最终检测到的受试者GES或PES相同或大体相似的GES或相应的PES。

本发明探究TNFα相关胰岛素耐受性或敏感性的GES或PES在制备用于治疗TNFα相关T2D或其症状的药物中的用途。

因此，本发明的一个方面提供在特定的TNFα相关胰岛素耐受性或敏感性水平下的GES或相应的PES，所述GES或相应的PES包含2个或更多选自PKM2、Skp1a、CD63、STEAP4、ACS1(即FACL2)、CS和CLU的基因或其同源物，其中当细胞中PKM2、Skp1a、CD63、STEAP4和/或CLU的表达较对照组增加和/或ACS1和/或CS的表达较对照组减少，说明产生胰岛素耐受性。

文中“对照组”包括胰岛素敏感细胞内的表达水平。

在另外一个实施方式中，本发明探究在特定的TNFα相关胰岛素耐受性或敏感性水平下的GES或相应的PES，所述GES或相应的PES包含2个或更多选自PKM2、Skp1a、CD63、STEAP4、ACS1、CS和CLU的基因或其同源物，其中当细胞中PKM2、Skp1a、CD63、STEAP4和/或CLU的表达较对照组减少和/或ACS1和/或CS的表达较对照组增加，说明产生TNFα相关胰岛素敏感性。

这里的“对照组”包括胰岛素耐受细胞内的表达水平。

本发明可就地实施或在源自受试者的生物样品上进行。因此，本发明进一步提供对TNFα相关T2D、TNFα相关T2D发病倾向或受试者体内TNFα相关T2D并发症进行诊断或预后的方法，所述方法包含：(a)从受试者中获取生物样品；(b)检测生物样品中基于2个或更多PKM2、Skp1a、CD63、STEAP4、ACS1、CS和/或CLU的GES或相应的PES；(c)比较生物样品中的GES和统计学确证的阈值，其中GES或其相应的PES有益于TNFα相关T2D的胰岛素敏感性或耐受性。

因此，这里所说的TNFα相关T2D的胰岛素耐受性或敏感性的生物学或生理学状态下的GES作为知识库。在制剂或药物存在的条件下，通过比较不同知识库的GES或相应的PES可以鉴别出有效的药物或TNFα相关T2D的治疗方法。

因此，本发明进一步探究鉴别能够降低细胞中TNFα相关T2D的胰岛素耐受性的化合物的方法，所述方法包含：接触具有有益于TNFα相关T2D的胰岛素耐受性(第一知识库)的第一GES或相应的PES的TNFα相关T2D的胰岛素耐受性细胞，然后筛选有益于TNFα相关T2D的胰岛素敏感性(第二知识库)的第二GES或相应的PES，其中能够促进第二GES发展的化合物选作所需化合物。

第一和第二知识库可通过试验检测或成为统计学验证控制(validated control)的一部分。

特别地，本发明涉及鉴别治疗人类TNFα相关T2D的药物。

使用GES比使用T2D单基因指示剂更加有效，尤其适用于监控治疗方案和筛选具有胰岛素敏化性质的潜在药物。

附图说明

某些图片包含颜色表示或实体。应要求，可以从专利权人或者从合适的专利局获得彩色照片。如果从专利局获得，可能要缴纳一定费用。

图1是使用基于TNF的GES进行小分子库筛选的结果概要图示。A.含有10个或更多成员的每个化合物组群的平均Zrcc值打分结果如图所示。胰岛素再敏化TNFα加TGZ和ASA(TTA)共处理及胰岛素耐受性TNFα的治疗(TNF)控制如图所示(TNF^*p＜0.05并且TTA^p＜0.05；n＝10-62)。

图2a和2b是3T3-L1脂肪细胞中HA标记的GLUT4在接受化合物刺激后向浆膜移位的图示。脂肪细胞分别和10μM的每种化合物共孵20小时后，用0.5nM的胰岛素对脂肪细胞产生急性刺激，随后测定HA标记的GLUT4向浆膜的移位。a.与TNFα加ASA和TGZ的共孵样品的GES属性(见图1)最相近的化合物在HA标记的GLUT4移动中的效果。与0.5nM胰岛素单独设置为1.0相比，数据以差异倍数形式表示平均值±标准误；n＝12-40/组。b.个别CAI成员对GLUT4移动的影响。与0.5nM胰岛素值(设定为′1′)相比，每个柱状物代表重复样本的平均值+标准差，并以差异倍数形式表示。与仅含0.5nM胰岛素比较，^*P＜0.003。阴性和阳性对照组包含0nM(p＝1.51×10-13，n＝32)和急性最大200nM的胰岛素(p＝2.55x 10-9，n＝32)，仅与0.5nM胰岛素相比，将10μM TGZ(n＝8)和5mMASA(n＝8)分别孵化20小时。

图3a至3e是醋甲唑胺对DIO及db/db小鼠代谢参数的影响图示。A.经过腹膜内葡萄糖耐受测试的DIO小鼠分别接受给药剂量为50mg/kg/天的每种相应药物连续给药14天的处理后血糖的曲线下面积(AUC)变化(以空白对照的百分比计)。缩略语：2-氨基苯磺酰胺(2ABS)、氯噻酮(CTD)、呋塞米(FUR)、二氯苯磺胺(DCP)、醋甲唑胺(MTZ)和N-甲基-醋甲唑胺(MMTZ)。B.MTZ对DIO小鼠体内血糖(上图)和血浆胰岛素水平(下图)的剂量依赖性影响。除空白对照组(n＝6)以外，动物用指示剂量(分别为50mg/kg(n＝5)和100mg/kg(n＝5))的MTZ处理14天(^*^p＜0.05)。C.MTZ对db/db小鼠空腹血糖水平的剂量依赖性影响。小鼠经空白溶剂(n＝24)或50mg/kg的MTZ(n＝23)处理8天(0天时，^*p＜0.05；相应空白对照组，^p＜0.05)。D.经50mg/kg的MTZ处理28天后，MTZ对db/db小鼠糖化血红蛋白(Hb1Ac)的剂量依赖性影响。柱状图表示平均值±标准误，n＝5-12。空白对照组^*p＜0.05。E.MTZ和二甲双胍联用对db/db小鼠空腹血糖水平的影响。经空白溶剂、20mg/kg MTZ、300mg/kg二甲双胍或20mg/kg MTZ与300mg/kg二甲双胍联用处理8天后小鼠血糖水平的变化。空白对照组^*p＜0.05，单用二甲双胍组^p＜0.05。

发明详述

除文义另有所指外，说明书中通篇出现的“包含”应理解为其中含有规定的元素、整体、元素组或整体组，而不应认为其中不含任何一种其它的元素、整体、元素组或整体组。

应注意的是，除非文中清晰地说明，在说明书中出现的“一(a\an\the)”等单数形式包含相应的复数概念。因此，例如文中所述的“GES”既包含单一GES，也包含两种或更多种GES；所述的“药剂”既包括单一药剂，也包括两种或更多种药剂；所述的“该发明”包括发明的一个或多个方面的内容等等。

本发明鉴别一组基因，这些基因的集体表达表征GES(或相应地PES)。GES描述与糖尿病，特别是TNFα相关T2D，相关的生物学或生理学状态并对该状态有益。更特别的是，这种生物学或生理学状态就是细胞内TNFα相关T2D的胰岛素耐受性或敏感性水平。这里提及的GES或PES决定TNFα相关T2D的胰岛素耐受性或敏感性的特殊状态作为知识库。因此，TNFα相关T2D由胰岛素敏感性向胰岛素耐受性的前进产生了不同的知识库。在各种药剂存在的条件下比较这些知识库能够鉴别出诱导受试者体内产生TNFα相关T2D的胰岛素敏感性的试剂。

GES包含2个或更多选自PKM2、Skp1a、CD63、STEAP4、ACS1(即FACL2)、CS和CLU的基因的表达信息。所提及的“2个或更多”或“2至7个”包括2、3、4、5、6或7个上述基因。2个或更多上述基因的任意或全部组合也包含在本发明中。在具体实施方案中，第一知识库定义为TNFα相关T2D的胰岛素耐受性，其中PKM2、Skp1a、CD63、STEAP4和CLU的表达增加而ASC1和CS的表达降低。第二知识库定义为TNFα相关T2D的胰岛素耐受性，其中PKM2、Skp1a、CD63、STEAP4和CLU的表达降低而ASC1和CS的表达增加。

因此，本发明也提供在TNFα相关T2D的胰岛素耐受性或敏感性水平下的GES或相应的PES，所述GES或相应的PES包含2个或更多选自PKM2、Skp1a、CD63、STEAP4、ACS1(即FACL2)、CS和CLU的基因或其同源物，其中细胞中PKM2、Skp1a、CD63、STEAP4和/或CLU的表达较对照组增加和/或ACS1和/或CS的表达较对照组减少，说明产生胰岛素耐受性。

因此，本发明提供表征II型糖尿病或其症状的基因表达特征(GES)或相应的蛋白组表达特征(PES)，所述GES或PES至少包含2个选自PKM2、Skp1a、CD63、STEAP4、ACS1(FACL2)、CS和CLU的基因或基因产品的表达水平。

上述“对照组”包括胰岛素敏感细胞中的表达水平。

在另一个实施方案中，本发明探究TNFα相关T2D的胰岛素耐受性或敏感性水平下的GES或相应的PES，所述GES或相应的PES包含2个或更多选自PKM2、Skp1a、CD63、STEAP4、ACS1、CS和CLU的基因或其同源物，其中细胞中PKM2、Skp1a、CD63、STEAP4和/或CLU的表达较对照组减少和/或ACS1和/或CS的表达较对照组增加，说明产生TNFα相关胰岛素敏感性。

这方面的“对照组”包括胰岛素耐受细胞内的表达水平。

本发明进一步提供对TNFα相关T2D、TNFα相关T2D发病倾向、受试者体内TNFα相关T2D并发症进行诊断或预后的方法，所述方法包含：(a)从受试者中获取生物样品；(b)检测生物样品中基于2个或更多PKM2、Skp1a、CD63、STEAP4、ACS1、CS和/或CLU的GES或相应的PES；(c)比较生物样品的GES和统计学确证的阈值，其中GES或其相应的PES有益于TNFα相关T2D。

本发明进一步优化T2D的治疗干预，首先使受试者分组在基于GES或相应PES的特定组中，然后选择并施用含有相同或相似GES/PES的药物。在一定时间内监控GES/PES且基于维持受试者GES/PES和已选药物GES/PES的相似性关联的原因，变化药物。

相应地，本发明探究使受试者分组以便在治疗II型糖尿病时简化治疗干预的方法，所述方法包含：检测受试者的GES或相应的PES(即选自PKM2、Skp1a1、CD63、ACS1(FACL2)、CS和CLU中的至少两种基因的表达水平的GES或相应的PES)以及使用与使受试者分组所用GES或PES相同或大体相似的GES或相应的PES来选择认作糖尿病症状逆转剂的药物。

本发明进一步提供治疗II型糖尿病或其症状的方法，所述方法包含：检测受试者的GES或相应的PES(即包含选自PKM2、Skp1a1、CD63、ACS1(FACL2)、CS和CLU中的至少两种基因的表达水平的GES或相应的PES)以及使用具有与上述受试者的GES或PES相同或相似的GES或相应的PES施用认作糖尿病症状逆转剂的药物。

本发明的另一方面涉及治疗具有II型糖尿病或其症状的受试者的方法，所述方法包含：检测受试者的GES或相应的PES(即包含选自PKM2、Skp1a1、CD63、ACS1(FACL2)、CS和CLU中的至少两种基因的表达水平的GES或相应的PES)以及使用具有与上述受试者的GES或PES相同或相似的GES或相应的PES施用认作糖尿病症状逆转剂的药物且在一定时间内监控GES或相应的PES并调节药物以使药物与最终检测到的受试者GES或PES相同或大体相似的GES或相应的PES。

所提及的“糖尿病症状逆转剂”包括逆转糖尿病，特别是II型糖尿病的药剂。

“生物样品”包括生物液体样品，例如但不限于全血、血浆、血清、黏液、尿液、分离的外周血单个核细胞、淋巴细胞、精液、粪便、胆汁、细胞提取物、呼吸道分泌物、灌洗液、淋巴液、唾液以及其他组织分泌物或液体。特别的生物液体是全血、血浆和血清。因此，生物样品可以是基于液态的样品或细胞，包括附着在固相载体上的细胞。物理化将生物样品从受试者中移除不是必需的，尽管生物样品的移除和后续生物标记物的分析实验是实施“即时法”最简便的方法。生物液体可经历富集过程或将可能干预分析实验的高丰度分子移除。

本发明在一定程度上预测生物标记物的鉴别，其中2个或更多生物标记物的共同表达有益于TNFα相关T2D及其并发症，例如肥胖症、失明、肾病和/或心血管疾病，或TNFα相关T2D发病率。

所提及的“鉴别”包括对2个或更多的用于说明胰岛素耐受性/敏感性的已选生物标记物或源自其的并发症进行排列、分组及分析。排列、分组及分析均包含在术语“表达特征”的范畴中。

本发明的适用范围扩展至GES或相应PES的基因衍生物和同源物。因此，本发明的生物标记物除上述以外，还包括具有如下特征的基因：其核苷酸序列具有70％同一性；或在高度严谨条件下，能够与其序列或互补配对形式杂交；或编码与基因编码氨基酸序列具有至少70％相似性的氨基酸序列。

所提及的“至少70％”包括70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％和100％。

特定的百分比相似性或同一性是至少约80％、至少约90％或至少约95％。

所述的术语“相似性”包括所比较的序列间在核苷酸或氨基酸水平上精确的同一性。当核苷酸水平上没有同一性时，其“相似性”包括能够产生在结构、功能、生化和/或构象水平上彼此相关的氨基酸的序列间的差异。当氨基酸水平上没有同一性时，其“相似性”则包括在结构、功能、生化和/或构象水平上彼此相关的氨基酸。在一个特别优选的实施例中，核苷酸和序列的比较建立在同一性水平上，而并非相似性水平上。

用于描述2个或更多多聚核苷酸或多肽之间序列关系的术语包括“参考序列”、“对照窗”、“序列相似性”、“序列同一性”、“序列相似性百分比”、“序列同一性百分比”、“基本上相似”和“基本同一”。“参考序列”为至少12个，通常为15至18个，有时至少含有25个或更多(例如30个)包括核苷酸及氨基酸残基在内的单元结构，长度方面，例子包括12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个和25个单元结构。由于两条多聚核苷酸各自包含(1)在两条多聚核苷酸间具有相似性的序列(抑或多聚核苷酸完整序列的一部分)及(2)在两条多聚核苷酸间存在分歧的序列，两条(或更多)多聚核苷酸间的序列比较通常是通过相对“对照窗”比较两条多聚核苷酸来鉴别和比较局部区域序列的相似性。“对照窗”是与参考序列相比通常具有12个连续残基的概念上的片段。对照窗可包括为了实现两条序列的最佳排列，对大约20％或更少的残基做出添加或删除(即缺口)，相比而言，参考序列则不包括添加和删除。为了排列对照窗而采用的序列最佳排列可通过电脑计算法(GAP，BESTFIT，FASTA，and TFASTA in the Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0，Genetics Computer Group，575Science Drive Madison，WI，USA)或任何已选方法产生的检验和最佳排列方法(即引起相对对照窗的最高百分比同源物)得以实现。也可参考例如Altschul等公开的(Nucl Acids Res 25：3389，1997)有关基础局部排列搜索工具(Basic Local Alignment Search Tool，BLAST)家族的方案。序列分析的详细讨论参见Ausubel等人论著中的19.3单元部分(“Current Protocols inMolecular Biology”，John Wiley&Sons Inc，第15章，1994-1998)。

“高度严谨条件”是指在该条件下，探针与目标序列进行特异性杂交的数量明显高于非特异性杂交。此外，高度严谨条件是可以辨别具有精确完整序列的多聚核苷酸或辨别仅含有的源自具有与探针相匹配的一些小区域(例如3至10个碱基)的随机序列的分散不匹配性的多聚核苷酸的条件。与含有14至17个或更多碱基的标准长度的互补体相比，这些互补的小区域更易融化，并且高度严谨条件杂化可使其容易辨别。相关的高度严谨条件包括如低盐和/或高温条件，例如大约0.02至大约0.10MNaCl或等价物，大约50℃至70℃。如果上述高度严谨条件几乎不能忍受探针与模板或目标序列的不匹配性，那么它将极其适合于检测特定生物标记物的表达。通常认为，随着甲酰胺加入量的增加，条件也会更加严格。

所提及的高度严谨条件包括和包含至少大约0至大约15％(v/v)的甲酰胺；至少大约1M至大约2M的杂交用盐；至少大约31％至大约50％(v/v)的甲酰胺，例如31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％和50％(v/v)的甲酰胺以及至少大约0.01至大约0.15M的杂交用盐，例如0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.10、0.11、0.12、0.13、0.14和0.15M；和至少大约0.01至大约0.15M的漂洗用盐，例如0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.10、0.11、0.12、0.13、0.14和0.15M。通常，漂洗按照T_m＝69.3+0.41(G+C)％(Marmurand Doty，J.Mol.Biol.5：109，1962)施行。然而，在1℃条件下，不匹配的碱基对数目每增加1％，双螺旋DNA的T_m值会相应降低(Bonner and Laskey，Eur J Biochem46：83，1974)。在上述杂交条件中，甲酰胺是可选择的。因此，高度严谨被定义为温度至少在65℃，含有0.1X枸橼酸钠缓冲液(Saline Sodium Citrate buffer，SSCbuffer)和0.1％(w/v)十二烷基磺酸钠(Sodium Dodecyl Sulfate，SDS)的条件。

在另一个实施例中，本发明提供诊断TNFα相关糖尿病、TNFα相关糖尿病并发症及TNFα相关糖尿病发病倾向的方法，所述方法包含筛选蛋白质或编码所述蛋白质(其中蛋白质均是表3中列出的从受试者得到的生物样品中的生物标记物)的mRNA或其同源物的水平，其中与统计学确证的阈值相比得到的蛋白质水平上的差异表示为TNFα相关糖尿病、其并发症及其发病倾向。

表达水平(或PES的蛋白水品)提供有关包含7个生物标记物中的2个或更多的生物学或生理学状态的统计学确证的公认定义。

除另有清晰说明以外，本申请中详细说明的不同量程范围内数值的使用依照以下规定：近似值采用在规定范围内的最小值和最大值前面冠以“大约”一词来表示。因此，规定范围上下的轻微浮动基本上也可以达到范围内部数值所能产生的效果。同理，范围的公开可认为是包括最小值与最大值之间每一个数值的连续范围。另外，特征的范畴延伸至2个或更多生物标记物水平的比值，其以数值的形式反映产生胰岛素耐受性的风险水平。

对2个或更多生物标记物水平或浓度的测定有助于建立基于统计学和机器学习算法的使用的诊断规则。该算法利用样本数据(伴随着已知的胰岛素耐受性和敏感性)中观察到的生物标记物与胰岛素耐受性或敏感性间的关系来推断随后用于预测未知状态患者的状态的关系。这个算法提供有关患者罹患TNFα相关胰岛素耐受性或TNFα相关胰岛素耐受性发病倾向以及TNFα相关T2D的概率指标。

因此，本发明探究样本数据的知识库的应用，该样本数据包含取自TNFα相关胰岛素耐受性受试者的此处所述的2个或更多生物标记物的水平进而产生一种算法，该算法在包含取自胰岛素耐受情况不明受试者的相同生物标记物水平的第二知识库数据输入的基础之上，提供预测胰岛素耐受性或敏感性与TNFα是否相关的概率指标。

“受试者”通常指人体。然而，本发明扩展至兽医学领域中的应用。因此，受试者也可以是非人的哺乳动物，诸如牛科、马科、羊亚科、猪科、犬科、猫科或非人的灵长目动物。虽然，本发明更加适用于检测人类TNFα相关T2D。所提及的“TNFα相关T2D”包括术语“T2D”或“II型糖尿病”所包含的全部T2D症状。

术语“样本数据”包括相对于对照组的2个或更多生物标记物的水平的知识。“对照组”包括对胰岛素耐受性或敏感性已知的或症状得到治疗的受试者的生物标记物水平的比较，或是基于实验的统计学测定水平。术语“水平”同样包含生物标记物水平的比值。

“样本数据”也包括PMK2、Skp1a、CD63、STEAP4、ACS1、CS和/或CLU中的1个或更多的生物标记物的集合。

本发明进一步探究用于测定受试者TNFα相关T2D胰岛素耐受性和敏感性的生物标记物平板，该平板包含与生物标记物进行特异性结合的试剂以检测2个或更多生物标记物的水平且然后使该水平符合源自第一知识库数据的算法(algorithm)(对于其中算法提供受试者是否具有TNFα相关T2D胰岛素耐受性或敏感性的概率指数的情况，上述数据包含采自未知状态受试者的相同生物标记物水平)，所述生物标记物选自PKM2、Skp1a、CD63、STEAP4、ACS1、CS和/或CLU中的2个或更多个。

与生物标记物进行“特异性结合”的试剂通常包括交互免疫分子(例如抗体、杂化物以及包括重组体或其改良物及其抗原结合片段的衍生物)。试剂也可以是受体或其他配体。这些试剂能够辅助检测生物标记物的水平。

在某些方面，本申请涉及通过比较源自受试者的生物样品中的GES(或相应的PES)对TNFα相关T2D、TNFα相关T2D胰岛素耐受性或敏感性状态，或相关并发症及TNFα相关T2D发病倾向进行诊断及预后的方法。GES或PES也可以和统计学确证的阈值相比较。源自对照组(例如普通组或人类受试者选择组)的可比较样品中的统计学确证的阈值基于生物标记物的水平。例如，选择组可以由表观健康者组成。这里所述的“表观健康”是指以前没有任何TNFα相关T2D发病征兆和症状(包括一个或更多糖尿病家族史)，没有与TNFα相关T2D有关因素的发病迹象(包括一个或更多的低活性水平，匮乏的饮食，超重(尤其是腰部)，年龄超过45周岁，高血压，高水平的甘油三酯，高密度脂蛋白胆固醇低于35，预先鉴定的受损葡萄糖不耐症、妊娠期及婴儿体重超过9磅时的预先糖尿病等因素)的个体。表现健康个体同样不表现出糖尿病的症状。换言之，这些经医务人员诊断过的个体的特征在于健康以及没有疾病症状。因此，所选对照值可以考虑到检验受试者所属的类别。以不逾越本领域技术人员的常用手段选择适宜的类别。

统计学确认的阈值与用来描述生物标记物(源自受试者的核酸或多肽)水平的值密切相关。因此，如果生物标记物核苷酸或多肽的水平是绝对值(例如特定转录的复制数或每毫升血液中蛋白质水平或细胞数目)，那么对照值的确定也会基于特定转录的复制数或每毫升血液中蛋白质水平或细胞数目。

统计学确认的阈值可采用多种形式。统计学确认的阈值可以是单一临界值(例如中间值或平均值)。统计学确认的阈值可基于比较组(例如，一个定义组内的风险是另一个定义组内风险的2倍的组)建立。统计学确认的阈值可以被平均(或不平均)分配到低风险组、中风险组或高风险组，或被分入不同象限(最低象限代表具有最低风险者，最高象限代表具有最高风险者)，且受试者是否有糖尿病或发病征兆的风险则取决于他或她的检验值落入的组。

所得生物标记物的统计学确认的阈值(如例如平均水平、中间水平或“临界”水平)是通过分析普通组或选择组中大量的个体样品并应用统计模型(例如，用于选择正性标准预测值的方法或用于定义最适宜特异性(最高真阴性比率)或敏感性(最高真阳性比率)的接受者操作特征曲线)而得到的，其描述于Knapp R.G.和Miller M.C.于1992年出版的《临床流行病学与生物统计学》(ClinicalEpidemiology and Biostatistics.1992，William and Wilkins，HarualPublishing Co.Malvern，Pa.，)，其特别包含于此作为参考。每一个经过分析的生物标记物均能测定其“临界”值。

受试者的生物样品中的每一选择的生物标记物核酸(基因组或核酸组标记物)或多肽(蛋白组标记物)可与单一对照值或一系列对照值作比较。如果受试者的生物样品中的生物标记物水平与统计学确认的阈值不同，那么，和那些与统计学确认的阈值相当的个体相比，这些检验受试者将面临发展成或患有TNFα相关T2D、或其相关症状或其发病倾向的更大风险。受试者GES/PES生物标记物水平和统计学确认的阈值之间的差异程度能够有效地描绘TNFα相关T2D胰岛素耐受性和敏感性的风险程度以及检测哪些个体会从特定的治疗中获益最大。在这些情况中，既然统计学确认的阈值范围已经被分到一系列组中(例如高风险、平均风险和低风险个体组的统计学确认的阈值范围)，比较包括检测受试者的相关风险水平预测落入的组。

本预测性检验有助于检测是否以及何时应该或不应该为个人开具或对化合物检验组选择旨在预防TNFα相关T2D，或延缓TNFα相关T2D进程，或治疗TNFα相关T2D症状的治疗药物。例如，具有与统计学确认的阈值不同的GES(或PES)值或在“正常范围”内有较高三分位数或四分位数的受试者可被鉴定出需要接受糖尿病治疗干预、改变生活方式等。

在具体实施方案中，可以使用与特异性作用于上述生物标记物的mRNA整体互补的核酸片段或使用与mRNA部分互补的较小片段。这些较小片段全长可能是大约14个、大约15个、大约16个、大约17个、大约18个、大约19个、大约20个、大约21个、大约22个、大约23个、大约24个、大约25个、大约25个、大约30个、大约50个、大约75个、大约100个或甚至几百个碱基且可以包含在发挥其他功能(例如激活子、限制性内切酶识别位点以及其他表达、信息处理或答复功能)的较大片段之中。在一个实施方案中，探针被设计用于和上面列举的生物标记物或其蛋白质产品进行选择性杂交。同理，被设计用于和含有选自PKM2、Skp1a、CD63、STEAP4、ACS1、CS和/或CLU的序列的核酸片段进行选择性杂交的探针或引物也是有用的。

本发明的方法还包括杂交产物的数量测定。该测定方法可以借助于示踪杂交探针的直接测定(例如应用含有放射性、荧光性或其他标记的探针)或可以应用目标序列扩增，及扩增产物的定量化方法。这里所述的逆转录聚合酶链式反应法(RT-PCR)就是有效的扩增方法。在该方法的具体操作中，扩增可以包含使目标核糖核酸与用于扩增生物标记物中mRNA的一对扩增引物接触，甚至还包含使核糖核酸与用于扩增包含核酸序列或其补码(该序列选自PKM2、Skp1a、CD63、STEAP4、ACS1、CS和/或CLU或其补码)的核酸片段的一对扩增引物接触。

诊断和预后的方法建立在如下步骤的基础之上：从受试者或患者中获取生物样品，在有利于基本互补的核酸进行杂交的条件下，使生物样品中的核酸和对生物标记物(PKM2、Skp1a、CS63、STEAP4、ACS1、CS和/或CLU中的2个或更多)特异的独立的核酸接触，且测定，且任选进一步表征由此形成的杂交的互补核酸。

该方法可以包括位于样品细胞中的核酸样品的原位测定。样品核酸也可以在接触之前从细胞中分离得到。样品核酸可以是DNA或RNA。

同源物是指源自另一动物物种的生物标记物基因。本发明延伸至源自灵长目动物(包括人类、绒猴、猩猩和大猩猩)、家畜(例如牛、羊、猪、马、驴)、实验用动物(例如小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠、兔子)、宠物(例如猫和狗)以及捕获的野生动物(例如啮齿类、狐狸、鹿、袋鼠)并通过核苷酸序列和/或氨基酸序列和/或功能测定的同源基因。

作为诊断或预后工具，抗体特别有利于测定TNFα相关T2D的PES。

例如，特定抗体能用来筛选生物标记物蛋白质。后者例如作为筛选源自细胞提取物或其他生物液体(如血清、血液、尿液或唾液)的一个或更多生物标记物水平的手段是非常重要的。其中包括的分析技术为业内所熟知，例如三明治分析法和ELISA法。

从最简单和最直观的角度讲，免疫分析法就是结合分析法。不同类型的酶联免疫吸附法(ELISA法)和放射免疫分析法(RIA)是业内熟知的首选免疫分析法。应用组织切片进行免疫组织化学检测也是非常有用的。然而，“检测方法不限于上述技术”这一论点很容易被公众理解且蛋白免疫印迹法(Western blotting)、点免疫印迹法(dot blotting)、流式细胞仪分析法(FACS)以及其他方法也同样得到使用。

在一项典型的ELISA实验中，与本发明中的编码蛋白质相结合的抗体被固定在抑制蛋白质亲和力的选定表面上(例如聚苯乙烯微量滴定板中的微孔)。然后，将疑似含有糖尿病生物标记物抗原的待测组合物(例如临床样品)加入到微孔中。经过结合作用并且清洗掉非特异性结合免疫复合物以后，便可以检测到结合的抗原。通常，通过加入可与目标蛋白质发生特异性作用(与可检测的标记结合)的第二抗体来完成检测过程。该类型的ELISA 法是一种简单的“三明治式ELISA”。另外，上述检测过程也可以通过加入第二抗体后，再加入对第二抗体具有结合亲和力的第三抗体来完成，而这种第三抗体则结合在可检测的标记上。

在另一种典型ELISA法中，疑似含有生物标记物抗原的样品被固定在微孔的表面之后，与本发明中的抗体接触。经过结合作用并且清洗掉非特异性结合免疫复合物以后，便可以检测到结合的抗原。因为最初的抗体已经结合可检测的标记，所以可直接检测免疫复合物。此外，免疫复合物的检测也可以通过加入对第一抗体具有结合亲和力的第二抗体来完成，而这种第二抗体则结合在可检测的标记上。

另外一种固定化蛋白质或多肽的ELISA法包括在检测中使用抗体竞争试验。在这种ELISA法中，将已标记的抗体加入到微孔中，使其与生物标记物蛋白质结合，并通过其标记进行检测。然后，未知样品中标记抗原的数量可通过将覆膜微孔中的样品与已标记抗体在培养之前或培养期间混合来测定。样品中标记抗原的存在降低了能够与微孔有效结合的抗体数量，进而降低最终信号。该方法适合于测定未知样品中与抗原覆膜微孔结合的未标记抗体以及降低能够有效结合已标记抗体的抗原数量。

不论采用的具体形式如何，ELISA法同样具有某些共同特征，例如，覆膜、培养或结合、清洗掉非特异性结合物种以及测定结合免疫复合物。

本发明还涉及使用作用于PES蛋白质的单克隆抗体对TNFα相关T2D或其临床前表现成像的体内方法。特别地，该方法涉及给予受试者成像有效量的标记可检测的生物标记物单克隆抗体或其片段以及药用上有效的载体，且检测已标记的单克隆抗体与病变的结合情况或上调或下调标记基因，健康组织。术语“体内成像”是指本发明中任何允许与受试者体内病变组织特定结合的已标记单克隆抗体或其片段进行检测的方法。“成像有效量”是指具体结合到位于受试者的身体的病变组织的标记单克隆抗体的检测方法。“成像有效量”是指为了足以检测到单克隆抗体或其片段与病变组织的结合或单克隆抗体或其片段与健康组织(相对于病变组织，健康组织的含量比例较高)的结合而给予的标记可检测的单克隆抗体或其片段的剂量。

试剂盒既是本发明的一部分也是此处鉴定的用于治疗TNFα相关T2D的药物。

本发明进一步提供上述GES(或相应的PES)在制备用于II型糖尿病的诊断实验或用于降低细胞中胰岛素耐受性或提高胰岛素敏感性的化合物的药剂中的用途。

后续的非限制性实例将进一步阐述本发明。

具体实施方式

实施例1：胰岛素耐受性GES的测定

如前所述，首先在3T3-L1脂肪细胞中建立TNFα诱导的胰岛素耐受性模型(Sartipy and Loskutoff J Biol Chem 278：52298-52306，2003)。随后将3T3-L1暴露在3ng/ml TNFα中72h，胰岛素耐受性通过应答胰岛素的细胞对2-脱氧葡萄糖(2-DOG)的摄取能力来测定。与胰岛素刺激对照组(p＜0.0001)相比，TNFα导致2-DOG摄入量减少37％(表1)。为了逆转TNFα的影响，在72h TNFα处理的最后24h内采用5mMASA和10μM TGZ的后处理，且发现其能够修复TNFα损伤(TNFα处理细胞组，p＝0.0053)。个别地，ASA和TGZ也可以完全逆转TNFα的影响(TNFα+TGZ的TNFα处理组，p＝0.0035；TNFα+ASA的TNFα处理组，p＝0.0011)。

在这些条件下，整体基因表达被研究用于鉴定表现每种生物学状态(“胰岛素耐受性”和“胰岛素再敏感性”)的GES。对照组、TNFα组及TNFα+ASA与TGZ共处理组3T3-L1脂肪细胞样品的微阵列分析实验通过采用每项处理20份样品进行来简化联合预测的统计性估计。总的说来，与对照组处理的脂肪细胞相比(名义上，p＜0.01)，应用鲁棒线性模型(基于多元t分布)伴随获得的似然率检验，3325个基因的表达受到TNFα处理的影响。其中1022个基因经过ASA和TGZ的处理后(名义上，p＜0.01)，表达得到逆转。这1022个基因经历贝叶斯模型选拔程序(Blangero et al.Hum Biol 77：541-559，2005)，在该程序中，将产生至多7个基因的模型并以此获得充当GES的贝叶斯平均回归方程。由7个基因组成的模型被发现具有98％的预测能力以可以区别胰岛素耐受性和胰岛素再敏化状态，被选为基于TNFα的GES。经鉴定，这些基因是乙酰辅酶A合成酶1(acyl-CoA synthetase1/ACS1)、前列腺六次跨膜上皮抗原4(six transmembrane epithelial antigen of theprostate 4/STEAP4)、S期激酶相关蛋白1A(S-phase kinase associated protein 1A/skp1a)、M2型丙酮酸激酶(pyruvate kinase，muscle 2，PKM2)、CD63、枸橼酸合成酶(CS)和凝聚素(CLU)，并且表现出各种各样的功能(表2)。它们的DNA微阵列表达谱显示：与对照组相比，接受TNFα处理后7个基因当中的5个(STEAP4、PKM2、Skp1a、CD63和CLU)表达水平提高，然而2个基因(ACS1和CS)的表达水平降低(表3)。

TNFα分别对ACS1和STEAP4的mRNA水平具有下调和上调作用，这一点之前已有报道(Moldes et al.J Biol Chem 276：33938-33946，2001；Weiner et al.J BiolChem 266：23525-23528，1991)。据我们所知，尚未有关于TNFα直接调节PKM2、Skp1a和CD63转录的报道。无论是在对照组与TNFα处理组状态之间，还是在TNFα处理组与TNFα+ASA与TGZ共处理组样品(p＜0.005)之间，7个基因中的每一个的表达水平均显著不同。这些基因中的4个(STEAP4、PKM2、CD63和CLU)在对照组与TNFα+ASA与TGZ共处理组(p＜0.002)之间保持显著不同，表明该胰岛素敏感化药物对TNFα的影响只产生部分逆转，然而，ASA和TGZ却将ACS1、Skp1a和CS的基因表达完全恢复到对照组的水平。每一个基因在每一条件下的基因表达变化的水平可由每次处理较小样本数半定量实时PCR确证(表3)。此外，所有基因在对照组与TNFα处理组之间或者在TNFα处理组与TNFα+ASA与TGZ共处理组(p＜0.05)之间保持显著不同。

为了鉴别新型胰岛素敏化剂，使用GES对由1120个高纯度、非专利保护的化合物组成的小分子库进行筛选。首先，将3T3-L1脂肪细胞培养于14个96孔板中，并且在TNFα处理的最后24h加入每个化合物各10μM之前，先用3ng/ml TNFα培养处理72h。每个96孔板中包括4个空白对照孔、4个TNFα孔及2个TNFα+ASA与TGZ处理孔作为对照。筛选的目的旨在鉴别出导致7个基因GES表达与胰岛素再敏化细胞中观察的表达水平极其相似的化合物，即可能表明这些细胞已经恢复了胰岛素敏感性。在RNA提取和cDNA合成以后，应用MassARRAY(Sequenom，San Diego，CA)对7个基因GES进行基因表达分析[Cullinan and CantorPharmacogenomics 9：1211-1215，2008]。数据通过Z值剩余系数相关法(Z-scoreresidual coefficient correlation，Zrcc)分析；Z值在样本-样本变化以及每个基因对GES的预测能力的相对贡献中是正常的。根据化合物的Z值将其由高到低排列，且作为概念确认检验的最初证据，对30个高排名化合物及23个随机抽取的中等排名化合物进行2-DOG摄取试验来测定它们的潜在胰岛素敏感化影响。在次极限量胰岛素(0.5nM，持续15min)存在或匮乏的条件下进行2-DOG摄取试验之前，3T3-L1脂肪细胞与25μM的各种化合物共同培养。结果是，与中等程度组的13％和30％相比(p＜0.03)，前30名化合物的葡萄糖摄入量显著提高(在0和0.5nM胰岛素条件下)，分别为50％和63％(表4)。在10μM剂量条件下，与中等程度化合物相比，前30名中的大部分化合物也增加葡萄糖的转运(在0和0.5nM胰岛素条件下)，然而，未达到显著性(表4)。总的说来，这些数据说明GES分析丰富具有胰岛素敏感化属性的化合物。

依据GES排列的化合物随后按照已知的作用机理或常规结构特征广泛分组并被重新描述为平均Zrcc。只有包含10个或更多元素的化合物组才被深入考虑。因此，得分最高处理组，进而代表对胰岛素最敏感的细胞，是对照组细胞，其平均Zrcc值为1.76±0.37；(TNFα处理组，p＜0.0001；TNFα+ASA与TGZ共处理组，p＜0.002)。与TNFα处理组相比(p＜0.05)，前20名化合物组中的13个化合物(其中包括TNFα+ASA与TGZ共培养样品)显著提高平均Zrcc值。然而，只有糖皮质激素和β肾上腺素拮抗剂的分值明显低于TNFα组样品(p＜0.05)(图1)。

随后进行二次筛选，对按照与胰岛素再敏化TNFα+ASA与TGZ共处理样品最接近的方式排列的8个药物组进行检验，从而在次极限量0.5nM胰岛素存在的条件下测定其影响外源HA标记的GLUT4向浆膜易位的能力(Govers et al.Mol CellBiol 24：6456-6466，2004)。选自钠通道阻断剂、β-内酰胺、GABA拮抗剂、磺酰胺叶酸拮抗剂、脂氧合酶抑制剂、多巴胺拮抗剂、碳酸酐酶抑制剂(CAIs)和抗生素的成员以10μM的剂量培养20h，且对每组元素的总体影响进行评估和均化。除急性极限量200nM胰岛素组以外，只在CAIs组和钠通道阻断剂组的联合成员中发现在次极限量胰岛素之上HA-GLUT4易位显著提高(p＜0.03)(图2a)。对包含钠通道阻断剂的化合物进行深入调查发现：它们当中的许多会影响葡萄糖和脂肪代谢，包括奎宁酸(GES筛选中Zrcc值为1.673)、普鲁卡因(Zrcc＝0.312)和丙吡胺(Zrcc＝0.126)(Boden et al.Circulation 85：2039-2044，1992；Hope-Gill et al.Horm Metab Res 6：457-463，1974；Kojima et al.Chem Pharm Bull(Tokyo)51：1006-1008，2003；Taketa and Yamamoto Acta Med Okayama 34：289-292，1980)。因此，CAIs组成为后续分析的焦点主题，且发现每一个CAI成员(除了美托拉宗)与ASA和TGZ处理组一样，均在次极限量胰岛素以上提高HA-GLUT4的易位(图2b)。

CAIs中的选择物是否显示出任何体内胰岛素敏化影响已有相关研究。饮食诱导性肥胖(DIO)小鼠经每一种CAI以50mg/kg/天的剂量处理14天。CAIs中的2-氨基苯磺酰胺(2ABS)、氯噻酮(CTD)、呋塞米(FUR)和二氯非那胺(DCP)不影响DIO小鼠的葡萄糖处理(disposal)(图3a)。另一方面，与对照组动物相比(p＜0.03)，醋甲唑胺(MTZ)引起葡萄糖曲线(AUC)下增量面积下降27％。当DIO大鼠经醋甲唑胺的N-甲基化衍生物(MMTZ)处理时，未观察到上述表现型(图3a)。这些衍生物中用来抑制CA的一个氨基氢原子被甲基取代以防止与CA结合(Relman et al.J Clin Invest 39：1551-1559，1960)并且通常显示出100倍弱化的体内碳酸酐酶抑制作用。在考察MTZ对循环血糖水平的影响时，与对照组小鼠相比，其体重、食物和水的摄入量或附睾脂肪量没有明显改变。此外，MYZ组和对照组间小鼠的24h排尿与肌酸分泌状况未见明显差异，表明上述动物体内观察到的葡萄糖代谢差异不应归于MTZ的利尿作用。经2ABS、CTD、FUR或DCP处理的DIO小鼠附加试验中对葡萄糖耐受性(浓度范围在20-100mg/kg/天，并给药14天)未发现明显影响。与对照组小鼠(图3b中的上图)相比，当浓度超过20mg/kg时，MTZ处理会导致循环血糖水平显著降低。降血糖作用伴随着血浆胰岛素水平的剂量依赖性下降(图3b中的下图)。

然后测定MTZ在II型糖尿病动物模型化db/db小鼠体内的安全性。以20或50mg/kg/天的剂量用MTZ处理小鼠14天，小鼠空腹血糖水平显示出剂量依赖性下降(p＜0.05；图3c)。施用MTZ 3天后可观察到上述影响且7天后达到峰值。对照组及20mg/kg MTZ处理组动物未观察到体重、食物或水摄入量的变化。然而，经过50mg/kg MTZ处理7天后，观察其体重减轻4％(对照组和MTZ处理组分别为38.6±1.0g和37.0±1.0g；p＜0.001)并且食物摄入量减少27％(对照组和MTZ处理组分别为6.3±0.3g/天和4.8±0.5g/天；p＜0.01)。为了研究MTZ导致的血糖下降是否归因于食物摄入量减少和体重减轻，对成对饲养的对照组和MTZ处理组db/db小鼠进行8天的血糖变化监测。结果是对照组小鼠体重减轻了8％(第0天为41.7±2.7g，第8天为38.3±3.2g，n＝6/组；p＜0.001)。然而在处理周期结束后，只有MTZ处理组动物的空腹血糖呈现明显下降(成对饲养的对照组为0.6±1.9mM，MTZ处理组为6.2±1.5mM；p＜0.02)。上述结果表明：MTZ的降血糖作用不应归于食物摄入量的减少或体重的减轻。此外，MTZ在db/db小鼠体内的抗糖尿病作用不应归于排尿引起的葡萄糖损失的增加。将MTZ(50mg/kg/天)处理14天的小鼠放置在代谢笼中24h。与对照组相比(p＜0.03)，MTZ处理组的尿液中葡萄糖浓度显著降低了18％。然而总尿中的葡萄糖排泄、尿量和水摄入量未见明显差异。随后检测MTZ处理对db/db小鼠体内HbA1c水平的影响。发现MTZ处理会导致HbA1c水平降低高达23％(p＜0.003)(图3d)。还研究MTZ与其它已知的胰岛素敏化治疗药物的联合影响。与对照组动物相比(p＜0.05)，300mg/kg二甲双胍或20mg/kg MTZ处理的db/db小鼠的血糖水平8天后均显示出显著的更低变化(图3e)。与单独施用二甲双胍相比，联合施用二甲双胍和MTZ会产生进一步降低血糖的效果(p＜0.02)。

实施例2：使用基于TNFα的GES表征体内胰岛素耐受群体

测定基于TNFα的GES产生的体内和体外生物学相关性。使用整体人源基因表达数据集来评价GES是否能够描述人类胰岛素耐受性表现型。该研究作为圣安东尼奥家族心脏研究(San Antonio Family Heart Study)(Blangero Nat Genetics2007)的一部分已在淋巴细胞上开始施行，并且使用Illumina公司珠基技术(bead-based technology)为来自42个大家族血统的1,240个个体绘制了47,289次转录表达的图谱。在这一群体中，糖尿病的发病频率为15.4％。受试者的特点如下(平均值±标准误)：年龄39.3±16.7岁，体重指数(BMI)29.3±6.6kg/m²，空腹血糖100.6±43.8mg/dl，空腹胰岛素16.2±19.1。

该数据集还包括人体测量值(如体重指数和其他身体组成指标)、胰岛素敏感性指标(口服葡萄糖耐受性测试)和标准血液化学参数(包括血浆中葡萄糖、胰岛素、脂类和细胞因子的水平)。使用该数据集，检测到人类表达研究数据集中3T3-L1脂肪细胞鉴定出7-基因GES，并且基于改变方向的考虑计算出GES的合计值，该合计值包括所述7个基因中每个标准化表达单元绝对值的总和。经基于胰岛素和葡萄糖的胰岛素耐受性自稳态模型评估(homeostasis model of assessment forinsulin resistance based on insulin and glucose，Homa-IR)发现，具有高GES值的受试者可测得较高水平的胰岛素耐受性(Spearmans rho 0.138；p＝0.0000012)。年龄和性别影响正常化以后，受试者最高和最低四分位(每个四分位的n＞400)之间可观察到基于GES值的空腹血浆胰岛素(p＝0.0004)、体重指数(p＝0.00000044)、甘油三酯水平(p＝0.001)和Homa-IR(p＝0.00081；表5)的显著统计学差异。这些观察结果与用于描述本研究群体中大多数胰岛素耐受性亚组特征的GES一致。

表1

3T3-L1脂肪细胞中TNFα诱导胰岛素耐受性的逆转

3T3-L1脂肪细胞经对照(Veh)、3ng/ml TNFα(TNF)或经如前细述的3ng/mlTNFα+10μM TGZ/5mM ASA(TTA)处理。然后细胞经胰岛素(0或10nM)处理30分钟，紧接着，在胰岛素刺激的最后10分钟内测定2-脱氧葡萄糖(2-DOG)的摄入情况。数据表示与对照处理的胰岛素刺激细胞相比2-DOG摄取的变化百分数，并且代表至少3个独立实验的平均值±标准误，且每个数据点平行测定3份后分析。基础水平以上的对照处理的胰岛素刺激脂肪细胞在2-DOG摄取方面的倍数增长为6.6±0.6(与单独对照组相比，p＝1.77×10^-7)。对照处理的脂肪细胞中2-DOG转运量为20.5±3.4pmol/min/孔。采用假设双尾分布和双样本等方差的t-检验方法进行统计分析。

表2

包含基于TNFα的GES的7个基因的鉴别

缩略语：ACS1，乙酰辅酶A合成酶长链家族成员1/FACL2，脂肪酸辅酶A连接酶，长链2；STEAP4，前列腺六次跨膜上皮抗原/TIARP，TNFα诱导脂肪相关蛋白/STAMP2，前列腺六次跨膜蛋白2；Skp1a，S期激酶相关蛋白1A；Pkm2，M2型丙酮酸激酶；CD63，CD63抗原/黑素瘤相关抗原MLA1/黑素瘤相关抗原ME491/Granulophysincs；CS，枸橼酸合成酶以及CLU，凝聚素/阿朴脂蛋白J/鼠硫酸化糖蛋白-2(MSGP-2)。

表3

基于TNFα的GES表达研究

对照处理(Veh)、TNFα处理(TNF)和TNFα+TGZ/ASA共处理(TTA)3T3-L1脂肪细胞中7个基因GES的微阵列表达研究(a)和实时PCR分析(b)。7个基因是乙酰辅酶A合成酶1(ACS1)、前列腺六次跨膜上皮抗原4(STEAP4)、S期激酶相关蛋白1A(Skp1a)、M2型丙酮酸激酶(PKM2)、CD63抗原(CD63)、枸橼酸合成酶(CS)和凝聚素(CLU)。基因表达值校正至对照处理值(设定为‘1’)。数据以平均值±标准误的形式表示；每个样品的n＝20(a)或n＝5(b)。对照处理组^*p＜0.05，TNFα处理样品^p＜0.05。采用假设双尾分布和双样本等方差的t-检验方法进行统计分析。

表4

通过基于TNFα的GES排列化合物家族

表5

基于TNFα的7-基因GES的定量特征相关性

^**表示相关显著性在0.01水平上(双尾)；^*表示在0.05水平上(双尾)。

因此，GES明显地鉴别出具有较高的胰岛素水平的肥胖个体，根据Homa-IR指数(由胰岛素驱动)，其胰岛素耐受性会增强。参照年龄制定的GES值标准化降低了联系的强度，但是除总体脂量以外的所有情况均保持显著不同。

实施例3：比较TNFα7-基因GES和单一基因GES

与单一基因候选物相比，本实施例强调7-基因GES在筛选具有胰岛素敏化性质化合物(而不是影响体外和体内胰岛素活性的已知化合物)过程中的安全性。7个基因是PKM2、Skp1a、CD63、STEAP4、ACS1(FACL2)、CS和CLU。用于比较目的的单一基因选自ACS1(FACL2)、CD63、PKM2和Skp1a。

基于TNFα的7-基因GES能够明显地表征具有正Zrcc值(0.5±0.2)的胰岛素再敏化(TTA)脂肪细胞，以区别具有负Zrcc值(-0.6±0.1)的胰岛素耐受性(TNF)脂肪细胞(p＝2.9x10^-7)(表6)。表6中的数据说明是否只对ACS1(FACL2)、CD63、PKM2或Skp1a进行筛选，这种单一基因筛选不会将胰岛素再敏化细胞(TTA)从胰岛素耐受性细胞(TNF)中区分开。在单一CD63筛选中，TTA组结果为负值，TNF组结果为正值(p＝0.02)。作为筛选的内部对照，3T3-L1脂肪细胞在TNFα培养过程(72h)的最后24h经对照(0.2％w/v DMSO)处理72h(n＝55)，3ng/ml TNFα处理72h(TNF)(n＝57)，或经3ng/ml TNFα+10μM TGZ/5mMASA处理(TTA)(n＝29)。使用MassARRAY系统(Cullinan and Cantor，2008 supra)进行GES的基因表达分析。在总体表达水平调整后，通过数据计算并结合源自贝叶斯预测模型(Zrcc)的相关系数，得到残余部分的Z值。由此产生的度量标准是Z值，其被样本-样本变化以及每个基因对GES预测能力的相对贡献规范化。数据以平均Zrcc值±标准误的形式表示(p值与TNFα处理的样品相比)。通过假设双尾分布和双样本等方差使用t-检验进行统计分析。

表6

通过7-基因与单一基因TNFα的GES在胰岛素再敏化细胞(TTA)和胰岛素耐受性细胞(TNF)中的排列

使用已知的胰岛素敏化剂，如单胺氧化酶抑制剂呋喃唑酮(FUR)、非甾体抗炎药5-氨基水杨酸(MES)和磷柳酸(FOS)以及雌激素(EST)，在所有Zrcc值为正数的化合物GES筛选过程中建立动态范围和置信区间。相反，已知的诱发胰岛素耐受性的化合物，如葡萄糖摄取抑制剂阿马林(AJM)和糖皮质激素皮质酮(COR)，进一步确证Zrcc值为负值的筛选。在这些筛选确证参数中，任何Zrcc值为正且范围与TTC相似的化合物均被当做潜在的胰岛素敏化化合物并进入二次筛选。使用这些参数可以鉴定VVP808作为具有胰岛素敏化活性的化合物(表7)。单一CS或单一STEAP4筛选项会将TTA处理细胞从TNF处理细胞中区分开来，然而，狭窄的动态范围不足以区分类TTA化合物和类TNF化合物(CS项：TTA组0.1±0.1，TNF组-0.05±0.03，p＝0.001；STEAP4项：TTA组0.2±0.05，TNF组-0.02±0.05，p＝0.005)。见表7。由于呋喃唑酮组和磷柳酸组或5-氨基水杨酸组和阿马林组的打分出现假阴性或假阳性现象，单一CS或单一STEAP4筛选项无法获得确证参数。单一CLU筛选项会将TTA处理细胞和TNF处理细胞区分开(TTA组0.3±0.1；TNF组0.3±0.1，p＝2.9x10^-7)。然而，仅使用CLU筛选化合物库也不会选出作为潜在胰岛素敏化剂的VVP808(假阴性)。

在该实验中，3T3-L1脂肪细胞与TNFα一起培养72h，随后在TNFα处理过程的最后24h内向其中加入每种各10μM的化合物(n＝2)。上述化合物包括VVP808，已发表的胰岛素敏化剂呋喃唑酮(FUR)(单胺氧化酶抑制剂)、5-氨基水杨酸(MES)和磷柳酸(FOS)(非甾体抗炎药)以及17-β-雌二醇(EST)，还有已知的引发胰岛素耐受性的化合物如阿马林(AJM)(葡萄糖摄入抑制剂)和皮质酮(COR)(糖皮质激素)。作为筛选的内部对照，3T3-L1脂肪细胞在TNFα培养过程(72h)的最后24h经对照(0.2％w/v DMSO)处理72h(n＝55)，3ng/ml TNFα处理72h(TNF)(n＝57)，或经3ng/ml TNFα+10μM TGZ/5nM ASA处理(TTA)(n＝29)。GES的基因表达分析和Z值计算如前细述。数据以平均Zrcc值±标准误的形式表示。结果参见表7。

表7

通过7-基因对比单一基因基于TNFα的GES的VVP808和已知的胰岛素敏化或耐受性诱导化合物的排列

实施例4：II型糖尿病治疗最优化

GES用来对糖尿病患者进行分类，以便使用经相同或相似GES鉴别的化合物来优化他们的治疗方案。该方法由例2(表5)中的数据支持，说明GES能够用来鉴别肥胖和胰岛素耐受性渐增的患者亚组。使用相同的GES鉴别的药物进行治疗应该可以使患者从中受益。

对GES超过一个疗程的治疗监测可以导致特征改变(例如由于脂肪酸或糖皮质激素的影响逆转而造成的改变)，而且患者体内这些不同的GES可以被测量。然后根据最代表他们的GES来优化治疗。

本领域的技术人员会理解除了那些特别描述以外，允许对此处所述的本发明进行变动和修改。可以了解本发明包括所有这些变动和修改。本发明还包括本说明书中单独地或共同地提及或说明的所有步骤、功能、组成和化合物以及任何两个或更多所述步骤或功能所组成的任何及所有组合。

参考文献

Alizadeh et al.Nature 403：503-511，2000

Altschul et al.Nucl Acids Res 25：3389，1997.

Arany et al.Proc Natl Acad Sci USA 105：4721-4726，2008

Ausubel et al.(“Current Protocols in Molecular Biology”John Wiley & Sons Inc，Chapter 15，1994-1998

Blangero et al.Hum Biol 77：541-559，2005

Blangero Nat Genetics 2007

Boden et al.Circulation 85：2039-2044，1992

Bonner and Laskey，Eur J Biochem 46：83，1974

Cooper et al.Nat Clin Pract Urol 4：677-687，2007

Cullinan and Cantor Pharmacogenomics 9：1211-1215，2008

Gao et al.J Biol Chem 278：24944-24950，2003

Govers et al.Mol Cell Biol 24：6456-6466，2004

Hope-Gill et al.Horm Metab Res 6：457-463，1974

Hotamisligil，Nature 444：860-867，2006

Knapp，R.G.，and Miller，M.C.(1992).Clinical Epidemiology and Biostatistics.

William and Wilkins，Harual Publishing Co.Malvern，Pa.

Kojima et al.Chem Pharm Bull (Tokyo)51：1006-1008，2003

Marmur and Doty，J.Mol.Biol.5：109，1962

Miles et al.Diabetes 46：1678-1683，1997

Mlinar，et al.Clin Chim Acta 375：20-35，2007

Moldes et al.J Biol Chem 276：33938-33946，2001

Nuyten and van de Vijver Semin Radiat Oncol 18：105-114，2008

Ohsumi et al.Endocrinology 135：2279-2282，1994

Peraldi and Spiegelman J Clin Invest 100：1863-1869，1997

Qi and Pekala Proc Soc Exp Biol Med 223：128-135，2000

Relman et al.J Clin Invest 39：1551-1559，1960

Ruan and Lodish Cytokine Growth Factor Rev 14：447-455，2003

Sartipy and Loskutoff J Biol Chem 278：52298-52306，2003

Taketa and Yamamoto Acta Med Okayama 34：289-292，1980

Tang et al.Proc Natl Acad Sci USA 103：2087-2092，2006

van de Vijver et al.N Engl J Med 347：1999-2009，2002

Weiner et al.J Biol Chem 266：23525-23528，1991

Yuan et al.Science 293：1673-1677，2001

Claims

1.一种用于说明II型糖尿病或其症状的基因表达特征(GES)或相应的蛋白组表达特征(PES)，所述GES或PES包含至少2个选自PKM2、Skp1a、CD63、STEAP4、ACS1(FACL2)、CS和CLU的基因或基因产品的表达水平。

2.根据权利要求1所述的GES或PES，其包含至少2至7个选自PKM2、Skp1a、CD63、STEAP4、ACS1(FACL2)、CS和CLU的基因或基因产品。

3.根据权利要求1所述的GES或PES，其包含至少3至7个选自PKM2、Skp1a、CD63、STEAP4、ACS1(FACL2)、CS和CLU的基因或基因产品。

4.根据权利要求1所述的GES或PES，其包含至少4至7个选自PKM2、Skp1a、CD63、STEAP4、ACS1(FACL2)、CS和CLU的基因或基因产品。

5.根据权利要求1所述的GES或PES，其包含至少5至7个选自PKM2、Skp1a、CD63、STEAP4、ACS1(FACL2)、CS和CLU的基因或基因产品。

6.根据权利要求1所述的GES或PES，其包含至少6或7个选自PKM2、Skp1a、CD63、STEAP4、ACS1(FACL2)、CS和CLU的基因或基因产品。

7.根据权利要求1所述的GES或PES，其包含PKM2、Skp1a、CD63、STEAP4、ACS1(FACL2)、CS和CLU的基因或基因产品。

8.根据权利要求1至7任一项所述的GES或PES，其中II型糖尿病是TNFα相关II型糖尿病。

9.根据权利要求1至8任一项所述的GES或PES，其中胰岛素敏感性状态用相对于对照组的PKM2、Skp1a、CD63、STEAP4和CLU的表达降低来表示。

10.根据权利要求1至9任一项所述的GES或PES，其中胰岛素敏感性状态用相对于对照组的ACS1(FACL2)和CS的表达提高来表示。

11.一种受试者体内II型糖尿病、其发病倾向或其相关并发症的诊断或预后方法，所述方法包含(a)从受试者中获取生物样品；(b)检测生物样品中基于2个或更多PKM2、Skp1a、CD63、STEAP4、ACS1、CS和/或CLU的GES或相应的PES；(c)比较生物样品中的GES和统计学确证的阈值，其中GES或相应的PES有益于胰岛素敏感性或耐受性。

12.根据权利要求11所述的方法，其中GES或相应地PES包含至少2至7个选自PKM2、Skp1a、CD63、STEAP4、ACS1(FACL2)、CS和CLU的基因或基因产品。

13.根据权利要求11所述的方法，其中GES或相应地PES包含至少3至7个选自PKM2、Skp1a、CD63、STEAP4、ACS1(FACL2)、CS和CLU的基因或基因产品。

14.根据权利要求11所述的方法，其中GES或相应地PES包含至少4至7个选自PKM2、Skp1a、CD63、STEAP4、ACS1(FACL2)、CS和CLU的基因或基因产品。

15.根据权利要求11所述的方法，其中GES或相应地PES包含至少5至7个选自PKM2、Skp1a、CD63、STEAP4、ACS1(FACL2)、CS和CLU的基因或基因产品。

16.根据权利要求11所述的方法，其中GES或相应地PES包含至少6或7个选自PKM2、Skp1a、CD63、STEAP4、ACS1(FACL2)、CS和CLU的基因或基因产品。

17.根据权利要求11所述的方法，其中的GES或相应地PES包含PKM2、Skp1a、CD63、STEAP4、ACS1(FACL2)、CS和CLU的基因或基因产品。

18.根据权利要求11至17任一项所述的方法，其中的II型糖尿病是TNFα相关II型糖尿病。

19.根据权利要求11至18任一项所述的方法，其中胰岛素敏感性状态用相对于对照组的PKM2、Skp1a、CD63、STEAP4和CLU的表达降低来表示。

20.根据权利要求11至19任一项所述的方法，其中胰岛素敏感性状态用相对于对照组的ACS1(FACL2)和CS的表达提高来表示。

21.一种鉴别降低细胞中胰岛素耐受性水平的化合物的方法，所述方法包含接触具有有益于胰岛素耐受性(第一知识库)的第一GES或相应的PES的胰岛素耐受性细胞，然后筛选有益于胰岛素敏感性(第二知识库)的第二GES或相应的PES的化合物，其中能够促进第二GES发展的化合物被选作所需化合物。

22.根据权利要求21所述的方法，其中GES或相应的PES包含至少2至7个选自PKM2、Skp1a、CD63、STEAP4、ACS1(FACL2)、CS和CLU的基因或基因产品。

23.根据权利要求21所述的方法，其中GES或相应地PES包含至少3至7个选自PKM2、Skp1a、CD63、STEAP4、ACS1(FACL2)、CS和CLU的基因或基因产品。

24.根据权利要求21所述的方法，其中GES或相应地PES包含至少4至7个选自PKM2、Skp1a、CD63、STEAP4、ACS1(FACL2)、CS和CLU的基因或基因产品。

25.根据权利要求21所述的方法，其中GES或相应地PES包含至少5至7个选自PKM2、Skp1a、CD63、STEAP4、ACS1(FACL2)、CS和CLU的基因或基因产品。

26.根据权利要求21所述的方法，其中GES或相应地PES包含至少6或7个选自PKM2、Skp1a、CD63、STEAP4、ACS1(FACL2)、CS和CLU的基因或基因产品。

27.根据权利要求21所述的方法，其中GES或相应地PES包含PKM2、Skp1a、CD63、STEAP4、ACS1(FACL2)、CS和CLU的基因或基因产品。

28.根据权利要求21至27任一项所述的方法，其中胰岛素耐受性与II型糖尿病相关。

29.根据权利要求28所述的方法，其中II型糖尿病是TNFα相关II型糖尿病。

30.根据权利要求21至29任一项所述的方法，其中胰岛素敏感性状态用相对于对照组的PKM2、Skp1a、CD63、STEAP4和CLU的表达降低来表示。

31.根据权利要求21至30任一项所述的方法，其中的胰岛素敏感性状态用相对于对照组的ACS1(FACL2)和CS的表达提高来表示。

32.根据权利要求1至10任一项所述的GES或PES在制备用于治疗II型糖尿病的药物中的用途。

33.根据权利要求1至10任一项所述的GES或PES在制备II型糖尿病诊断试剂中的用途。

34.根据权利要求1至10任一项所述的GES或PES在制备用于降低细胞中胰岛素耐受性或提高细胞中胰岛素敏感性的化合物中的用途。

35.一种使受试者分组以便在治疗II型糖尿病时简化治疗干预的方法，所述方法包含检测受试者的选自PKM2、Skp1a1、CD63、ACS1(FACL2)、CS和CLU中的至少两种基因的表达水平的GES或相应的PES以及使用用于使受试者分组的GES或PES相同或大体相似的GES或相应的PES来选择认作糖尿病症状逆转剂的药物。

36.一种治疗具有II型糖尿病或其症状的受试者的方法，所述方法包含检测受试者的选自PKM2、Skp1a1、CD63、ACS1(FACL2)、CS和CLU中的至少两种基因的表达水平的GES或相应的PES以及使用对上述受试者检测到的GES或PES相同或大体相似的GES或相应的PES施用认作糖尿病症状逆转剂的药物。

37.一种治疗具有II型糖尿病或其症状的受试者的方法，所述方法包含检测受试者的选自PKM2、Skp1a1、CD63、ACS1(FACL2)、CS和CLU中的至少两种基因的表达水平的GES或相应的PES以及使用对上述受试者检测到的GES或PES相同或大体相似的GES或相应的PES施用认作糖尿病症状逆转剂的药物并且在一定时间内监控GES或相应的PES药物并调节药物以使药物具有与最终检测到的受试者GES或PES相同或大体相似的GES或相应的PES。

38.根据权利要求35或36或37所述的方法，其中GES或相应的PES包含至少2至7个选自PKM2、Skp1a、CD63、STEAP4、ACS1(FACL2)、CS和CLU的基因或基因产品。

39.根据权利要求35或36或37所述的方法，其中GES或相应的PES包含至少3至7个选自PKM2、Skp1a、CD63、STEAP4、ACS1(FACL2)、CS和CLU的基因或基因产品。

40.根据权利要求35或36或37所述的方法，其中GES或相应的PES包含至少4至7个选自PKM2、Skp1a、CD63、STEAP4、ACS1(FACL2)、CS和CLU的基因或基因产品。

41.根据权利要求35或36或37所述的方法，其中GES或相应的PES包含至少5至7个选自PKM2、Skp1a、CD63、STEAP4、ACS1(FACL2)、CS和CLU的基因或基因产品。

42.根据权利要求35或36或37所述的方法，其中GES或相应的PES包含至少6或7个选自PKM2、Skp1a、CD63、STEAP4、ACS1(FACL2)、CS和CLU的基因或基因产品。

43.根据权利要求35或36或37所述的方法，其中GES或相应的PES包含PKM2、Skp1a、CD63、STEAP4、ACS1(FACL2)、CS和CLU的基因或基因产品。

44.根据权利要求35至43任一项所述的方法，其中II型糖尿病是TNFα相关II型糖尿病。

45.根据权利要求35至44任一项所述的方法，用于对受试者的II型糖尿病实施最优化治疗。