PL237595B1

PL237595B1 - Sposób oznaczania wrażliwości tkanek na insulinę oraz sposób identyfikacji insulinooporności i/lub określania predyspozycji do zaburzenia z nią związanego

Info

Publication number: PL237595B1
Application number: PL422387A
Authority: PL
Inventors: Marek STRĄCZKOWSKI; Marek Strączkowski; Monika Karczewska-Kupczewska; Monika Karczewskakupczewska; Marta KOBLOWSKA; Marta Koblowska; Roksana IWANICKA-NOWICKA; Roksana Iwanicka-Nowicka; Anna FOGTMAN; Anna Fogtman
Original assignee: Univ Medyczny W Bialymstoku
Priority date: 2017-07-28
Filing date: 2017-07-28
Publication date: 2021-05-04
Also published as: WO2019022627A1; EP3658690B1; EP3658690A1; PL422387A1; EP3658690C0; WO2019022627A4

Abstract

Przedmiotem niniejszego zgłoszenia jest sposób oznaczania wrażliwości tkanek na insulinę u osoby, polegający na tym, że z próbki krwi pełnej pobranej od osoby izoluje się RNA i mierzy się ekspresję następujących genów: KLF9, PEMT i EGR1; i na podstawie uzyskanych wyników pomiarów oznacza się wskaźnik insulinowrażliwości. Przedmiotem niniejszego zgłoszenia jest również sposób identyfikacji insulinooporności i/lub określania predyspozycji do zaburzenia związanego z insulinoopornością u osoby, polegający na tym, że z próbki krwi pełnej pobranej od osoby izoluje się RNA i mierzy się ekspresję następujących genów: KLF9, PEMT i EGR1; na podstawie uzyskanych wyników pomiarów oznacza się wskaźnik insulinowrażliwości, i na podstawie uzyskanego wyniku wskaźnika insulinowrażliwości identyfikuje się insulinooporność i określa predyspozycję do zaburzenia związanego z insulinoopornością. Przedmiotem niniejszego zgłoszenia jest również wskaźnik insulinowrażliwości do zastosowania jako biomarker diagnostyczny, do zastosowania jako biomarker insulinooporności, do zastosowania jako biomarker prognostyczny zaburzenia związanego z insulinoopornością oraz do zastosowania do określania predyspozycji do zaburzenia związanego z insulinoopornością. Przedmiotem zgłoszenia jest także zastosowanie takiego wskaźnika insulinowrażliwości do monitorowania wrażliwości tkanek na insulinę, zwłaszcza w przebiegu zaburzenia i/lub choroby związanej z insulinoopornością, zwłaszcza cukrzycy typu 2. Ponadto przedmiotem niniejszego wynalazku są zestawy diagnostyczne do realizacji takich sposobów oraz ich zastosowanie do prognozowania, diagnozowania, w tym do wczesnego diagnozowania, i/lub monitorowania terapii zaburzenia związanego z insulinoopornością.

Description

Opis wynalazku

Dziedzina wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest sposób oznaczania in vitro wrażliwości tkanek na insulinę u ludzi przy wykorzystaniu pomiaru ekspresji wybranych genów we krwi pełnej z zastosowaniem wskaźnika insulinowrażliwości. Przedmiotem wynalazku jest także sposób identyfikowania insulinooporności i/lub określania predyspozycji do zaburzenia związanego z insulinoopornością z zastosowaniem wskaźnika insulinowrażliwości.

Stan techniki

Zmniejszona odpowiedź organizmu na insulinę, czyli insulinooporność, jest najważniejszym czynnikiem w patogenezie cukrzycy typu 2. Insulinooporność wiąże się również z predyspozycją do dyslipidemii, nadciśnienia tętniczego, miażdżycy, choroby niedokrwiennej serca, chorób neurodegeneracyjnych i wielu innych schorzeń. Chociaż znany jest związek insulinooporności z otyłością, zmniejszona wrażliwość na inulinę może także występować u ludzi z prawidłową masą ciała. Zmniejszoną wrażliwość tkanek na insulinę w przypadku wielu chorób i zaburzeń u ludzi opisano w piśmiennictwie (patrz, przykładowo, Reaven GM. Banting lecture 1988. “Role of insulin resistance in human disease”, Diabetes 1988, 37: 1595-1607). Insulinooporność i związana z nią przewlekła reakcja zapalna odgrywa rolę np. w patogenezie miażdżycy i chorób układu sercowo-naczyniowego (patrz, przykładowo, Fernandez-Real JM, Ricart W. “Insulin resistance and chronic cardiovascular inflammatory syndrome”, Endocr Rev 2003, 24: 278-301; i w publikacji Nigro J, Osman N, Dart AM, Little PJ. Insulin resistance and atherosclerosis. Endocr Rev 2006, 27: 242-259). Opisano także rolę zmniejszonej wrażliwości na insulinę w procesie starzenia mózgu i zaburzeniach funkcji poznawczych (patrz, przykładowo, Roriz-Filho J, Sa-Roriz TM, Rosset I, Camozzato AL, Santos AC, Chaves ML, Moriguti JC, Roriz-Cruz M. (Pre)diabetes, brain aging, and cognition. Biochim Biophys Acta 2009, 1792: 432-443).

Wczesne rozpoznanie insulinooporności może mieć zatem istotne znaczenie dla włączenia działań profilaktycznych w celu zapobiegania związanym z nią chorobom i zaburzeniom. Metody oceny wrażliwości tkanek na insulinę są znane. Dostępne są artykuły przeglądowe dotyczące sposobów pomiaru wrażliwości tkanek na insulinę.

Obecnie „złoty standard” wśród metod oceny wrażliwości tkanek na insulinę in vivo stanowi technika klamry hiperinsulinemicznej normoglikemicznej, która została wprowadzona przez DeFronzo i wsp. Metoda ta została szczegółowo opisana w artykule DeFronzo RA, Tobin JD, Andres R. “Glucose clamp technique: a method for quantifying insulin secretion and resistance.”, Am J Physiol 1979, 237: E214E223. Od czasu opublikowania tego artykułu, technika klamry stała się szeroko stosowana w badaniach, w tym badaniach u ludzi, jednak jej wykorzystanie praktyczne ograniczone jest do badań naukowych prowadzonych w specjalistycznych ośrodkach. Badanie techniką klamry wymaga bowiem założenia dwóch podkłuć dożylnych, przynajmniej 2-godzinnego stałego wlewu insuliny i zmiennego, regulowanego wlewu glukozy oraz pobierania krwi co 5 minut. Wymaga to wykorzystania specjalistycznego sprzętu medycznego, zaangażowania wykwalifikowanego personelu medycznego, a także jest kłopotliwe i uciążliwe dla osoby poddawanej badaniu.

W dostępnym piśmiennictwie dotyczącym metod oceny wrażliwości tkanek na insulinę podkreślane są ograniczenia związane z badaniem techniką klamry, a także innych metod stosowanych do tego celu, takich jak test supresji insuliny wymagający 3-godzinnego wlewu glukozy, insuliny oraz somatostatyny lub jej analogu-oktreotydu (patrz, przykładowo, Muniyappa R, Madan R, Quon MJ. „Assessing insulin sensitivity and resistance in humans”, w: De Groot LJ, Chrousos G, Dungan K, Feingold KR, Grossman A, Hershman JM, Koch C, Korbonits M, McLachlan R, New M, Purnell J, Rebar R, Singer F, Vinik A, wyd. Endotext [Internet], South Dartmouth (MA): MDText.com, Inc.; 2000-. ; Antuna-Puente B, Disse E, Rabasa-Lhoret R, Laville M, Capeau J, Bastard JP. “How can we measure insulin sensitivity/resistance?”, Diabetes Metab 2011,37: 179-188; 9; Wallace TM, Matthews DR., “The assessment of insulin resistance in man.”, Diabet Med 2002, 19: 527-534; Ferrannini E, Mari A. “How to measure insulin sensitivity.” J Hypertens 1998, 16: 895-906). Opisane w piśmiennictwie ograniczenia obecnie dostępnych metod diagnostycznych związane są przede wszystkim z faktem, że są to badania czasoi pracochłonne, drogie, wymagające specjalistycznego sprzętu i wykwalifikowanego personelu. Dlatego ani technika klamry, ani test supresji insuliny nie są uznawane za mogące mieć zastosowanie w badaniach epidemiologicznych, dużych badaniach klinicznych oraz w codziennej praktyce lekarskiej.

Ponadto opisano inne badania dynamiczne do oceny wrażliwości tkanek na insulinę, takie jak np. dożylny test tolerancji glukozy z analizą modelu „Minimal Model”. Jednak wymaga on również wlewu

PL 237 595 B1 dożylnego i wielokrotnego pobierania krwi. Dodatkowo przy niemal takiej samej pracochłonności, nie jest on tak precyzyjny, jak technika klamry.

Wśród sposobów oznaczania wrażliwości tkanek na insulinę znane są wskaźniki oparte na doustnym teście tolerancji glukozy. Jest to 2-godzinny standardowy test obciążenia 75 g glukozy stosowany w praktyce klinicznej, w którym ocenia się tolerancję glukozy. Przykładowym wskaźnikiem wrażliwości tkanek na insulinę opracowanym na podstawie doustnego testu tolerancji glukozy jest wskaźnik Matsudy (Matsuda M. “Measuring and estimating insulin resistance in clinical research setting”. Nutr Metab Cardiovasc Dis 2010, 20: 79-86). Do wyliczenia tego wskaźnika potrzebne jest oznaczanie stężenia glukozy i insuliny we krwi w 0, 30, 60, 90, 120 minucie testu tolerancji glukozy, co jest dość czasochłonne i wymaga wielokrotnego pobierania krwi. Należy też podkreślić, że na tolerancję glukozy wpływa nie tylko wrażliwość tkanek na insulinę, ale także sekrecja insuliny, tempo wchłaniania glukozy, efekt inkretynowy, stopień supresji glukagonu i wiele innych czynników. Doustny test tolerancji glukozy cechuje się ponadto małą powtarzalnością (patrz, przykładowo, Ko GT, Chan JC, Woo J, Lau E, Yeung VT, Chow CC, Cockram CS. „The reproducibility and usefulness of the oral glucose tolerance test in screening for diabetes and other cardiovascular risk factors.” Ann Clin Biochem 1998; 35: 62-67; Libman IM, Barinas-Mitchell E, Bartucci A, Robertson R, Arslanian S. ‘‘Reproducibility of the Oral Glucose Tolerance Test in Overweight Children.” J Clin Endocrinol Metab 2008; 93: 4231-4237). Pomiar wrażliwości na insulinę na podstawie doustnego testu tolerancji glukozy nie znalazł zastosowania w populacji ogólnej, a także w badaniach diagnostycznych, epidemiologicznych, oraz w codziennej praktyce lekarskiej.

Opracowano także proste wskaźniki mające odzwierciedlać wrażliwość tkanek na insulinę, takie jak HOMA-IR (ang. Homeostasis Model Assessment - Insulin Resistance) czy QUICKI (ang. Quantitative Insulin Sensitivity Check Index), w których przeprowadza się pomiar stężeń glukozy i insuliny we krwi na czczo. Wskaźniki te mają również swoje ograniczenia, które wynikają m.in. z faktu, że odzwierciedlają one przede wszystkim wątrobową wrażliwość/oporność na insulinę, podczas gdy w rzeczywistości w predyspozycji/rozwoju zaburzenia związanego ze zmniejszoną wrażliwością tkanek na insulinę, takiego jak cukrzyca typu 2, najważniejszą rolę odgrywa obwodowa oporność na insulinę, za którą odpowiedzialne są przede wszystkim mięśnie szkieletowe (i która mierzona jest w badaniu techniką klamry). Należy też podkreślić, że insulina wydzielana jest pulsacyjnie, a stężenie glukozy we krwi regulowane jest nie tylko przez insulinę, ale też wiele innych hormonów, np. glukagon. Na indywidualne wahania insulinemii wpływa ponadto wiele innych czynników, np. stres czy aktywność fizyczna. Chociaż wskaźniki HOMA-IR i QUICKI ogólnie wykazują dobrą korelację z wynikami uzyskanymi techniką klamry, gdy uwzględnione są osoby ze znaczną insulinoopornością i/lub nietolerancją glukozy, związek ten staje się znacznie słabszy w populacji ogólnej. Z tych powodów wskaźniki HOMA-IR i QUICKI mają swoje ograniczenia w identyfikacji osób z insulinoopornością w populacji ogólnej (Ruige JB, Mertens IL, Bartholomeeusen E, Dirinck E, Ferrannini E, Van Gaal LF., „Fasting-based estimates of insulin sensitivity in overweight and obesity: a critical appraisal.”, Obesity 2006, 14: 1250-1256; Malita FM, Karelis AD, St-Pierre DH, Garrel D, Bastard JP, Tardif A, Prud’homme D, Rabasa-Lhoret R., „Surrogate indexes vs. euglycaemic-hyperinsulinemic clamp as an indicator of insulin resistance and cardiovascular risk factors in overweight and obese postmenopausal women.”, Diabetes Metab 2006, 32: 251-255).

Z uwagi na to, że testy dynamiczne są skomplikowane, czasochłonne i pracochłonne, mało powtarzalne, a wskaźniki oparte na oznaczeniu glukozy i insuliny we krwi na czczo są nadmiernie uproszczone, a także w mniejszym stopniu oceniają ogólnoustrojową insulinooporność, obecnie nie istnieje idealny, prosty wskaźnik oceniający wrażliwość tkanek na insulinę w badaniach klinicznych, populacyjnych, a także w codziennej praktyce lekarskiej.

Cel wynalazku

Celem niniejszego wynalazku jest dostarczenie prostych i wiarygodnych sposobów diagnostycznych, które odzwierciedlają wrażliwość tkanek na insulinę i pozwalają na identyfikację, wczesne diagnozowanie i/lub wykrywanie insulinooporności i predyspozycji do chorób związanych ze zmniejszoną wrażliwością tkanek na insulinę, czyli insulinoopornością, w populacji ogólnej, zapewniając jednocześnie powtarzalne wyniki z wysoką czułością i specyficznością. Celem niniejszego wynalazku jest zatem dostarczenie nowych, skutecznych narzędzi do oznaczania wrażliwości tkanek na insulinę, zapewniających powtarzalne wyniki z wysoką czułością i specyficznością, w sposób szybki, wiarygodny i ekonomicznie opłacalny, nadających się do rutynowego stosowania w populacji ogólnej, w badaniach epidemiologicznych, dużych badaniach klinicznych oraz w codziennej praktyce lekarskiej, w tym do oceny

PL 237 595 B1 wrażliwości tkanek na insulinę, identyfikacji insulinooporności i/lub określania predyspozycji do zaburzeń związanych z insulinoopornością, wczesnej diagnostyki chorób związanych z insulinoopornością, jak również monitorowania przebiegu leczenia i oceny klinicznej progresji takich zaburzeń. Celem niniejszego wynalazku jest także dostarczenie nowych, skutecznych narzędzi do oznaczania wrażliwości tkanek na insulinę i identyfikacji insulinooporności in vitro w sposób niekłopotliwy dla pacjenta, minimalizujący poczucie jego dyskomfortu i bólu związanych z długotrwałym badaniem, wielokrotnymi wkłuciami i wielokrotnym pobieraniem krwi. Cele te zostały zrealizowane poprzez wynalazek opisany tu poniżej i zdefiniowany w zastrzeżeniach patentowych.

Krótki opis wynalazku

Przedmiotem niniejszego wynalazku jest sposób oznaczania wrażliwości tkanek na insulinę u osoby, polegający na tym, że:

a) z próbki krwi pełnej pobranej od osoby izoluje się RNA i mierzy się ekspresję następujących genów: KLF9, PEMT i EGR1;

b) oznacza się wskaźnik insulinowrażliwości na podstawie uzyskanych wyników pomiarów z punktu a) za pomocą następującego równania:

Wskaźnik insulinowrażliwości = 7,2109 - log2 KLF9 x 1,8717 + log2 PEMT x 1,2903+ log2 EGR1 x 0,1145, w którym

KLF9 oznacza wartość pomiaru ekspresji genu KLF9,

PEMT oznacza wartość pomiaru ekspresji genu PEMT,

EGR1 oznacza wartość pomiaru ekspresji genu EGR1, przy czym uzyskanie wartości wskaźnika insulinowrażliwości wynoszącej 6,3 lub mniej wskazuje na obniżoną wrażliwość tkanek na insulinę, i przy czym niższa wartość odpowiada niższej wrażliwości tkanek na insulinę, a wyższa wartość wskazuje na wyższą wrażliwość tkanek na insulinę (również w zakresie poniżej i powyżej punktu odcięcia).

Przedmiotem niniejszego wynalazku jest ponadto sposób identyfikacji insulinooporności i/lub określania predyspozycji do zaburzenia związanego z insulinoopornością u osoby, polegający na tym, że

Wskaźnik insulinowrażliwości = 7,2109 - log2 KLF9 x 1,8717 + log2 PEMT x 1,2903 + log2 EGR1 x 0,1145, w którym

KLF9 oznacza wartość pomiaru ekspresji genu KLF9,

PEMT oznacza wartość pomiaru ekspresji genu PEMT,

EGR1 oznacza wartość pomiaru ekspresji genu EGR1;

c) identyfikuje się insulinooporność i/lub określa się predyspozycję do zaburzenia związanego z insulinoopornością przy uzyskaniu wartości wskaźnika insulinowrażliwości wynoszącej 6,3 lub mniej.

W sposobach według wynalazku korzystnie w etapie a) izoluje się RNA i ekspresję wskazanych genów mierzy się metodą odwrotnej transkrypcji i PCR w czasie rzeczywistym.

Korzystniej w sposobach według wynalazku w metodzie PCR w czasie rzeczywistym stosuje się następujące startery: dla genu KLF9 starter przedni o sekwencji nr 1 (5’-CTCCGAAAAGAGGCACAAGT) i starter wsteczny o sekwencji nr 2 (5’-CGGGAGAACTTTTTAAGGCAGT), dla genu PEMT starter przedni o sekwencji nr 3 (5’-GGCCTCGGCAATATTGATT) i starter wsteczny o sekwencji nr 4 (5’-GTCCACGTAGCCCAGCAG), dla genu EGR1 starter przedni o sekwencji nr 5 (5’-AGCACCTGACCGCAGAGT) i starter wsteczny o sekwencji nr 6 ( 5 ’- GGCAGTCGAGTGGTTTGG).

W powyższych sposobach według wynalazku korzystniej mierzy się także ekspresję mRNA genu referencyjnego, zwłaszcza GAPDH.

Jeszcze korzystniej w sposobach według wynalazku w metodzie PCR w czasie rzeczywistym stosuje się następujące startery dla genu referencyjnego GAPDH: starter przedni o sekwencji nr 7 (5’CTCTGCTCCTCCTGTTCGAC) i starter wsteczny o sekwencji nr 8 (5’-ACGACCAAATCCGTTGACTC).

Sposób identyfikacji insulinooporności i/lub określania predyspozycji do zaburzenia związanego z insulinoopornością według wynalazku korzystnie stosuje się do prognozowania, diagnozowania,

PL 237 595 B1 w tym do wczesnego diagnozowania, i/lub monitorowania terapii zaburzenia związanego z insulinoopornością.

Zaburzenia związane z insulinoopornością obejmują przykładowo: nadwagę, otyłość, nieprawidłową tolerancję glukozy, dyslipidemię, zespół metaboliczny, stłuszczenie wątroby, zespół policystycznych jajników, nadciśnienie tętnicze, miażdżycę, chorobę niedokrwienną serca, udar mózgu, choroby neurodegeneracyjne, w szczególności cukrzycę typu 2.

Zaburzenia związane z insulinoopornością mogą przykładowo wystąpić u osoby z prawidłową masą ciała, osoby z nadwagą, osoby z otyłością, osoby z podwyższoną glikemią na czczo, osoby z nieprawidłową tolerancją glukozy, osoby z cukrzycą typu 2, osobę z dyslipidemią, osoby z zespołem metabolicznym, osoby ze stłuszczeniem wątroby, kobietę z zespołem policystycznych jajników, osoby z nadciśnieniem tętniczym, osobę z miażdżycą, osoby z chorobą niedokrwienną serca, osoby po udarze mózgu, osoby z chorobą neurodegeneracyjną, kobiety, która przebyła cukrzycę ciężarnych lub urodziła dziecko o masie ciała powyżej 4 kg, i krewnego pierwszego stopnia osoby chorej na cukrzycę i/lub choroby sercowo-naczyniowe oraz osoby przed zabiegiem bariatrycznym i/lub po takim zabiegu.

Szczegółowy opis wynalazku

Twórcy niniejszego wynalazku opracowali nowy sposób oznaczania wrażliwości tkanek na insulinę in vitro przy wykorzystaniu pomiaru ekspresji wybranych genów w próbce pobranej jednorazowo od badanej osoby, takiej jak próbka krwi pełnej. Dokładniej sposób oznaczania wrażliwości tkanek na insulinę według wynalazku wymaga oznaczania ekspresji następujących genów: KLF9, PEMT i EGR1, w próbce krwi pobranej jednorazowo od pacjenta, korzystnie ekspresji mRNA wskazanych genów. Wymagane jest do tego celu zastosowanie standardowych metod, odczynników, zestawów i aparatów powszechnie znanych i stosowanych w dziedzinie procedur przygotowania materiału biologicznego, izolacji RNA oraz pomiaru ekspresji genów, w tym ekspresji mRNA. Wyniki powyższej opisanych pomiarów stosuje się do oznaczania wrażliwości tkanek na insulinę przy zastosowaniu wskaźnika insulinowrażliwości opracowanego przez twórców niniejszego wynalazku. Wynalazki według niniejszego zgłoszenia pozwalają również na identyfikację insulinooporności, a także określanie predyspozycji do rozwinięcia zaburzenia związanego z insulinoopornością u badanej osoby. Stwierdzenie podatności czy też występowania predyspozycji do takiego zaburzenia pozwala z kolei na wczesne podjęcie działań mających na celu zapobieganie rozwojowi takiego zaburzenia i w konsekwencji także chorób z tym związanych.

Rozwiązania według wynalazku pozwalają na dokładne oznaczanie wrażliwości tkanek na insulinę i/lub insulinooporności w sposób szybki, wiarygodny, powtarzalny i ekonomicznie opłacalny. Wyniki sposobu oznaczania wrażliwości tkanek na insulinę według wynalazku oraz sposobu identyfikacji insulinooporności i/lub określania predyspozycji do zaburzenia związanego z insulinoopornością są wiarygodne i powtarzalne również dzięki temu, że są niezależne od wahań insulinemii wywoływanych stresem czy aktywnością fizyczną. Rozwiązania według wynalazku znakomicie nadają się dzięki temu do stosowania w populacji ogólnej, do przeprowadzania badań epidemiologicznych, oceny predyspozycji do chorób związanych z insulinoopornością, wczesnej diagnostyki zaburzeń i/lub chorób związanych z insulinoopornością, jak również monitorowania progresji takich chorób i/lub przebiegu ich leczenia. Szczególnie nadają się one do stwierdzania insulinooporności oraz prognozowania, diagnozowania i/lub monitorowania zaburzenia związanego z insulinoopornością takiego jak nadwaga, otyłość, nieprawidłowa tolerancja glukozy, dyslipidemia, zespół metaboliczny, zespół policystycznych jajników, stłuszczenie wątroby, nadciśnienie tętnicze, miażdżyca, choroba niedokrwienna serca, udar mózgu, choroba neurodegeneracyjna, a w szczególności cukrzyca typu 2.

Wynalazki jak zdefiniowano w zastrzeżeniach patentowych nadają się do stosowania w populacji ogólnej, a zwłaszcza u następujących osób: osoby z prawidłową masą ciała, osoby z nadwagą, osoby z otyłością, osoby z podwyższoną glikemią na czczo, osoby z nieprawidłową tolerancją glukozy, osoby z cukrzycą typu 2, osoby z dyslipidemią, osoby z zespołem metabolicznym, osoby ze stłuszczeniem wątroby, kobiety z zespołem policystycznych jajników, osoby z nadciśnieniem tętniczym, osoby z miażdżycą, osoby z chorobą niedokrwienną serca, osoby po udarze mózgu, osobę z chorobą neurodegeneracyjną, kobiety, która przebyła cukrzycę ciężarnych lub urodziła dziecko o masie ciała powyżej 4 kg, i krewnego pierwszego stopnia osoby chorej na cukrzycę i/lub choroby sercowo-naczyniowe. Ponadto znajdują one zastosowanie u osób kwalifikowanych do zabiegu bariatrycznego, w przypadku których wrażliwość tkanek na insulinę czy też występowanie insulinooporności może być elementem decydującym przy doborze odpowiedniego zabiegu bariatrycznego, jak również u osób po takim zabiegu, u których oznaczenie wrażliwości tkanek na insulinę czy też występowanie insulinooporności może być ele

PL 237 595 B1 mentem decydującym przy doborze odpowiedniej dalszej terapii. Sposoby według wynalazku są niekłopotliwe i nieuciążliwe dla badanej osoby, minimalizują odczuwany przez nią ból i poczucie dyskomfortu związane z długotrwałym badaniem i wielokrotnymi wkłuciami wymaganymi w sposobach stosowanych do tej pory w dziedzinie niniejszego wynalazku.

Sposoby według wynalazku opracowano odnosząc wyniki oznaczania panelu standardowych badań laboratoryjnych oraz stężeń białek w surowicy do pomiaru wrażliwości tkanek na insulinę metodą klamry hiperinsulinemicznej normoglikemicznej, będącej złotym standardem w ocenie działania insuliny in vivo.

Do realizacji opisanych powyżej sposobów według wynalazku opracowano odpowiednie zestawy diagnostyczne zawierające środki do pomiaru ekspresji wskazanych powyżej genów.

Definicje

Stosowane w niniejszym opisie pojęcia naukowe i techniczne mają zwykłe znaczenie stosowane w dziedzinie, do której należy niniejszy wynalazek. Poniższe definicje dostarczone są celem ułatwienia czytelnikowi realizacji niniejszego wynalazku.

Pojęcie „wrażliwość na insulinę” dotyczy w kontekście niniejszego wynalazku zdolności do prawidłowej odpowiedzi na insulinę, co przejawia się przede wszystkim zwiększeniem wychwytu glukozy przez mięśnie szkieletowe, zahamowaniem lipolizy oraz wątrobowej produkcji glukozy. Wrażliwość na insulinę można mierzyć, np., metodą klamry hiperinsulinemicznej normoglikemicznej, (inaczej, w skrócie, techniką klamry), będącej obecnie „złotym standardem” w określaniu wrażliwości na insulinę. W technice tej wartość insulino-zależnego wychwytu glukozy (wartość M, określanej też tu dalej zmienną M) może być wyrażona w mg/kg beztłuszczowej masy ciała (Fat-Free Mass; FFM)/min.

Pojęcie „zmniejszona wrażliwość na insulinę” czyli inaczej „insulinooporność” oznacza w kontekście niniejszego wynalazku zmniejszoną odpowiedź organizmu na insulinę endo- lub egzogenną w zakresie metabolizmu węglowodanów, lipidów i białek. Według techniki klamry hiperinsulinemicznej normoglikemicznej, za insulinooporność przyjmuje się zwykle wartość poniżej 6 mg/kg FFM/min. W kontekście niniejszego wynalazku za insulinooporność przyjmuje się wartość określoną z zastosowaniem zdefiniowanego tu zgodnie z wynalazkiem współczynnika insulinowrażliwości wynoszącą 6,3 lub mniej. Ponadto należy zauważyć, że zgodnie z niniejszym wynalazkiem niższy wynik odpowiada niższej wrażliwości na insulinę (również w zakresie poniżej punktu odcięcia), a wyższy wynik odpowiada wyższej wrażliwości tkanek na insulinę (również w zakresie powyżej punktu odcięcia). Im niższa jest zatem wartość oznaczonego wskaźnika insulinowrażliwości, tym niższa jest wrażliwość tkanek na insulinę (również w zakresie punktu odcięcia), co wskazuje na występowanie u badanej osoby insulinooporności. Identyfikacja insulinooporności pozwala z kolei na stwierdzenie występowania u badanej osoby predyspozycji do rozwinięcia zaburzenia związanego z insulinoopornością. Natomiast wyższa uzyskana wartość wskaźnika insulinowrażliwości odpowiada wyższej wrażliwości tkanek na insulinę (również w zakresie powyżej punktu odcięcia).

Objawami insulinooporności są nieprawidłowo podwyższone stężenia insuliny i/lub glukozy we krwi. Insulinooporność predysponuje do rozwinięcia się szeregu nieprawidłowości czy też zaburzeń, w tym nieprawidłowej tolerancji glukozy, a następnie cukrzycy typu 2, aterogennej dyslipidemii, tj. hipertriglicerydemii, obniżonego stężenia cholesterolu frakcji lipoprotein o dużej gęstości (ang. high density lipoprotein, HDL) w krwi oraz obecności małych, gęstych cząsteczek lipoprotein o małej gęstości (ang. low density lipoprotein, LDL), hiperurykemii, obniżonej aktywności fibrynolitycznej osocza, nadciśnienia tętniczego, miażdżycy, chorób układu sercowo-naczyniowego (Reaven, G. M. Physiol Rev. 75(3): 47386, 1995) i chorób neurodegeneracyjnych (Roriz-Filho, J. i wsp. Biochim Biophys Acta. 1792: 432-43, 2009).

Pojęcie „zaburzenie związane z insulinoopornością” dotyczy w kontekście niniejszego wynalazku zaburzenia, w którym odpowiedź na działanie insuliny jest zmniejszona, innymi słowy wrażliwość na insulinę jest zmniejszona. Zaburzenia związane z insulinoopornością, czyli zmniejszoną wrażliwością na insulinę, obejmują m.in. nadwagę, otyłość, nieprawidłową tolerancję glukozy, dyslipidemię, stłuszczenie wątroby, zespół metaboliczny, zespół policystycznych jajników, choroby układu krążenia, w tym nadciśnienie tętnicze, miażdżycę, chorobę niedokrwienną serca, udar mózgu; choroby neurodegeneracyjne, niektóre nowotwory, a w szczególności cukrzycę typu 2.

Pojęcie „pomiar ekspresji genu” oznacza tutaj dowolny sposób pomiaru ekspresji genów w próbce biologicznej pobranej od osoby, takiej jak próbka krwi pełnej. W kontekście niniejszego wynalazku przez pomiar ekspresji genów rozumie się korzystnie pomiar ekspresji mRNA z wykorzystaniem metody odwrotnej transkrypcji i łańcuchowej reakcji polimerazy w czasie rzeczywistym (ang. Real-time PCR,

PL 237 595 B1 qPCR), zwanej inaczej ilościową PCR, ilościową PCR w czasie rzeczywistym, qPCR, RQ-PCR, RTQPCR. Nazwy te to synonimy, określające zmodyfikowaną łańcuchową reakcję polimerazy pozwalającą na monitoring przyrostu ilości produktu na bieżąco w czasie jej trwania, dzięki zastosowaniu dodatku związków fluorescencyjnych do mieszaniny reakcyjnej. Emisja fluorescencji związana jest z kinetyką przyrostu liczby cząsteczek DNA. Warunki przeprowadzania reakcji PCR w czasie rzeczywistym są znane. Jednak w celu pomiaru ekspresji genów można wykorzystać również inne metody, takie jak cyfrowy PCR (ang. digital PCR), NanoString oraz metody analiz wielkoskalowych: mikromacierzy i sekwencjonowania, takich jak sekwencjonowanie DNA (na przykład cDNA wygenerowane w reakcji odwrotnej transkrypcji RNA) i RNA. Sekwencjonowanie może być wykonane dowolną znaną metodą lub techniką. Takie metody sekwencjonowania obejmują: sekwencjonowanie nowej generacji (ang. Next Generation Sequencing), sekwencjonowanie wysokoprzepustowe, pirosekwencjonowanie, sekwencjonowanie przez ligację, sekwencjonowanie przez syntezę, sekwencjonowanie przez hybrydyzację, technikę RNA-seq, sekwencjonowanie pojedynczej cząsteczki przez syntezę (SMSS), sekwencjonowanie półprzewodnikowe, sekwencjonowanie na nanoporach, sekwencjonowanie pojedynczej cząsteczki w czasie rzeczywistym SMRT, masowe równoległe sekwencjonowanie.

W przypadku metod pomiarowych stosowanych do oznaczenia ekspresji genów o innej charakterystyce niż metoda PCR w czasie rzeczywistym, na przykład o innej czułości i/lub zakresie referencyjnym uzyskiwanych wartości pomiarowych, w stosunku do wyliczenia wskaźnika insulinowrażliwości zgodnie z niniejszym wynalazkiem, odpowiednia może być konieczna korekta obliczeń wskaźnika, uwzględniająca zakresy wartości pomiarów ekspresji w wykorzystywanej metodzie.

Pojęcie „starter” oznacza tutaj krótki odcinek sekwencji kwasu nukleinowego, który tworzy pary zasad z komplementarną matrycą i ma wolną grupę 3’-hydroksylową służącą jako punkt początku replikacji nici matrycowych. Synteza DNA może rozpocząć się z udziałem starterów w obecności czynnika polimerazowego, na przykład polimerazy DNA lub odwrotnej transkryptazy w odpowiednich warunkach roztworów buforowych i temperatury oraz w obecności czterech różnych trifosforanów nukleozydów. Te warunki, bufory i enzymy są znane i powszechnie stosowane przez specjalistów w tej dziedzinie. W wynalazku można stosować dowolne polimerazy DNA i odwrotne transkryptazy odpowiednie do zastosowania w reakcji odwrotnej transkrypcji i PCR. Konkretne warunki reakcji odwrotnej transkrypcji i PCR mogą dobrać specjaliści w tej dziedzinie w rutynowy sposób.

Gen KLF9 oznacza w kontekście niniejszego wynalazku gen kodujący białko - Kruppel-podobny czynnik 9 (ang. Kruppel-like factor 9) będące czynnikiem transkrypcyjnym z motywem palca cynkowego, wiążącym się z elementami kasety GC zlokalizowanej w regionie promotora. KLF9 reguluje wiele procesów komórkowych, np. różnicowanie komórek. Wykazuje też interakcję z receptorem progesteronowym. Poziom ekspresji tego genu, zwłaszcza mRNA, wykorzystywany jest do obliczania wskaźnika insulinowrażliwości opracowanego przez twórców niniejszego wynalazku, zdefiniowanego opisanym zgodnie z wynalazkiem równaniem.

Gen PEMT oznacza gen kodujący białko - N-metylotransferazę fosfatydyloetanolaminy, przekształcające fosfatydyloetanolaminę do fosfatydylocholiny. W badaniach doświadczalnych wykazano udział tego enzymu w rozwoju otyłości, stłuszczenia wątroby i chorób układu krążenia. Poziom ekspresji tego genu, zwłaszcza mRNA, wykorzystywany jest do obliczania wskaźnika insulinowrażliwości opracowanego przez twórców niniejszego wynalazku, zdefiniowanego opisanym zgodnie z wynalazkiem równaniem.

Gen EGR1 oznacza gen kodujący jądrowe białko odpowiedzi wczesnego wzrostu 1, pełniące funkcję regulatora transkrypcyjnego, produkty genów docelowych którego są wymagane do różnicowania i mitogenezy. Dane wskazują, że EGR1 funkcjonuje jako supresor nowotworów, reguluje także aktywność i plastyczność neuronów. Poziom ekspresji tego genu, zwłaszcza mRNA, wykorzystywany jest do obliczania wskaźnika insulinowrażliwości opracowanego przez twórców niniejszego wynalazku, zdefiniowanego opisanym zgodnie z wynalazkiem równaniem.

Gen referencyjny oznacza w kontekście niniejszego wynalazku wewnętrzny gen, który charakteryzuje się względnie stałą ekspresją w różnych warunkach eksperymentalnych i który stosowany jest jako kontrola wewnętrzna reakcji PCR. Do tego celu najczęściej stosowane są geny metabolizmu podstawowego, takie jak, nieograniczająco, gen GAPDH.

Gen GAPDH oznacza gen metabolizmu podstawowego kodujący białko metabolizmu podstawowego-dehydrogenazę aldehydu 3-fosfoglicerynowego. Enzym ten katalizuje reakcje procesu glikolizy przekształcenie aldehydu 3-fosfoglicerynowego w 1,3-bisfosfogIicerynian. W ten sposób odgrywa on

PL 237 595 B1 ważną rolę w uzyskiwaniu przez komórki energii z węglowodanów. Gen GAPDH stosowany jest powszechnie jako gen referencyjny lub kontrola wewnętrzna w ilościowym oznaczaniu ekspresji genów metodą łańcuchowej reakcji polimerazy (PCR) w czasie rzeczywistym.

Pojęcie „czułość” w odniesieniu do sposobu lub testu diagnostycznego oznacza stosunek wyników prawdziwie dodatnich do sumy prawdziwie dodatnich i fałszywie ujemnych uzyskanych w danym teście. Czułość ta określa zdolność testu do wykrywania osób chorych lub predysponowanych do rozwoju choroby.

Czułość definiowana jest następującym wzorem:

CZUŁOŚĆ = (PD / PD + FU) X 100, w którym PD oznacza wyniki prawdziwie dodatnie, a FU oznacza wyniki fałszywie ujemne.

W kontekście niniejszego wynalazku pojęcie „czułość” w odniesieniu do sposobu lub testu diagnostycznego oznacza wskaźnik informujący jaką frakcję wszystkich badanych z wrażliwością na insulinę mniejszą od 6 mg/kg FFM/min w badaniu techniką klamry poprawnie identyfikuje kryterium decyzyjne oparte o daną wartość odcięcia. Jest ona obliczana jako stosunek liczby osób, u których sposób lub test zgodnie z rzeczywistością wskazuje na insulinooporność do wszystkich obserwowanych osób, u których ona wystąpiła. W badaniu z zastosowaniem wskaźnika insulinowrażliwości tu ujawnionego wartość ta wynosi 6,3.

Pojęcie „specyficzność” w odniesieniu do sposobu czy testu diagnostycznego oznacza stosunek wyników prawdziwie ujemnych do sumy prawdziwie ujemnych i fałszywie dodatnich uzyskanych w danym teście. Określa on zdolność testu do wykrywania osób zdrowych lub niemających predyspozycji do rozwoju choroby, lub inaczej poprawnego wykluczenia choroby lub predyspozycji do niej, i odnosi się tylko do populacji osób zdrowych. Swoistość definiowana jest następującym wzorem:

SPECYFICZNOŚĆ = (PU/PU + FD) X 100%, w którym PU oznacza wyniki prawdziwie ujemne, a FD oznacza wyniki fałszywie dodatnie.

W kontekście niniejszego wynalazku pojęcie „specyficzność” oznacza wskaźnik informujący jaką frakcję osób, u których nie występuje insulinooporność poprawnie identyfikuje kryterium decyzyjne oparte o daną wartość odcięcia w danym teście. Jest ona obliczana jako stosunek liczby osób o zgodnym z rzeczywistością negatywnym wyniku testu do wszystkich obserwowanych osób, u których wrażliwość na insulinę była większa bądź równa 6 mg/kg FFM/min w badaniu techniką klamry. W badaniu z zastosowaniem wskaźnika insulinowrażliwości tu ujawnionego wartość ta wynosi 6,3.

Pojęcie „moc diagnostyczna” w odniesieniu do sposobu lub testu diagnostycznego oznacza jego dokładność. Bardzo popularnym wskaźnikiem mocy diagnostycznej jest wyliczanie pola powierzchni (AUC, ang. area under curve) pod wykresem krzywej charakterystyki operatora odbiornika (ROC, ang. Receiver Operating Characteristic). Wartość wskaźnika AUC przyjmuje wartości z przedziału od 0 do 1, przy czym im większa wartość, tym lepsza jest moc diagnostyczna sposobu lub testu diagnostycznego. W badaniu z zastosowaniem wskaźnika insulinowrażliwości tu ujawnionego wartość ta wynosi 0,82.

W chwili obecnej dokładna ocena wrażliwości tkanek na insulinę jest trudna i pracochłonna - wymaga zastosowania przynajmniej 2-godzinnego badania techniką klamry metabolicznej, z dwoma podkłuciami dożylnymi oraz wlewem insuliny i glukozy. Sposób ten z uwagi na jego trudność i pracochłonność nie nadaje się do stosowania na poziomie populacyjnym do rutynowych badań diagnostycznych w populacji ogólnej. Dostępne wskaźniki oparte o stężenia glukozy i insuliny we krwi na czczo nie są wystarczająco czułe, żeby stwierdzić insulinooporność w jej wczesnych stadiach, np. u młodych, ogólnie zdrowych osób. Natomiast wskaźniki oparte o stężenia glukozy i insuliny w trakcie doustnego testu tolerancji glukozy cechują się małą powtarzalnością (w niektórych badaniach nawet tylko ok. 30%).

Przedmiotem niniejszego wynalazku jest sposób oznaczania, in vitro, wrażliwości tkanek na insulinę u osoby, polegający na tym, że

Wskaźnik insulinowrażliwości = 7,2109 - log2 KLF9 x 1,8717 + log2 PEMT x 1,2903 +log2 EGR1 x 0,1145, w którym

KLF9 oznacza wartość pomiaru ekspresji genu KLF9,

PEMT oznacza wartość pomiaru ekspresji genu PEMT,

EGR1 oznacza wartość pomiaru ekspresji genu EGR1,

PL 237 595 B1 przy czym uzyskanie wartości wskaźnika insulinowrażliwości wynoszącej 6,3 lub mniej wskazuje na obniżoną wrażliwość tkanek na insulinę, i przy czym niższa wartość odpowiada niższej wrażliwości tkanek na insulinę, a wyższa wartość wskazuje na wyższą wrażliwość tkanek na insulinę (również w zakresie poniżej i powyżej punktu odcięcia).

Wyliczenie wskaźnika insulinowrażliwości na podstawie opisanych powyżej pomiarów pozwala na oznaczenie dokładnej i wiarygodnej wrażliwości tkanek na insulinę u badanej osoby.

Uzyskanie zatem w sposobie identyfikacji insulinooporności i/lub określania predyspozycji do zaburzenia związanego z insulinoopornością według wynalazku wartości wskaźnika insulinowrażliwości wynoszącej 6,3 lub mniej wskazuje na obniżoną wrażliwość tkanek na insulinę, czyli insulinooporność. Niższy wynik odpowiada niższej wrażliwości na insulinę (również w zakresie poniżej punktu odcięcia), a wyższy wynik odpowiada wyższej wrażliwości tkanek na insulinę (również w zakresie powyżej punktu odcięcia). Stwierdzenie występowania insulinooporności pozwala z kolei na stwierdzenie występowania u badanej osoby predyspozycji do rozwinięcia zaburzenia związanego z insulinoopornością jak opisano powyżej.

Nową cechą niniejszego wynalazku jest unikalne połączenie wyników pomiarów ekspresji genów we krwi pełnej, aby w jak najlepszy sposób przewidywały one wrażliwość tkanek na insulinę danej osoby. W celu realizacji sposobów według wynalazku wymagane jest tylko jedno pobranie krwi na czczo. Zgodnie z wynalazkiem uzyskuje się konkretną wartość liczbową, którą można zinterpretować zarówno jako stwierdzenie insulinooporności lub jej braku (insulinooporność-TAK/NIE w zależności od stosunku do punktu odcięcia), jak i jako zmienną ciągłą, której wyższa wartość odzwierciedla wyższą wrażliwość tkanek na insulinę.

Rozwiązania według wynalazku zostały opracowane z wykorzystaniem złożonych modeli regresji (regresja grzbietowa, lasso, losowy las, „supervised principal components”) jako optymalny model stwierdzania insulinooporności i określenia predyspozycji do rozwinięcia zaburzenia z nią związanego. W porównaniu do znanych badań wrażliwości na insulinę opartych na np. 2-godzinnym doustnym teście tolerancji glukozy, wymagane jest tylko jedno pobranie krwi. Należy podkreślić, że sposoby według wynalazku są powtarzalne, specyficzne i czułe. Charakteryzują się one ponadto wysoką mocą diagnostyczną. Czułość sposobów według niniejszego wynalazku wynosi 80%, specyficzność 78%, zaś moc diagnostyczna wynosi 0,82.

Insulinooporność można wykryć już u młodych osób, na wiele lat przed rozwinięciem się związanych z nią zaburzeń i/lub chorób. Opracowanie prostego wskaźnika oceniającego poziom czy też stopień wrażliwości tkanek na insulinę i insulinooporności ma więc istotne zastosowanie w profilaktyce cukrzycy typu 2 oraz innych zaburzeń i chorób związanych z insulinoopornością. Rozwiązania według wynalazku doskonale nadają się więc do tego celu, w szczególności do zastosowania w populacji ogólnej.

Przy opracowaniu niniejszego wynalazku badaniom poddano 150 młodych, zdrowych ochotników, z różnym wskaźnikiem masy ciała, u których wrażliwość na insulinę zmierzono przy zastosowaniu techniki klamry metabolicznej, stanowiącej złoty standard w ocenie działania insuliny in vivo. Część badań polegała na przeprowadzeniu dokładnej charakterystyki klinicznej badanych osób, a następnie na zastosowaniu złożonych modeli regresji w celu wykrycia układu czynników w optymalny sposób określających wrażliwość tkanek na insulinę. Dzięki temu opracowano sposoby według wynalazku i stosowany w nich wskaźnik tu ujawniony. Umożliwiają one uzyskanie konkretnej wartości liczbowej i odniesienie jej do wartości zalecanych. Pozwala to na ocenę wrażliwości tkanek badanej osoby na insulinę w sposób szybki i wiarygodny, na podstawie badania próbki krwi z jednego pobrania. Dzięki temu możliwe jest zrealizowanie sposobu identyfikacji insulinooporności i oceny predyspozycji do rozwinięcia zaburzenia z nią związanego, a w ten sposób możliwa jest też dokładna wczesna diagnostyka insulinooporności lub zmniejszonej wrażliwości na insulinę. Należy podkreślić, że rozwiązania według wynalazku nadają się do stosowania w populacji ogólnej, celem identyfikacji insulinooporności i oceny predyspozycji do chorób związanych z insulinoopornością lub obniżoną wrażliwość na insulinę, ale w szczególności można je stosować u osób obciążonych wywiadem rodzinnym cukrzycy, u osób otyłych, z nadciśnieniem tętniczym, chorobami sercowo- naczyniowymi, zaburzeniami lipidowymi, u kobiet z zespołem policystycznych jajników, u kobiet, które przebyły cukrzycę ciążową lub urodziły dziecko o masie ciała powyżej 4 kg oraz osób przed zabiegiem bariatrycznym i/lub po takim zabiegu.

Do oznaczenia wrażliwości tkanek na insulinę oraz identyfikacji insulinooporności i określenia predyspozycji do zaburzenia z nią związanego zgodnie z niniejszym wynalazkiem wymagane jest tylko

PL 237 595 B1 jednorazowe pobranie krwi pełnej i pomiar ekspresji wskazanych powyżej genów. Pomiar ekspresji genów korzystnie przeprowadza się zgodnie z wynalazkiem poprzez izolację RNA i pomiar ekspresji mRNA wskazanych powyżej genów metodą odwrotnej transkrypcji i PCT w czasie rzeczywistym. Warunki przeprowadzania takich reakcji są znane specjalistom w tej dziedzinie i zostały opisane w piśmiennictwie (zobacz, na przykład, Holland PM, Abramson RD, Watson R, Gelfand DH. Detection of specific polymerase chain reaction product by utilizing the 5' > 3' exonuclease activity of Thermus aquaticus

DNA polymerase. Proc Natl Acad Sci USA 1991,88, 7276-7280; Gibson UEM, Heid CA, Williams PM. A Novel Method for Real Time Quantitative RT-PCR. Genome Res 1996, 6, 995-1001; Bustin SA. Absolute quantification of mRNA using real-time reverse transcription polymerase chain reaction assays. J Mol Endocrinol 2000, 25, 169-193). Przykładowe, korzystne, metody i warunki izolacji RNA oraz przeprowadzania reakcji odwrotnej transkrypcji i PCR w czasie rzeczywistym podano poniżej w przykładach.

Jednak w celu pomiaru ekspresji wskazanych tu genów można wykorzystać również inne metody, takie jak, m. in., cyfrowy PCR (ang. digital PCR), NanoString oraz metody analiz wielkoskalowych: mikromacierzy i sekwencjonowania, takich jak sekwencjonowanie DNA (na przykład cDNA wygenerowane w reakcji odwrotnej transkrypcji RNA) i RNA. Sekwencjonowanie może być wykonane dowolną znaną metodą lub techniką. Takie metody sekwencjonowania obejmują: Sekwencjonowanie Nowej Generacji (ang. Next Generation Sequencing), sekwencjonowanie wysokoprzepustowe, pirosekwencjonowanie, sekwencjonowanie przez ligację, sekwencjonowanie przez syntezę, sekwencjonowanie przez hybrydyzację, technikę RNA-seq, sekwencjonowanie pojedynczej cząsteczki przez syntezę (SMSS), Sekwencjonowanie Półprzewodnikowe, sekwencjonowanie na nanoporach, sekwencjonowanie pojedynczej cząsteczki w czasie rzeczywistym SMRT, masowe równoległe sekwencjonowanie. Dla szczegółowego opisu powyższych metod do pomiaru ekspresji genów, które można zastosować zgodnie z wynalazkiem zobacz, na przykład, Cao L i wsp. “Advances in Digital Polymerase Chain Reaction (dPCR) and Its Emerging Biomedical Applications”, Biosens Bioelectron 2017, 90, 459-474; NanoString Technologies, nCounter® Gene Expression “Strategies for Successful Gene Expression Assays”, Tech Note, 2015; Veldman-Jones MH i wsp. “Evaluating Robustness and Sensitivity of the NanoString Technologies nCounter Platform to Enable Multiplexed Gene Expression Analysis of Clinical Samples” Cancer Res 2015,75 (13): 2587-93; Sabour L i wsp. “Clinical Applications of Next- Generation Sequencing in Cancer Diagnosis” Pathol Oncol Res 2016, 23 (2), 225-234; Mardis ER “DNA sequencing technologies: 20062016” Nat Protoc. 2017; 12 (2): 213-218; Kamps R i wsp. “Next-Generation Sequencing in Oncology: Genetic Diagnosis, Risk Prediction and Cancer Classification” Int J Mol Sci 2017; 18 (2): 308; Morozova O i wsp. “Applications of new sequencing technologies for transcriptome analysis” Annu Rev Genomics Hum Genet 2009; 10:135-51 ; Yadav NK “Next Generation Sequencing: Potential and Application in Drug Discovery” Scientific World Journal 2014; Wang J, Song Y “Single cell sequencing: a distinct new field” Clin Transi Med 2017; 6 (1): 10; Cuevas-Diaz Duran R, Wei H, Wu JQ “Single-cell RNA-sequencing of the brain” Clin Transl Med 2017; 6 (1): 20; Garrido-Cardenas JA, Garcia-Maroto F, AlvarezBermejo JA, Manzano-Agugliaro F “DNA Sequencing Sensors: An Overview” Sensors 2017, 17, 588; Gupta AK, Gupta UD, “Next Generation Sequencing and Its Applications”, Animal Biotechnology Models in Discovery and Translation, Rozdział 19, 2014; Harrington CT, Lin El, Olson MT, Eshleman JR “Fundamentals of pyrosequencing” Arch Pathol Lab Med 2013;137(9): 1296-303 i Hrdlickova R, Toloue M, Tian B ,,RNA-Seq methods for transcriptome analysis” Wiley Interdiscip Rev RNA 2017; 8 (1).

W przypadku metod pomiarowych stosowanych do oznaczenia ekspresji genów o innej charakterystyce niż metoda PCR w czasie rzeczywistym, na przykład o innym zakresie uzyskiwanych wartości pomiarowych, w stosunku do wyliczenia wskaźnika insulinowrażliwości zgodnie z niniejszym wynalazkiem, odpowiednia może być konieczna korekta obliczeń wskaźnika, uwzględniająca zakresy wartości pomiarów ekspresji w wykorzystywanej metodzie.

Wymagane jest przy tym zastosowanie standardowych, ogólnie znanych procedur przygotowania materiału biologicznego, izolacji kwasów nukleinowych, w tym RNA, oraz pomiaru ekspresji genów, w tym mRNA, z wykorzystaniem powszechnie znanych metod i komercyjnie dostępnych aparatów i zestawów. Wyniki uzyskanych tu powyższych pomiarów stosuje się do oznaczenia wrażliwości na insulinę czy też insulinooporności przy zastosowaniu opracowanego przez twórców niniejszego wynalazku wskaźnika insulinowrażliwości zdefiniowanego następującym równaniem:

KLF9 oznacza wartość pomiaru ekspresji genu KLF9,

PEMT oznacza wartość pomiaru ekspresji genu PEMT,

PL237 595 Β1

EGR1 oznacza wartość pomiaru ekspresji genu EGR1.

Przy interpretacji otrzymanego wyniku zalecane jest także branie pod uwagę wartości bezwzględnej wzoru, jako parametru odzwierciedlającego wynik badania klamry, tzn. niższy wynik odpowiada niższej wrażliwości tkanek na insulinę (również w zakresie poniżej punktu odcięcia), a wyższy wynik wyższej wrażliwości tkanek na insulinę (również w zakresie powyżej punktu odcięcia). Przy uzyskaniu wartości wskaźnika insulinowrażliwości wynoszącej 6,3 lub mniej identyfikuje się insulinooporność i/lub predyspozycję do zaburzenia związanego z insulinoopornością.

W przypadku wartości pomiaru stosowanej do wyliczenia opisanego tu wskaźnika insulinowrażliwości, która wyrażona jest w innych jednostkach czy zakresach referencyjnych niż te, które uzyskuje się metodą odwrotnej transkrypcji i POR w czasie rzeczywistym, należy ją odpowiednio przeliczyć.

W Tabeli 1 przedstawione są zakresy wartości ekspresji genów uzyskiwanie korzystnie zgodnie z wynalazkiem.

T a b e I a 1. Średnie ± S.D oraz zakresy wartości ekspresji genów wykorzystanych w metodzie odwrotnej transkrypcji i PCR w czasie rzeczywistym

Gen	Średnia	S.D.	Minimum	Maksimum
KLF9	0,0368	0,0157	0,0193	0,1256
PEMT	0,0093	0,0056	0,0033	0,0431
EGR1	0,0106	0,0087	0,0019	0,0507

W przypadku metod pomiarowych stosowanych do oznaczenia parametrów potrzebnych do wyliczenia wskaźnika insulinowrażliwości zgodnie z niniejszym wynalazkiem o innym zakresie uzyskiwanych wartości pomiarowych w stosunku do wskazanych powyżej, możliwa jest korekta obliczeń, tzn. w przypadku, gdy wartość średnia danego parametru odbiega znacząco od zakresu referencyjnego, należy odpowiednio skorygować mnożnik - np. w przypadku, gdy średnia zakresu jest pięciokrotnie wyższa, należy pięciokrotnie zmniejszyć mnożnik przy danym parametrze.

Czułość sposobów według niniejszego wynalazku wynosi 80%, a specyficzność 78%. Pole pod krzywą ROC (ang. receiver operating characteristic), czyli moc diagnostyczna, wynosi 0,82.

Weryfikacja doświadczalna

Sposoby według wynalazku zostały przetestowane w analizie statystycznej w tzw. próbie uczącej i próbie testowej. Następnie zostały zweryfikowane w próbkach pochodzących z wcześniejszych badań twórców niniejszego wynalazku, obejmujących ponad 400 osób, u których wrażliwość na insulinę zmierzono metodą klamry metabolicznej. Wskaźnik został pozytywnie zweryfikowany jako biomarker diagnostyczny, dokładniej biomarker obniżonej wrażliwości tkanek na insulinę, czyli insulinooporności, w grupach osób z prawidłową masą ciała, nadwagą i otyłością, u osób z nieprawidłową tolerancją glukozy, a także u kobiet z zespołem policystycznych jajników.

Badania przeprowadzono w grupie 150 młodych, zdrowych ochotników, z różnym wskaźnikiem masy ciała, u których wrażliwość na insulinę zmierzono przy zastosowaniu techniki klamry metabolicznej, stanowiącej złoty standard w ocenie działania insuliny in vivo. Część badań polegała na przeprowadzeniu dokładnej charakterystyki klinicznej badanych osób, ocenie podstawowych parametrów laboratoryjnych, a także na pomiarze stężeń panelu białek w surowicy.

Następnie, w celu wykrycia układu czynników w optymalny sposób określających wrażliwość tkanek na insulinę, zbudowano złożone modele regresji: model liniowy z regularyzacją (regresja grzbietowa oraz lasso), model „supervised principal components” oraz model losowego lasu. W analizach wykorzystano losowo dobraną próbę uczącą i próbę testową. Wynik badania klamry, określający wrażliwość tkanek na insulinę, poddano kategoryzacji, przyjmując za punkt odcięcia wartość 6 mg/kg FFM/min. Zrezygnowano z podziału zmiennej jakościowej (wrażliwość tkanek na insulinę) według mediany lub tertyli w badanej populacji ze względu na powiązanie tych wartości z badaną próbą. Modele regresji zbudowano dla wszystkich badanych zmiennych oraz dla poszczególnych obszarów zmiennych (charakterystyka kliniczna, charakterystyka biochemiczna, ekspresja genów we krwi pełnej, ekspresja genów w tkankach, stężenia białek we krwi). Zaobserwowano, że obszary zmiennych dotyczące charakterystyki klinicznej oraz ekspresji genów we krwi pozwalają na predykcję wrażliwości na insulinę niezależnie od siebie nawzajem. Ponadto analizowano cały obszar charakterystyki klinicznej, zawierający

PL 237 595 B1 również pomiary uzyskane podczas doustnego testu tolerancji glukozy, jak również ten obszar ograniczony tylko do wyników uzyskanych na czczo.

Pod uwagę brano czułość oraz specyficzność danego testu. Czułość jest to wskaźnik informujący jaką frakcję wszystkich badanych z wrażliwością na insulinę mniejszą od 6 poprawnie identyfikuje kryterium decyzyjne oparte o daną wartość odcięcia. Jest obliczana jako stosunek liczby osób, u których test zgodnie z rzeczywistością wskazuje na insulinooporność do wszystkich obserwowanych osób, u których ona wystąpiła. Specyficzność jest to wskaźnik informujący jaką frakcję pacjentów u których nie występuje insulinooporność poprawnie identyfikuje kryterium decyzyjne oparte o daną wartość odcięcia. Jest obliczana jako stosunek liczby osób o zgodnym z rzeczywistością negatywnym wyniku testu do wszystkich obserwowanych osób, u których wrażliwość na insulinę była większa bądź równa 6.

Analiza statystyczna

Analizę statystyczną przeprowadzono przy użyciu programu STATISTICA 15.5 (StatSoft Polska, Kraków). Przed przeprowadzeniem testów statystycznych sprawdzone zostały założenia normalności rozkładu i jednorodności wariancji w porównywanych grupach ochotników. Przy ocenie normalności rozkładu stosowano test Shapiro-Wilka, natomiast przy ocenie jednorodności wariancji test Levene’a oraz test Browna-Forsythe’a. Następnie przeprowadzono testy istotności różnic pomiędzy grupami ochotników. W przypadku porównania 2 grup zastosowano nieparametryczny test Manna-Whitneya oraz parametryczny test t-Studenta dla prób niezależnych. W celu analizy rozkładów zmiennych jakościowych w grupach wyznaczonych przez zmienną M (insulinowrażliwość wyrażona w mg/kg FFM/min)przeprowadzono test niezależności chi-kwadrat Pearsona. Analizę korelacji oraz regresję prostą przeprowadzono dla zmiennych niezależnych oraz między zmiennymi niezależnymi i zmienną zależną M stosując analizę współczynnika korelacji rang R Spearmana, a także korelacji liniowej r Pearsona.

Ze względu na dużą liczbę zmiennych oraz fakt, że była ona większa niż liczba obserwacji, zastosowano specjalne techniki analizy danych opisane poniżej. W celu wykrycia układu czynników w optymalny sposób określających wrażliwość tkanek na insulinę, zbudowano złożone modele regresji: model liniowy z regularyzacją (regresja grzbietowa oraz lasso), model „supervised principal components” oraz model losowego lasu. W analizach wykorzystano losowo dobraną próbę uczącą i próbę testową. Próba ucząca służyła do budowy modeli, a próba testowa do ich oceny. Podział zbioru na dwie próby jest zgodny z dobrą praktyką stosowaną przy budowie modeli i miała na celu zwiększenie wiarygodności oceny jakości przygotowanych modeli. Wielkość próby uczącej ustalono na poziomie 80% wielkości całej próby. W związku z tym do próby uczącej przypisano 120 ochotników a do próby testowej 30. Przydział badanych osób do prób był losowy, przy czym brano pod uwagę zgodność rozkładów zmiennej zależnej M w obu grupach. Wynik badania klamry, określający wrażliwość tkanek na insulinę, poddano kategoryzacji, przyjmując za punkt odcięcia wartość 6 mg/kg FFM/min. Zrezygnowano z podziału zmiennej M według mediany lub tertyli w badanej populacji ze względu na powiązanie tych wartości z badaną próbą. Wartość 6 mg/kg FFM/min przyjęto na podstawie własnych wcześniejszych obserwacji, a także na podstawie piśmiennictwa. Taki punkt odcięcia powoduje przypisanie 60 osób (40% badanej grupy) do grupy ze zmniejszoną wrażliwością na insulinę.

Modele regresji zbudowano dla wszystkich badanych zmiennych oraz dla poszczególnych obszarów zmiennych (charakterystyka kliniczna, charakterystyka biochemiczna, ekspresja genów w krwi pełnej, ekspresja genów w tkankach, stężenia białek we krwi). Zaobserwowano, że obszary zmiennych dotyczące charakterystyki klinicznej, biochemicznej oraz ekspresji genów we krwi pozwalają na predykcję wrażliwości na insulinę niezależnie od siebie nawzajem. Do budowy modeli wykorzystano oprogramowanie STATISTICA Data Miner (StatSoft, 2011) oraz pakiet R (pakiety impute (Hastie T, Tibshirani T, Narasimhan B, Chu G. impute: impute: Imputation for microarray data. 2014, R package version 1.32.0), glmnet (Friedman J, Hastie T, Tibshirani R. (2010). Regularization Paths for Generalized Linear Models via Coordinate Descent. Journal of Statistical Software, 2010, 33: 1-22. URL http://www.jstat- soft.org/v33/i01) oraz superpc (Bair E.,Tibshirani R. superpc: Supervised principal components. 2012, R package version 1.09. http://CRAN.R-project.org/package=superpc).

Opisane modele można podzielić na dwie grupy - modele, których celem jest jak najlepsze przewidzenie wartości zmiennej M w oparciu o wszystkie zmienne oraz modele, które są łatwiejsze w interpretacji ze względu na redukcję liczby predyktorów. Jakość dopasowania modeli z pierwszej grupy (regresja grzbietowa oraz losowy las) jest nieco lepsza niż pozostałych. Z drugiej strony modele lasso oraz „supervised principal components” redukują liczbę zmiennych pozwalając znaleźć istotne czynniki diagnostyczne i tym samym pomóc w zrozumieniu badanego zjawiska. Szczególnie model „supervised principal components”, oprócz wskazania istotnych czynników wpływających na wartości zmiennej M,

PL 237 595 B1 pokazuje relacje między predyktorami. Do opracowania wskaźnika insulinowrażliwości wybrano ostatecznie model „supervised principal components”, który w optymalny sposób przewidywał zmienną M przy jednoczesnej redukcji liczby predyktorów (w przeciwieństwie do wykorzystania wszystkich badanych zmiennych w modelu regresji grzbietowej oraz losowego lasu).

We wszystkich analizach przedstawionych w przykładach wykonania niniejszego wynalazku za poziom istotności statystycznej przyjęto p < 0,05.

Zastosowane modele regresji umożliwiły opracowanie wskaźnika insulinowrażliwości określającego w optymalny sposób wrażliwość tkanek na insulinę, również w porównaniu do wspomnianych wcześniej, już stosowanych wskaźników. Opracowany zgodnie z wynalazkiem wskaźnik jest niezależny od wahań insulinemii i glukozy, i pozwala na uzyskanie czułości oznaczenia wynoszącej 80% i specyficzności 78%. Moc diagnostyczna wynosi 0,82 i jest większa niż moc diagnostyczna znanych dotychczas wskaźników.

Należy dodać, że analizowano również opracowany sposób oznaczania wrażliwości tkanek na insulinę oraz sposób identyfikacji insulinooporności i/lub określania predyspozycji do zaburzenia z nią związanego oraz wskaźnik insulinowrażliwości tu ujawniony w odniesieniu do pomiaru wrażliwości tkanek na insulinę w badaniu techniką klamry jako zmiennej ciągłej, tzn. bez kategoryzacji osób z wysoką i niską wrażliwością tkanek na insulinę, czyli metodą analizy korelacji. Również w tym przypadku wykazywał on wyższość w porównaniu do znanych wcześniej wskaźników. Należy zauważyć, że badana grupa składała się z młodych, ogólnie zdrowych osób, w takiej sytuacji korelacje różnych wskaźników z wartością uzyskaną w badaniu techniką klamry są zwykle słabsze niż w przypadku badania grup osób z istotnym stopniem insulinooporności. W tym kontekście cenna jest obserwacja, że opracowane sposoby według wynalazku do oznaczania wrażliwości tkanek na insulinę oraz identyfikacji insulinooporności i/lub określania predyspozycji do zaburzenia związanego z insulinoopornością, jak również wskaźnik insulinowrażliwości tu ujawniony wykazywały silną, istotną korelację z wartością wrażliwości na insulinę uzyskaną w badaniu klamry (r=0,57, p<0,0001), silniejszą niż HOMA-IR (r =-0,39, p<0,003) oraz QUICKI (r=0,36, p<0,002). Opracowane sposoby według wynalazku do oznaczania wrażliwości tkanek na insulinę i insulinooporności oraz wskaźnik insulinowrażliwości tu ujawniony wykazywały również wyższość w stosunku do wskaźnika Matsudy (korelacja Matsuda v s wartość z badania klamry: r=0,38, p<0,001), co jest tym ważniejsze, że wskaźnik Matsudy wymaga pomiaru stężeń glukozy i insuliny we krwi podczas 2-godzinnego testu tolerancji glukozy, a do opracowanego sposobu oznaczania wrażliwości tkanek na insulinę i wskaźnika insulinowrażliwości tu ujawnionego wymagana jest jedynie próbka krwi pobranej jednorazowo na czczo.

Podsumowując, zgodnie z niniejszym wynalazkiem opracowano sposób oznaczania wrażliwości tkanek na insulinę oraz sposób identyfikacji insulinooporności i/lub określania predyspozycji do zaburzenia związanego z insulinoopornością oparte na pomiarach in vitro ekspresji wskazanych genów. Sposoby według wynalazku pozwalają na oznaczenie wrażliwości tkanek na insulinę badanej osoby i pozwalają na uzyskanie konkretnej wartości liczbowej oznaczającej wrażliwość tkanek na insulinę, a poprzez odniesienie jej do wartości zalecanych oznaczenie czy wrażliwość na insulinę jest zmniejszona czy też nie. Dzięki temu możliwa jest dokładna identyfikacja insulinooporności, wczesna diagnostyka insulinooporności, a także ocena występowania predyspozycji do zaburzenia związanego z insulinoopornością, na podstawie wyników uzyskanych z jednorazowego pobrania krwi na czczo.

Sposoby według wynalazku mogą być stosowane do określania predyspozycji do chorób związanych z insulinoopornością. Choroby związane z insulinoopornością obejmują przykładowo cukrzycę typu 2, choroby sercowo-naczyniowe, nadwagę, otyłość, nadciśnienie tętnicze, miażdżycę, chorobę niedokrwienną serca, udar mózgu, nieprawidłową tolerancję glukozy, dyslipidemię, zespół metaboliczny, stłuszczenie wątroby, zespoły endokrynologiczne, w tym zespoły związane z zaburzeniami płodności, na przykład zespół policystycznych jajników, oraz choroby neurodegeneracyjne.

Opisany powyżej wskaźnik insulinowrażliwości tu ujawniony nadaje się do rutynowego stosowania w praktyce klinicznej do badań w populacji ogólnej, u osób z prawidłową masą ciała, do oceny predyspozycji do chorób związanych z insulinoopornością, w szczególności u osób: z obciążonym wywiadem rodzinnym cukrzycy, z podwyższoną glikemią na czczo, z nieprawidłową tolerancją glukozy, z nadwagą, otyłych, z zaburzeniami lipidowymi, dyslipidemią, z zespołem metabolicznym, ze stłuszczeniem wątroby, z chorobami sercowo-naczyniowymi, w tym z nadciśnieniem tętniczym, z miażdżycą, z chorobą niedokrwienną serca, po udarze mózgu, z chorobami neurodegeneracyjnymi, kobiet, które przebyły cukrzycę ciążową lub urodziły dziecko o masie ciała powyżej 4 kg, lub krewnych pierwszego

PL 237 595 B1 stopnia osoby chorej na cukrzycę i/lub choroby sercowo-naczyniowe oraz osób przed zabiegiem bariatrycznym i/lub po takim zabiegu.

Do realizacji opisanych powyżej sposobów według wynalazku opracowano odpowiednie zestawy diagnostyczne zawierające środki do pomiaru ekspresji wskazanych powyżej genów w szczególności środki do pomiaru ekspresji mRNA genów metodą odwrotnej transkrypcji i PCR w czasie rzeczywistym, takie jak stosowane zgodnie z wynalazkiem startery do am plifikacji genów: KLF9, PEMT i EGR1 oraz genu referencyjnego, korzystnie GAPDH, zawarte w odpowiednich pojemnikach.

Można stosować w nich dowolne startery do amplifikacji wskazanych genów, bez ograniczenia do wskazanych powyżej korzystnych par starterów, jednak startery te muszą być wysoce specyficzne do amplifikowanej sekwencji. W przypadku Real-time PCR stosuje się takie same zasady projektowania starterów, jak w klasycznej PCR. Optymalna długość startera to między 18 a 22 nukleotydów. Temperatury topnienia starterów z jednej pary nie powinny różnić się o więcej niż 5°C. Standardowa temperatura topnienia powinna dogodnie zawierać się w przedziale 52-60°C. Im wyższa temperatura topnienia tym niższe ryzyko uzyskania niespecyficznych produktów reakcji. W celu uzyskania wysokiej wydajności reakcji PCR należy unikać starterów tworzących struktury drugorzędowe lub struktury typu starter-dimer między oligonukleotydami jednej pary starterów, gdyż w takiej sytuacji możliwe jest uzyskanie sygnału nie tylko z produktu będącego przedmiotem zainteresowania, ale również sygnału z niespecyficznych produktów reakcji oraz struktur drugorzędowych utworzonych między starterami. Opisane tu zestawy mogą także zawierać środki do pomiaru ekspresji genu referencyjnego, stosowanego w reakcji PCR w czasie rzeczywistym, takiego jak GAPDH. Opisane zestawy diagnostyczne mogą zawierać także instrukcje do realizacji sposobów według wynalazku i interpretacji uzyskanych wyników z wykorzystaniem wskaźnika insulinowrażliwości opracowanego przez twórców niniejszego wynalazku. Zestawy takie mogą ponadto zawierać inne składniki do przeprowadzania omówionych powyżej reakcji, takie jak odwrotną polimerazę, polimerazę DNA, trójfosforany nukleotydów i bufory, jak wiadomo w tej dziedzinie.

Niniejszy wynalazek zostanie poniżej zilustrowany za pomocą przykładów wykonania i figur, które nie mają jednak w jakikolwiek sposób ograniczać zakresu ochrony wynalazku jak zdefiniowano w zastrzeżeniach patentowych.

Krótki opis rysunków

Figura 1 przedstawia krzywą dla próby testowej. Dla punktu odcięcia 6,30 czułość opracowanego wskaźnika insulinowrażliwości tu ujawnionego wynosi 80%, natomiast specyficzność wynosi 78%.

Figura 2 przedstawia wyniki analizy korelacji wskaźnika insulinowrażliwości tu ujawnionego z wynikami wrażliwości na insulinę uzyskanymi w badaniu techniką klamry, oraz z zastosowaniem wskaźników HOMA-IR i QUICKI. Na Figurze 2 A widać silną, istotną statystycznie korelację z wartością zmiennej M (r=0,56, p<0,000001). Na Figurze 2 B przedstawiono uzyskaną statystycznie istotną korelację, silniejszą niż z zastosowaniem wskaźnika HOMA-IR, (r=-0,39, p=0,001), zaś na Figurze 2 C przedstawiono wykazującą istotność statystyczną korelację ze wskaźnikiem QUICKI (r=0,36, p=0,002).

P r z y k ł a d y

Grupa badana

Badaniem objęto 150 ogólnie zdrowych osób w wieku 18-35 lat, 117 mężczyzn i 33 kobiety. Ochotników do badania rekrutowano poprzez lokalne ogłoszenia, a także wśród personelu medycznego i studentów. Wszystkie osoby badane były niepalące, bez współistniejących chorób (choroba niedokrwienna serca, nadciśnienie, infekcje, alergie, cukrzyca, nowotwory, choroby nerek, wątroby, układu wewnętrznego wydzielania i inne), bez cech niedożywienia oraz bez otyłości olbrzymiej (wskaźnik masy ciała [BMI - body mass index] pomiędzy 18,9 a 40 kg/m2), i nie przyjmowały żadnych leków. Masa ciała była stabilna w okresie ostatnich 3 miesięcy. Żadna z kobiet nie wykazywała zaburzeń miesiączkowania, wszystkie były badane między 3 a 5 dniem cyklu miesięcznego.

Uzyskano zgodę Komisji Bioetycznej Uniwersytetu Medycznego w Białymstoku na przeprowadzenie badania. Wszystkie badane osoby wyraziły pisemną zgodę na udział w badaniu po przeczytaniu informacji o badaniu i wyjaśnieniu wszelkich wątpliwości z lekarzem uczestniczącym w projekcie.

Protokół badania i metody

I etap

Badanie lekarskie i pomiary antropometryczne

Badania przeprowadzono dwuetapowo. Wszystkie badania wykonane były na czczo, po przynajmniej 10-godzinnym okresie bez posiłku. W pierwszym etapie badania u kolejno badanych ochotników przeprowadzono pełne badanie lekarskie oraz dokonano pomiarów antropometrycznych. Zmierzono: masę ciała, wzrost, obwód talii (najmniejszy obwód między łukiem żebrowym, a grzebieniem

PL 237 595 B1 biodrowym), obwód bioder (najszersze miejsce między talią a udami), procent tłuszczu w organizmie metodą impedancji bioelektrycznej przy użyciu analizatora Tanita TBF-511 Body FAT Analyzer (Tanita Copr., Tokio, Japonia). Następnie wyliczono BMI jako masa ciała x wzrost -2 i wyrażono w kg/m2, wskaźnik talia-biodra (WHR; ang. Wist-to-Hip Ratio) oraz masę ciała tłuszczową (FM, ang. Fat Mass) i beztłuszczową masę ciała (FFM, ang. Fat-Free Mass) na podstawie masy ciała i procentu tłuszczu w organizmie. Do dalszych badań kwalifikowano osoby niepalące, bez współistniejących chorób, bez odchyleń w badaniu przedmiotowym, nieprzyjmujące żadnych leków.

Ocena tolerancji glukozy i wstępne badania biochemiczne

Po wstępnej kwalifikacji lekarskiej wykonywano standardowy doustny test tolerancji glukozy (OGTT, ang. oral glucose tolerance test). Krew w trakcie badania pobierano z żyły odłokciowej na czczo, przed podaniem glukozy, w 30, 60 oraz 120 minucie po obciążeniu doustnym 75 g glukozy, w celu oznaczenia stężeń glukozy w osoczu oraz insuliny i wolnych kwasów tłuszczowych (WKT) w surowicy. Stężenia glukozy w osoczu oznaczano bezpośrednio w trakcie badania. Ponadto, we krwi pobranej na czczo wykonano bezpośrednio oznaczenia standardowych parametrów laboratoryjnych z użyciem standardowych zestawów odczynników i aparatów diagnostycznych: morfologii krwi z rozmazem, krzepnięcia krwi, lipidów, elektrolitów, kwasu moczowego, klirensu kreatyniny, bilirubiny, białka całkowitego i proteinogramu; aktywności: aminotransferazy asparaginianowej (AspAt), aminotransferazy alaninowej (AlAt), fosfatazy zasadowej, γ-glutamylo-transpeptydazy (GGTP); stężenie żelaza, ferrytyny, całkowitej zdolności wiązania żelaza (TIBC, ang. total iron binding capacity), białka C-reaktywnego (hsCRP), TSH, fT3 i fT4, kortyzolu oraz hormonów płciowych. W rutynowy sposób wykonano również badanie ogólne moczu oraz badanie mikroalbuminurii. Do czasu wykonania pozostałych analiz próbki surowicy i osocza przechowywano w temp. -80°C. Do drugiego etapu badania kwalifikowano osoby z prawidłową tolerancją glukozy i z prawidłowymi wynikami panelu badań laboratoryjnych.

II etap

W II etapie u badanych osób wykonywano biopsję mięśnia obszernego bocznego uda oraz biopsję podskórnej tkanki tłuszczowej, a następnie mierzono wrażliwość na insulinę za pomocą techniki klamry hiperinsulinemicznej normoglikemicznej w znany sposób, opisany przykładowo w publikacjach: Karczewska-Kupczewska M, Lelental N, Adamska A, Nikołajuk A, Kowalska I, Górska M, Zimmermann R, Komhuber J, Strączkowski M, Lewczuk P. The influence of insulin infusion on the metabolism of amyloid β peptides in plasma. Alzheimers Dement 2013, 9: 400-405; oraz Karczewska-Kupczewska M, Kowalska I, Nikołajuk A, Adamska A, Zielińska M, Kamińska N, Otziomek E, Górska M, Strączkowski M. Circulating brain-derived neurotrophic factor concentration is downregulated by intralipid/heparin infusion or high-fat meal in young healthy male subjects. Diabetes Care 2012, 35: 358-362. Badania te wykonywane były przynajmniej po 5 dniach po OGTT, rano na czczo.

Biopsja tkanki mięśnia obszernego bocznego uda i podskórnej tkanki tłuszczowej

Przed badaniem klamry wykonywana była biopsja mięśnia obszernego bocznego uda oraz podskórnej tkanki tłuszczowej z okolicy pępka, w znieczuleniu miejscowym 1% lidokainą, po małym nacięciu skóry (ok. 1 cm). Biopsja mięśnia była wykonywana przy użyciu specjalnej igły (Popper and Sons, New Hyde Park, NY, USA), ok. 15 cm powyżej rzepki. Biopsja tkanki tłuszczowej była wykonywana przy użyciu igły Byron Accelerator III.

Materiał z biopsji tkanek został umieszczony w temperaturze -80°C w celu zabezpieczenia do czasu izolacji RNA i białka. Ekspresja genów w tkankach była mierzona metodą mikromacierzy mRNA, a następnie metodą Real Time PCR.

Przy realizacji wszystkich badań i testów tu opisanych wykorzystano standardowe, ogólnie znane procedury przygotowania materiału biologicznego, analiz biochemicznych, izolacji RNA oraz pomiaru ekspresji genów, a także komercyjne dostępne zestawy i aparaty do tych celów, postępując zgodnie z zalecaniami ich wytwórców, o ile nie wskazano inaczej.

P r z y k ł a d 1

Pomiar wrażliwości tkanek na insulinę oraz identyfikacja wysokiej i niskiej wrażliwości na insulinę oraz pomiar ekspresji genów metodą mikromacierzy mRNA

W celu wykonania badania z zastosowaniem techniki klamry ochotnikom zakładano 2 igły wenflonowe do 2 żył odłokciowych. Jedna z igieł wenflonowych przeznaczona była do jednoczesnego wlewu glukozy i insuliny, natomiast druga, umieszczona po przeciwnej stronie, służyła do pobierania krwi w celu oznaczeń aktualnej glikemii. Kończynę, z której pobierana była krew, ogrzewano przy pomocy poduszki elektrycznej do temperatury około 60°C w celu arterializacji krwi żylnej. Podczas badania trwa

PL 237 595 B1 jącego 2 godziny stosowano dożylny wlew insuliny krótko działającej (Actrapid HM, Novo Nordisk, Kopenhaga, Dania): w ciągu pierwszych 5 min w tempie 80 mU x m-2 x min-1, od 5 minuty -60 mU x m-2 x min-1 a następnie, od 10 min stały wlew w tempie 40 mU x m-2 x min-1, uzyskując stabilną hiperinsulinemię, wystarczającą do zahamowania endogennego wydzielania insuliny, do supresji lipolizy oraz do zmniejszenia endogennej produkcji glukozy do 10-15% wartości wyjściowych. Stężenie glukozy w trakcie trwania klamry oznaczano co 5 minut, przy użyciu analizatora YSI2300 Stat Plus. Do oznaczenia glikemii potrzebna była minimalna ilość krwi, a wynik uzyskiwany był po 15-45 sek. W czasie badania klamry dokonywała się automatyczna kalibracja analizatora - przynajmniej co 30 min. W 4 minucie badania rozpoczynano wlew 20% glukozy (1,11 mol/l), początkowo w tempie 2 mg x kg-1 x min-1, następnie od 10 minuty wlew glukozy był regulowany manualnie, w zależności od aktualnych stężeń glukozy tak, aby glikemia była jak najbliższa 90 mg/dl (5,0 mmol/l). U wszystkich osób tempo przepływu glukozy regulowano empirycznie.

Przy zastosowaniu wyżej opisanych protokołów uzyskuje się stabilne warunki metaboliczne stałą hiperinsulinemię W drugiej godzinie badania uzyskiwane są stabilne stężenia glukozy oraz stabilne tempo przepływu glukozy. W takiej sytuacji, tempo przepływu glukozy równe jest szybkości metabolizmu glukozy w tkankach, przede wszystkim w mięśniach szkieletowych. Za wartość insulino-zależnego wychwytu glukozy w organizmie przyjmuje się średnie tempo wlewu glukozy z ostatnich 40 minut badania klamry, skorygowane do niewielkich zmian glikemii w tym przedziale czasowym i przeliczone na FFM (wartość M).

Wynik badania techniką klamry, określający wrażliwość tkanek na insulinę, poddano kategoryzacji, przyjmując za punkt odcięcia wartość 6 mg/kg FFM/min. Zrezygnowano z podziału zmiennej jakościowej (wrażliwość tkanek na insulinę) według mediany lub tertyli w badanej populacji ze względu na powiązanie tych wartości z badaną próbą. Wartość 6 mg/kg FFM/min przyjęto na podstawie własnych wcześniejszych obserwacji, a także na podstawie piśmiennictwa.

Ponadto, przed badaniem klamry pobrano krew w celu wykonania pomiarów stężeń wybranych białek w surowicy, przeprowadzenia analizy proteomicznej, izolacji komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC, ang. peripheral blood mononuclear cells), w celu przeprowadzenia analiz ekspresji genów metodą mikromacierzy mRNA oraz PCR w czasie rzeczywistym (Real Time PCR). Wykonano także analizę ekspresji wybranych genów we krwi pełnej metodą Real Time PCR.

Izolacja komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC)

Izolację PBMC przeprowadzono w warunkach podstawowych (na czczo, przed badaniem klamry) oraz po badaniu klamry (w 120 minucie). Próbki krwi (ok. 8 ml) pobierano do probówek BD Vacutainer® CPT™ Cell Preparation Tube (Becton Dickinson AG, NJ, USA) z cytrynianem sodu. Zmieszano krew z cytrynianem poprzez 10-krotne odwracanie probówki, inkubowano przez 20 minut w temp. pokojowej, a następnie odwirowano w temp. pokojowej przez 30 minut przy 1800 RCF (ang. relative centrifugal force - względna siła wirowania). Po wirowaniu PBMC oraz płytki znajdowały się w białawej warstwie tuż poniżej warstwy osocza, która została delikatnie zlana bez naruszenia warstwy PBMC. Komórki te zostały przeniesione przy pomocy pipety Pasteura do probówki stożkowej typu Falcon o pojemności 15 ml z zakrętką i zalane PBS (ang. phosphate buffered saline - sól fizjologiczna buforowana fosforanami) do objętości 15 ml. Probówkę wirowano przez 15 minut przy 300 RCF w temp. pokojowej, a następnie zlano supernatant bez naruszenia osadu komórek. Osad został rozbity poprzez delikatne stukanie probówki, następnie ponownie dodano PBS (10 ml). Powtórzono wirowanie - 10 minut przy 300 RCF w temp. pokojowej, następnie zlano supernatant, a pelet PBMC został zawieszony w 80 μl odczynnika stabilizującego RNA (RNALater, Ambion, Thermo Scientific Inc., Wilmington, DE, USA). Wszystkie opisane procedury wykonano w ciągu 2 godzin od pobrania krwi. Próbki zamrożono w temp. -80°C do czasu przeprowadzenia dalszych analiz.

Izolacja RNA

Z tkanki mięśniowej

Materiał pobrany podczas biopsji (ok. 60-80 mg) wyjęto z odczynnika stabilizującego materiał badawczy (RNA Later, Ambion), a następnie płukano w PBS. Tkankę mięśniową homogenizowano przy użyciu TissueRuptor (Qiagen) na lodzie ok. 40 sekund w 300 μl buforu RLT z dodatkiem β-merkaptoetanolu. Homogenizacja polega na rozbiciu struktur komórkowych w wyniku obrotu końcówki homogenizatora z prędkością do 35000 rpm. Należy stosować wymienne, autoklawowalne końcówki wielokrotnego użytku, dzięki czemu niemożliwa jest kontaminacja próbek. Zhomogenizowane próby umieszczano w aparacie do automatycznej izolacji (QiaCube, Qiagen). RNA z homogenatu izolowano z zastosowaniem zestawu RNeasy Fibrous Tissue Kit (Qiagen) przy użyciu kolumn ze złożem krzemionkowym

PL 237 595 B1 wiążącym kwasy nukleinowe. Sole chaotropowe zawarte w zestawie do izolacji powodują rozpad błon komórkowych i denaturację białek, co sprzyja izolacji kwasów nukleinowych. RNA zawieszono w 40 μl wody wolnej od RNaz i natychmiast zamrożono w -80°C do dalszych analiz.

Z tkanki tłuszczowej

Tkankę tłuszczową (ok. 100 mg) pochodzącą z biopsji wyjęto z odczynnika stabilizującego materiał badawczy (Allprotect Tissue reagent, Qiagen) i płukano w PBS. Następnie przeprowadzono homogenizację ok. 30 sekund w 1ml odczynnika przeznaczonego do rozbicia struktur adipocytów (QIAzol Lysis Ragent, Qiagen). Zhomogenizowane próby umieszczano w aparacie do automatycznej izolacji (QiaCube, Qiagen). RNA z tłuszczu izolowane było przy użyciu dedykowanego tej tkance zestawu (RNeasy Lipid Tissue Mini Kit, Qiagen). RNA zawieszono w 30 μl wody wolnej od RNaz i natychmiast zamrożono w -80°C do dalszych analiz.

Z komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC)

Komórki PBMC przechowywane w odczynniku stabilizującym materiał (RNA later, Ambion) rozmrożono i odwirowano z prędkością 300 g przez 5 minut. Supernatant usunięto, a do osadu komórek dodano 350 μl buforu do homogenizacji RLT z dodatkiem β-merkaptoetanolu. Przygotowane próby umieszczono w urządzeniu do automatycznej izolacji (QiaCube, Qiagen). Do izolacji RNA z komórek PBMC stosowane były kolumny do automatycznej homogenizacji (QIAshredder spin column, Qiagen) oraz zestaw RNeasy Mini Kit (Qiagen). RNA z komórek zawieszono w 30 μl wody wolnej od RNaz i natychmiast zamrożono w -80°C do dalszych analiz.

Z krwi pełnej

Krew pełną pobrano do probówki PAXgene™, która zawiera odczynnik stabilizujący cały wewnątrzkomórkowy RNA. Probówki z krwią przechowywane w -80°C ogrzewano w temperaturze pokojowej przez minimum 2 godziny, a następnie zwirowano z prędkością 3000 g przez 10 minut. Supernatant usunięto, a osad zawieszono w wodzie i ponownie żwirowano. Uzyskany osad przeniesiono do czystej probówki typu Eppendorf i umieszczono w aparacie do automatycznej izolacji (QiaCube, Qiagen). RNA z krwi pełnej izolowane było przy użyciu zestawu PAX gene Blood RNA kit (Qiagen). RNA z komórek zawieszono w 60 μl wody wolnej od RNaz i natychmiast zamrożono w -80°C do dalszych analiz.

Ocena ilościowa i jakościowa RNA

RNA ze wszystkich izolacji zostało ocenione pod względem ilości oraz jakości. Ilość RNA mierzono przy pomocy NanoDrop 2000 (ThermoScientific). Kwasy nukleinowe pochłaniają światło w nadfiolecie (UV) w zakresie fal miedzy 210 nm a 300 nm, z maksimum przypadającym na 260 nm. Czystość materiału oszacowano na podstawie stosunku absorbancji (A) przy 260 nm i 280 nm (A260/A280). Dla RNA stosunek ten w przybliżeniu wynosił A260/A280=2,0. Oceniana jest również długości fali 230, która mówi o zanieczyszczeniach pochodzących z węglowodorów, białek lub fenolu. Wartość A260/A230 wynosiła około 2,2.

RNA oceniano również pod względem jakościowym przy pomocy analizatora Bioanalyzer 2100 (Agilent), który wykorzystuje technikę elektroforezy kapilarnej. Pozwala on wykryć degradację RNA przy pomocy wskaźnika RIN (RNA Integrity Number) oraz określa stosunek ilości materiału w podjednostkach 18S i 28S. Do dalszych analiz wybrano jedynie próby o wartości RIN 9-10.

Dodatkowo, w celu usunięcia wszelkich zanieczyszczeń DNA, próby RNA poddano trawieniu DNazą. Do tego celu wykorzystano zestaw Turbo DNA-free Kit (Ambion). Ewentualną obecność DNA w próbach sprawdzano przy pomocy reakcji PCR (FastStartTaq DNA Polymerase, dNTPPack, Roche). Jako standardu użyto starterów β-globiny o stężeniu 10 pM/μl o następującej sekwencji:

F1:5’GTACGGCTGTCATCACTTAG 3’ (numer identyfikacyjny sekwencji 13)

R1:5’CCTGAGACTTCCACACTGAT 3’ (numer identyfikacyjny sekwencji 14).

Produkt PCR umieszczano na czipie DNA 7500 Agilent w celu sprawdzenia produktu DNA w próbach RNA.

Analiza mikromacierzy mRNA

Analiza mikromacierzy została przeprowadzona na próbkach RNA izolowanych z tkanki tłuszczowej, mięśni oraz PBMC. W PBMC analizy przeprowadzono w 2 punktach czasowych - w 0 i 120 minucie klamry. Metoda ta umożliwia analizę pełnego profilu genów (transkryptomu) oraz nie jest obciążona hipotezą badawczą a priori. Próby RNA były kwalifikowane do eksperymentu mikromacierzowego na podstawie RIN. Kolejnym etapem było przygotowanie znakowanych prób aRNA lub cDNA - zależnie od wybranego typu mikromacierzy, do którego później dana próba była hybrydyzowana. W trakcie uzyski

PL 237 595 B1 wania znakowanego materiału wykonywano szereg analiz jakościowych. Po etapie amplifikacji, znakowania i fragmentacji przeprowadzano testy jakości aby do hybrydyzacji wyselekcjonować jedynie próby spełniające wszystkie niezbędne kryteria jakościowe.

Znakowany kwas nukleinowy hybrydyzowano do mikromacierzy w odpowiednio dobranej temperaturze zależnie od typu mikromacierzy. RNA izolowany z tkanki mięśniowej i tłuszczowej po wyznakowaniu hybrydyzowano do mikromacierzy typu Affymetrix GeneChip Human Genome U133Plus 2.0, a z PBMC do mikromacierzy typu GeneChip Human Gene 2.0 st. Po etapie hybrydyzacji prowadzono płukanie i wybarwianie w stacjach płuczących, aby następnie używając urządzenia GeneChip Scanner 3000 7G otrzymać obraz mikromacierzy. Oprogramowanie Affymetrix Launcher generowało dla każdej hybrydyzowanej próby pliki Cel, które importowano do programu Partek Genomics Suite i wykonywano normalizację, analizę jakościową prób oraz analizę bioinformatyczną. Wstępną ocenę powtarzalności profilu ekspresji przeprowadzono z zastosowaniem analizy składowych głównych (Principal Component Analysis). Do wykrycia genów o istotnie zmienionej ekspresji zastosowano analizę wariancji (ANOVA). Następnie wyznaczono grupy genów i próbek o podobnych profilach ekspresji za pomocą analizy skupień (Hierarchical Clustering). Analizę funkcjonalną otrzymanych list genów wykonywano przy użyciu oprogramowania Ingenuity Pathway Analysis.

Metody analityczne

Stężenie glukozy w osoczu było mierzone metodą enzymatyczną przy użyciu analizatora biochemicznego (YSI 2300 STAT PLUS). Stężenie lipidów w surowicy oznaczono metodą kolorymetryczną przy użyciu autoanalizatora Cobas c111 (Roche Diagnostics, Mannheim, Niemcy). Aktywności: AspAt, AlAt oznaczono metodą kinetyczno-spektrofotometryczną przy użyciu analizatora ARCHITECTc4000 (całkowity współczynnik zmienności (CV, ang. coefficient of variation) dla AlAt wynosił poniżej 5,3%). Stężenie hsCRP zmierzono metodą nefelometryczną (Dade Behring, Marburg, Niemcy).

Stężenie insuliny w surowicy zmierzono metodą immunoradiometryczną (IRMA; DLAsource ImmunoAssays S.A., Nivelles, Belgia) o czułości 1 mlU/ml oraz wewnątrztestowymi i międzytestowymi wartościami CV wynoszącymi odpowiednio: poniżej 2,2% oraz 6,5%. Stężenie WKT w surowicy zmierzono przy użyciu komercyjnie dostępnego zestawu (Wako Chemicals, Richmond, VA, USA). Oznaczono także miano przeciwciał przeciwwyspowych.

Wszystkie oznaczenia wykonano przy użyciu znanych metod oraz komercyjnie dostępnych zestawów i analizatorów postępując według zaleceń producentów.

Analiza statystyczna

Analizę statystyczną przeprowadzono przy użyciu programu STATISTICA 15.5 (StatSoft Polska, Kraków). Przed przeprowadzeniem testów statystycznych sprawdzone zostały założenia normalności rozkładu i jednorodności wariancji w porównywanych grupach ochotników. Przy ocenie normalności rozkładu stosowano test Shapiro-Wilka, natomiast przy ocenie jednorodności wariancji test Levene’a oraz test Browna-Forsythe’a. Następnie przeprowadzono testy istotności różnic pomiędzy grupami ochotników. W przypadku porównania 2 grup zastosowano nieparametryczny test Manna-Whitneya oraz parametryczny test t-Studenta dla prób niezależnych. W celu analizy rozkładów zmiennych jakościowych w grupach wyznaczonych przez zmienną M przeprowadzono test niezależności chi-kwadrat Pearsona. Analizę korelacji oraz regresję prostą przeprowadzono dla zmiennych niezależnych oraz między zmiennymi niezależnymi i zmienną zależną M stosując analizę współczynnika korelacji rang R Spearmana, a także korelacji liniowej r Pearsona.

Ze względu na charakter problemu tj. dużą liczbę zmiennych oraz fakt, że była ona większa niż liczba obserwacji, zastosowano specjalne techniki analizy danych. W celu wykrycia układu czynników w optymalny sposób określających wrażliwość tkanek na insulinę, zbudowano złożone modele regresji: model liniowy z regularyzacją (regresja lasso) oraz model „supervised principal components”. Wykorzystano też metodę ścieżek stabilności służącą do ograniczenia liczby zmiennych, które weszły do modelu, ale nie mają związku z badanym zjawiskiem. Wykorzystuje się w niej wyniki modeli lasso przeprowadzanych na wielokrotnie próbkowanym podzbiorze (np. połowie) przypadków.

W analizach wykorzystano losowo dobraną próbę uczącą i próbę testową. Próba ucząca służy do budowy modeli a próba testowa do ich oceny. Podział zbioru na dwie próby jest zgodny z dobrą praktyką stosowaną przy budowie modeli i ma na celu zwiększenie wiarygodności oceny jakości przygotowanych modeli. Wielkość próby uczącej ustalono na poziomie 80% wielkości całej próby. W związku z tym do próby uczącej przypisano 120 ochotników a do próby testowej 30. W przypadku ekspresji genów we krwi pełnej, z uwagi na utratę części materiału, wyniki były dostępne u 73 osób.

PL237 595 Β1

W takiej sytuacji próba ucząca wynosiła 58 osób, a testowa - 15. Przydział badanych osób do prób był losowy, przy czym brano pod uwagę zgodność rozkładów zmiennej zależnej M w obu grupach.

Modele regresji zbudowano dla wszystkich badanych zmiennych oraz dla poszczególnych obszarów zmiennych (charakterystyka kliniczna, charakterystyka biochemiczna, ekspresja genów we krwi pełnej, w tkankach). Do opracowania wskaźnika wykorzystano ekspresję genów we krwi pełnej. Do budowy modeli wykorzystano oprogramowanie STATISTICA Data Miner (StatSoft, 2011) oraz pakiet R (pakiety impute, glmnet oraz superpc). We wszystkich analizach poziom istotności statystycznej przyjęto dla p < 0,05.

Wyniki

Zaobserwowano, że obszary zmiennych dotyczące charakterystyki klinicznej i biochemicznej oraz ekspresji genów we krwi pełnej pozwalają na predykcję wrażliwości na insulinę niezależnie od siebie nawzajem.

Charakterystyka kliniczna osób z wysoką i niską wrażliwością tkanek na insulinę według badania klamry przedstawiona jest w Tabeli 2.

Osoby z niską wrażliwością tkanek na insulinę cechowały się wyższym skurczowym ciśnieniem tętniczym (p=0,046), masą ciała (p=0,002), BMI (p=0,013), obwodem talii (p=0,0004), obwodem bioder (p=0,001 ) oraz wskaźnikiem talia-biodra (WHR, p=0,039), stężeniem glukozy w osoczu (p=0,023), insuliny w surowicy (p=0,0027), wyższymi stężeniami cholesterolu całkowitego (p=0,007), triglicerydów (p=0,0001) i LDL cholesterolu (p=0,037), natomiast niższym stężeniem HDL-cholesterolu (p=0,03), wyższą ilością krwinek czerwonych (RBC, p=0,0018), stężeniem hemoglobiny we krwi (Hb, p=0,008), hematokrytem (Ht, p=0,019), liczbą krwinek białych (WBC, p=0,003), aktywnością AlAt (p=0,002), stężeniem sodu (p=0,001), kwasu moczowego (p=0,004), klirensem kreatyniny (p=0,003), wyższą TIBC (p=0,02) oraz ferrytyną (p=0,02) (Tabela 2 poniżej). U wszystkich badanych osób stwierdzono ujemne miano przeciwciał przeciwwyspowych.

T a b e I a 2. Charakterystyka kliniczna osób z wysoką (M > 6 mg/kg FFM/min; n = 90) i niską (M < 6 mg/kg FFM/min; n = 60) wrażliwością tkanek na insulinę.

	Wysoka wrażliwość na insulinę	Niska wrażliwość na insulinę
Wiek (lata)	23,41±2,76	23,37±3,18
Ciśnienie skurczowe	121,53+14,63	125,80±9,21*
(mmHg) Ciśnienie rozk. (mmHg)	76,38±8,22	78,32±7,69
Masa ciała (kg)	76,67+13,87	84,48±17,03*
BMI (kg/m²)	24,47+3,67	26,14±4,44*
Obwód talii (cm)	84,91±9,70	91,65±12,97*
Obwód bioder (cm)	98,29±8,90	103,10±8,50*
WHR	0,86±0,06	O,89±O,O8*
% tłuszczu	21,72±8,86	22,85±9,06

PL 237 595 Β1

Glukoza w osoczu	85,5317,92	88,6718,64*
(mg/dl)
Insulina w surowicy	10,10+5,22	13,01+6,42*
(μΐυ/ml)
WKT w surowicy	0,65+0,26	0,7210,28
(mmol/1)
Cholesterol (mg/dl)	164,77129,01	178,84132,38*
Triglicerydy (mg/dl)	76,48+32,40	104,65154,67*
HDL-cholesterol (mg/dl)	61,31112,34	56,98110,73*
LDL-cholesterol (mg/dl)	95,83128,66	107,26136,71*
RBC (mln/μΐ)	4,9610,42	5,17+0,34*
Hb(g/dl)	14,6411,21	15,1310,90*
Ht (%)	43,32+3,42	44,53+2,46*
WBC (tys/μΐ)	5,9011,11	6,5011,33*
Płytki krwi (tys/μΐ)	240,18141,63	244,17148,62
Fibrynogen (mg/dl)	281,82149,60	287,22151,07
AspAt (U/l)	23.70+9,56	23,92+7,47
AlAt (U/l)	21,98115,64	28,58113,12*
Sód (mmol/1)	138,5312,36	139,87+2.57*
Potas (mmol/1)	4,3610,31	4,42+0,35
Wapń całk. (mmol/1)	2,43+0,12	2,46+0,11
Żelazo (pg/dl)	106,41144,37	94,02141,48
TIBC (gg/dl)	304_t67±93,65	338,84174,28*
Fenytyna (ng/ml)	60,28147,16	78,66147,99*
Kwas moczowy (mg/dl)	4,8011,12	5,341,13*
Kreatynina (mg/dl)	0,9210,19	0,93+0,11
Klirens kreatyniny	131,82±26,40	146,16131,11*
(ml/min)
Białko całk. (g/dl)	7,3710,39	7,4710,35
Albuminy (%)	61,21+3,66	62,2314,04
β-globuliny (%)	11,68+1,20	12,09+1,46

PL237 595 Β1

γ-globuliny (%) hsCRP (mg/1) M (mg/kg FFM/min)	15,61+8,02 0,61 ±0,56 8,94+2,51	13,85±2,49 0,81+0,77 4,57±l,04*
* p < 0,05 vs grupa z wyso	cą wrażliwością na insulinę

Przykład2

Pomiar ekspresji genów metodą odwrotnej transkrypcji i PCR w czasie rzeczywistym

Ekspresję genów wytypowanych na podstawie analiz mikromacierzy PBMC weryfikowano następnie metodą Real Time PCR we krwi pełnej.

Odwrotna transkrypcja

Sprawdzone RNA przepisano na cDNA przy pomocy kitu OuantiTect Reverse Transcripion, Qiagen. Do reakcji użyto O^g całkowity RNA. Reakcja przebiega w 2 etapach. W pierwszym etapie następuje eliminacja genomowego DNA. Polega to na oczyszczeniu prób RNA poprzez krótką inkubację w 42°C przez 4 min w gDNA Wipeout Buffer. W drugim etapie zachodzi odwrotna transkrypcja. Dodane zostają; Ouantiscript Reverse Transcriptase (otrzymana z E.Coli), Ouantiscript RT Buffer 5x (dNTP) oraz RT Primer Mix (mieszanina oligo-dT oraz Randomprimer, co zapewnia wysokiej jakości cDNA zawierający wszystkie regiony transkryptu RNA, nawet z regionu 5’). Tak przygotowaną próbę inkubowano w 42°C przez 15 min, a następnie w 95°C przez 3 min, kiedy to dochodzi do deaktywacji odwrotnej transkryptazy.

Analiza ekspresji genów w tkankach metodą Real Time PCR

Ekspresję genów w tkankach ocenianą analizą mikromacierzy w największym stopniu różnicującą grupy osób z wysoką i niską wrażliwością tkanek na insulinę, a także najbardziej zmienioną pod wpływem insuliny, weryfikowano następnie w reakcji łańcuchowej polimerazy w czasie rzeczywistym (Real Time PCR). Ekspresję genów w PBMC uzyskaną w analizie mikromacierzy w największym stopniu różnicującą grupy osób z wysoką i niską wrażliwością tkanek na insulinę, a także najbardziej zmienioną pod wpływem insuliny potwierdzano we krwi pełnej metodą Real Time PCR. Ponadto, po wstępnej analizie statystycznej, ekspresję niektórych genów wytypowanych na podstawie analizy mikromacierzy w tkankach oceniono metodą Real Time PCR we krwi pełnej.

Ekspresję wytypowanych genów badano metodą Real Time PCR przy pomocy specyficznych starterów oraz sond TaqMan Real Time PCR), na sprzęcie Light Cycler480ll Roche (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Niemcy). W reakcji zastosowano następujący skład mieszaniny reakcyjnej: 5 μΙ LightCycler480 Probes Master (mieszanina reakcyjna zawierająca polimerazę FastStartTaq DNA), 0,5 μΙ RealTime Ready Assay - mieszanina starterów i sond TaqMan (końcowe stężenie starterów 8 pmol oraz sondy TaqMan 4pmol), 1 μΙ otrzymanego cDNA (końcowe stężenie 75 pg). Całość uzupełniono wodą (PCR Grade) do końcowej objętości równej 10 μΙ.

Reakcję PCR przeprowadzono w następujących warunkach reakcyjnych:

- etap wstępnej denaturacji i aktywacji polimerazy DNA (10 min, 95°C),

- 45 cykli namnażania badanego DNA przebiegających w 3 etapach: denaturacji (10 s, 95°C), przyłączenia starterów (30 s, 60°C) oraz syntezy (72°C, 1 s),

- chłodzenie urządzenia (30 s, 40°C).

Próbki RNA testowano na obecność pozostałości DNA przy użyciu metody reakcji łańcuchowej polimerazy (ang. polymerase Chain reaction, PCR) stosując startery komplementarne do genu β-globiny o stężeniu 10 ρΜ/μΙ (F1:5’GTACGGCTGTCATCACTTAG 3’; R1:5’CCTGAGACTTCCACACTGAT 3’; odpowiednio numery identyfikacyjne sekwencji 13 i 14).

Reakcja PCR przebiegała następująco: przeprowadzono wstępną denaturację (4 min, 94°C), 35 cykli denaturacji (45 s, 95°C), przyłączania starterów (45 s, 57°C) i syntezy (60 s, 72°C)). Do reakcji PCR brano 2,5 μΙ RNA oczyszczonego jak opisano powyżej.

Badania wykonano w trzech powtórzeniach. Wykorzystano testy Real-Time Ready Custom RTqPCR (Roche Diagnostics GmbH). Jako gen referencyjny wykorzystano dehydrogenazę gliceraldehydo-3-fosforanową (ang. glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH). Obliczenia wykonano przy użyciu programu Light Cycler480 Software 1.5.0 SP3. Porównuje on poziom dwóch różnych sekwencji docelowych w pojedynczej próbce (gen badany i gen odniesienia (referencyjny)), gdzie końcowy wynik wyrażany jest jako stosunek poziomów tych genów. Stosunek docelowego genu do genu

PL 237 595 Β1 referencyjnego jest względną, bezwymiarową liczbą, ma znaczenie tylko w porównaniu pomiędzy próbkami. Sekwencje stosowanych starterów przedstawia Tabela 3.

T a b e I a 3. Sekwencje starterów

PL237 595 Β1

Sekwencje matrycowe (cDNA), odpowiednich amplikonów wskazanych powyżej genów, dla wskazanych powyżej starterów podano w załączonym wykazie sekwencji.

Dla genu KLF9 jest to sekwencja:

CTCCGAAAAGAGGCACAAGTGCCCCTACAGTGGCTGTGGGAAAGTCT

ATGGAAAATCCTCCCATCTCAAAGCCCATTACAGAGTGCATACAGGTG

AACGGCCCTTTCCCTGCACGTGGCCAGACTGC

CTTAAAAAGTTCTCCCG (nr identyfikacyjny sekwencji 9).

Dla genu PEMT jest to sekwencja:

GGCCTCGGCAATATTGATTTTAGACAGGCAGACTTCTGCGTTATGACC

CGGCTGCTGGGCTACGTGGAC (nr identyfikacyjny sekwencji 10)

Dla genu EGFR1 jest to sekwencja:

AGCACCTGACCGCAGAGTCTnTCCTGACATCTCTCTGAACAACGAGA

AGGTGCTGGTGGAG

ACCAGTTACCCCAGCCAAACCACTCGACTGCC (nr identyfikacyjny sekwencji 11).

Dla genu referencyjnego GAPDH jest to sekwencja:

CACTAGGCGCTCACTGTTCTCTCCCTCCGCGCAGCCGAGCCACATCGC

TCAGACACCATGGGGAAGGTGAAGGTCGGAGTCAACGGATTTGGTCG

TATTGGGC (nr identyfikacyjny sekwencji 12).

Mając na uwadze prostotę potencjalnego wskaźnika, analizy przeprowadzono we krwi pełnej pobranej na czczo. Jak wspomniano, oprócz genów wytypowanych na podstawie analiz PBMC, uwzględniono również ekspresję we krwi pełnej genów, których ekspresja w tkankach w największym stopniu była związana z insulinowrażliwością w złożonych modelach regresji: KLF9 (pierwotnie wytypowany w mięśniu) oraz PEMT (pierwotnie wytypowany w tłuszczu). Najbardziej istotne różnice w ekspresji badanych genów między grupami osób z wysoką i niską wrażliwością tkanek na insulinę przedstawione są w Tabeli 4, a wyniki analiz jednoczynnikowych korelacji badanych parametrów (tzn. ekspresji genów we krwi pełnej) ze zmienną zależną M - w Tabeli 5.

T a b e I a 4. Istotne różnice w ekspresji genów we krwi pełnej między grupami osób z wysoką i niską wrażliwością tkanek na insulinę.

	Wysoka wrażliwość na insulinę	Niska wrażliwość na insulinę
Log2 KLF9	-4,94±0_t53	-4,65±0,39*
Log2 PEMT	-6,80±0,64	-7,17±0,51*
Log2 EGR1	-6,71±0,85	-7,16±0,72*

PL 237 595 Β1

T a b e I a 5. Korelacje najbardziej istotnych badanych parametrów na czczo ze zmienną zależną M

	R Pearsona	P
Log2 KLF9	-0,41	0,0004
Log2 PEMT	0,37	0,002
Log2 EGR1	0,37	0,002

Następnie zastosowano opisane wcześniej złożone modele regresji. Na tej podstawie opracowano ujawniony tu wskaźnik wrażliwości tkanek na insulinę według, a jego parametry znajdują się w Tabeli 6 poniżej.

T a b e I a 6. Współczynniki modelu z obszaru ekspresja genów we krwi pełnej w najlepszym stopniu przewidujące zmienną M.

Zmienna	Średnia	S.D.	Współczynnik
Wyraz wolny			7,2109
Log2 KLF9	-4,86	0,51	-1,8717
Log2 PEMT	-6,90	0,63	1,2903
U)&EGR1	-6,84	0,84	0,1145

S.D. - odchylenie standardowe.

Współczynnik - współczynniki równania pozwalającego wyznaczyć wartość przewidywaną zmiennej zależnej M na podstawie oryginalnych (niewystandaryzowanych) wartości predyktorów.

Miary jakości dopasowania modelu przedstawia Tabela 7.

T a b e I a 7. Miary jakości dopasowania przedstawianego modelu.

Model	Charakterystyka
N zmiennych	34
N model	3
R²	0,31
R	0,56
RMSE	1.91
AUC	0,82

N zmiennych - liczba zmiennych niezależnych w zbiorze danych wykorzystanym w budowie modelu,

N model - liczba zmiennych niezależnych używanych w modelu,

R² - współczynnik determinacji,

R - współczynnik korelacji r Pearsona między wartościami obserwowanymi i przewidywanymi zmiennej zależnej M,

RMSE- pierwiastek kwadratowy z błędu średniokwadratowego,

AUC wartość AUC (pole pod krzywą ROC}.

PL237 595 Β1

Pole pod krzywą (AUC, ang. area underthe curve) wykresu ROC (ang. receiver operating characteristics) dla próby testowej świadczy o uzyskaniu mocy diagnostycznej wynoszącej 0,82.

Wykresy czułości i specyficzności ilustrują jak zmienia się czułość i specyficzność testu w zależności od punktu odcięcia. Figura 1 przedstawia krzywą dla próby testowej. Dla punktu odcięcia 6,30 czułość opracowanego wskaźnika insulinowrażliwości wynosi 80%, natomiast specyficzność -78%.

Przykład3

Porównanie wskaźnika insulinowrażliwości tu ujawnionego z innymi sposobami i wskaźnikami insulinowrażliwości/insulinooporności.

Zbadano również różnice między opracowanym sposobem oznaczania wrażliwości na insulinę i wskaźnikiem insulinowrażliwości tu ujawnionym oraz innymi sposobami i wskaźnikami insulinowrażliwości/insulinooporności znanymi w tej dziedzinie. Grupa osób z niską wrażliwością na insulinę wykazywała wyższy wskaźnik HOMA-IR (p=0,003) oraz niższy wskaźnik QUICKI (p=0,002). Najwyższą istotność statystyczną zaobserwowano dla opracowanego przez twórców niniejszego wynalazku wskaźnika insulinowrażliwości - był on istotnie niższy w grupie osób z niską wrażliwością na insulinę ocenioną w badaniu klamry (p=0,0005) (Tabela 8).

T a b e I a 8. Opracowany wskaźnik oraz inne wskaźniki insulinowrażliwości/insulinooporności w badanych grupach osób.

	Wysoka wrażliwość na insulinę	Niska wrażliwość na insulinę	P
Wskaźnik	6,92±1,17	5,84±l,03	0,0005
insulinowrażliwości
HOMA-IR	2,18±l,06	3,35+2,07	0,003
QUICKI	0,15+0,01	0,14±0,01	0,002
M (mg/kg FFM/min)	9,34+2,77	4,73+0,93	0,000000

Przeanalizowano również korelację opracowanego przez twórców niniejszego wynalazku wskaźnika z wynikiem wrażliwości na insulinę uzyskanym w badaniu klamry i wykazano silną, istotną korelację ze zmienną M (r=0,56, p < 0,000001, Figura 2A), która to korelacja jest silniejsza niż w przypadku wskaźnika HOMA-IR (r=-0,39, p=0,001, Figura 2B) oraz OUICKI (r=0,36, p=0,002, Figura 2C). Znaczy to, że przedstawiony wskaźnik lepiej i precyzyjniej odzwierciedla wrażliwość tkanek na insulinę.

Przykład4

Identyfikacja insulinooporności i określanie predyspozycji do zaburzenia związanego z insulinoopornością

U ochotnika (nr 136) przeprowadzono sposób identyfikacji insulinooporności i/lub określania predyspozycji do zaburzenia związanego z insulinoopornością w sposób opisany powyżej. Wszystkie badania i analizy przeprowadzono w sposób opisany powyżej. Uzyskano następujące wartości pomiarów: KLF9: 0,064 (Iog2 =-3,977), PEMT: 0,006 (Iog2 =-7,345), EGR1: 0,013 (Iog2 =-6,31). Następnie w następujący sposób obliczono wskaźnik insulinowrażliwości zgodnie z niniejszym wynalazkiem:

Wskaźnik insulinowrażliwości =7,2109 - (-3,977) x 1,8717 + (-7,345) x 1,2903 + (-6,31) x 0,1145 =4,458.

Uzyskano wartość wskaźnika insulinowrażliwości wynoszącą 4,458, znacznie poniżej punktu odcięcia wynoszącego 6,3, i stwierdzono występowanie insulinooporności oraz predyspozycji do zaburzenia związanego z insulinoopornością u tej osoby.

Wynik ten potwierdzono z zastosowaniem badania techniką klamry w sposób i z użyciem zestawów i aparatury jak opisano powyżej. Uzyskano wartość M wynoszącą 4,289 mg/kg FFM/min, co świadczy o występowaniu insulinooporności u tej osoby.

Wyniki te świadczą zatem o tym, że wynalazek pozwala na określanie występowania insulinooporności i predyspozycji do zaburzeń z nią związanych na podstawie wyników pomiarów uzyskanych z jednorazowego pobrania krwi, w sposób czuły, specyficzny, szybki i wiarygodny.

PL 237 595 B1

P r z y k ł a d 5

Identyfikacja braku insulinooporności i określanie braku predyspozycji do zaburzenia związanego z insulinoopornością.

U ochotnika (nr 125) przeprowadzono sposób identyfikacji insulinooporności i/lub określania predyspozycji do zaburzenia związanego z insulinoopornością w sposób opisany powyżej. Wszystkie badania i analizy przeprowadzono w sposób i z zastosowania zestawów i analizatorów jak opisano powyżej. Uzyskano następujące wartości pomiarów; KLF9: 0.019 (log2 = -5,695), PEMT: 0,011 (log2 = -6,493), EGR1: 0.036 (log2 =-4.78). Następnie w następujący sposób obliczono wskaźnik insulinowrażliwości zgodnie z niniejszym wynalazkiem:

Wskaźnik insulinowrażliwości = 7,2109 - (-5.695) x 1,8717 + (-6,493) x 1,2903 + (-4,78) x 0.1145 = 8.947.

Uzyskano wartość wskaźnika insulinowrażliwości wynoszącą 8,947, znacznie powyżej punktu odcięcia wynoszącego 6,3 i stwierdzono zatem występowanie wysokiej wrażliwości tkanek na insulinę, brak insulinooporności u tej osoby.

Wynik ten potwierdzono z zastosowaniem badania techniką klamry w sposób opisany powyżej. Uzyskano wartość M wynoszącą 11,518 mg/kg FFM/min. co świadczy o nie występowaniu u tej osoby insulinooporności.

Wyniki te świadczą zatem o tym, że wynalazek pozwala na określanie wrażliwości tkanek na insulinę, ocenę występowania insulinooporności i predyspozycji do zaburzeń z nią związanych na podstawie wyników pomiarów uzyskanych z jednorazowego pobrania krwi, w sposób czuły, specyficzny, szybki i wiarygodny.

PL 237 595 B1

Wykaz sekwencji < 110> Uniwersytet Medyczny w Białymstoku < 120> Sposób oznaczania wrażliwości tkanek na insulinę < 130> 17P39554PLOO < 160> 14 < 170> BiSSAP 1.3.6 < 210> 1 < 211> 20 < 212> DNA < 213> Homo sapiens <220>

< 223> starter przedni dla genu KLF9 < 400> 1 ctccgaaaag aggcacaagt < 210> 2 < 211> 22 < 212> DNA < 213> Homo sapiens <220>

< 223> starter wsteczny dla genu KLF9 < 400> 2 cgggagaact ttttaaggca gt 22 < 210> 3 < 211> 19 < 212> DNA < 213> Homo sapiens <220>

< 223> starter przedni dla genu PEMT < 400> 3 ggcctcggca atattgatt 19 < 210> 4 < 211> 18 < 212> DNA < 213> Homo sapiens <220>

< 223> starter wsteczny dla genu PEMT < 400> 4 gtccacgtag cccagcag 18 < 210> 5 < 211> 18 < 212> DNA < 213> Homo sapiens <220>

< 223> starter przedni dla genu EGR1 < 400> 5 agcacctgac cgcagagt 18 < 210> 6 < 211> 18 < 212> DNA < 213> Homo sapiens <220>

< 223> starter wsteczny dla genu EGR1 < 400> 6 ggcagtcgag tggtttgg 18 < 210> 7 < 211> 19

PL 237 595 B1 < 212> DNA < 213> Homo sapiens <220>

< 223> starter przedni dla genu GAPDH < 400> 7 ctctgctcct cctgttcgac 19 < 210> 8 <211> 20 <212> DNA < 213> Homo sapiens <220>

< 223> starter wsteczny dla genu GAPDH < 400> 8 acgaccaaat ccgttgactc 20 < 210> 9 <211> 144 <212> DNA < 213> Homo sapiens <220>

< 223> sekwencja amplikonu dla genu KLF9 < 400> 9 ctccgaaaag aggcacaagt gcccctacag tggctgtggg aaagtctatg gaaaatcctc60 ccatctcaaa gcccattaca gagtgcatac aggtgaacgg ccctttccct gcacgtggcc120 agactgcctt aaaaagttct cccg144 < 210> 10 <211> 69 <212> DNA <213> Homo sapiens <220>

<223> sekwencja amplikonu dla genu PEMT <400> 10 ggcctcggca atattgattt tagacaggca gacttctgcg ttatgacccg gctgctgggc 60 tacgtggac 69 <210> 11 <211> 94 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> sekwencja amplikonu dla genu EGR1 <400> 11 agcacctgac cgcagagtct tttcctgaca tctctctgaa caacgagaag gtgctggtgg 60 agaccagtta ccccagccaa accactcgac tgcc 94 <210> 12 <211> 103 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> sekwencja amplikonu dla genu GAPDH <400> 12 cactaggcgc tcactgttct ctccctccgc gcagccgagc cacatcgctc agacaccatg 60 gggaaggtga aggtcggagt caacggattt ggtcgtattg ggc 103 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <220>

PL 237 595 B1 < 223> starter przedni dla genu beta globiny < 400> 13 gtacggctgt catcacttag 20 < 210> 14 < 211> 20 < 212> DNA < 213> Homo sapiens <220>

< 223> starter wsteczny dla genu beta globiny < 400> 14

Cctgagactt ccacactgat

Claims

1. Sposób oznaczania wrażliwości tkanek na insulinę u osoby, znamienny tym, że:

c) z próbki krwi pełnej pobranej od osoby izoluje się RNA i mierzy się ekspresję następujących genów: KLF9, PEMT i EGR1;

d)oznacza się wskaźnik insulinowrażliwości na podstawie uzyskanych wyników pomiarów z punktu a) za pomocą następującego równania:

KLF9 oznacza wartość pomiaru ekspresji genu KLF9,

PEMT oznacza wartość pomiaru ekspresji genu PEMT,

2. Sposób identyfikacji insulinooporności i/lub określania predyspozycji do zaburzenia związanego z insulinoopornością u osoby, znamienny tym, że

d) oznacza się wskaźnik insulinowrażliwości na podstawie uzyskanych wyników pomiarów z punktu a) za pomocą następującego równania:

KLF9 oznacza wartość pomiaru ekspresji genu KLF9,

PEMT oznacza wartość pomiaru ekspresji genu PEMT,

EGR1 oznacza wartość pomiaru ekspresji genu EGR1:

c) identyfikuje się insutinooporność i/lub określa się predyspozycje do zaburzenia związanego z insulinoopornością przy uzyskaniu wartości wskaźnika insulinowrażliwości wynoszącej 6,3 lub mniej.

3. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że w etapie a) izoluje się RNA i ekspresję wskazanych genów mierzy się metodą odwrotnej transkrypcji i PCR w czasie rzeczywistym.

4. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że w metodzie PCR w czasie rzeczywistym stosuje się następujące startery: dla genu KLF9 starter przedni o sekwencji nr 1 (5'-CTCCGAAAAGAGGCACAAGT ) i starter wsteczny o sekwencji nr 2 ( 5' CGGGAGAACTTTTTAAGGC AGT), dla genu PEMT starter przedni o sekwencji nr 3 ( 5' -GGCCTCGGCAATATTGATT) i starter wsteczny o sekwencji nr 4 (5‘-GTCTACGTAGCCCAGCAG), dla genu EGR1 starter przedni o sekwencji nr 5 (5'-AGCACCTGACCGCAGAGT) i starter wsteczny o sekwencji nr 6 (5' GGCAGTCGAGTGGTTTGG).

PL 237 595 Β1

5. Sposób według zastrz. 3 albo 4, znamienny tym, ze mierzy się także ekspresję mRNA genu referencyjnego, zwłaszcza GAPDH.

6. Sposób według zastrz. 5, znamienny tym, że w metodzie PCR w czasie rzeczywistym stosuje się następujące startery dla genu referencyjnego GAPDH: starter przedni o sekwencji nr 7 (5'CTCTGCTCCTCCTGTTCGAC) i starter wsteczny o sekwencji nr 8 ( 5’ -ACGACCAAATCCGTTGACTC).

7. Sposób według jednego z zastrz. 2 do 6, znamienny tym, że sposób ten stosuje się do prognozowania, diagnozowania, w tym do wczesnego diagnozowania, i/lub monitorowania terapii zaburzenia związanego z insulinoopornością.