CN102329008A - 利用基于磁性介孔碳的固定化漆酶去除水体中酚类污染物的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种利用基于磁性介孔碳的固定化漆酶去除水体中酚类污染物的方法，包括以下步骤：先调节待处理的含酚水体的pH值为5.0～6.0，并调节含酚水体中的酚类初始浓度为1mM～4mM，然后在所述含酚水体中加入基于磁性介孔碳的固定化漆酶，每毫升含酚水体中加入的基于磁性介孔碳的固定化漆酶不少于0.6mg，接着在25℃～30℃的温度下对混合液进行振荡反应6h～12h，再通过磁性分离将基于磁性介孔碳的固定化漆酶与水体分离，将分离后的水体调节至中性后排放，完成对水体中酚类污染物的去除；本发明的方法操作简便、成本低、处理工艺简单、去除效率高。

Description

利用基于磁性介孔碳的固定化漆酶去除水体中酚类污染物的方法

技术领域

本发明涉及废水处理领域，具体涉及利用基于磁性介孔碳的固定化漆酶去除水体中酚类污染物的方法。

背景技术

酚类污染物作为一类持久性有机污染物，具有较高的毒性和稳定性，少量进入环境即可造成较高的公共健康风险，且难以通过自净作用在环境中去除，对其降解转化方法的研究近年来引起了广泛的关注。生物降解技术，尤其是生物催化技术，作为一种新兴的处理方法，具有能耗低、易操作、降解效率高等优点，是一项前景广阔的处理技术。

漆酶(laccase，E.C.1.10.3.2)是一种含铜多酚氧化酶，具有较广泛的底物专一性和较强的稳定性，能催化许多酚类和芳香胺类物质，如苯酚、对氯苯酚、苯胺以及多酚和多胺类物质，因而广泛应用于生物转化及废水处理中。但由于在水中游离漆酶不可回收也不能长期保存，且在高温或其他极端环境下稳定性不易保持，限制了其在实际中的应用。固定化技术是提高漆酶重复利用性和稳定性的有效手段，常用的固定化载体包括活性炭、壳聚糖、多孔硅胶、微滤膜多种材料。

因此，利用固定化的漆酶去除水体中酚类污染物，具有很多优势，但现有的利用固定化漆酶去除水体中酚类污染物的方法，操作复杂，去除效率低。

新型介孔材料由于具有纳米规整有序孔道结构和巨大的比表面积及孔容等特征，在生物催化和分离尤其是作为酶固定化载体的研究和应用上显示了极大潜力。文献(Andrea Salis et al，Journal of Molecular Catalysis B：Enzymatic，2009，175-180)用功能化介孔硅SBA-15固定来自Pleurotus sajor-caju的漆酶，可用于处理含多种酚类污染物的橄榄油作坊废水。但介孔材料具有制备过程繁琐、难以分离的缺点。

发明内容

本发明要解决的技术问题是：针对现有技术的不足，提供一种操作简便、成本低、处理工艺简单、去除效率高的利用基于磁性介孔碳的固定化漆酶去除水体中酚类污染物的方法。

为解决上述问题，本发明采用以下技术方案：

一种利用基于磁性介孔碳的固定化漆酶去除水体中酚类污染物的方法，包括以下步骤：先调节待处理的含酚水体的pH值为5.0～6.0，并调节含酚水体中的酚类初始浓度为1mM～4mM，然后在所述含酚水体中加入基于磁性介孔碳的固定化漆酶，每毫升含酚水体中加入的基于磁性介孔碳的固定化漆酶不少于0.6mg，接着在25℃～30℃的温度下对混合液进行振荡反应6h～12h(振荡反应采用摇床进行，所述摇床的转速为100rpm～150rpm)，再通过磁性分离将基于磁性介孔碳的固定化漆酶与水体分离，将分离后的水体调节至中性后排放，完成对水中酚类污染物的去除。

上述的技术方案中，优选地，所述含酚水体的pH值为6.0，所述含酚水体的酚类初始浓度为2mM，所述振荡反应的温度为30℃，所述振荡反应的时间为12h。

作为对上述技术方案的优化，上述方法采用的基于磁性介孔碳的固定化漆酶以磁性介孔碳为载体，漆酶通过物理吸附作用固定于所述磁性介孔碳上，所述磁性介孔碳的孔道内嵌入有磁性纳米颗粒，所述磁性介孔碳上的漆酶吸附量在140mg/g以上，所述固定化漆酶的酶活性回收率为60％～95％(优选的技术方案可达75％～95％)。

作为对上述技术方案的优化，所述的磁性介孔碳与漆酶的质量配比为1∶(1～2.5)。

作为对上述技术方案的优化，所述磁性介孔碳含有有序双峰介孔结构，所述有序双峰介孔结构是指孔径分布的两个峰值分别出现在4nm附近区域和18nm附近区域。4nm附近区域特别是指孔径主要集中分布在4nm～5nm的孔径范围内，18nm附近区域特别是指孔径主要集中分布在14nm～18nm的孔径范围内。

作为对上述技术方案的优化，所述的基于磁性介孔碳的固定化漆酶，通过以下方法得到：先准备磁性介孔碳和漆酶溶液，所述漆酶溶液中漆酶的初始浓度为0.3mg/ml～1.0mg/ml，所述漆酶溶液的pH值为3.0～6.0；然后将磁性介孔碳加入至所述漆酶溶液中，在25℃～30℃的温度下对该溶液振荡3h以上；再经过洗涤、磁性分离、冷冻和真空干燥后，得到固定化漆酶。

作为对上述技术方案的进一步优化，所述漆酶溶液中漆酶的初始浓度为0.4mg/ml或1.0mg/ml，所述漆酶溶液的pH值为4.0，所述振荡的转速为100rpm，所述振荡的时间为3h。

本发明的固定化漆酶的上述应用中，固定化漆酶的制备方法对固定化漆酶产品的性能有着重要影响，而固定化漆酶产品的性能又会进一步影响漆酶在废水中的应用处理效果，因此，优化和确定漆酶的固定化时间，漆酶溶液的pH值以及漆酶的初始浓度对本发明有着重要意义。我们以不同固定化条件下的载体吸附酶量和固定化酶活性作为确定标准，通过以下实验得到了本发明的固定化漆酶制备方法中的工艺参数。

1.固定化时间范围的确定

取40mg磁性介孔碳作为载体，加入100mL装有40mg漆酶的磷酸缓冲液中(浓度为50mM，pH值为4.0)，于30℃下以100rpm的速度振荡15min～420min，磁性分离后用缓冲液清洗数次；用福林酚试剂法(lowry法)分别测定固定前缓冲溶液中漆酶量及固定后缓冲液中剩余的漆酶量，计算不同时间内单位载体吸附的漆酶量，得到的结果如表1所示；由表1可知，单位载体吸附漆酶量随时间增长不断增高，但在3h后吸附漆酶量达到平衡，因此，适宜的固定化时间范围为3h以上；考虑到随着时间延长，漆酶活损失增加，因此，上述技术方案中确定的优选振荡固化时间为3h～7h，最佳的固定化时间为3h。

表1：不同振荡时间下载体吸附漆酶量

时间(min)	15	30	60	120	180	300	420
								吸附漆酶量(mg/g)	56.7	116.7	163.3	183.3	216.7	220	223.3

2.pH值范围的确定

调节柠檬酸缓冲液pH值为3.0～4.0，磷酸缓冲液pH值为5.0～8.0；取40mg磁性介孔碳作为载体，加入100mL装有40mg漆酶的不同pH值的缓冲液中(浓度50mM)，于30℃下以100rpm的速度振荡3h，磁性分离后用缓冲液清洗数次；用紫外分光光度计测定固定化漆酶氧化2，2-连氮-二(3-乙基并噻-6-磺酸)(ABTS)吸光度在420nm处的变化，得到的固定化漆酶的相对活性情况如表2所示；由表2可知，固定化漆酶的相对活性在pH值为3.0～6.0时较高。因此，上述技术方案中优选的pH值范围为4.0～6.0，最佳pH值为4.0，此时相对活性最高。

表2：不同pH值条件下制得的固定化漆酶的相对活性

pH值	3.0	4.0	5.0	6.0	7.0	8.0
							相对活性(％)	58.9	100	69.8	62.5	39.2	32.9

3.初始漆酶浓度范围的确定

取40mg磁性介孔碳作为载体，加入100mL装有10mg～400mg漆酶的磷酸缓冲液中(浓度为50mM，pH值为4.0)，于30℃下以100rpm的速度振荡3h，磁性分离后用缓冲液清洗数次；分别测定不同初始漆酶浓度的条件下，载体吸附漆酶量、固定化漆酶的相对活性以及固定化漆酶的酶活性回收率(即活性恢复R，活性恢复R按以下公式计算得来：R(％)＝(Ai/Af)×100)；其中，A_i表示固定化漆酶的活性，A_f表示同等质量的游离漆酶的活性)，测得的结果如表3所示，由表3可知，载体吸附漆酶量随着初始漆酶浓度增加而不断增长，而在0.4mg/ml～2.0mg/ml初始漆酶浓度条件下制备的固定化漆酶的相对活性较高，但在0.1mg/ml～1.0mg/ml初始漆酶浓度范围内，固定化漆酶的活性恢复较高；因此，适宜的初始酶浓度范围为0.3mg/ml～1.0mg/ml，最佳初始漆酶浓度为0.4mg/ml左右或1.0mg/ml，此时漆酶吸附量和酶活性回收率均相对较高，且相对活性也维持在一个较高水平。

表3：不同初始漆酶浓度下制得的固定化漆酶性质

作为对上述技术方案的优化，所述磁性介孔碳通过下述方法得到：

(1)先将嵌段共聚物与正硅酸乙酯在30℃～35℃的温度下混合搅拌20h～24h，再将混合液转移至135℃～140℃下水热反应22h～24h，得到白色沉淀，将所述白色沉淀洗涤至中性后过滤、干燥，得到白色粉末；

(2)将上述得到的白色粉末在500℃～550℃的温度下煅烧4h～5h(模板剂被脱除)后得到介孔硅模板；

(3)利用初湿浸渍法将由金属硝酸盐、乙醇和糠醇组成的多元溶液渗透到所述介孔硅模板中，然后在70℃～80℃的空气中对渗透有多元溶液的介孔硅模板固化10h～12h，干燥后得到复合物；

(4)将上述得到的复合物在N₂中于800℃～900℃的温度下热处理1h～2h，然后用加热至80℃～90℃的氢氧化钠溶液洗涤移除复合物中的硅模板，再对移除硅模板后的复合物过滤、清洗和干燥，得到磁性介孔碳。

上述的技术方案中，所述金属硝酸盐优选是指摩尔比为1∶(1～11)的Fe(NO₃)₃与Ni(NO₃)₂的混合物。

与现有技术相比，本发明的优点是：

1、本发明的利用基于磁性介孔碳的固定化漆酶去除水体中酚类污染物的方法，去除效率高，在最优pH值6.0、初始酚类浓度2.0mM的条件下，6h时可达到对苯酚和对氯苯酚分别为约58％及约62％的去除率；在最优条件下，12h时的苯酚去除率和对氯苯酚去除率可分别达到78％和85％以上；

2、本发明利用磁性介孔碳固定的漆酶去除水体酚类污染物，载体磁性介孔碳材料的孔道结构有利于污染物的传质，利用载体的传质和酶催化的协同作用可高效去除水体中酚类污染物；同时，本发明提供的方法可利用磁性材料的易于分离等特点，且操作简单，投资费用和运行费用较低。

附图说明

图1为本发明实施例1制得的磁性介孔碳的透射电镜图；

图2为本发明实施例1制得的磁性介孔碳的氮气吸附-解吸曲线图；

图3为本发明实施例1制得的磁性介孔碳的孔径分布曲线图；

图4为本发明实施例1中的固定化漆酶和对照样(游离漆酶)在60℃下不同时间段的活性变化曲线图；

图5为本发明实施例1中对制得的基于磁性介孔碳的固定化漆酶的进行操作稳定性检测的结果图；

图6为本发明实施例3中利用基于磁性介孔碳的固定化漆酶和失活的固定化漆酶(对照样)在不同振荡反应时间下去除含酚水体中酚类污染物的去除率曲线图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例，对本发明作进一步地说明。

实施例1

一种本发明的利用基于磁性介孔碳的固定化漆酶去水体中的酚类污染物的方法，包括以下步骤：

(1)制备磁性介孔碳：(a)先将4.0g嵌段共聚物Pluronic P123(Sigma公司生产，分子量为5800)置于160ml浓度为1.54M的HCl中，置于35℃水浴中搅拌直至溶解，然后逐滴加入8.5g正硅酸乙酯(TEOs)，将得到的混合物在35℃下搅拌20h，再将混合液转移至反应釜中，在140℃下水热反应24h，得到白色沉淀，将白色沉淀洗涤至中性后过滤、室温下风干，干燥后得到白色粉末；(b)为了去除多余的模板剂(即嵌段共聚物Pluronic P123)，将上述得到的白色粉末放入箱式炉中，控制升温速率为1℃/min，在550℃空气中煅烧4h，模板剂被脱除后，经研磨即得介孔硅模板(SBA-15白色粉末)；(c)将1.5mmol金属硝酸盐(0.75mmolFe(NO₃)₃·9H₂O及0.75mmol Ni(NO₃)₂·6H₂O)溶解于0.5ml乙醇中，在搅拌下加入1ml糠醇，形成多元溶液，抽取1.4ml多元溶液，用初湿浸渍法逐滴渗透到1.2g的SBA-15中，通过搅拌使溶液与颗粒混合均匀，然后在80℃的空气中对渗透有多元溶液的介孔硅模板固化10h以使糠醇转化为聚合糠醇，常温下干燥后得到复合物；(d)将步骤(c)得到的复合物在N₂中于900℃的温度下热处理2h以碳化糠醇，控制升温速率为2℃/min，同时将金属氧化物还原成合金，然后用加热至80℃～90℃的浓度为2M的NaOH溶液洗涤两次，移除复合物中的硅模板，再对移除硅模板后的复合物过滤、清洗至中性，在70℃温度下干燥，得到磁性介孔碳。

将制得的磁性介孔碳进行透射电镜成像，得到如图1所示的透射电镜图，由图1可知，图中有序条带清晰可见，表明磁性介孔碳的有序介孔结构未经破坏，同时，大范围分散在孔道内部、表面的黑点则为磁性介孔碳的磁性纳米颗粒；将制得的磁性介孔碳进行N₂吸附-解析实验，在ASAP2020M+C全自动比表面积分析仪上进行，得到如图2所示的吸附-解吸等温线，图中的两个滞回环表明了磁性介孔碳中两种介孔结构的存在；用BET方法计算磁性介孔碳的比表面积，得出磁性介孔碳的比表面积为1058.7m²/g；用BJH模型估测磁性介孔碳的总粒径分布，得到如图3所示的粒径分布图，由图3可知，磁性介孔碳的孔径分布峰值主要出现为4nm附近和18nm附近，这表明本实施例的磁性介孔碳非常适宜于漆酶的固定；测得磁性介孔碳的饱和磁化值为4.1emu/g，表明磁性介孔碳的磁性可应用于磁性分离。

(2)制备基于磁性介孔碳的固定化漆酶：将40mg步骤(1)中得到的磁性介孔碳分散在100ml含有1mg/ml漆酶的柠檬酸缓冲液(pH值为4.0)中，将混合液置于摇床中于30℃下以100rpm的速度振荡3h以达到吸附平衡；再用pH值为4.0的柠檬酸缓冲液洗涤数次，利用磁性分离器磁性分离后，经-40℃冷冻真空干燥，得到基于磁性介孔碳的固定化漆酶(制得的基于磁性介孔碳的固定化漆酶在-4℃下保存)；

以游离漆酶作为对照样，对上述制得的基于磁性介孔碳的固定化漆酶和游离漆酶分别进行pH值的适应范围，温度的适应范围和热稳定性进行对比实验。

对比实验以对照样游离漆酶和基于磁性介孔碳的固定化漆酶的酶活力作为标准，其中，游离漆酶活力的测定采取ABTS为底物，取2.9ml以0.1M柠檬酸缓冲液为介质的ABTS(0.5mM)，加入0.1ml稀释后的漆酶液启动反应，用紫外分光光度计(UV-2250，SHIMADZUCorporation，日本)测定反应体系3min内420nm处的吸光度变化，每分钟转化1μmol的ABTS所需的酶量为一个酶活单位(U)；固定化漆酶活力的测定则是将1mg固定化酶加入4.8ml柠檬酸缓冲液及0.2ml的ABTS(12.5mM)的混合溶液中启动反应，30s后加入19％的硫酸溶液终止反应，磁性分离后测定上清液在420nm处的吸光度。

1.pH值的适应范围

分别测定不同pH条件下游离漆酶和基于磁性介孔碳的固定化漆酶的活性，得到的相对活性变化情况如表4所示，由表4可知，基于磁性介孔碳的固定化漆酶的最适pH值相对游离漆酶略有上升，表明基于磁性介孔碳的固定化漆酶中的固定化载体改变了漆酶所处的微环境；游离漆酶在pH值为2.2～4时活性较高，但pH值较高时，尤其是pH值为7和8时，游离漆酶几乎失去活性；基于磁性介孔碳的固定化漆酶的适宜pH值较游离漆酶广泛，在pH值为2～6间均能保持较高活性，在较高pH值时仍保持一定活性；因此，与游离漆酶相比，本实施例制得的基于磁性介孔碳的固定化漆酶受溶液pH值的影响不显著，具有较好的pH值适应范围。

表4：游离漆酶和基于磁性介孔碳的固定化漆酶在不同pH条件下的相对活性

2.温度的适应范围

分别测定不同温度条件下游离漆酶和基于磁性介孔碳的固定化漆酶的活性，得到的相对活性变化情况如表5所示，由表5可知，游离漆酶与基于磁性介孔碳的固定化漆酶具有相同的最适温度，但基于磁性介孔碳的固定化漆酶较游离酶固定化酶在较高温度下具有更高活性，表明基于磁性介孔碳的固定化漆酶具有更广泛的温度适应范围；因此，与游离漆酶相比，本实施例制得的基于磁性介孔碳的固定化漆酶更有利于适应于实际应用时温度变化的复杂环境。

表5：游离漆酶和基于磁性介孔碳的固定化漆酶不同温度条件下的相对活性

3.热稳定性

将游离漆酶和基于磁性介孔碳的固定化漆酶分别置于pH为4.0的柠檬酸缓冲溶液中，于60℃下保温；然后每隔30min，取出一定量的基于磁性介孔碳的固定化漆酶及游离漆酶，检测其氧化ABTS的活性，得到的不同时间段基于磁性介孔碳的固定化漆酶及游离漆酶的相对活性如图4所示，由图4可知，基于磁性介孔碳的固定化漆酶的失活速度明显远低于游离漆酶的失活速度；保温2h时，基于磁性介孔碳的固定化漆酶的相对活性仍能维持75％左右，而游离漆酶的相对活性不足20％；保温4h后，两者相对活性相差约60％；由此可见，本实施例制得的基于磁性介孔碳的固定化漆酶热稳定性显著增长，表明基于磁性介孔碳的固定化漆酶中的载体磁性介孔碳能提供更适宜环境抵抗热变化，因此，基于磁性介孔碳的固定化漆酶中的载体磁性介孔碳有利于增强热稳定性。

最后，对本实施例制得的基于磁性介孔碳的固定化漆酶进行重复利用性实验：将基于磁性介孔碳的固定化漆酶在25℃下与0.5mMABTS反应，再用柠檬酸缓冲溶液(0.1M，pH4.0)冲洗分离出的基于磁性介孔碳的固定化漆酶，基于磁性介孔碳的固定化漆酶再次与0.5mMABTS反应，测试基于磁性介孔碳的固定化漆酶的重复使用性，结果如图5所示，由图5可知，较大的酶活损失发生在第3次循环和第6次循环，可能是一些与载体结合较弱的漆酶被洗脱；反映循环进行到第6批次后，基于磁性介孔碳的固定化酶相对活性差异较小，且当反应循环进行10批次后，基于磁性介孔碳的固定化漆酶活仍能超过50％，表明该固定化酶具有一定的操作稳定性，可以重复使用；

由以上可见，本实施例制得的基于磁性介孔碳的固定化漆酶具有较宽的pH值的适应范围和温度的适应范围，并具有良好的热稳定性，同时也有一定的重复利用性。

(3)去除酚类污染物(分别去除含苯酚水体和对氯苯酚水体)：

将浓度为25mM的苯酚溶液分成六组，调节柠檬酸缓冲液pH值为3.0～4.0，磷酸缓冲液pH值为5.0～8.0，将每组苯酚溶液分别加入到缓冲液中，使得每组苯酚的浓度均为2mM，体积为10ml，并使得每组混合液的pH值分别为3.0、4.0、5.0、6.0、7.0和8.0；用多层纱布将每组装有混合液的瓶口封好，将每组混合液在往复振荡培养箱中充分振荡，使溶液中的溶解氧饱和；然后往每组混合液中分别加入6mg上述制得的基于磁性介孔碳的固定化漆酶，将温度控制在30℃，以100rpm的速度进行振荡去除反应6h，充分反应后再通过磁性分离器将基于磁性介孔碳的固定化漆酶与水体磁性分离，将分离后的水体调节至中性后排放，完成对水中苯酚的去除；

按照上述相同的步骤，对含对氯苯酚水体(浓度为25mM的对氯苯酚溶液)中的对氯苯酚进行去除；

分别测定经上述工艺后含酚水中残留的苯酚和对氯苯酚污染物的浓度，测量结果如表6所示；由表6可知，在pH值为6.0时，约58.0％和63.4％的苯酚和对氯苯酚被去除，去除效果最佳，因此最优的pH值为6.0，而适宜pH值范围为5.0～6.0，在适宜的pH值范围内，本实施例对含酚水体中的酚类污染物的去除取得了良好的效果。

表6：基于磁性介孔碳的固定化漆酶在不同pH值条件下对酚类的去除

实施例2：

一种利用实施例1制得的基于磁性介孔碳的固定化漆酶去除水体中的苯酚的方法，包括以下步骤：分别配制10ml不同苯酚初始浓度(0.25mM、0.5mM、1.0mM、2.0mM、4.0mM和6.0mM)，pH值为6.0的含酚废水，再用纱布包扎好后，在往复振荡培养箱中充分振荡；将6mg基于磁性介孔碳的固定化漆酶投加至每组混合液中，在温度为30℃、转速为100rpm的条件下进行振荡去除反应6h，充分反应后再通过磁性分离器将基于磁性介孔碳的固定化漆酶与水体磁性分离，将分离后的水体调节至中性后排放，完成对水中苯酚的去除；

再配制10ml不同对氯苯酚初始浓度(0.25mM、0.5mM、1.0mM、2.0mM、4.0mM和6.0mM)，pH值为6.0的含酚废水，按照上述相同的步骤，对含对氯苯酚水体中的对氯苯酚进行去除；

用紫外-分光光度计测量上述经去除后的含酚水体中残余的苯酚和对氯苯酚污染物的浓度，结果如表7所示；由表7可知，本发明的基于磁性介孔碳的固定化漆酶处理酚类废水的适宜酚类初始浓度为1.0mM～4.0mM，最佳浓度为2.0mM，在适宜的酚类初始浓度范围内，本实施例对含酚水体中的酚类污染物的去除取得了良好的效果。

表7：基于磁性介孔碳的固定化漆酶在不同酚类初始浓度下对酚类的去除

实施例3：

一种利用实施例1制得的基于磁性介孔碳的固定化漆酶去除水体中的苯酚的方法，包括以下步骤：将含苯酚水体加入至磷酸缓冲液中，配置得到10ml苯酚初始浓度为2mM，pH值为6.0的混合液，将混合液用多层纱布密封后在摇床上振荡15min以使混合液中的溶解氧饱和；然后加入实施例1制得的基于磁性介孔碳的固定化漆酶，于恒温摇床中在30℃下以100rpm的速度振荡反应持续12h，每隔一段时间取出一定量的混合溶液，磁性分离后，上清液用紫外分光光度计在270nm和279nm处分别测定剩余的苯酚的浓度；将分离后的水体调节至中性后排放，完成对水中苯酚的去除；

按照上述相同的步骤，对含对氯苯酚水体中的对氯苯酚进行去除；

上述的去除结果如图6所示，由图6可知，振荡反应6h以上，苯酚去除率和对氯苯酚去除率在58％和62％以上，最佳振荡反应时间为12h，此时的苯酚去除率和对氯苯酚去除率可分别达到78％和85％以上；因此，优选的振荡时间为6h以上，在适宜的振荡反应时间范围内，本实施例对含酚水体中的酚类污染物的去除取得了良好的效果。

将实施例1制得的基于磁性介孔碳的固定化漆酶置于95℃水浴下一段时间，直至用ABTS测定出固定化酶活性为零；将失活的固定化漆酶作为对照样，与基于磁性介孔碳的固定化漆酶进行对比，将6mg失去活性的固定化漆酶加入10ml含有2mM苯酚或对氯苯酚的磷酸缓冲液(pH值为6.0)中，在与实施例3相同的条件下处理含酚水体；反应持续12h，每隔一段时间取出一定量的混合溶液，磁性分离后，上清液用紫外分光光度计在270nm和279nm处分别测定剩余苯酚和对氯苯酚浓度。

失活的固定化漆酶吸附水中酚类污染物的效果如图6所示，由图6可知，反应初始时段，固定化酶较高的污染物去除速度，尤其是反应初始1h时的污染物高速去除可归因于载体磁性介孔碳的吸附与固定化漆酶的催化去除的协同作用，由于载体的吸附作用可在短时间内达到平衡，因此，基于载体磁性介孔碳的固定化酶可在短时间内快速去除污染物，同时，也说明了利用载体磁性介孔碳的固定化漆酶去除酚类污染物可利用载体的吸附性能和漆酶的高效催化特性的协同效应达到高效去除酚类污染物的效果。

Claims (9)

1.一种利用基于磁性介孔碳的固定化漆酶去除水体中酚类污染物的方法，其特征在于，包括以下步骤：先调节待处理的含酚水体的pH值为5.0～6.0，并调节含酚水体中的酚类初始浓度为1mM～4mM，然后在所述含酚水体中加入基于磁性介孔碳的固定化漆酶，每毫升含酚水体中加入的基于磁性介孔碳的固定化漆酶不少于0.6mg，接着在25℃～30℃的温度下对混合液进行振荡反应6h～12h，再通过磁性分离将基于磁性介孔碳的固定化漆酶与水体分离，将分离后的水体调节至中性后排放，完成对水体中酚类污染物的去除。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述含酚水体的pH值为6.0，所述含酚水体的酚类初始浓度为2mM，所述振荡反应的温度为30℃，所述振荡反应的时间为12h。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述基于磁性介孔碳的固定化漆酶以磁性介孔碳为载体，漆酶通过物理吸附作用固定于所述磁性介孔碳上，所述磁性介孔碳的孔道内嵌入有磁性纳米颗粒，所述磁性介孔碳上的漆酶吸附量在140mg/g以上，所述固定化漆酶的酶活性回收率为60％～95％。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述的磁性介孔碳与漆酶的质量配比为1∶(1～2.5)。

5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述磁性介孔碳含有有序双峰介孔结构，所述有序双峰介孔结构是指孔径分布的两个峰值分别出现在4nm附近区域和18nm附近区域。

6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于，所述基于磁性介孔碳的固定化漆酶通过以下方法制得：先准备磁性介孔碳和漆酶溶液，所述漆酶溶液中漆酶的初始浓度为0.3mg/ml～1.0mg/ml，所述漆酶溶液的pH值为3.0～6.0；然后将磁性介孔碳加入至所述漆酶溶液中，在25℃～30℃的温度下对该溶液振荡3h以上；再经过洗涤、磁性分离、冷冻和真空干燥后，得到固定化漆酶。

7.根据权利要求6所述的固定化漆酶的制备方法，其特征在于：所述漆酶溶液中漆酶的初始浓度为0.4mg/ml或1.0mg/ml，所述漆酶溶液的pH值为4.0，所述振荡的转速为100rpm，所述振荡的时间为3h。

8.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述磁性介孔碳通过下述方法得到：

(1)先将嵌段共聚物与正硅酸乙酯在30℃～35℃的温度下混合搅拌20h～24h，再将混合液转移至135℃～140℃下水热反应22h～24h，得到白色沉淀，将所述白色沉淀洗涤至中性后过滤、干燥，得到白色粉末；

(2)将上述得到的白色粉末在500℃～550℃的温度下煅烧4h～5h后得到介孔硅模板；

(3)利用初湿浸渍法将由金属硝酸盐、乙醇和糠醇组成的多元溶液渗透到所述介孔硅模板中，然后在70℃～80℃的空气中对渗透有多元溶液的介孔硅模板固化10h～12h，干燥后得到复合物；

(4)将上述得到的复合物在N₂中于800℃～900℃的温度下热处理1h～2h，然后用加热至80℃～90℃的氢氧化钠溶液洗涤移除复合物中的硅模板，再对移除硅模板后的复合物过滤、清洗和干燥，得到磁性介孔碳。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述金属硝酸盐是指摩尔比为1∶(1～1.1)的Fe(NO₃)₃与Ni(NO₃)₂的混合物。

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