CN102321707B - 一种利用固定化β-葡萄糖苷酶制备龙胆低聚糖的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用固定化β-葡萄糖苷酶制备龙胆低聚糖的方法，利用固定化β-葡萄糖苷酶制备龙胆低聚糖的方法包括以下步骤：1)黑曲霉固态发酵制备β-葡萄糖苷酶；2)采用交联-包埋法固定化β-葡萄糖苷酶；3)利用固定化β-葡萄糖苷酶转化葡萄糖生产龙胆低聚糖。该方法制备固定化酶的酶活回收率最高可达60％，固定化酶对底物葡萄糖的转化率可达45％；固定酶的稳定性及pH耐受性显著提高，机械强度好，可连续重复使用4-6批次，酶活保持不变。本发明提高了酶法生产龙胆糖酶的利用率，降低了生产成本和龙胆糖分离纯化难度，适合大规模连续化生产，对提高我国生产龙胆低聚糖的技术水平具有重要意义。
Description
技术领域
本发明涉及酶工程技术领域，特别涉及一种利用固定化β-葡萄糖苷酶制备龙胆低聚糖的方法。
背景技术
龙胆低聚糖是一类由葡萄糖以β-1，6糖苷键结合的低聚糖。它不易消化，低热值；对pH和热较稳定，具有调节肠道菌群环境，增殖肠道有益菌群，改善通便效果等功能，还具有柔和、特殊的提神苦味，用于果汁、糖果、冰淇淋等产品中可产生良好效果，因而被广泛应用于保健食品等领域。
目前制备龙胆低聚糖的方法较多，最早是从龙胆属茎、根中提取的，由于受原料限制，难以大量生产。近年来，随着酶法制备低聚糖的兴起，工业生产龙胆低聚糖制品已成为可能。但利用游离酶制备龙胆低聚糖，酶难于回收，利用率低，也不利于产物低聚糖分离，生产成本高。酶在龙胆低聚糖的生产成本中占很大比重，因此降低酶的成本是降低总成本的关键。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种固定化β-葡萄糖苷酶的制备方法及利用固定化β-葡萄糖苷酶制备龙胆低聚糖的方法，所制备的固定化β-葡萄糖苷酶能够重复使用，利用率高，能够有效的降低制备龙胆低聚糖的成本。
为了实现上述目的，本发明一种利用固定化β-葡萄糖苷酶制备龙胆低聚糖的方法采用如下技术方案：
一种利用固定化β-葡萄糖苷酶制备龙胆低聚糖的方法，包括以下步骤：
1)黑曲霉固态发酵制备β-葡萄糖苷酶；
2)采用交联-包埋法固定化β-葡萄糖苷酶；
3)利用固定化β-葡萄糖苷酶转化葡萄糖生产龙胆低聚糖。
所述步骤1)中，首先配制黑曲霉固态发酵培养基，按质量百分比加入黑曲霉，接种量为5％-10％，30℃培养3-7d，形成发酵物；培养基组成为：按质量份，麸皮120份，硫酸铵2.7份，磷酸二氢钾0.72份，硫酸镁1.08份，蒸馏水240份；
β-葡萄糖苷酶的制备：取发酵物，用pH3.4-4.8的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液在40-60℃浸提3次，过滤，再用20-35％饱和度的硫酸铵盐析，除杂，取清液，再用70-80％饱和度的硫酸铵二次盐析，然后再在4℃，离心力为12400-25900×g的条件下离心12-18min，弃溶液，得β-葡萄糖苷酶。
所述步骤2)中，β-葡萄糖苷酶的固定化工艺为：取质量浓度为3.0-5.0％海藻酸钠AmL和酶活为35-50U的β-葡萄糖苷酶液BmL，充分混合后，加入体积浓度为25％的戊二醛CmL，混匀，4℃交联3-5h；将交联后的溶液匀速滴入质量浓度为1.0-2.5％CaCl2溶液中，4℃硬化2-5小时；滤出凝胶球即为固定化β-葡萄糖苷酶，用pH3.4-4.8的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液冲洗，并4℃保存于pH3.4-4.8的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液中，备用；其中A∶B∶C＝10∶2∶0.8。
用pH3.4-4.8的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液冲洗凝胶球，并4℃保存于pH3.4-4.8的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液中，备用。所述步骤3)中的固定化酶转化葡萄糖生产龙胆低聚糖的工艺为：配制质量浓度为50％-80％葡萄糖缓冲溶液，其pH值为3.4-4.8；将固定化β-葡萄糖苷酶加入反应柱中，测定反应柱中固定化β-葡萄糖苷酶的酶活力，按30-60U/g(反应柱中总的酶或除以30-60U，即为反应柱中需要加入葡萄糖缓冲液的克数)的比例加葡萄糖于反应柱中，55-65℃反应36-72h，移出反应液即为龙胆低聚糖与葡萄糖的混合液。
步骤3)中还包括将龙胆低聚糖从龙胆低聚糖与葡萄糖的混合液中分离出来的步骤。
步骤3)中还包括以下步骤：测定移出反应液后反应柱中固定化β-葡萄糖苷酶的活力，按照30-60U/g的比例加入新的葡萄糖缓冲溶液于反应柱中进行反应。
本发明所制固定酶可连续使用4-6批次，其酶活保持不变。
与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：
本发明制备的固定化酶的酶回收率可达50-60％；固定化酶对底物葡萄糖的转化率可达45％；固定化β-葡萄糖苷酶，可反复使用4-6次，显著提高了酶的利用率，降低了生产成本；固定化酶对环境耐受力较游离酶显著提高：游离酶耐受pH2.8-5.5，耐受温度40-70℃。固定化酶耐受pH2.8-7.0，耐受温度30-80℃；降低了产物分离难度；转化反应可连续进行，适合大规模连续化生产。
具体实施方式
下面将结合具体的固定化工艺和生产龙胆糖的工艺对本发明做进一步的说明，所述是对本发明的解释而不是限定。
符合本发明的利用固定化β-葡萄糖苷酶转化葡萄糖，制备龙胆低聚糖的方法按照以下步骤进行：
实施例1：
1)配制黑曲霉固态发酵培养基，按质量百分比加入黑曲霉，接种量为5％，30℃培养3d形成发酵物。培养基组成为：麸皮120g，硫酸铵2.7g，磷酸二氢钾0.72g，硫酸镁1.08g，蒸馏水240mL。酶的制备：取发酵物，用pH3.4的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液在40℃浸提3次，过滤，20％饱和度的硫酸铵盐析，除杂，取清液，再用70％饱和度的硫酸铵二次盐析，4℃离心12min，离心力为12400×g，弃溶液，得β-葡萄糖苷酶。
(2)采用交联-包埋法固定β-葡萄糖苷酶的工艺为：取质量浓度为3.0％海藻酸钠7.2mL和酶活为37U的β-葡萄糖苷酶液2mL，充分混合后，加入体积浓度为25％戊二醛0.8mL，混匀，4℃交联3h。将上述溶液匀速滴入质量浓度为1.5％CaCl2溶液中，4℃硬化5h。滤出凝胶球，用pH3.4的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液冲洗，并4℃保存于pH3.4的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液中，备用。
(3)利用固定化β-葡萄糖苷酶转化葡萄糖生产龙胆低聚糖的工艺为：配制质量浓度为50％葡萄糖缓冲溶液(pH3.4)，按30U/g葡萄糖的比例加酶于反应柱中，55℃反应36h，移出反应液即为龙胆低聚糖与葡萄糖的混合液。加入新的葡萄糖缓冲溶液进行反应。本发明所制固定酶可连续使用4批次，其酶活保持不变。
实施例2：
1)配制黑曲霉固态发酵培养基，按质量百分比加入黑曲霉，接种量为8.5％，30℃培养4d形成发酵物。培养基组成为：麸皮1200g，硫酸铵27g，磷酸二氢钾7.2g，硫酸镁10.8g，蒸馏水2400mL。酶的制备：取发酵物，用pH3.8的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液在45℃浸提3次，过滤，30％饱和度的硫酸铵盐析，除杂，取清液，再用75％饱和度的硫酸铵二次盐析，4℃离心15min，离心力为13400×g，弃溶液，得β-葡萄糖苷酶。
2)取取质量浓度为3.6％海藻酸钠7.2mL和酶活为46U的β-葡萄糖苷酶液2mL，充分混合后，加入体积浓度为25％戊二醛0.8mL，混匀，4℃交联3.5h。将上述溶液匀速滴入质量浓度为2.0％CaCl2溶液中，4℃硬化2h。滤出凝胶球，用pH3.8的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液冲洗，并4℃保存于pH3.8的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液中，备用。
3)配制质量浓度为70％葡萄糖缓冲溶液(pH3.8)，按60U/g葡萄糖的比例加酶于反应柱中，65℃反应48h，移出反应液即为龙胆低聚糖与葡萄糖的混合液。加入新的葡萄糖缓冲溶液进行反应。本发明所制固定酶可连续使用6批次，其酶活保持不变。
实施例3：
1)配制黑曲霉固态发酵培养基，按质量百分比加入黑曲霉，接种量为10％，30℃培养7d形成发酵物。培养基组成为：麸皮12000g，硫酸铵270g，磷酸二氢钾72g，硫酸镁108g，蒸馏水24000mL。酶的制备：取发酵物，用pH4.8的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液在60℃浸提3次，过滤，35％饱和度的硫酸铵盐析，除杂，取清液，再用80％饱和度的硫酸铵二次盐析，4℃离心18min，离心力为25900×g，弃溶液，得β-葡萄糖苷酶。
2)取质量浓度为5.0％海藻酸钠7.2mL和酶活为70U的β-葡萄糖苷酶液2mL，充分混合后，加入体积浓度为25％戊二醛0.8mL，混匀，4℃交联4h。将上述溶液匀速滴入质量浓度为2.5％CaCl2溶液中，4℃硬化3h。滤出凝胶球，用pH4.8的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液冲洗，并4℃保存于pH4.8的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液中，备用。
3)配制质量浓度为80％葡萄糖缓冲溶液(pH4.8)，按50U/g葡萄糖的比例加酶于反应柱中，60℃反应72h，移出反应液即为龙胆低聚糖与葡萄糖的混合液。加入新的葡萄糖缓冲溶液进行反应。本发明所制固定酶可连续使用6批次，其酶活保持不变。
Claims (1)
1.一种利用固定化β-葡萄糖苷酶制备龙胆低聚糖的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）黑曲霉固态发酵制备β-葡萄糖苷酶；
2）采用交联-包埋法固定化β-葡萄糖苷酶；
3）利用固定化β-葡萄糖苷酶转化葡萄糖生产龙胆低聚糖；
所述步骤1）中，首先配制黑曲霉固态发酵培养基，按质量百分比加入黑曲霉，接种量为5%-10%，30℃培养3-7d，形成发酵物；培养基组成为：按质量份，麸皮120份，硫酸铵2.7份，磷酸二氢钾0.72份，硫酸镁1.08份，蒸馏水240份；
β-葡萄糖苷酶的制备：取发酵物，用pH3.4-4.8的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液在40-60℃浸提3次，过滤，再用20-35%饱和度的硫酸铵盐析，除杂，取清液，再用70-80%饱和度的硫酸铵二次盐析，然后在4℃，离心力为12400-25900×g的条件下离心12-18min，弃溶液，得β-葡萄糖苷酶；
所述步骤2）中，β-葡萄糖苷酶的固定化工艺为：取质量浓度为3.0-5.0％海藻酸钠AmL和酶活为35-70U的β-葡萄糖苷酶液BmL，充分混合后，加入体积浓度为25%的戊二醛CmL，混匀，4℃交联3-5h；将交联后的溶液匀速滴入质量浓度为1.0-2.5％CaCl2溶液中，4℃硬化2-5小时；滤出凝胶球即为固定化β-葡萄糖苷酶，用pH3.4-4.8的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液冲洗，并4℃保存于pH3.4-4.8的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液中，备用；
其中A：B：C=7.2：2：0.8；
所述步骤3）中的固定化酶转化葡萄糖生产龙胆低聚糖的工艺为：配制质量浓度为50%-80%葡萄糖缓冲溶液，其pH值为3.4-4.8；将固定化β-葡萄糖苷酶装入反应柱中，测定反应柱中固定化β-葡萄糖苷酶的酶活力，按30-60U/g葡萄糖缓冲液的比例添加葡萄糖于反应柱中，55-65℃反应36-72h，移出反应液，即为龙胆低聚糖与葡萄糖的混合液。
2.根据权利要求1所述的一种利用固定化β-葡萄糖苷酶制备龙胆低聚糖的方法，其特征在于，步骤3）中还包括将龙胆低聚糖从龙胆低聚糖与葡萄糖的混合液中分离出来的步骤。
3.根据权利要求1所述的一种利用固定化β-葡萄糖苷酶制备龙胆低聚糖的方法，其特征在于，步骤3）中还包括以下步骤：测定移出反应液后反应柱中固定化β-葡萄糖苷酶的活力，按照30-60U/g的比例继续加入新的葡萄糖缓冲溶液于反应柱中进行反应。
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