CN102321162B - 抗植物枯萎病和黄萎病的GbRPS1基因及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种能够提高植物对枯萎病和黄萎病的抗性的GbRPS1基因及其编码的GbRPS1蛋白质多肽，以及经重组技术产生这种GbRPS1蛋白质的方法。本发明还公开了GbRPS1基因分别在抗植物枯萎病菌和抗黄萎病菌的广谱抗病方面的功能与应用。

Description

抗植物枯萎病和黄萎病的GbRPS1基因及其应用

技术领域

本发明涉及一种从构建的海岛棉cDNA库中分离的能够抗棉花枯萎病菌和黄萎病菌的广谱抗病蛋白。

背景技术

在自然环境中存在着众多的植物病原微生物，它们引起的疾病若发生爆发会导致农作物产量的大幅减少，甚至绝收。因此提高植物抗病能力，以保证农作物的产量是作物遗传改良的重要方向。

在长期的进化过程中，植物逐渐形成了一系列复杂有效的保护机制：(1)植物的细胞壁是植物有效防止病原物入侵的有效屏障；(2)当病原菌通过植物细胞壁后，植物通过与病原物激发子相互识别产生病原菌相关抗性反应。在病原菌相关抗性反应过程中，植物受体激酶与激发子的识别诱导质膜蛋白的磷酸化与去磷酸化，这种磷酸化的信号向细胞内传递引起一系列抗性相关基因的表达变化，导致植物产生抗性反应。这种抗性水平经过一段时间后逐渐扩展到整株植物，最终形成对病原微生物侵染的广谱抗性。

广谱抗性基因能够有效激发植物防御反应，提高植物的防御反应速度，增强植物的抗性水平。利用植物广谱抗性特点开发的广谱抗病策略具有诱发植物自身抗性、可行性强、无种属专一性、作用持久等特点，广谱抗病策略是开展植物转基因育种抗病重要方向。

棉花在整个生长过程中主要受到枯萎病、黄萎病2种病害的危害。我国科学家曾将几丁质酶、过氧化物酶等基因转化到棉花的感病品种中，对提高棉花的耐枯萎病和黄萎病性能力有一定作用，但是上述基因对于枯萎病和黄萎病均无显著抗性。因此，迫切需要开发新的广谱抗性基因。

发明内容

本发明的目的是提供一种能够提高植物对枯萎病和黄萎病抗性的广谱抗病基因以及蛋白。

在本发明的第一方面，提供新颖的分离出的GbRPS1蛋白质多肽，它包含：具有SEQ ID NO：2氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。较佳地，该多肽选自下组：(a)具有SEQ ID NO：2氨基酸序列的多肽；(b)将SEQ IDNO：2氨基酸序列经过一个或多个(较佳地1-20个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有抗枯黄萎病功能的GbRPS1蛋白质活性的由(a)衍生的多肽。

在本发明的第二方面，提供编码分离的这些多肽的多核苷酸，该多核苷酸包含一核苷酸序列，该核苷酸序列选自下组：(a)编码上述GbRPS1蛋白质多肽的多核苷酸；和(b)与多核苷酸(a)互补的多核苷酸。较佳地，该多核苷酸编码具有SEQ ID NO：2或3所示氨基酸序列的多肽。更佳地，该多核苷酸的序列是选自下组的一种：(a)具有SEQID NO：1中202-2916位的序列；(b)具有SEQ ID NO：1中1-3120位的序列。

在本发明的第三方面，提供了含有上述多核苷酸的载体，以及被该载体转化或转导的宿主细胞或者被上述多核苷酸直接转化或转导的宿主细胞。

在本发明的第四方面，提供了一种改变植物抗枯黄萎病抗性的方法，它包括步骤：

(1)提供携带表达载体的农杆菌，所述的表达载体含有GbRPS1的DNA编码序列，所述的GbRPS1选自下组：

(a)具有SEQ ID NO：2氨基酸序列的多肽；

(b)将SEQ ID NO：2氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有抗枯黄萎病抗性的由(a)衍生的多肽；

(2)将植物细胞或组织或器官与步骤(1)中的农杆菌接触，从而使GbRPS1基因编码序列转入植物细胞，并且整合到植物细胞的染色体上；

(3)选择出转入GbRPS1基因的DNA编码序列的植物细胞或组织或器官；

(4)将步骤(3)中的植物细胞或组织或器官再生成植株。

(5)将步骤(4)中的植物进行枯黄萎病的抗性鉴定，植株具有高抗水平。

本发明的其它方面由于本文的技术的公开，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

本发明人经过广泛而深入的研究，首次采用分子克隆方法从构建的海岛棉cDNA库中分离获得了新的GbRPS1基因，并且通过实验证实了它具有高抗枯黄萎病抗性，并且转入植物后可导致植物对枯黄萎病抗性的提高。在此基础上完成了本发明。

在本发明中，术语“GbRPS1蛋白质”、“GbRPS1多肽”或“广谱抗性蛋白”可互换使用，都指具有抗枯黄萎病蛋白GbRPS1氨基酸序列(SEQ ID NO：2)的蛋白或多肽。它们包括含有或不含起始甲硫氨酸的GbRPS1蛋白质。

如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。

如本文所用，“分离的GbRPS1蛋白或多肽”是指GbRPS1多肽基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化GbRPS1蛋白质。

本发明的多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽，优选重组多肽。本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本发明的多肽还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。

本发明还包括GbRPS1蛋白质的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的天然GbRPS1蛋白质相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另一个化合物融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列)。根据本文所述，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。

在本发明中，术语“GbRPS1多肽”指具有抗枯黄萎病菌活性的SEQ ID NO.2序列的多肽。该术语还包括具有与GbRPS1蛋白质相同功能的、SEQ ID NO.2序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括GbRPS1蛋白的活性片段和活性衍生物。

该多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严谨程度条件下能与GbRPS1DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗GbRPS1多肽的抗血清获得的多肽或蛋白。本发明还提供了其他多肽，如包含GbRPS1多肽或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括了GbBGbRPS11多肽的可溶性片段。通常，该片段具有GbRPS1多肽序列的至少约10个连续氨基酸，通常至少约30个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。

发明还提供GbRPS1蛋白质或多肽的类似物。这些类似物与天然GbRPS1多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到。

在本发明中，“GbRPS1蛋白质保守性变异多肽”指与SEQ ID NO：2的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行氨基酸替换而产生。

表1

最初的残基	代表性的取代	优选的取代
			Ala(A)	Val；Leu；Ile	Val
Arg(R)	Lys；Gln；Asn	Lys
			Asn(N)	Gln；His；Lys；Arg	Gln
Asp(D)	Glu	Glu
			Cys(C)	Ser	Ser
Gln(Q)	Asn	Asn
			Glu(E)	Asp	Asp
Gly(G)	Pro；Ala	Ala
			His(H)	Asn；Gln；Lys；Arg	Arg
Ile(I)	Leu；Val；Met；Ala；Phe	Leu
			Leu(L)	Ile；Val；Met；Ala；Phe	Ile
Lys(K)	Arg；Gln；Asn	Arg
			Met(M)	Leu；Phe；Ile	Leu
Phe(F)	Leu；Val；Ile；Ala；Tyr	Leu
			Pro(P)	Ala	Ala
Ser(S)	Thr	Thr
			Thr(T)	Ser	Ser
Trp(W)	Tyr；Phe	Tyr
			Tyr(Y)	Trp；Phe；Thr；Ser	Phe
Val(V)	Ile；Leu；Met；Phe；Ala	Leu

本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO：1所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQ ID NO：2的蛋白质，但与SEQ ID NO：1所示的编码区序列有差别的核酸序列。

编码SEQ ID NO：2的成熟多肽的多核苷酸包括：只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。

术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。

本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。

本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90％以上，更好是95％以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸编码的多肽与SEQID NO：2所示的成熟多肽有相同的生物学功能和活性。

本发明还涉及与上述的序列杂交的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的长度至少含15个核苷酸，较好是至少30个核苷酸，更好是至少50个核苷酸，最好是至少100个核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的扩增技术(如PCR)以确定和/或分离编码GbRPS1蛋白质的多聚核苷酸。

本发明中的多肽和多核苷酸优选以分离的形式提供，更佳地被纯化至均质。

本发明的GbRPS1核苷酸全长序列或其片段通常可以用人工合成、PCR扩增法、或重组法的方法获得。例如首先根据SEQ ID NO：1的序列进行全序列合成。

对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用人工合成的GbRPS1核苷酸全长序列或其片段作为模板，扩增而得有关序列。

一旦获得了有关的序列，就可用重组法大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。

目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段和衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。

本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或GbRPS1基因编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述多肽的方法。

通过常规的重组DNA技术(Science，1984；224：1431)，可利用本发明的多聚核苷酸序列可用来表达或生产重组的GbRPS1多肽。一般来说有以下步骤：

(1).用本发明的编码GbRPS1多肽的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；

(2).在合适的培养基中培养的宿主细胞；

(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。

本发明中，GbRPS1蛋白质多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒或其他载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以使用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含GbRPS1基因编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。

此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。

包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。

宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如植物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属、农杆菌；真菌细胞如酵母；植物细胞；昆虫细胞等。

本发明的多核苷酸在高等真核细胞中表达时，如果在载体中插入增强子序列时将会使转录得到增强。增强子是DNA的顺式作用因子，通常大约有10到300个碱基对，作用于启动子以增强基因的转录。

本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。

用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl₂法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl₂。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。转化植物也可使用农杆菌转化或基因枪转化等方法，例如叶盘法。对于转化的植物细胞、组织或器官可以用常规方法再生成植株，从而获得抗枯黄萎病抗性提高的植物。

获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。

在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

另一方面，本发明还包括对GbRPS1基因的DNA或是其片段编码的多肽具有特异性的多克隆抗体和单克隆抗体，尤其是单克隆抗体。较佳地，指那些能与GbRPS1蛋白质基因产物或片段结合但不识别和结合于其它非相关抗原分子的抗体。本发明中抗体包括那些能够结合并抑制GbRPS1蛋白质的分子，也包括那些并不影响GbRPS1蛋白质功能的抗体。本发明还包括那些能与修饰或未经修饰形式的GbRPS1蛋白质基因产物结合的抗体。

本发明的多核苷酸的一部分或全部可作为探针固定在微阵列(microarray)或DNA芯片(又称为“基因芯片”)上，用于基因的表达分析。用GbRPS1蛋白质特异的引物进行RNA-聚合酶链反应(RT-PCR)体外扩增也可检测GbRPS1蛋白质的转录产物。

在本发明的一个实例中，提供了一种分离的多核苷酸，它编码具有SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的多肽。本发明的多核苷酸是从采用原位杂交技术从构建的海岛棉cDNA文库库中分离的。其序列如SEQ ID NO：1所示，它包含的多核苷酸序列全长为3120个碱基，其开放读框位于202-2916位，编码全长为904个氨基酸的GbRPS1蛋白质(SEQ ID NO：2)。

经实验证明(见实施例6、7)，转基因植株分别具有明确的抗枯萎病菌和黄萎病菌入侵功能。

已知黄萎病菌为半知菌亚门、淡色孢科、轮枝菌属，而枯萎病菌属于半知菌亚门镰刀菌属。由于两种病害为不同病原菌侵入产生的病害，说明GbRPS1基因不具有病菌小种的种属专一性。根据基因对基因的原则，证明GbRPS1基因为广谱抗病基因。

本发明的GbRPS 1蛋白质的创造性在于：A)抗枯黄萎病菌入侵功能性在棉花等植物上没有报道；B)结构新，在核酸水平上与已见报道的GbRPS1蛋白质编码基因无任何同源性，在氨基酸水平上与其它的RNA抑制蛋白家族的同源性最高为20％，同源性位点不含有现有专利保护序列和突变位点。

GbRPS1蛋白质为提高植物的枯黄萎病抗性提供了新的途径，因而具有巨大的应用前景。通过将GbRPS1基因导入农作物品种(例如棉花、番茄等棉属或者茄科类农作物)，改变现有优良农作物品种的抗枯黄萎病抗性，可获得抗枯黄萎病的棉花、番茄等棉属或者茄科类农作物品种，提高抗枯黄萎病菌尤其大丽轮枝菌(Vetricillium dahliae)的抗性，解决农业生产中存在的实际问题。

附图说明

图1是是GbRPS1基因遗传转化载体的构建示意图。图中，LB、RB分别为T-DNA的左右边界序列。CaMV35S为烟草花叶病毒35S启动子。NOS为终止子。NPTII为卡那霉素抗性基因(见实施例3)。

图2是转GbRPS1基因棉花幼苗(T0)叶片PCR检测图。M为DL2000分子量标记。标记的分子量分别为2000、1000、750、500、250和100bp；图中，P是阳性对照(GbRPS1质粒)；1-5为经过转化GbRPS1基因的转基因棉花幼苗编号(见实施例4)。

图3是转GbRPS1基因的棉花植株的Southern杂交分析情况。图中，P是GbRPS1基因质粒DNA；1-5：转基因植株编号(见实施例5)。

具体实施方式

下面结合具体实施例进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。本发明的其它方面由于本文的技术的公开，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1抗枯黄萎病的GbRPS1基因克隆

(1)海岛棉根部cDNA文库的构建

文库的构建方法采用Stratagene公司的cDNA文库构建试剂盒的方法实施，该方法的具体步骤如下。

海岛棉品种Pima-90经过黄萎病菌(大丽轮枝菌)处理2小时以后，即可以用于抽提棉花的总RNA。称取0.5g海岛棉幼根，用液氮研磨成细粉，分装于两个1.5ml的eppendorf管中。每管加入1ml TRIZOL用力摇动使混合均匀，室温下放置5min。然后在4℃，12,000g的条件下离心10min，将上清液吸入干净的1.5ml的eppendorf管中。每管加0.2ml氯仿，用力振荡15s，室温放置2～3min。然后在4℃、12,000g的条件下离心15min。将上清液转移到干净的1.5ml的eppendorf管中，加入等体积异丙醇，颠倒混匀，室温放置10min。在4℃，12,000g的条件下离心10min。弃上清，加入1ml 75％乙醇洗涤，在4℃，7,500g离心5min。弃上清，室温干燥15-20min后溶于适量RNAase-free的水中(55～60℃水浴10min使RNA充分溶解)。所获得的RNA用于cDNA合成反应。

按照QIAGEN公司的mRNA纯化试剂盒的方法将总RNA纯化为mRNA，然后立刻按照ClonTECH^TM试剂盒中所提供的方法进行单链cDNA合成和双链cDNA合成。

将BM25.8和XL1-Blue分别涂布于带有卡那霉素、四环素抗性LB固体平板上，37℃培养箱过夜培养。挑单菌落接种到相应的LB+MgSO₄培养基上37℃过夜培养。此平板即可用于以后的实验菌源。按照下列的梯度将cDNA连接到载体λTriplEx2上。连接反应缓冲液在16℃水浴过夜连接。

将每一管连接产物分别做λ噬菌体包装反应，获得克隆数在1～2×10⁶个左右的cDNA文库。

(2)采用原位杂交的方法分离广谱抗病基因

将获得的λ噬菌体按照每个培养皿(直径为20cm)大约10000个克隆的数目进行铺平板，总共平板数目为20个。取直径为20厘米的圆形尼龙膜进行方位标记，标记后的尼龙膜影印上述的平板，将平板上的噬菌体克隆影印到尼龙膜上。

尼龙膜经过酸变性(0.25mol/L HCl溶液处理5分钟)、碱变性(0.4mol/L NaOH溶液处理10分钟)以及中和反应(0.5mol/L Tris-HCl(pH7.5)，1.5mol/LNaCl溶液中和10min，蒸馏水冲洗3次)后即可用于southern杂交。

按照每200cm²尼龙膜加入100ng探针的用量。按照以下的反应体系进行探针标记。探针标记前将探针在100℃沸水中水浴10min，再将其放入冰上10min，使探针充分变性。探针标记体系为：充分变性DNA5-15μL，dNTPs(dATP，dTTP，dGTP)6μL，Klenow fragment2units，标记缓冲液5μL，随机引物4μL，加入无菌水补足50μL体系，迅速混匀后离心。按每管2μL加入³²P同位素，静置5hr使DNA充分标记。将充分标记后的探针变性后备用。

按《分子克隆第2版》方法进行Southern杂交。杂交结束后，用保鲜膜包裹杂交膜，测膜上放射性强度。在暗匣中依次放置增感前屏、杂交膜、X-光片和增感后屏，-70℃冰箱中自显影7-10天后洗X-光片。取出杂交膜后用吸水纸吸干增感屏上的水分，风干30min。

(3)广谱抗病基因的cDNA片段的测序验证

挑取与尼龙膜杂交结果相对应的阳性克隆噬菌体。按照Stratagene公司的cDNA文库构建试剂盒的所示方法将携带有阳性克隆的插入片断质粒转染到大肠杆菌DH5α中。大肠杆菌经过质粒抽提后即可进行序列测定。从已经挑选出的7个克隆分别进行测序，测序结果见SEQ1。

实施例2抗枯黄萎病的GbRPS1蛋白质基因的人工合成

根据已完成的含2712bp编码区的核苷酸序列，首先分8个区段分别根据正链和副链序列，分别合成出长度约150-200bp、具有粘性末端的单链寡核苷酸片段。将正链和副链各一一对应的8个互补的单链寡核苷酸片段分别退火，形成8个带有粘性末端的双链寡核苷酸片段。混合双链寡核苷酸片段，经T₄DNA连接酶催化组装成一个完整的GbRPS1基因。该合成的DNA片段含有SEQ ID NO：1中202-2916位的核苷酸序列，并且合成基因的两端含XbaI和SacI位点。

将上述人工合成的5’和3’端酶切位点为XbaI和SacI位点GbRPS1基因，用于下面抗枯黄萎病的GbRPS1蛋白质基因植物表达载体的构建。

实施例3广谱抗性GbRPS1基因植物表达载体的构建

广谱抗性GbRPS1基因植物表达载体构建的具体方法如下：

A.pBI121和pCAMBIA2301用HindIII和EcoRI双酶切，将pBI121带有p35S-GUS-Nos-ter的片段连入pCAMBIA2301，形成中间载体p35S-2301-GUS；

B.用XbaI和SacI双切p35S-2301-GUS和上述人工合成的GbRPS1基因，用GbRPS1置换p35S-2301-GUS相应酶切位点的GUS，从而获得GbRPS1基因植物表达载体(图1)。再将其转入农杆菌系LBA4404中，用于转化棉花。

实施例4利用农杆菌介导转化构建获得广谱抗病基因的转基因棉花

把含有目的基因的农杆菌在合适抗性的LB培养基上划线，28℃下培养2天，挑取单菌落接种于50ml(浓度为50mg/L卡那霉素)的LB液体培养基中。培养基在200rpm，28度条件下摇床上培养42-48小时。当OD600达到0.3-0.8之间时，3000g离心收集菌体。利用1/2MS液体培养基将收集的菌体稀释至OD600＝0.2-0.4之间。

(1)外植体与农杆菌的共培养：取5-6天苗龄的珂字312(Coker312)下胚轴，切成长约0.5-0.8cm长的小段，于1/2MS液体培养基稀释的农杆菌菌液中浸泡15分钟，取出，用滤纸吸干下胚轴表面的菌液后，转入不加任何抗生素的固体CB2.1培养基(4.4g·L^-1MS、30g·L^-1Glc、KT和2，4-D各0.1mg·L^-1、2.0g·L^-1MgCl₂.6H₂O、2.0g·L^-1植物凝胶，pH 6.0)中，每皿30-40块下胚轴，于25℃下共培养50-60小时。

(2)愈伤组织(callus)的诱导：用含有cef250mg/l的无菌水洗共培养的下胚轴3-4次，把下胚轴用无菌滤纸吸干下胚轴表面的水后，把下胚轴转入CB3.1培养基(4.4g·L^-1MS、30g·L^-1Glc、KT和2，4-D各0.1mg·L^-1、2.0g·L^-1MgCl₂.6H₂O、500mg·L^-1Cef、50mg·L^-1Kan、2.0g·L^-1植物凝胶，pH 6.0。)上28℃-30℃(16h光/8h暗循环光照培养)培养3-4周。小的愈伤组织大约在3周时可以被看到，然后，每隔一个月继代培养，直到愈伤组织达到合适的数量。

(3)胚性愈伤组织和体细胞胚的诱导：将一定数量的愈伤组织转入CB4培养基(4.4g·L^-1MS、30g·L^-1Glc、1.9g·L^-1KNO₃、2.0g·L^-1MgCl₂·6H₂O、2.5g·L^-1植物凝胶，pH 6.0。)中，28℃-30℃(16h光/8h暗循环光照培养)培养，每隔一个月继代培养，至体细胞胚出现。

(4)体细胞胚的萌发：把体细胞胚转到CB5培养基(MSB-NH₂NO₃、30g·L^-1Glc、1.9g·L^-1KNO₃、0.5g·L^-1Asn、1.0g·L^-1Gln、2.0g·L^-1MgCl₂.6H₂O、2.5g·L^-1植物凝胶，pH 6.0。)中，让它们萌发并长成小苗。

(5)转基因植株的获得：转移幼苗(2-4cm长，具有叶子的嫩枝)转到CB6培养基(MSB-NH₂NO₃、30g·L^-1Glc、1.9g·L^-1KNO₃、0.5g·L^-1Asn、1.0g·L^-1Gln、2.0g·L^-1MgCl₂.6H₂O、2.5g·L^-1植物凝胶，pH 6.0。)中，28℃-30℃(16h光/8h暗循环光照培养)生长4个月。将具有较好根系的转基因植株直接转到含有湿土的小盆中，并在培养室中28℃-30℃(16h光/8h暗，循环光照培养)培养2周，然后，转移这些小盆到温室中。每天对转基因植株进行浇水，对之进行施肥等直到棉铃成熟。然后，收集种子，4℃保存种子。

(6)转基因的PCR鉴定：

用小量抽提植物总DNA的方法得到植物总DNA，以1.5μl总DNA为模板以引物(2400-2420bp，3000-3025bp)进行PCR扩增，共检测了53棵无菌棉花苗，其中有5棵被检测到有特异性条带的阳性植株(T₀)，部分植株PCR产物电泳结果如图2所示。

实施例5利用Southern杂交方法鉴定棉花转入GbRPS1基因植株

利用Southern blot分析目标基因在转基因植株基因组中整合情况，

(1)对照和转基因植株基因DNA组的酶切和电泳

按照表2所示的方法进行棉花基因组DNA的酶切反应。转基因植株和对照植株DNA于37℃酶切24-48h后，取5μL产物电泳，于UV灯下检测是否酶切完全，酶切完全的在泳道上为均匀弥散状条带，然后将酶切产物在冷冻干燥离心机上浓缩至50μL，加6μLLoading buffer后，在1％琼脂糖凝胶电泳。先用120V电泳20min，当DNA全部跑出点样孔后，将电压调为2V/cm，电泳5h。

表2棉花DNA限制性内切酶体系。

成分	体积
		棉花基因组DNA	60μg
10×限制性内切酶Buffer	20μL
		限制性内切酶(15U/μL)	5μL
ddH2O	总体积至200μL

(2)转膜

电泳结束后取出凝胶，切去多余的胶块，测量长和宽，切去右上角作为标记，然后放入脱嘌呤液10-15min进行脱嘌呤处理，此时溴酚蓝的颜色变黄。

将胶块转移至一新托盘内，用去离子水漂洗2次，然后将样品转移到变性液中至少50min做DNA变性处理。

变性结束后，将胶块转移至另一新托盘内，用去离子水漂洗2次，然后将样品转移到中和液中30min。

玻璃平板置于陶瓷方盘上，并铺上两张Whatman 3MM滤纸作为虹吸桥，盘中加入足量的转移缓冲液10×SSC，用玻璃棒赶出虹吸桥和玻璃板中的气泡。将一长和宽和凝胶大小一致的硝酸纤维素滤膜，切去一角，在10×SSC溶液浸润3-5min。

将凝胶正面朝下，放置于虹吸桥中央，用玻璃棒赶出滤纸和胶块之间的气泡。将硝酸纤维膜覆盖于凝胶上，并使切角对齐。用Parafilm封凝胶的四边，以防短路。在膜上放三层3MM滤纸，并用玻璃棒赶出气泡。将多层吸水纸覆盖于滤纸上，顶部放一合适大小的玻璃板，并在玻璃板上方放置500g重物，转膜3-5d，期间应不断更换吸水纸。转膜完成后，取下胶体，用EB染色10min，并进行紫外检测，检查转膜效果。用3MM滤纸夹住尼龙膜，置于室温30min晾干，然后置于80℃固定2-3h后，将尼龙膜包裹于锡泊纸中，于4℃保存备用。

(3)探针制备

根据抗病基因3’端相对非保守区域设计特异引物，扩增400bp长度的片段(位于基因2600-3000bp位点)作为Southern blot检测的探针。

探针标记步骤如下：取20μLCross-linker用80μL水(试剂盒内提供)稀释成工作浓度。工作液在2-8℃可保存一个星期。用试剂盒内提供的水将用于标记的DNA稀释到10ng/μL。核酸中的盐浓度必须尽可能低，不超过50mmol/L。取10μL稀释过的DNA样品于微量Eppendorf离心管中，在沸水浴中变性5min。立即将样品置于冰上冷却5min，在微量离心机上轻轻离心，将混合物收集到管底。向冷却的DNA样品中加入10μLReaction buffer，轻轻地混匀，置于冰上。

加入2μL Labeling reagent，轻轻地混匀。加入10μL Cross-linker工作液，彻底混匀，在微量离心机上轻轻离心，将混合物收集到管底。反应混合物于37℃温育30min。标记后的探针可以立即使用，或置于冰上保存2h。长时间保存需要加入50％甘油(v/v)。

(4)杂交

取所需体积的杂交缓冲液，预热至55℃。Buffer用量为0.25mL/cm²杂交膜。对于大的杂交膜，Buffer用量可以减少到0.125mL/cm²；将膜置于Hybridization buffer中，在杂交炉中预杂交至少15min；在预杂交Buffer中加入标记好的探针，一般每毫升Buffer中加入5-10ng探针；在55℃杂交炉中杂交过夜。可通过改变杂交温度(50-75℃)调控严谨度。

(5)洗膜：

将Primary wash buffer预热至55℃，其用量为2-5mL/cm²；小心地将纤维膜转移到Primary wash buffer中，55℃漂洗10min；用Primary wash buffer在55℃漂洗10min；将纤维膜转移至一干净容器，加入过量Secondary wash buffer，在室温下漂洗5min；用Secondary wash buffer再一次漂洗5min。

(6)检测：

去除膜上多余的Secondary wash buffer，并将膜置于一层平整的SanranWrap上面，使样品面朝上；将检测试剂滴于膜上(30-40μL/cm2)，放置2-5min，除去多余检测试剂；

在X光片夹中铺一层干净滤纸，滤纸下面放上增感屏前屏；将膜用保鲜膜包好，正面向上放在滤纸上，用胶带固定；暗室中取一张X光片放在杂交膜上。再放上增感屏后屏，合上光片夹，封上胶带，曝光2h左右；在暗室中将显影液倒入大方盘中，取出X光片，置显影液中，轻轻晃动液体，显影3-5min至黑色曝光条带显现，立即将X光片转移至定影液中，定影20min左右，取出X光片置流水中冲洗过夜；

转GbRPS1基因棉花植株的Southern杂交分析情况见图3。图3中1-5为转GbRPS1基因植株，P为阳性质粒对照。图3的实验结果说明GbRPS1基因已经整合到棉花的基因组中，拷贝数为1-2个，转基因植株可用于基因的功能分析鉴定。

实施例6利用苗期接种鉴定分析转GbRPS1基因棉花植株对枯萎病的抗性水平

1、方法

转基因棉花和对照植株的枯萎病抗性采用温室蘸根土壤接菌法进行鉴定。来自湖北荆州的棉花枯萎病菌7号小种作为抗性鉴定的菌种。枯萎病菌在灭菌的棉籽培养基中生长3-7天后用于接种鉴定。转基因棉花和对照植株在苗期(真叶数目为3-5叶)进行抗性鉴定，鉴定采用每个株系为10株，重复3次。

将移栽的转基因棉花和对照植株从土壤中拔出，放入100ml的培养基(1/2MS+10⁶枯萎病菌孢子/ml)中10分钟，浸泡的棉花植株重新转入土壤中在温室中培养(28-35℃)。接种15天后调查转基因棉花和对照植株的发病情况。

2、结果

转基因植株和对照植株幼苗生长15天后，可看到所有的转基因植株均属于高抗的水平，其中仅3号株系的病级为1级，其它4个株系均无病叶，病级为0级(未发病)；而未转基因的对照植株不具有对棉花枯萎病的抗性，病级为4级。具体结果详见表4。

3、结论

转GbRPS1基因植物对枯萎病具有抗性。

实施例7利用苗期接种鉴定分析转GbRPS1基因棉花植株对黄萎病的抗性水平

1、方法

转基因棉花和对照抗黄萎病性采用温室蘸根土壤接菌法进行鉴定。在棉花苗期(真叶数目为3-5叶)接种棉花黄萎病菌(落叶型强致病力菌系邯郸207，由河北农业大学棉花研究室提供)。采用蘸根接种的方法进行抗性鉴定，具体操作为：

黄萎病菌在灭菌的察氏培养基中生长3-7天后用于接种鉴定。转基因棉花和对照植株在苗期(真叶数目为3-5叶)进行抗性鉴定，鉴定采用每个株系为10株，重复3次。

将移栽的转基因棉花和对照植株从土壤中拔出，放入100ml的培养基(1/2MS+10⁶孢子/ml)中10分钟，浸泡的棉花植株重新转入土壤中。转基因棉花和对照植株在温室中培养(28-35℃、湿度为60％、光照强度为10000Lex)生长。接种15天后调查转基因棉花和对照植株的发病情况。

2、结果

转基因植株和对照植株幼苗生长15天后，可看到所有的转基因植株均属于高抗的水平，其中株系1、4、5均无病叶，病级为0级，株系2为1级，株系3为1级；而未转基因的对照植株不具有对棉花枯萎病的抗性，病级为4级。具体结果详见表4。

3、结论

转GbRPS1基因植物对黄萎病具有抗性。

实施例6和实施例7两个实验中，评价转基因棉花植株与对照植株的的抗性水平按表3的标准进行，评价结果见表4：

表3棉花苗期枯萎病、黄萎病抗性鉴定分级标准。

表4转GbRPS1基因植株抗病性分析表。

Claims (9)

1.一种分离的GbRPS1蛋白质多肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

2.权利要求1所述的多肽在提高植物对枯萎病和黄萎病抗性方面的应用。

3.一种分离的多核苷酸，为：

(a)编码权利要求1所述多肽的多核苷酸；或

(b)与(a)互补的多核苷酸。

4.权利要求3所述的多核苷酸，其序列选自：

(a)SEQ ID NO:1中202-2916位；或

(b)SEQ ID NO:1中1-3120的序列。

5.权利要求3或4所述的多核苷酸在提高植物对枯萎病菌和黄萎病抗性方面的应用。

6.一种载体，其特征在于含有权利要求3或4所述的多核苷酸。

7.一种遗传工程化的宿主细胞，其特征在于含有权利要求6所述的载体。

8.权利要求1所述多肽的制备方法，包含：

(a)在适合表达的条件下，培养权利要求7所述的宿主细胞；

(b)从培养物中分离出具有GbRPS1蛋白质活性的多肽。

9.一种提高植物对枯萎病菌和黄萎病抗性的方法，包括：

(a)提供携带权利要求6所述的载体的农杆菌；

(b)将植物细胞或组织或器官与步骤(a)中的农杆菌接触，从而使所携带的表达载体中的DNA编码序列转入植物细胞，并且整合到植物细胞的染色体上；

(c)选择出转入有GbRPS1蛋白质的DNA编码序列的植物细胞或组织或器官；

(d)将步骤(c)中的植物细胞或组织或器官再生成植株。

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