CN102319282B - 一种双水相萃取葛根中总黄酮的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种双水相萃取葛根中总黄酮的方法，包括有以下步骤：1）固液浸提：将葛根药材粉碎，加入浸取剂，加热回流提取，合并滤液，得到葛根粗提液；2）双水相萃取：取步骤1）所得葛根粗提液，浓缩加入无水乙醇/磷酸二氢钾形成的双水相体系，加水，混匀，静置后分为上下两相；3）减压蒸馏，真空干燥得到葛根总黄酮提取物。本发明优点在于：1）分相迅速，回收率高；2）过程集成，双水相萃取既达到了纯化的目的，又浓缩了料液；3）避免了有毒溶剂正丁醇的使用；4）界面张力小，有助于两相之间的质量传递；5）有利于纯化样品；6）易于工艺放大和连续操作，与后续纯化工序可直接相连，无需进行特殊处理。

Description

一种双水相萃取葛根中总黄酮的方法

技术领域

本发明属于天然产物有效成分的分离纯化领域，具体的讲是涉及一种双水相萃取葛根中总黄酮的方法。

背景技术

葛根别名鹿藿、鸡齐，为野葛或粉葛的干燥根，是常用的中药材，历代以来本草均有记载，味甘、辛、性平，具有解肌退热、生津、透疹、温阳止泻、提高机体免疫力等功能。目前，葛根广泛用于改善心脑血管。治疗腹泻、糖尿病等重要复方制剂中，用量极大，是制剂的重要成分。《中华人民共和国药典》和《卫生部药品标准》中收录大约有140余种葛根复方制剂，其中主要有葛根片剂、针剂等。实际上葛根主要有效成分为葛根总黄酮，尤其野葛含葛根总黄酮较多，主要作为葛根制剂、药品、保健品等的原料。黄酮类化合物具有抗癌抗肿瘤、抗心脑血管疾病、抗过敏、抗辐射、抗炎抑菌、抗病毒、抗氧化、抗突变、以及增强免疫能力等广泛的生理活性。能防治心脑血管系统的疾病和呼吸系统的疾病等，如对治疗冠心病、心绞痛、高血压等有显著效果，对防治心肌梗塞、心肌缺血，心律失常等也起重要疗效。葛根黄酮广泛应用于医药、食品、化妆品等工业中，且因其毒性较低及显著独特的生物活性，还被应用到保健食品方面，即用作食品、化妆品的天然添加剂，如食用色素、甜味剂、抗氧化剂等。葛根多糖由于独特的生理活性也备受人们青睐。

葛根中含有的黄酮类化合物多以糖苷的形式存在，一般提取时多采用水、甲醇、乙醇溶液做提取溶剂，用正丁醇做萃取剂。另据报道，有人采用大孔吸附树脂的方法提取分离黄酮类化合物，采用正丁醇萃取，使用的溶剂毒性较大，而且需重复三次，操作繁琐；采用大孔吸附树脂，前处理方法复杂，而且提取率较低，费时。

双水相萃取技术（Aqueous two-phase extraction, ATPS）又称水溶液两相分配技术，是近年来出现的引人注目，极有前途的新型分离技术。ATPE技术始于20世纪60年代，从1956年瑞典伦德大学Albertsson发现双水相体系到1979年德国GBF的Kula等将双水相萃取分离技术应用于生物产品分离，虽然只有二、三十年的历史，但由于其条件温和，质量传输快，成本低，易操作，可调节，容易放大，可连续操作等特点，与传统的有机溶剂萃取体系相比较，双水相萃取体系在生物物质的分离中有独到的优越之处。迄今，双水相体系已经在生物化学、细胞生物学、生物化工等有机物分离提纯方面得到了较为广泛的应用。传统的高聚物/高聚物或高聚物/无机盐双水相体系，已经成功用于分离和提取各种蛋白质（多肽和酶），分离和提取各种抗生素、氨基酸、金属和中药的有效成份等领域。

在生物物质分离过程中得到应用的双水相系统有两类，一类是聚合物和聚合物双水相体系，一类是聚合物和无机盐双水相体系。因为所用的聚合物无毒性，已被许多国家的药典所收录，而且其多元醇、多元糖结构能使生物大分子稳定，但在实际应用中这两类双水相系统各有优缺点，这两种体系对生物活性物质变性作用低，界面吸附少，但是所用的聚乙二醇（简称PEG）和葡聚糖（简称Dextran）成本太高，而且体系黏度大，影响工业规模应用的进展，目前真正工业化的例子还很少。因此，开发廉价的双水相体系则成了双水相萃取分离技术发展的方向。

当能与水混溶的普通的有机溶剂，如乙醇、异丙醇、丙酮等，加入到某些电解质水溶液中，利用盐离子的水化作用，使盐离子夺取原来与有机溶剂水合的水分子而释放出有机溶剂分子，可形成有机溶剂/无机盐双水相体系。当生物物质或天然产物中的有效成分进入双水相体系时，由于表面性质、电荷作用和各种力（憎水键、氢键和离子键）的存在和环境因素（浓度、温度、pH 值以及离子的种类和强度等）的影响，生物物质或天然产物中的有效成分易在两相间形成选择性的分配。利用这一点，可以实现生物物质和天然产物中有效成分的提取、浓缩和分离。这类新型的萃取体系，在众多领域中表现出广阔的应用前景，中草药有效成分分子中多具有疏水性结构，因此双水相萃取技术在中草药有效成分分离纯化中应用是当前研究的热门。

发明内容

   本发明所要解决的技术问题是针对现有技术而提供了一种双水相萃取葛根中总黄酮的方法，其不但避免了有毒溶剂的使用，提高了葛根中总黄酮的提取率，且能将粗提品中的黄酮与多糖进行分离，达到纯化葛根黄酮的目的，且方法本身操作简单经济。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种双水相萃取葛根中总黄酮的方法，包括有以下步骤：

1）固液浸提：将葛根药材粉碎，加入浸取剂，葛根药材与浸取剂固液比为1g∶5ml- 1g∶30ml，加热回流提取三次，每次1小时，合并三次提取后的滤液，得到葛根粗提液；

2）双水相萃取：取步骤1）所得葛根粗提液，浓缩至原滤液体积的1/5-1/4，加入无水乙醇/磷酸二氢钾形成的双水相体系，加水，使系统中无水乙醇质量为系统总质量的16%-30%，磷酸二氢钾质量为系统总质量的17%-22%，混匀，静置后分为上下两相，其中，分相温度为30℃-80℃，分相时间为5-20分钟，控制pH为5.0-9.0；

3）减压蒸馏，真空干燥：取出含有大量葛根总黄酮的乙醇上相，对其进行减压蒸馏，减压蒸馏的温度为70℃-80℃，最后在70℃-80℃下真空干燥，得到葛根总黄酮提取物。

按上述方案，所述的浸取剂为质量百分比浓度为50-90%甲醇溶液或者乙醇溶液。

按上述方案，所述的无水乙醇与磷酸二氢钾质量分数比为1:1-2:1。

与现有技术相比，本发明所提供的双水相萃取葛根黄酮的方法的优点在于：1）分相迅速，回收率高，在实验中观察到，采用双水相萃取法，约10分钟即可分相，并且没有乳化层，缩短了实验周期，且回收率高；2）过程集成，双水相萃取既达到了纯化的目的，又浓缩了料液，浓缩倍数达到4倍以上；3）避免了有毒溶剂正丁醇的使用，采用了低度的无水乙醇，利用环保且节约了试剂；4）界面张力小，有助于两相之间的质量传递；5）大量杂质可与固体物质一同除去，有利于纯化样品；6）易于工艺放大和连续操作，与后续纯化工序可直接相连，无需进行特殊处理。

附图说明

    图1为乙醇/磷酸二氢钾相图；

图2为葛根素对照品紫外吸收光谱图；

图3葛根黄酮的标准曲线。

具体实施方式

以下实施例是对本发明的进一步说明，不是对本发明的限制。

实施例1：

1）固液浸提

取粉碎的葛根药材约50.0g，精密称定，在90℃水浴中用体积分数为70%乙醇加热回流提取1h，固液比为1 g：10 ml，重复3次后过滤，合并滤液即得到葛根粗提液，加热浓缩得浸膏，以水分散至原滤液体积的1/5，即得葛根样品溶液；

2）双水相萃取

取上述葛根样品溶液，加入无水乙醇，磷酸二氢钾分别为100 ml和53 g，加水，控制无水乙醇和磷酸二氢钾的质量分数在乙醇/磷酸二氢钾相图（图1）曲线的上方，使其中无水乙醇质量分数为25%，磷酸二氢钾质量分数为17%，pH为5.8，30℃放置5分钟，静置分相，分别测量上下相中总黄酮的含量；

3）葛根总黄酮测定

精密称取干燥的葛根素标准品5.3 mg，置于50 mL容量瓶中，95%乙醇定容，作为标准液。得到0.106 mg/mL的葛根素标准溶液。依次移取该标准溶液0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mL于10 mL容量瓶中，用95%乙醇稀释定容，得到系列对照品溶液。根据图2，得到标准品的最佳吸收波长为250 nm，将配置好的系列对照品溶液于250 nm处测其吸光度，得到吸光度A与葛根黄酮浓度C(mg/mL)的线性关系，如图3所示。

由标准曲线得，线性回归方程为：A = 56.5027C + 0.01957；

线性回归系数为：R= 0.99936

步骤2）所得上相稀释20倍后，测得上相吸光度为1.508，根据回归方程计算的浓度为0.526 mg/ml, 步骤2）所得下相稀释5倍后，测得吸光度为0.923，计算得下相为浓度为0.08 mg/ml。利用紫外分光光度法测定双水相萃取体系中葛根总黄酮的浓度，按公式（3）计算回收率Y：

(1)   r=V_上/V_下                  (1)

(2)   Ｋ＝Ｃ_上/Ｃ_下               (2)

(3)   Y=R×K/(1+R×K)×100%        (3)

式中：r为相比；V_上和V_下为上下相的体积（ml）；Ｃ_上，Ｃ_下分别是上、下相中目标分离物的质量浓度(mg/ml)；K为分配系数。当r为1时，计算得总黄酮在乙醇相的收率为86.8%； 

3）浓缩萃取液

取出含有大量葛根总黄酮的乙醇上相，置于70℃减压蒸馏，70℃真空干燥后得到葛根总黄酮提取物。

实施例2：

1）固液浸提

取粉碎的葛根药材约50.0g，精密称定，在90℃水浴中用体积分数为70%乙醇加热回流提取1h，固液比为1 g：15 ml，重复3次后过滤，滤液加热浓缩得浸膏，以水分散至原滤液体积的1/5，既得葛根样品溶液。

2）双水相萃取

取上述葛根样品溶液，加入无水乙醇，磷酸二氢钾分别为100 ml和55 g，加水，其中无水乙醇质量分数为27.8%，磷酸二氢钾质量分数为19.4%，pH为6.5，30℃放置10分钟，静置分相，经计算，同实施例1，得总黄酮在乙醇相的收率为92.8%。

3）浓缩萃取液

取出无水乙醇相，置于70℃减压蒸馏，70℃真空干燥后得到葛根总黄酮提取物。

实施例3：

1）固液浸提

取粉碎的葛根药材约50.0g，精密称定，在90℃水浴中用体积分数为70%乙醇加热回流提取1h，固液比为1 g：20 ml，重复3次后过滤，滤液加热浓缩得浸膏，以水分散至原滤液体积的1/5，既得葛根样品溶液。

2）双水相萃取

取上述葛根样品溶液，加入无水乙醇，磷酸二氢钾分别为100 ml和50 g，加水，其中无水乙醇质量分数为28.3%，磷酸二氢钾质量分数为17.9%，pH为5.3，30℃放置15分钟，静置分相。经计算，同实施例1，得总黄酮在乙醇相的收率为87.2%。

3）浓缩萃取液

取出无水乙醇相，置于70℃减压蒸馏，70℃真空干燥后得到葛根总黄酮提取物。

Claims (1)

1.一种双水相萃取葛根中总黄酮的方法，包括有以下步骤：

1）固液浸提：将葛根药材粉碎，加入浸取剂，所述的浸取剂为质量百分比浓度为50-90%乙醇溶液，葛根药材与浸取剂固液比为1g∶5ml- 1g∶30ml，加热回流提取三次，每次1小时，合并三次提取后的滤液，得到葛根粗提液；

2）双水相萃取：取步骤1）所得葛根粗提液，浓缩至原滤液体积的1/5-1/4，加入无水乙醇/磷酸二氢钾形成的双水相体系，所述的无水乙醇与磷酸二氢钾质量分数比为1:1-2:1，加水，使系统中无水乙醇质量为系统总质量的16%-30%，磷酸二氢钾质量为系统总质量的17%-22%，混匀，静置后分为上下两相，其中，分相温度为30℃-80℃，分相时间为5-20分钟，控制pH为5.0-9.0；

3）减压蒸馏，真空干燥：取出含有大量葛根总黄酮的乙醇上相，对其进行减压蒸馏，减压蒸馏的温度为70℃-80℃，最后在70℃-80℃下真空干燥，得到葛根总黄酮提取物。

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