CN102319234A - 姜黄素在制备甲状腺癌治疗剂中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了姜黄素在制备甲状腺癌治疗剂中的应用，属于姜黄素的医药用途技术领域。姜黄素可特异性杀伤甲状腺癌细胞而对正常甲状腺细胞影响较小。姜黄素能促进甲状腺癌细胞凋亡，引起聚腺苷二磷酸核糖聚合酶（PARP）的切割并显著抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，同时，姜黄素还能够抑制甲状腺癌细胞基质金属蛋白酶-9的分泌以及细胞对胞外基质的粘附。以上结果显示，姜黄素对甲状腺癌细胞的增殖、迁移、粘附各环节都显示出良好的干预作用，可以用于制备治疗甲状腺癌药物。

Description

姜黄素在制备甲状腺癌治疗剂中的应用

技术领域

本发明涉及一种治疗甲状腺癌的药物，具体的说是将姜黄素及其衍生物用于在制备甲状腺癌治疗剂中的应用，属于姜黄素的医药用途技术领域。

背景技术

甲状腺癌是内分泌系统最常见的肿瘤，是由数种不同生物学行为以及不同病理类型的癌肿组成，主要包括乳头状癌（papillary thyroid carainoma，PTC）、滤泡状癌（follicular thyroid carainoma，FTC）、未分化癌（undifferentiated thyroid carainoma，uDTC）、髓样癌（medulla thyroid carcinoma，MTC)）四种类型。

甲状腺癌的发病率为2－10/10万，约占全身恶性肿瘤的1%。据国际癌症学会资料统计，各国甲状腺癌的发病率逐年增加。2009年，美国甲状腺癌的新发病例数达37200，死亡病例数为1630，主要是PTC发病率的增加。研究调查结果显示，我国甲状腺癌的发病率也在明显增加。而且，在国内一些肿瘤医院中，甲状腺癌占头颈部肿瘤的首位。

姜黄素(curcumin)是从姜科姜黄属植物姜黄中提取得到的一种植物多酚。除姜黄外，咖喱、芥茉中也富含姜黄素，因其毒副作用小，已广泛用作食品天然色素。同时姜黄素的药理作用广泛，是抗突变剂，也是抗癌剂，美国国家肿瘤研究所已将其列为第三代癌化学预防药。近年来，对姜黄素在各种生物学体系的作用机制的研究越来越多，姜黄素显著抑制肿瘤细胞增殖也得以证实。姜黄素抗肿瘤作用的分子机制相当复杂，其作用靶点从基因(DNA)水平到mRNA水平及酶(蛋白质)水平，姜黄素可能在某一水平或在这几个水平上同时产生作用。总结起来其抗癌机制有以下几方面：(1)细胞毒作用；(2)诱导肿瘤细胞凋亡；(3) 诱导肿瘤细胞分化；(4) 抑制肿瘤的侵袭与转移。

目前已有文献报道姜黄素对多种肿瘤细胞具有杀伤作用，但姜黄素对甲状腺癌细胞的作用国内外均尚无报道。我们通过研究发现姜黄素可特异性杀伤甲状腺癌细胞而对正常甲状腺细胞影响较小并能促进甲状腺癌细胞凋亡，引起聚腺苷二磷酸核糖聚合酶（PARP）的切割并显著抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，同时能够抑制甲状腺癌细胞基质金属蛋白酶-9的分泌和对细胞外基质的粘附，对甲状腺癌细胞的增殖、迁移、粘附各环节都显示出良好的干预作用，可以用于制备治疗甲状腺癌药物的应用。

发明内容

本发明的目的是提供姜黄素在制备治疗甲状腺癌药物的用途。姜黄素化学命名：1,7-bis-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-1,6-heptadiene-3,5-dione，英文名为curcumin，分子式为C₂₁H₂₀O₆，分子量368.37，对人体毒性小。

本发明的技术方案：姜黄素及其衍生物的应用，用于制备治疗甲状腺癌的药物。

抑制甲状腺癌细胞增殖，使甲状腺癌细胞接触姜黄素，姜黄素能够抑制甲状腺癌细胞增殖。

诱导甲状腺癌细胞凋亡，使甲状腺癌细胞接触姜黄素，姜黄素能诱导甲状腺癌细胞凋亡。

诱导甲状腺癌细胞凋亡，姜黄素诱导甲状腺癌细胞凋亡的机制主要是通过促进甲状腺癌细胞PARP的切割并抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表达。

抑制甲状腺癌细胞侵袭及转移，使甲状腺癌细胞接触姜黄素，姜黄素能抑制甲状腺癌细胞基质金属蛋白酶－9的分泌和对细胞外基质的粘附。

所述姜黄素选用姜黄素、去甲氧基姜黄素、或双去甲氧基姜黄素；姜黄素衍生物选用取代姜黄素中的甲氧基或双甲氧基的基团后的衍生物。

姜黄素及其衍生物用化学合成方法制备得到。

姜黄素及其衍生物从植物提取得到。

姜黄素及其衍生物用于制备治疗甲状腺癌药物剂型为：液体制剂、颗粒剂、片剂、冲剂、胶丸、胶囊、缓释剂、滴丸剂、口崩制剂或注射剂。

肿瘤细胞最显著的特点之一就是其生长不受机体控制，进入无限增殖状态。这可能与细胞正常的生长调控机制发生障碍有关。我们研究发现姜黄素对于恶性程度不同的甲状腺癌细胞均有不同程度的抑制增殖作用，其中以滤泡癌FTC-133最为敏感。30 μM姜黄素作用，FTC-133细胞死亡率达40.9±5.7%，而乳头状癌K1为23.3±8.3%，未分化癌8505C为7.9±1.7%。目前临床使用的抗癌药物多无选择性，有不同程度的毒副作用，药物在消灭肿瘤细胞的同时也破坏正常细胞。然而，我们研究发现，对于原代培养的甲状腺正常或癌细胞，高剂量的姜黄素（50 μM）对甲状腺癌细胞杀伤强度要远远高于对正常甲状腺细胞的损害（50.5±4.68% vs20.87±1.65%），显示出一定的肿瘤杀伤特异性。

在肿瘤发生和发展过程中，细胞不仅发生了异常增殖，更重要的是其发生凋亡的能力和倾向降低了。姜黄素与K1或FTC-133细胞作用24小时后，Annexin V/PI双染，流式细胞仪检测发现，姜黄素可梯度依赖性地诱导K1和FTC-133细胞凋亡。当姜黄素浓度达40μM时，所有细胞几乎都发生了凋亡，其中K1细胞的凋亡率为99.41%，FTC-133细胞的凋亡率为99.56%。

Bcl-2家族在细胞凋亡调控中有重要的作用，是目前细胞凋亡研究的热点之一。Bcl-2家族分为抑制凋亡和促进凋亡蛋白两大类。Bcl-2和Bax分别是Bcl-2家族中最主要的抑制凋亡和促进凋亡蛋白。当细胞凋亡，DNA发生损伤时，聚腺苷二磷酸核糖聚合酶（PARP）可作为细胞内的分子感受器，识别、结合到DNA断裂处，并被激活。我们通过western blot方法检测，姜黄素梯度依赖性地促进K1和FTC-133细胞PARP的切割并抑制Bcl-2的表达，其中20μM以上姜黄素对Bcl-2的抑制效果极为显著。

肿瘤转移是一个多步骤、多因素、多基因相互作用的连续复杂的过程。一个有转移潜能的肿瘤细胞从离开肿瘤原发部位到新的部位扎根增殖，需要经过许多步骤：1. 原发部位的细胞转化和肿瘤生长；2. 原发部位血管生长因子的合成与分泌以及血管形成；3. 癌细胞浸润薄壁淋巴管、小静脉或毛细管的基质；4. 癌细胞进入血循环或淋巴循环继续存活并随之转运；5. 癌细胞通过粘附新部位的内皮细胞或暴露的内皮下基底膜而被捕获；6. 癌细胞通过降解细胞外基质而渗出血管或淋巴管；7. 癌细胞在新的部位增殖，形成肿瘤。目前已知，转移的肿瘤细胞通常会发生一系列的生理生化过程，包括细胞骨架的重排、粘附能力的改变及运动能力的提高，并可合成分泌蛋白水解酶来降解基底膜等。这些变化在肿瘤细胞发生转移的过程中起到了十分重要的作用。通过明胶酶谱分析，我们发现姜黄素与K1细胞作用24小时后，可梯度依赖性地抑制基质金属蛋白酶-9的活性，其中25，50，100μM姜黄素能够极显著地抑制基质金属蛋白酶-9的活性。同时对细胞做粘附分析，发现姜黄素可显著降低甲状腺癌细胞对胞外基质I型胶原蛋白的粘附。与溶剂对照组相比，以姜黄素12.5，25，50μM处理FTC-133细胞，可将细胞粘附率分别由69.2±7.7%，60.8±1.9%，65.5±8.4%降低至28.5±0.9%，6±4.5%，6.8±5.6%，抑制效果极其显著。

本发明的有益效果：（1）提出了姜黄素的新用途；（2）姜黄素可特异性杀伤甲状腺癌细胞而对正常甲状腺细胞影响较小并能促进甲状腺癌细胞凋亡，引起PARP的切割并显著抑制抗凋亡Bcl-2的表达，同时能够抑制甲状腺癌细胞基质金属蛋白酶-9的分泌并降低细胞对胞外基质的粘附，对甲状腺癌细胞的增殖、迁移、粘附各环节都显示出良好的干预作用；（3）姜黄素对人体正常细胞安全、低毒，可用于治疗甲状腺癌的药物。

附图说明

图1　姜黄素对三种甲状腺癌细胞（K1，FTC-133, 8505C）的生长抑制率比较。姜黄素与细胞作用24 小时后，Hoechest/PI 双染，计数细胞死亡率。溶剂对照（0.1% DMSO).*P<0.05, **P<0.01 vs 溶剂对照 (学生t检验).

图2　姜黄素对原代培养甲状腺正常及癌细胞生长抑制率比较。溶剂对照（0.1% DMSO)..*P<0.05, **P<0.01 vs溶剂对照 (学生t检验). ^##P<0.01，原代甲状腺正常细胞与原代甲状腺癌细胞比较.

图3　姜黄素诱导甲状腺癌细胞凋亡。姜黄素与细胞作用24小时后，Annexin V/PI双染，流式细胞仪检测。(A) K1。（B）FTC-133。

图4　姜黄素促进甲状腺癌细胞PARP的切割并抑制Bcl-2的表达。

图5　姜黄素抑制甲状腺癌细胞基质金属蛋白酶-9的分泌。

图6　姜黄素降低甲状腺癌细胞对细胞外基质的粘附。

具体实施方式

　　下面结合具体实施例和附图对本发明作进一步的说明。

实施例1：姜黄素抑制原代培养或甲状腺癌细胞株的增殖。

1. 实验材料

下述实施例中的实验方法和所用的试剂，如无特别说明，均为常规方法和常规试剂。

1.1细胞系：本实验中所用乳头状癌细胞株K1、滤泡状癌细胞株FTC-133、未分化癌细胞株8505C均购自欧洲细胞库。FTC-133细胞使用DMEM与 Hams F-12培养基1:1（v/v）培养；K1细胞使用DMEM培养基、Hams F-12培养基与MCDB105培养基2:1:1（v/v）培养，8505C细胞使用MEM培养基培养。以上三株细胞在相应培养基中均添加10%胎牛血清（杭州四季青）培养。

1.2原代细胞培养流程：取适量临床手术并经病理鉴定的甲状腺癌组织、癌旁或对侧正常甲状腺组织，用含1000 U/mL硫酸庆大霉素的1640培养基洗涤3次，去除包膜和结缔组织，剪成１立方毫米大小碎块。用0.2% （600 U/mL）胶原酶37℃消化，每15分钟振摇一次，4 小时后吸取上清，800 rpm离心10分钟后，弃上清，细胞重悬于红细胞裂解液中3分钟，再以1000 rpm离心10分钟，弃上清。细胞重悬，用含15% 胎牛血清和1U/L牛促甲状腺激素（TSH）和100 U/mL青-链霉素的F-12 培养基常规二氧化碳培养箱培养。

1.3姜黄素的配制：姜黄素（sigma公司，货号C7727，纯度≥80%）以二甲基亚砜（DMSO）充分溶解，配成 10mg/mL贮存液，-20℃保存。临用时以各细胞使用的培养基稀释到所需药物浓度。

2. 实验方法

2.1     细胞处理：当原代培养的甲状腺癌细胞或甲癌细胞株汇合度达80%左右时，进行胰酶消化，按10000个细胞/孔接种于96孔板中，待细胞贴壁后给药，以不同浓度的姜黄素（10，20，30，40，50　μM）作用24小时，溶剂对照组按姜黄素最大剂量（50　μM）中所含溶剂的量加入0.18% (v/v)的DMSO。药物作用结束后，加入碘化吡啶（PI）(10　μg/mL) 和赫斯特33342　荧光染料（Hoechest 33342）　(10 μg/mL)染色10分钟后，荧光显微镜下（Olympus, IX5）拍摄5个视野，计数。细胞死亡率(%)= (PI 阳性染色细胞/总细胞数)×100%。

2.2 实验结果

姜黄素与甲状腺癌细胞株或原代培养甲状腺正常或癌细胞共孵24小时后，Hoechest 33342/PI 双染，计算PI阳性细胞比例。如图1所示，姜黄素对于恶性程度不同的甲状腺癌细胞均有不同程度的杀伤作用，其中以滤泡癌FTC-133最为敏感。30 μM姜黄素作用，FTC-133细胞死亡率达40.9±5.7%，而乳头状癌K1为23.3±8.3%，未分化癌8505C为7.9±1.7%。图2显示，对于原代培养的甲状腺正常或癌细胞，高剂量的姜黄素（50 μM）对甲癌细胞杀伤强度要远远高于对正常甲状腺细胞的损害（50.5±4.68% vs20.87±1.65%），显示出一定的肿瘤杀伤特异性。

实施例2：姜黄素对原代培养或甲状腺癌细胞株的生长抑制作用。

1. 实验材料

AnnexinV-FITC（异硫氰酸荧光素标记的磷脂结合蛋白5）细胞凋亡检测试剂盒，BD　Pharmingen公司，货号556547。

2. 实验方法

凋亡检测按照BD公司 AnnexinV-FITC细胞凋亡检测试剂盒使用说明进行。细胞重悬于1×结合缓冲液中，调整到1 × 10⁶/mL，每100 μL细胞悬液中加入5 μL的Annexin V-FITC和5 μL的PI溶液，室温避光保存15分钟。进行流式细胞仪分析前每管中加入400 μL 1 ×结合缓冲液。流式细胞仪，FL1和FL2通道分别检测AnnexinV和PI阳性细胞，统计分析细胞凋亡率。

3. 实验结果

姜黄素与K1或FTC-133细胞作用24小时后，Annexin V/PI双染，流式细胞仪检测。如图3所示，姜黄素可梯度依赖性地诱导K1和FTC-133细胞凋亡。当姜黄素浓度达40μM时，所有细胞几乎都发生了凋亡，其中K1细胞的凋亡率为99.41%，FTC-133细胞的凋亡率为99.56%。

实施例3：姜黄素促进甲状腺癌细胞PARP的切割并抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表达。

1. 实验材料

PARP一抗，碧云天生物技术公司，1︰1000稀释；Bcl-2一抗，碧云天生物技术公司，1︰1000稀释；辣根过氧化物酶标记羊抗兔二抗，碧云天生物技术公司，1︰1000稀释。ECL化学发光试剂盒，碧云天生物技术公司。

2.实验方法

细胞内凋亡蛋白表达的检测采用Western blot法。K1和FTC-133细胞以4×10⁵个/mL的密度接种到6孔细胞培养板，每孔1 mL，37℃、5% CO₂培养过夜后，加入不同浓度的姜黄素（10-50 μM）或溶剂对照分组处理，培养结束后收集细胞，6000 rpm离心5分钟，PBS洗涤两次，加入25 μL细胞裂解缓冲液 [150 mM NaCl，1%（w/v）已基苯基聚乙二醇，0.02%（w/v）叠氮化纳，10 μg/mL苯甲基磺酰氟，50 mM Tris-HCl（pH8.0）]裂解细胞，裂解产物在4℃下10,000 rpm离心5离心，收集上清，考马斯亮兰法测定蛋白浓度。取30 μg蛋白，加入4 μL上样缓冲液（500 mM三羟甲基氨基甲烷，600 mM二硫苏糖醇，20.3%（w/v）十二烷基硫酸钠，30% (v/v)甘油，0.012%（w/v）溴酚兰，pH 6.8），煮沸5分钟，15%（w/v）SDS-PAGE凝胶电泳，湿法转膜，硝酸纤维素膜室温下置于含5%（w/v）脱脂牛奶的TBST 缓冲液（137 mM NaCl，20 mM三羟甲基氨基甲烷-HCl，0.1%(v/v) 吐温-20，pH 7.6）中封闭1小时，孵育PARP、Bcl-2一抗，4℃过夜，用TBST缓冲液清洗三次，每次5分钟，孵育辣根过氧化物酶标记的羊抗兔或抗鼠二抗，室温下1小时，生物素标记法化学发光，X光胶片感光显影。

3.实验结果

姜黄素与K1或FTC-133细胞作用24小时后，western blot检测PARP的切割及抗凋亡蛋白Bcl-2的表达水平。如图4所示，姜黄素梯度依赖性地促进K1和FTC-133细胞PARP的切割并抑制Bcl-2的表达。其中20μM以上姜黄素对Bcl-2的抑制效果尤为显著。β-肌动蛋白（β-actin)作为内参对照。

实施例4：姜黄素抑制甲状腺癌细胞基质金属蛋白酶的分泌。

1.实验材料

    明胶，上海生工生物工程有限公司，货号G9764。

2.实验方法 

使用明胶酶谱分析可检测基质金属蛋白酶-2（MMP-2, 72KD）和9（MMP-9, 92KD）的活性。甲状腺乳头状癌细胞株K1，以7.5×10⁴/孔悬于24孔培养板中，加入不同浓度的姜黄素（12.5、25、50、100 μM）或溶剂对照分组处理，在37^oC、5%CO₂ 的培养箱中孵育24小时，离心，取上清。将20μL上清与10μL Tris 缓冲液 （62.5 mM Tris-HCl，10%甘油，0.00125%溴酚蓝，12% SDS）混合，以含2 mg/mL明胶的10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离。电泳后凝胶用洗涤缓冲液（50 mM Tris-HCl，2.5% Triton X-100，5 mM CaCl₂，1μM ZnCl₂，0.05% NaN₃）洗涤，每次30分钟，以除去SDS，再以去离子水洗涤30分钟，重复以上洗涤步骤一次，然后将凝胶置于孵育缓冲液中（50 mM Tris-HCl，5 mM CaCl₂，1μM ZnCl₂，0.05% NaN₃）37^oC孵育24小时，用蒸馏水洗两次后再用0.25%考马斯亮蓝R-250染色30 min，并用含10% 醋酸和10% 异丙醇的溶液脱色2 小时。蓝色背景上的亮带（明胶降解区）即显示蛋白裂解活性。

3.实验结果

姜黄素与K1细胞作用24小时后，使用明胶酶谱法分析基质金属蛋白酶-2和9的活性。如图5所示，姜黄素可梯度依赖性地抑制基质金属蛋白酶-9的活性，其中25，50，100μM姜黄素能够极显著地抑制基质金属蛋白酶-9的活性，而对基质金属蛋白酶-2的活性基本没有影响，各溶剂对照组基质金属蛋白酶酶活无显著变化。

实施例5：姜黄素降低甲状腺癌细胞对细胞外基质的粘附能力。

1.实验材料

    鼠尾I型胶原，sigma, 货号C7661；BSA，上海申能博彩生物公司，货号A0710。

2.实验方法

在96孔板内加入50μL用0.02 M醋酸稀释的鼠尾I型胶原(50μg/mL)，4℃过夜。PBS洗三次后，用0.2% BSA室温封闭2小时，再以PBS洗涤三次。胰酶消化细胞，记数，稀释成2.5× 10⁵/mL的细胞悬液，每孔加入100μL细胞悬液，同时加入不同浓度的姜黄素（12.5、25、50 μM）或溶剂对照处理，每组做三个平行的孔，37℃培养2小时。孵育完毕后，用温热的无血清培养基洗三次，洗去未粘附的细胞，以Hoechest 33342　(10 μg/mL)染色10分钟后，荧光显微镜拍照并计数。以只用BSA包被孔的细胞数作为空白对照，以加入细胞不经冲洗直接染色的孔的细胞数做为接种总细胞数，粘附细胞百分数通过以下公式计算得到，粘附细胞百分数（%）=[（胶原包被组细胞数－BSA包被组细胞数）／不洗组细胞数]×100％。

3. 实验结果

细胞粘附是细胞迁移运动的首要条件。通过粘附分析，考察姜黄素对甲状腺癌细胞与胞外基质I型胶原蛋白粘附能力的影响。如图6所示，姜黄素可显著降低甲状腺癌细胞与胞外基质I型胶原蛋白的粘附。与溶剂对照组相比，以姜黄素12.5，25，50μM处理FTC-133细胞，可将细胞粘附率分别由69.2±7.7%，60.8±1.9%，65.5±8.4%降低至28.5±0.9%，6±4.5%，6.8±5.6%，而各溶剂对照组对细胞的粘附能力影响不大。  

Claims (9)

1.姜黄素及其衍生物的应用，用于制备治疗甲状腺癌的药物。

2.根据权利要求1所述姜黄素及其衍生物的应用，其特征在于：抑制甲状腺癌细胞增殖，使甲状腺癌细胞接触姜黄素，姜黄素能够抑制甲状腺癌细胞增殖。

3.根据权利要求1所述姜黄素及其衍生物的应用，其特征在于：诱导甲状腺癌细胞凋亡，使甲状腺癌细胞接触姜黄素，姜黄素能诱导甲状腺癌细胞凋亡。

4.根据权利要求3所述姜黄素及其衍生物的应用，其特征在于：诱导甲状腺癌细胞凋亡，姜黄素诱导甲状腺癌细胞凋亡的机制是通过促进甲状腺癌细胞PARP的切割并抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表达。

5.根据权利要求1所述姜黄素及其衍生物的应用，其特征在于：抑制甲状腺癌细胞侵袭及转移，使甲状腺癌细胞接触姜黄素，姜黄素能抑制甲状腺癌细胞基质金属蛋白酶－9的分泌和对细胞外基质的粘附。

6.根据权利要求1所述的姜黄素及其衍生物的应用，其特征在于：所述姜黄素选用姜黄素、去甲氧基姜黄素、或双去甲氧基姜黄素；姜黄素衍生物选用取代姜黄素中的甲氧基或双甲氧基的基团后的衍生物。

7.根据权利要求1所述的姜黄素及其衍生物的应用，其特征在于：姜黄素及其衍生物用化学合成方法制备得到。

8.根据权利要求1所述的姜黄素及其衍生物的应用，其特征在于：姜黄素及其衍生物从植物提取得到。

9.根据权利要求1所述的姜黄素及其衍生物的应用，其特征在于：姜黄素及其衍生物用于制备治疗甲状腺癌药物剂型为：液体制剂、颗粒剂、片剂、冲剂、胶丸、胶囊、缓释剂、滴丸剂、口崩制剂或注射剂。

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