CN102313976B - 显微镜自聚焦装置及相配的自聚焦用光阑 - Google Patents

Abstract

本发明涉及用于显微镜(40)的三角形自聚焦装置(21)中的自聚焦用光阑(5，6)，其中孔径光阑(5，6)包含至少一个膜片孔(3，4)，利用该膜片孔可将用于自聚焦并沿自聚焦装置(21)光轴(18)方向伸展的测量束锥(34)限制在其截面内，其中自聚焦用光阑(5，6)的膜片孔(3，4)被安置在离该自聚焦装置(21)光轴(18)有一定距离的偏心位置，其中偏心的自聚焦测量束(36)通过在测量束锥(34)的一半截面(17)内的膜片孔(3，4)产生。

Description

显微镜自聚焦装置及相配的自聚焦用光阑

技术领域

本发明涉及用于显微镜的三角形自聚焦装置中的自聚焦用光阑或膜片，其中自聚焦用光阑包含至少一个膜片孔，可将用于自聚焦并沿自聚焦装置的光轴方向伸展的测量束锥限制在其截面内，同时，本发明还涉及用于显微镜的三角形自聚焦装置，其包括用于产生自聚焦测量束的所述类型的孔径光阑和自聚焦光学机构，以利用该显微镜的物镜通过自聚焦测量束在物上生成测量图形。所谓测量图形是指测量斑或测量缝或其它适当的图形，一般用在三角形自聚焦装置中的散焦检测。

背景技术

美国专利文件US 5,136,149B1公开了一种三角形自聚焦装置。德国专利文件DE 19537376A1对该美国专利文件进行了讨论并将其中所描述的自聚焦原理称为“三角形”自聚焦原理。在现有技术中，很多显微镜具有三角形自聚焦装置或自聚焦扫描装置，它们利用了角向或倾斜的自聚焦测量束和在物上的反射或单向或者定向反射。因此，如附图1所示，这相当于上述US 5,136,149B1所说的三角形自聚焦原理，其中自聚焦光源19被这样安置：在测量束30偏转后或者该束30通过显微镜物镜10之后，自聚焦测量束按对角线或以斜角照到物平面16上。此自聚焦扫描部件还包括用于检测束内横向偏移的位置敏感自聚焦检测器28(后面将给予说明)，和用于移动物镜10的马达27。或者，物平面16也可以朝光轴方向偏移。

在如图1所示的显微镜自聚焦装置中，测量束30被分束器20在点A处偏入束截面的一半内(相对于光轴8而言)。该被偏转的测量束30被物镜10偏转或折射，使它沿对角线或倾斜角α照到物平面16的反射点C上。该束30作为被反射的测量束32被反射或送回或传送，然后再次由物镜10偏转并在束路径另一侧(相对于A点而言)的B点处经过分束器20。然后该偏转束32照射检测器28，即位置敏感检测器(PSD)，其输出信号取决于束所照到或接触的位置，因此可以用这种方法确定位置。

出现散焦时，即在目前图1的状下中，物平面16偏移到平面16’(即成像点从16移到16’)，测量束30首先在偏转点D偏转，此偏转点不仅朝光轴8的方向，而且也朝横向或侧向，相对于C点移动。如图所示，相应的反射束32’到达检测器28的不同位置，同时提供相对于聚焦位置有所改变的信号。用这种方法可以测量散焦的程度并通过马达27移动物镜来补偿。

下面的专利说明论及以上述三角形原理为基础的系统。

德国专利文件DE 3219503A1披露了用于光学设备(特别是反射光显微镜)的一种自聚焦装置。在此装置中提供了激光自聚焦设备，由它产生其中一半被光学元件遮挡的测量束锥。这个减小为其横截面一半的测量束锥作为自聚焦测量束被耦合到反射光显微镜的照明束路径内，而且再经过物镜光孔和物镜落到物上。按这种方法，此一半被遮挡的测量束-最好是在红外(IR)波段的脉冲激光-在物上产生用于自聚焦的测量斑，它不妨碍显微镜的观察。在散焦时此测量斑在物表面上偏移。

作为例子，遮挡一半测量束锥的光学元件可以是偏转棱镜，在此情况下，它的一半被引入测量束路径中直至光轴。偏转棱镜的指向激光光源的该侧是完全反射的，因此一半被遮挡的测量束沿光轴方向伸展直至物镜光孔，并通过物镜作为测量斑被聚焦在物上。在从物表面上被反射后，此被送回的(一半)自聚焦测量束还沿光轴伸展回到该偏转棱镜，而在其“返回路径”中此被传送的自聚焦测量束是在该光孔内行进，其中一半是与向外的路径相反的，指向物的测量光束锥被遮挡部分就处在此向外的路径内。被反射的自聚焦测量束通过偏转棱镜被传送到主要由差动二极管(双二极管)组成的检测器内。当系统处在最佳聚焦状态时，测量斑的像处于相对检测器的所述双二极管准确对称的位置。出现散焦时，该测量斑的像沿双二极管中一个的方向(取决于散焦的方向)偏离中心位置。作为一级近似，测量斑在差动二极管上的偏移量与散焦量成正比。此装置可以通过相应地沿z-方向反向调整物镜和/或工件台，使检测到的散焦倒向。利用这里提出的装置还可以设定已限定的散焦量(“偏移”)，以便能在不同的高度进行显微观察，例如当物沿z-方向具有不同结构的情况下。

美国专利文件US 2004/0113043A1也公开了一种使用类似测量原理的自聚焦系统。同样，为了产生测量缝，将半遮挡的测量束引向将要在显微镜下观察的物上面。被反射的测量束被提供给电荷耦合器件(CCD)传感器。接在下游的信号处理装置把散焦信号送到计算部件(CPU)，由后者控制工件台和/或物镜以校正任何散焦。该测量缝是利用红外光产生的，而测量缝的像在物的界面(盖玻片表面，盖玻片下面的样品表面)处反射。被反射的测量缝通过光学装置(其最后部分为圆柱透镜)成像在线状检测器(CCD传感器)上。相应检测信号和实际聚焦位置之间的相互关系在该美国专利说明书中已举例说明。

美国专利文件US 7,345,814B2公开了一种用于具有投射光照明的倒置式显微镜的类似自聚焦系统。为尽可能减少散射光，在自聚焦装置束路径中提供了极化分束器和λ/4板。在这里所述的特定应用中，该自聚焦装置保证了在盖玻片上的聚焦，为的是之后将显微镜物镜沿z方向移动一个预定量(“偏移”)。

为完整起见，应当指出，显微镜的自聚焦从较早的德国专利说明书2102922就已经知道。用于显微镜的在不同物平面上自动聚焦的类似装置可从奥地利专利文件AT-353497中得到了解。

上述自聚焦过程的共同特点是：它们利用固定的半光圈特别是中心可变膜片工作，该膜片在从光轴至束截面边缘的一边被关闭。结果目标物被自聚焦测量束在一边照明(三角形原理)。由这种几何结构产生的结果是：在散焦过程中自聚焦标记的像在传感器上移动，同时散焦量与像的形心的偏心成正比(按一级近似)。检测器的尺寸限定了物附近在z-方向聚焦调整的最大捕捉范围。因此，这类系统不大合用，尤其不适合用于寻找在散焦很大时的焦点位置。

现有系统的另一个缺点是所谓的一级反射，即这些反射最容易在光学表面(透镜)的顶端形成，而且对测量信号具有高度破坏性的影响。当使用盖玻片和水溶液之间的界面作为设定聚焦的参考表面时，被一级反射削弱的信噪比变得特别明显，因为在这个界面上的反射仅有千分之4(4‰)。其结果是自聚焦反射可能被散射光遮挡。因此，为了使散射光最小化，在上述US 7,345,814B2中使用了带λ/4板的极化分束器。

发明内容

因此，我们希望提供尽可能避免现有系统上述缺点的改进型显微镜三角形自聚焦系统，特别是按照本发明的系统应该具有大的捕捉范围，应该限制散射光的破坏性影响，和/或应该适合在反射很差的样品上自聚焦。

为了解决这个问题，本发明提出了一种用于显微镜三角形自聚焦装置中的自聚焦用光阑，和具有所述类型的自聚焦用光阑的自聚焦装置。此外，本发明提出了相应的使用至少两个按照本发明的自聚焦用光阑的用途。按照本发明，用于显微镜的三角形自聚焦装置中的自聚焦用光阑结构如下：该自聚焦用光阑包含至少一个膜片或孔阑，当该自聚焦用光阑被插入测量束锥内时，可将沿自聚焦装置光轴方向伸展的测量束锥限制在它的截面内，光阑的膜片孔被安置在离该自聚焦装置光轴一定距离的偏心位置，而在测量束锥一半截面内的膜片孔能产生偏心的自聚焦测量束。

除非另有说明，所谓“膜片孔被安置在离光轴一定距离”意味着此膜片孔的每一点离光轴的距离大于零。此外，该膜片孔是被完全位于测量束锥的一半截面内，因此该自聚焦用光阑的膜片孔限制了沿自聚焦装置光轴方向伸展的测量束锥的截面，使得这个被遮挡的束锥(以后称为自聚焦测量束)不会穿越靠近光轴的区域。因而按照本发明的带偏心膜片孔的自聚焦用光阑，将在测量束锥原来截面的一半内产生不与光轴重合的偏心自聚焦测量束。被自聚焦用光阑遮挡的自聚焦测量束可能在其束锥内包含具有发散的，收敛的，或平行的轨迹的束。

因此，按照本发明提出的自聚焦用光阑不仅将测量束锥的截面限制到至多一个半圆部分，而且将另外一个半圆部分的大部分和光轴附近的面积盖住。这样就基本上防止了导致上述一级反射的靠近轴的束。所以出现在测量束路径内的光学表面(透镜)的顶端就没有自聚焦测量束通过其中，结果是那儿产生的反射没有能照到该自聚焦装置的检测器。于是测量信号的信噪比可以得到改善而有利于高精度测量。这特别有利于使用低反射度界面(例如盖玻片和水溶液之间，或皮氏培养皿和水溶液之间的界面)作为设定聚焦的参考表面的自聚焦系统。这时反射度仅为1％的4/10(0.004)，远比玻璃上的反射度(约为4％即0.04)要低。因此迄今为止利用附加光学元件来降低反射光的传统方法可以废弃不用。

如果自聚焦用光阑的膜片孔是由两个半径不同的圆弧形界定的圆弧段将会更好。此段可以是在圆周方向的整个半圆段。不过在圆周方向小一些的伸展更为有利。业已证明，椭圆形，卵形或肾脏形的自聚焦用光阑膜片孔适合于测量图形(尤其是测量缝)的高质量成像。

如果膜片孔的形心离自聚焦装置光轴或测量束锥的距离相当于显微镜物镜入口光孔半径的至少一半，则可特别有效地抑制一级反射。成功防止反射现象的最低要求是，膜片孔形心离自聚焦装置光轴或测量束锥的距离与物镜的类型有关，至少为0.5mm至1.0mm。换句话说，如果围绕光轴半径至少0.5mm至1.0mm的区域被光阑遮挡，那么大部分一级反射可在具有较小入口光孔的物镜内被抑制。此最大距离只受入口光孔半径的限制。为了达到50％以上的反射下降，离光轴的最小距离应为显微镜物镜入口光孔半径的25％至40％(例如，对40x的物镜为25％，对63x和100x的物镜为40％左右)。另外，膜片孔最好应处于测量束锥截面边缘尽可能远的地方。这样得到的自聚焦测量束是充分偏心的。这个关于膜片孔形心离光轴距离的标准同时限制膜片孔相对于测量束锥截面的尺寸。

按照另一个方案，本发明涉及用于显微镜的三角形自聚焦装置，它具有自聚焦用光阑(用于限制该自聚焦装置测量束锥的截面)和自聚焦光学装置，以利用自聚焦用光阑产生的自聚焦测量束通过显微镜物镜在物上生成测量图形。这类普通三角形自聚焦装置的基本结构和运行模式已在本说明书的引言中详细说明过。按照本发明，在这类自聚焦装置中，可以选择至少一个前面讨论过的根据本发明第一种方案的自聚焦用光阑来产生自聚焦测量束，并将该光阑插入此自聚焦装置的测量束路径中。这类自聚焦装置将提供最佳的信噪比，因而可以使用反射度极低的界面来维持聚焦。

最好在这类三角形自聚焦装置中提供至少两个不同的自聚焦用光阑，其偏心膜片孔被安置成离该自聚焦装置的光轴具有不同的距离，同时可从中选择一个并插入测量束路径内。

从前述三角形自聚焦装置工作模式可知，“偏心较大”的光阑(即其膜片孔离光轴距离较大的光阑)较之“偏心较小”的光阑(即自聚焦测量束更靠近光轴地伸到时)，使自聚焦测量束离光轴的距离更大，并因而在物上具有更大的α角(参看前述图1)。当物的范围内出现散焦时，大的α角本身又导致检测器上的测量图形产生显著的位移。因此，即使很小的物散焦(在z-方向的位移，参看图1)也将导致可测量到的结果。因为这个原因，“偏心较大”的光阑有助于在重新调节聚焦设定(所谓的“保持聚焦”)时达到较高的精度，但不利于在散焦较大时用于寻找焦点位置。实际上，当物在z-方向的散焦较大的情况下，测量图形很可能移出检测器的范围，也就是说，可能会超过检测器的最大捕捉范围。

与此相反，使用“较低偏心”的自聚焦用光阑可以在大散焦的情况下寻找焦点位置，因为偏心较小的用光阑产生较小的α角，从而使检测器上测量图形的位移比较小，因为被自聚焦扫描的物界面是移动的。所以，使用偏心较小的自聚焦用光阑(也就是膜片孔偏心较小)，以尺寸不变的检测器寻找焦点位置的捕捉范围，将比使用偏心较大的光阑时大得多。

实际上，自聚焦往往聚焦在一定的界面上，例如样品表面的空气界面或样品流体和玻璃之间的界面上。这可以由用户通过对样品的视觉监测而人工实现，或者使用自聚焦装置的专门聚焦搜寻功能来实现，此时焦点位置是通过对比检测器输出信号和原来记录下来的校正曲线的信号值，从这些输出信号确定的。实际的显微观察可以通过“补偿装置”来操作，此时由用户将自聚焦调节到与视觉焦点不一样的、更容易扫描的界面上(参看本说明书的开头)。这时预先假定，这两个焦点之间的距离已经知道，比方说是显微制备的盖玻片厚度或者支托被视觉观察的样品的皮氏培养皿底座的厚度。

特别是在进行长时间显微观察的情况下(例如对细胞样品的观察)，把焦点维持在确定的界面(例如在盖玻片与水溶液之间)上是有益的，此时由用户选定的焦点总是在重新调整。为了搜寻界面，最好采用带较小偏心膜片孔的自聚焦用光阑、以得到较大的捕捉范围，而在界面附近具有较小偏心膜片孔的自聚焦光阑将产生较小的捕捉范围，并因此造成较大的敏感性。

在特别优选的实施例中，至少两个不同的自聚焦用光阑与不同的显微镜物镜的不同入口光孔直径相结合，并可根据当前选定的物镜入口光孔直径选择和用于测量束路径中。甚至可以想到显微镜的每个物镜都具有相应的自聚焦用光阑。但是，实践发现，两个其膜片孔安置在离自聚焦装置光轴不同距离处的自聚焦用光阑就足以覆盖显微镜物镜入口光孔直径的正常范围。这里考虑的显微镜通常其物镜工作的放大率在10x至100x，但也可以是其它的物镜(例如150x)。

为了更好地了解自聚焦用光阑孔的偏心(如这里所述，这是更可取的选择)与所用显微镜物镜入口光孔直径的关系，我们首先来讨论显微像在物侧和像侧的焦深。为了使用管状透镜在像平面上以高放大率使物结构成像(用于通过目镜观察的中间像)，在显微成像中使用较高放大率和较大数值孔径的物镜。管状透镜的焦距比物镜的焦距要大很多倍。虽然物范围内的焦深随着物镜放大率的增加和数值孔径的增加而减小，而且只是在0.5至10λ(所用光的波长)的总范围内，但对同样的物镜在像范围内(例如在检测器表面上)的焦深随着物镜放大率增加而增加，而且在大得多的范围内(1000至5000λ)变化。粗略估计焦点设定的精度为焦深的1/3。

物镜入口光孔直径正比于数值孔径与物镜焦距之乘积。虽然普通显微镜物镜的数值孔径总是随着放大率增加而增加，但在另一方面，焦距的减小更明显，所以物镜入口光孔直径随着放大率增加而下降。因此，对于低放大率显微镜物镜使用较大的偏心光阑比对高放大率显微镜物镜更有利。我们已经说过，偏心较大的光阑(膜片孔离光轴距离大)具有小的捕捉范围，但由于在检测器处的灵敏度，这时能进行高精度的聚焦设定或焦点调节(所谓的“固定聚焦”)，这对低放大率物镜也同样需要，对此前面我们已经详细解释过。另一方面，具有较小入口光孔直径的高放大率显微镜物镜使用偏心较小的自聚焦光阑则应该更有利。由于低偏心的膜片孔具有较高的捕捉范围，它们适合于用于搜寻焦点的位置。如上面详细说明过的那样，这又与高放大率物镜的聚焦准确性具有非常大的容差相一致。

业已证明，对于这里所考虑的放大率在10x至100x的显微镜物镜，提供两个不同的偏心自聚焦用光阑插入测量束路径或引入测量束锥内就足够了。如果各膜片孔的形心离自聚焦装置光轴或测量束锥的距离至少相差一倍尤其有利。不言而喻，此要求原则上不限于只有两个光阑的情况。

对于准确的自聚焦测量，如将所述至少两个自聚焦用光阑安置在测量束锥内，使得它们的膜片孔形心处在同一条垂直于自聚焦装置光轴的线上，将会有所帮助，因为这样一来物结构将被带两个自聚焦用光阑的自聚焦测量束从同一方向照射。因此，自聚焦测量束在检测器上的缝像可以按同样的方式得到评估。自聚焦用光阑最好具有相同大小的面积，以便接收到同样的信号强度。

实际上，可以把所提供的各种自聚焦用光阑的聚焦信号的校正曲线储存起来。为此目的，对每个自聚焦用光阑进行目标物上的聚焦(通过调节显微镜工件台的高度或物镜实现“z-调节”)并将把检测器信号和各z-位置联系起来的相应信号曲线记录在检测器上。这样可以让客户按照信号强度、对比度等将焦点位置和相应选定的光阑储存起来。

如果两个自聚焦用光阑的膜片孔在它们在测量束锥截面上的投影内不重叠，也是很有利的。特别是，当各膜片孔的形心离光轴的距离相差一倍时，就得到离光轴的偏心很不相同的自聚焦用光阑。

自动选取适当的光阑并将它用于测量束路径内作为显微镜物镜或它的入口光孔直径的函数是很方便的。为此，所用的物镜将由它们在机械化或自动化显微镜中的特性来检验。

实践业已证明，使用偏心较大的自聚焦用光阑，其用于“较低物镜放大率”(即在10x至63x之间，显然也包括各中间值)比用于“较高物镜放大率”(特别是在63x至100x之间或更高，显然也包括各中间值)更有利。因此，举例来说，当实现从20x物镜放大率到100x物镜放大率转换时，或者例如从40x物镜放大率到150x物镜放大率转换时，改变自聚焦用光阑，并因此改变自聚焦测量束的偏心，也是有利的。

上述特征和后面将要说明的特征，不仅可以用于所述的特定组合，而且可用于其它的一些组合或单独使用，这都没有超出本发明的范围。

下面将参照附图通过实例对本发明作详细的说明。

附图说明

图1示意性地示出了按照现有技术的三角形自聚焦装置实例；

图2a示意性地示出了光阑的第一个实例，其具有较高偏心；

图2b示意性地示出了光阑的第二个实例，其稍有偏心；

图3是通过按照本发明的三角形自聚焦装置的整个光束路径示意图；

图4是通过与自聚焦装置相关的倒置式显微镜的光束路径示意图；

图5表示不同物镜的一级反射相对强度与光孔半径的关系。

具体实施方式

在本说明书引言部分我们已经详细讨论了按图1的三角形自聚焦装置。

图2a和2b显示了两个这类不同的自聚焦用光阑5和6，它们适宜替代性地用于显微镜三角形自聚焦装置中，以将用作自聚焦并沿着自聚焦装置光轴方向的测量束锥34限制在其截面内。为此自聚焦用光阑5包含高度偏心的膜片孔3，而自聚焦用光阑6包含稍有偏心的膜片孔4。两个膜片孔3和4中的每一个偏心成离自聚焦装置的光轴18或测量束锥具有一定的距离，使得每个膜片孔3或4处在该光轴18的外面。此外，为进行三角形自聚焦测量，每个膜片孔3，4是处于测量束锥截面17的一半内。自聚焦用光阑5和6的准确外部结构在图2中未显示，因为它们可能有不同的形式。例如，它们可以安置在光阑或膜片滑板上，后者可以被推入束路径内。或者也可以把它们安装在旋转杠杆上。通过旋转此相关的杠杆就可以把自聚焦用光阑引入测量束锥内。光阑5和6覆盖测量束锥的除各膜片孔3或4区域以外的整个截面17，所以在通过光阑5或6之后就得到偏心的自聚焦测量束。圆形区域1和2表示各显微镜物镜入口光孔的截面，该物镜最好和各光阑5或6一起使用。

自聚焦用光阑5和6的两个实施例分别具有椭圆形结构的膜片孔3或4，后者被安置在光阑5或6的边缘，所以膜片孔3和4的横向长度大于该特定膜片孔的径向长度。这样在保持偏心不变的同时该膜片孔的面积增加了。由于表面较大，在从检测器出口处的信号强度比圆形膜片孔要大。这将改善信噪比，特别是对于在焦点处反射很差的样品或界面。膜片孔3和4的形心离光轴18的各自距离至少相差一倍。此外，膜片孔3和4在它们的投影内不与测量束锥的截面17重叠。这样可保证能使用两个自聚焦用光阑，它们的膜片孔3和4被安置在束截面内很不相同的偏心位置。这是在三角形自聚焦装置中使用所示的自聚焦用光阑5和6的主要优点，后面我们会详细说明。

图3示出了使用图2所示两个自聚焦用光阑5或6中的一个的自聚焦装置21(在本例中是自聚焦用光阑5)。与图1的自聚焦装置中相同的元件被冠以同样的附图标记。从照明缝22(它可以由发光二极管(LED)等产生，其前面有集光器和缝阑)开始，测量束锥34沿着自聚焦装置21的光轴18伸展。安置在光轴18中心上的是例如如图2所示的自聚焦用光阑5。在此应该指出，自聚焦用光阑5也可以是例如膜片轮或膜片滑板的一部分。这类用于代替或改变膜片或光阑的机械结构大家都知道，因此不是这里讨论的主题。

照明光学装置23连同聚焦透镜24将照明缝成像在照明场膜片26内。自聚焦测量束36通过所谓的移动式光学装置25(包括可沿光轴移动的聚焦透镜24和另一个移动式透镜35)被引导到显微镜的物镜10。二色分束器20将显微镜成像束路径42从这里所示的自聚焦装置束路径分离到管41内。自聚焦测量束36到达目标物平面16并将测量图形(在本场合下是测量缝)成像到目标物上。当测量缝的像清晰时，则自聚焦测量束36处于聚焦状态。

从图3可以看出，带膜片孔3的自聚焦用光阑5在沿光轴18伸展的测量束锥34的一半截面17内产生自聚焦测量束36，此自聚焦测量束36偏心地离光轴18伸展。于是自聚焦测量束36不再通过光轴18区域而是靠近此光轴。所以，在移动式光学装置25或物镜10等上面的一级反射大大减小，而且不进入检测器28。

返回或送回的即被物反射的自聚焦测量束36’接着通过分束器20和移动式光学系统25照到偏转棱镜33，如图3所示意性地显示的那样。偏转棱镜33使自聚焦测量束36’被反射至自聚焦装置21的检测器侧(与照明边相反的一侧)。与检测器光路29一起，返回的自聚焦测量束36’又在检测器28上形成缝的像，在这种情况下设有二维的CCD相机。也可以使用线性CCD矩阵。红外波段特别适合于用作自聚焦测量束的光谱波段，因此人眼看不见物16上的测量缝。但是，自聚焦测量束也可以用在可见光谱波段。散射光利用接插在检测器28前面的只有与自聚焦测量束对应的波长才能透过的光谱过滤器31被滤掉。自然，检测器28的灵敏度也必须在这个波段范围之内。

利用图3所示的设备可以产生三角形自聚焦装置21，它能将焦点维持在例如反射度很低的界面上。由于一级反射被抑制，信噪比高到足以保持焦点长时间稳定，即使反射度低至千分之几的范围。

为了初步设定显微镜上的聚焦(参见后面图4)，举例来说，用户可通过目测聚焦至盖玻片与含水样本之间的界面上。这样在检测器28上得到的测量缝位置被作为“零线”记录下来。这是位置敏感的检测器28(例如CCD芯片)的强度信号，它将测量缝的像表示为检测器28在一个方向上的强度曲线。当信号很弱时，也可以将曲线相加几次，以大幅提高信噪比。此强度曲线在测量缝的位置处具有峰值，在它的左侧或右侧此峰值的一半被定义为聚焦信号。

由于自聚焦用光阑5的膜片孔3是在自聚焦用光阑上相对于光轴18偏心安置的，此自聚焦测量缝造成样品的对角线或角向照明。其结果是峰值的两侧稍有不同，由于其中之一通常是多少处在阴影中，很难确定最大值的一半是多少。因此，在开始测量之前，用户最好选择将用哪一侧来获取信号。自然，也可以提供自动信号评估，从检测器28的强度信号中自动确定“较好”的一侧。

一旦超过聚焦信号的某个阈值，自聚焦装置可以调节聚焦位置，这可用于找出具有最佳聚焦信号的焦点，或者设定或万一样品和物镜之间的距离改变时(例如由显微镜受热的影响或样品变化-诸如细胞分裂，细胞迁移等-引起的变化)自动重调聚焦。

对于视觉清晰的像，也即通过视觉聚焦，自聚焦测量缝可能仍然没有聚焦。因此，为了得到清晰的缝像，在保持视觉聚焦的同时，即不改变样品界面和物镜之间的距离z，可将聚焦透镜24沿轴向移动，直至检测器28的聚焦信号超过阈值或达到预定的最佳值。在这种情况下显微镜上的视觉聚焦等同于自聚焦装置的测量缝聚焦。

对于所使用的每个物镜，技术数据如放大率、干或湿物镜和数值孔径等被储存在自聚焦装置的执行装置中。如果需要，可以提供有关允许的z值的附加信息，也即物镜相对于样品的距离。这可防止物镜前面的透镜不小心置于样品上，以防损坏样品。此外，所用盖玻片的厚度可以储存在自聚焦装置的执行装置中，用于有计划的研究。

按照这种方法，在另一种初始设定中，盖玻片远离物的一面被选作测量缝焦点的位置(盖玻片的厚度约为170μm左右)，而显微镜视觉焦点是在盖玻片下面，也即在该界面上。为此，按照前面所述设定视觉焦点和测量缝焦点。通过相当于已知盖玻片厚度的确定量沿光轴移动聚焦透镜24，则测量缝焦点的位置被移至与视觉焦点相反的盖玻片那面。这样得到的好处是自聚焦测量缝被聚焦在玻璃-空气界面上，在那儿能实现较强的反射，结果可产生具有较好调节特性的较强聚焦信号。

在选择了适当的初始设定之后进行显微观察，在观察过程中通过自聚焦装置21保持测量缝焦点不变，从而也保证视觉焦点维持不变。

尤其优选的实施例是将自聚焦用光阑5，6选择成显微镜物镜入口光孔直径的函数，此显微镜是与三角形自聚焦装置一起使用，这在本说明书的概论部分已经说明过。对此我们将参照图4的具体实施例简单描述显微镜的束路径。

图4表示常用于细胞观察的那类倒置式研究显微镜的束路径。倒置式显微镜可方便地用于观察皮氏培养皿中的样品。它们尤其适于在显微观察过程中处理细胞，因为可以自由地进入上部物空间。对倒置式显微镜和观察(活)细胞过程的普通显微镜的进一步详情可参考此课题的一般文献。图4示出了倒置式显微镜40的物镜10。物镜光孔(或物镜入口光孔)的标号为11且处于整个物镜10的后部(远离物的一边)，实际上物镜包含多个透镜元件，作为例子这里只示意地显示了其中一个透镜元件。物镜10和管状透镜12，13一起在像平面14上产生第一个中间像。与物镜光孔11共轭的是中间光孔11’。第二中间像由移动式光学装置12’，13’产生在平面15上，并由人眼通过目镜观察。自然也可以不用人眼观察而装上照相机或其它类型的像检测器。图4中也用标号20表示二色分束器。它用于，举例来说，将自聚焦测量束36耦合到自聚焦装置21内，或者将从物反射的自聚焦测量束36’从自聚焦装置21耦合出来，如图3所示。

考虑三角形自聚焦的基本原理时(参看对图1的说明)并同时观察图2和3可以看出，当使用偏心较小的光阑6时，对于预定的物镜10和预定的检测器28尺寸，物平面16的散焦在检测器28上引起的移动比使用偏心较大的光阑5时要小得多。因此，捕捉范围，即可被检测器28记录的最大散焦，对偏心较小的光阑6要比偏心较大的光阑5高许多倍。

在下文指定的条件下，对以下作为例子所选择的物镜，得到下面典型的捕捉范围：

-对20x干物镜：从界面以下-50μm至以上200μm左右，也即聚焦在样品内；

-对40x干物镜：从界面以下-20μm至以上80μm左右，也即聚焦在样品内；

-对40x油物镜：从界面以下-20μm至以上80μm左右，也即聚焦在样品内；

-对100x油物镜：从界面以下-20μm至以上30μm左右，也即聚焦在样品内。

现在将考虑40x/0.85的物镜对物镜光孔内自聚焦测量束不同偏心度所能实现的灵敏度。该物镜具有数值孔径NumAp＝0.85。在具有多个无穷远物镜的系统中(物镜焦距5mm；Leica＝参考焦距200mm)，以及，检测器焦距100mm，CCD芯片宽度3mm，平均自聚焦波长Lambda＝546nm，在物镜光孔内自聚焦测量束偏心度例如2mm和4mm，我们得到下面的焦深DF的方程式：

DF＝Lambda/(NumAp)²＝546nm/0.85²＝0.75μm

物在z-方向散焦为准确的一个焦深DF，当自聚焦测量束在物镜光孔内有2mm偏心时，在检测器上产生13μm的横向偏移。

物在z-方向散焦为准确的一个焦深DF，但当自聚焦测量束在物镜光孔内有4mm偏心时，在检测器上得到40μm的横向偏移。

当使用40x干式物镜和其膜片孔3离光轴18的偏心为4mm的自聚焦用光阑时，在物空间得到±28μm的捕捉范围。如使用同样的40x干式物镜和其膜片孔离光轴的偏心只有2mm的光阑时，则可达到大得多的捕捉范围±88μm。因此，对上述40x干式物镜，通过将正确的自聚焦用光阑与适当偏心的膜片孔相结合可得到大的捕捉范围，而且与此同时，在用于自聚焦的界面附近的重要区域可达到很高的灵敏度，也即通过调节可实现很高的聚焦稳定性。

图5表示从本申请者自己的研究领域选作例子的三个物镜的一级反射的相对反射强度。此相对反射强度用与以mm为单位的光孔半径的关系来表示。它是无量纲的，而且在透镜顶点处被标准化为1(＝100％)。该图示出了放大率分别为40x，63x和100x的物镜的三条曲线。100x的物镜的相对反射强度下降最陡峭，而其它两个物镜的相对反射强度下降较平缓。

所显示的曲线还表示了入口光孔，它们是从各曲线端点得到的。因此，对这儿所用的100x物镜的入口光孔半径是差不多2.5mm以上，所以入口光孔直径是大概5mm以上。这里显示的63x物镜相应具有10mm左右的入口光孔直径，而这里显示的40x物镜具有12mm左右的入口光孔直径。

根据图5所示对作为例子使用的物镜的曲线，可以选择自聚焦用光阑膜片孔的形心应该处在的离测量束锥光轴的距离：例如，对所示100X物镜，如光孔半径为1mm左右，则相对反射强度下降至0.4即40％。因此，此处将膜片孔形心离光轴的距离设置为1mm以使反射强度下降60％是有道理的。

倘若打算只使用相对反射强度小于0.4的光孔区域来自聚焦，那么对于40x物镜，大约25％光孔半径的中心区域将不得不被放弃，而对于63X物镜，将要损失大约40％的中心区域，对于100X物镜，将要损失大约30-40％的光孔半径。与此相反，如自聚焦照明是处于约2mm光孔半径处，则对于几种不同的物镜，与光孔中心区域相比，所产生的反射下降只有它的1/2.5至1/4。

附图标记一览

1，2  入口光孔截面

3，4  膜片孔

5，6  光阑

8     光轴

10        物镜

11        物镜光孔，入口光孔

11        中间光孔

12，13    管状透镜

12’，13’移动式光学装置

14，15    像平面

16，16’  目标物平面

17        测量束锥截面

18        光轴

19        自聚焦光源

20        分束器，二色分束器

21        自聚焦装置

22        照明缝

23        照明光学装置

24        聚焦透镜

25        移动式光学装置

26        照明场膜片

27        马达

28        自聚焦检测器

29        检测器光路

30        测量束

31        光谱过滤器

32，32’  已传送测量束

33        偏转棱镜

34        测量束锥

35        移动式透镜

36        自聚焦测量束

36’      被反射的自聚焦测量束

40        倒置式显微镜

41        管

42        显微镜成像束路径

A      偏转点

B，B’ 偏转点

C      偏转点

D      偏转点

α     角度

Claims (6)

1.显微镜(40)的具有自聚焦用光阑(5，6)的三角形自聚焦装置(21)，它包含至少一个膜片孔(3，4)，用于限制沿该自聚焦装置(21)的光轴(18)方向伸展的测量束锥(34)的截面以及产生单一的自聚焦测量束(36)，此三角形自聚焦装置具有自聚焦光学装置(25，26)，用于通过自聚焦测量束(36)利用显微镜(40)的物镜(10)在目标物上产生测量图形，其特征在于：该自聚焦用光阑(5，6)的膜片孔(3，4)被安置在离该自聚焦装置(21)的光轴(18)有一定距离的偏心位置，其中偏心的自聚焦测量束(36)通过在测量束锥(34)的一半截面(17)内的膜片孔(3，4)产生，选择至少两个不同自聚焦用光阑(5，6)中的一个，光阑的膜片孔(3，4)被安置在离该自聚焦装置(21)的光轴(18)不同的距离，且两个自聚焦用光阑(5，6)的膜片孔(3，4)在测量束路径(34)的截面上的投影中不相重叠。

2.如权利要求1所述的自聚焦装置，其特征在于：所述至少两个不同自聚焦用光阑(5，6)与不同显微镜物镜(10)的入口光孔(1，2)的不同直径相结合，根据已选定的物镜(10)的入口光孔直径来选择各产生自聚焦测量束(36)的光阑。

3.如权利要求1或2所述的自聚焦装置，其特征在于：提供至少两个自聚焦用光阑(5，6)，光阑的膜片孔(3，4)的形心离自聚焦装置(21)的光轴(18)的各自距离至少相差一倍。

4.如权利要求1或2所述的自聚焦装置，其特征在于：该至少两个自聚焦用光阑(5，6)被这样安置，使得其膜片孔(3，4)的形心处在垂直于自聚焦装置(21)的光轴(18)的同一直线上。

5.如权利要求1所述的自聚焦装置，其特征在于：提供了正好两个自聚焦用光阑(5，6)。

6.如权利要求1或2所述的自聚焦装置，其特征在于：自聚焦用光阑的选择是根据显微镜(40)中所用的物镜(10)进行的。