CN102307995A - 积累疫苗的转化的大豆植物及其用途 - Google Patents

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Abstract

产生了通过将编码阿尔茨海默病疫苗的基因插入编码野生型种子贮藏蛋白的基因的可变区中而获得的其中导入了编码修饰的种子贮藏蛋白的基因的转化的大豆植物，在其种子中产生并积累了所述疫苗。

Description

积累疫苗的转化的大豆植物及其用途
技术领域
本发明涉及在其种子中积累阿尔茨海默病疫苗的转化的大豆植物及其用途。
背景技术
阿尔茨海默病是由于病原物质例如β-淀粉状蛋白在脑中的积累而引起的神经变性疾病，其引起对神经细胞的损害。虽然预料到随着老龄化社会的到来，患阿尔茨海默病的患者数将会增加，但是难以获得针对该疾病的预防药和治疗药，需要开发新的预防药、治疗药、疫苗等等。已经使用β-淀粉状蛋白作为抗原开发了针对阿尔茨海默病的疫苗，β-淀粉状蛋白是该疾病的病原物质，但疫苗的开发是艰难的，因为存在例如副作用的问题。因此，需要使用不引起副作用的β-淀粉状蛋白抗原决定簇(表位)来开发疫苗并建立大量生产该疫苗的技术。
大豆是无胚乳的种子，其不具有胚乳并且其营养物质在对应于子叶的胚中积累。种子的整个体积的大约40％(对应于胚)被贮藏蛋白占据。因此，作为贮藏组织，大豆具有不同于其它作物例如水稻和玉米的特征，水稻和玉米将淀粉作为主要的储存物质贮藏在胚乳中，所以大豆是适合于产生和积累异源蛋白的作物。大豆中主要的种子贮藏蛋白是11S球蛋白(大豆球蛋白)和7S球蛋白(β-伴大豆球蛋白(conglycinin))。这些种子贮藏蛋白的空间结构和它们在细胞中的积累机制已经被阐明，并且已知编码它们的基因具有被称作可变区的部分。人们认为，即使将异源基因插入可变区中之后，也可以维持所述蛋白的空间结构，并且贮藏蛋白的特性不会被这种插入影响。
一般而言，β-淀粉状蛋白抗原决定簇是包括数个氨基酸的分子量相对较低的蛋白(肽)，难以通过将编码该肽的基因导入大豆而使该肽在转化的大豆的种子中大量积累以实现大量生产该肽的目的，这是因为该肽被细胞中的酶例如蛋白酶降解。
另一方面，已知有下列在其种子中积累生物活性肽和疫苗的转化的作物：积累低血压肽的转化的大豆(专利文献1)、积累针对雪松花粉引起的过敏症的疫苗的转化的水稻(专利文献2)、产生β-淀粉状蛋白的马铃薯(非专利文献1)和产生β-淀粉状蛋白的番茄(非专利文献2)。
然而，大量积累包括β-淀粉状蛋白抗原决定簇(表位)的阿尔茨海默病疫苗的转化的大豆以及使用所述大豆大量生产疫苗的技术目前为止仍然是未知的。
菜豆(common bean)是属于豆科(Leguminosae)的植物，大豆也属于该豆科，菜豆种子中的蛋白含量是20％。已知菜豆中的主要种子贮藏蛋白之一arcelin可以被分为多种类型，即，arcelin 1至7，编码它们的结构蛋白的部分的核苷酸序列之间具有高度同源性。相对于大豆而言，对菜豆中的arcelin蛋白的结构分析较少，仅揭示了arcelin 1和5的空间结构。
另外还已知，水稻中的主要种子贮藏蛋白之一谷醇溶蛋白(prolamin)是难消化的蛋白，其可以被分为具有不同分子量的数种类型(例如，10K、13K和16K)。尚未揭示谷醇溶蛋白的空间结构。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：JP 2006-238821 A
专利文献2：JP 2004-321079 A
非专利文献
非专利文献1：Federation of European Biochemical Societies(2005)第579卷，第6737-6744页.
非专利文献2：Biotechnology Letters(2008)第30卷，第1839-1845页.
发明内容
本发明旨在提供转化的大豆植物，可以在其种子中产生并积累阿尔茨海默病疫苗。另外，本发明旨在提供使用该转化的大豆产生阿尔茨海默病疫苗的方法。
本发明人进行了深入研究以解决上述问题。
结果，本发明人成功制备出其中导入了编码修饰的种子贮藏蛋白的基因的转化的大豆植物，所述基因是通过将编码阿尔茨海默病疫苗的基因插入编码野生型种子贮藏蛋白的基因的可变区而获得的，并且还成功地在所述转化的大豆植物的种子中产生并积累了阿尔茨海默病疫苗。
另外，本发明人发现，通过将编码修饰的种子贮藏蛋白的基因导入缺失内源性种子贮藏蛋白的大豆而产生的转化的大豆植物能够有效地在其种子中产生并积累阿尔茨海默病疫苗。
即，本发明提供了：
[1]其中导入了编码修饰的种子贮藏蛋白的基因的转化的大豆植物，其中通过将编码阿尔茨海默病疫苗的基因插入编码野生型种子贮藏蛋白的基因的可变区而不发生移码，从而获得所述的编码修饰的种子贮藏蛋白的基因，该修饰的种子贮藏蛋白在种子中表达并在其中积累。
[2]根据[1]的转化的大豆植物，其中所述阿尔茨海默病疫苗是β-淀粉状蛋白抗原决定簇。
[3]根据[2]的转化的大豆植物，其中所述β-淀粉状蛋白抗原决定簇具有如下序列：含有彼此相连的1至3个拷贝的具有SEQ ID NO：3所示序列的肽。
[4]根据[1]至[3]任一项的转化的大豆植物，其中缺失内源性大豆11S球蛋白和/或大豆7S球蛋白。
[5]根据[1]至[4]任一项的转化的大豆植物，其中所述野生型种子贮藏蛋白是大豆11S球蛋白的A1aB1b亚基、菜豆的arcelin或水稻的谷醇溶蛋白。
[6]根据[5]的转化的大豆植物，其中所述野生型种子贮藏蛋白含有SEQID NO：2所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列具有不少于90％同一性的氨基酸序列，并且编码阿尔茨海默病疫苗的基因所插入的可变区是编码选自对应于SEQ ID NO：2的氨基酸位置111-128、氨基酸位置198-216、氨基酸位置268-315和氨基酸位置490-495的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸序列的区域。
[7]根据[5]的转化的大豆植物，其中所述野生型种子贮藏蛋白含有SEQID NO：37所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO：37所示的氨基酸序列具有不少于90％同一性的氨基酸序列，并且编码阿尔茨海默病疫苗的基因所插入的可变区是编码对应于SEQ ID NO：37的氨基酸位置149-150和/或氨基酸位置250-251的氨基酸序列的区域。
[8]根据[5]的转化的大豆植物，其中所述野生型种子贮藏蛋白含有SEQID NO：45所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO：45所示的氨基酸序列具有不少于90％同一性的氨基酸序列，并且编码阿尔茨海默病疫苗的基因所插入的可变区是编码对应于SEQ ID NO：45的氨基酸位置110-111的氨基酸序列的区域。
[9]根据[1]至[8]任一项的转化的大豆植物，其中编码修饰的种子贮藏蛋白的基因的表达由菜豆arcelin2的启动子或大豆11S球蛋白的A1aB1b亚基的启动子调节。
[10]根据[1]至[9]任一项的转化的大豆植物的细胞。
[11]根据[1]至[9]任一项的转化的大豆植物的种子。
[12]通过加工根据[11]的种子而产生的加工的大豆种子。
[13]使用根据[1]至[9]任一项的转化的大豆植物产生阿尔茨海默病疫苗的方法，其中在所述转化的大豆植物的种子中产生阿尔茨海默病疫苗。
[14]载体，其包含：
诱导大豆种子特异性表达的启动子；和
编码修饰的种子贮藏蛋白的基因，其中通过将编码阿尔茨海默病疫苗的基因插入编码野生型种子贮藏蛋白的基因的可变区而不发生移码，从而获得所述的编码修饰的种子贮藏蛋白的基因，并且所述编码修饰的种子贮藏蛋白的基因连接于所述启动子的下游。
[15]根据[14]的载体，其中所述启动子是菜豆arcelin2的启动子或大豆11S球蛋白的A1aB1b亚基的启动子。
由于本发明的转化的大豆植物能够在其种子中大量积累阿尔茨海默病疫苗，所以可以使用所述转化的大豆植物有效生产阿尔茨海默病疫苗。
附图说明
图1是示意图，其显示了大豆的大豆球蛋白的A1aB1b亚基的氨基酸序列中的可变区编码的氨基酸序列。
图2是示意图，其显示了质粒pUHGA1aB1bM的构建程序。
图3是示意图，其显示了用于引入编码修饰的种子贮藏蛋白的基因的质粒pUHG的结构。任意修饰的种子贮藏蛋白的基因被插入到SmaI位点。
图4显示了照片，其显示了在导入了编码修饰的A1aB1M1的基因的转化的大豆的种子中积累的β-淀粉状蛋白抗原决定簇的检测，所述检测通过蛋白质印迹进行。各个泳道中的样品如下。1：通过将A1aB1M1导入品种Jack中而产生的转化的大豆10-2 No.1；2：通过将A1aB1M1导入品种Jack中而产生的转化的大豆10-2 No.2；3：通过将A1aB1M1导入品种Jack中而产生的转化的大豆10-2 No.3；4：品种Jack(对照)；5：通过将A1aB1M1导入贮藏蛋白缺陷型品系而产生的转化的大豆16-2 No.1；6：通过将A1aB1M1导入贮藏蛋白缺陷型品系而产生的转化的大豆16-2 No.2；7：通过将A1aB1M1导入贮藏蛋白缺陷型品系而产生的转化的大豆16-2 No.3；和8：贮藏蛋白缺陷型品系(对照)。
图5显示了照片，其显示了在导入了编码修饰的arcelin的基因(Arc5M1)的转化的大豆的种子中积累的β-淀粉状蛋白抗原决定簇的检测，所述检测通过蛋白质印迹进行。各个泳道中的样品如下。1：通过将Arc5M1导入品种Jack中而产生的转化的大豆2-1 No.1；2：通过将Arc5M1导入品种Jack中而产生的转化的大豆2-1 No.2；3：通过将Arc5M1导入品种Jack中而产生的转化的大豆2-2 No.1；和4：通过将Arc5M1导入品种Jack中而产生的转化的大豆2-2 No.2。
图6显示了照片，其显示了在导入了编码修饰的谷醇溶蛋白的基因(PR10M1)的转化的大豆的种子中积累的β-淀粉状蛋白抗原决定簇的检测，所述检测通过蛋白质印迹进行。各个泳道中的样品如下。1：通过将PR10M1导入品种Jack中而产生的转化的大豆1-1 No.1；2：通过将PR10M1导入品种Jack中而产生的转化的大豆1-1 No.2；3：通过将PR10M1导入品种Jack中而产生的转化的大豆4-2 No.1；和4：通过将PR10M1导入品种Jack中而产生的转化的大豆4-2 No.2。
图7显示了照片，其显示了在导入了编码修饰的A1aB1M1或A2PA1aB1bM3的基因的转化的大豆的种子中积累的β-淀粉状蛋白抗原决定簇的检测，所述检测通过蛋白质印迹进行。各个泳道中的样品如下。1：通过将A2PA1aB1bM3导入贮藏蛋白缺陷型品系而产生的转化的大豆品系4-6；2：通过将A1aB1bM1导入贮藏蛋白缺陷型品系而产生的转化的大豆品系7-1；3：通过将A1aB1bM1导入品种Jack而产生的转化的大豆品系8-1 No.1；4：通过将A1aB1bM1导入品种Jack而产生的转化的大豆品系8-1 No.2；5：贮藏蛋白缺陷型品系；6：通过将A2PA1aB1bM3导入贮藏蛋白缺陷型品系而产生的转化的大豆品系3-1 No.1；和7：通过将A2PA1aB1bM3导入贮藏蛋白缺陷型品系而产生的转化的大豆品系3-1 No.2。
图8显示了图(照片)，其显示了转化的大豆A1aB1bM3的种子中的Aβ4-10(具有SEQ ID NO：3所示氨基酸序列的肽)的稳定性测验的结果。各个泳道中的样品如下。A-1、A-2：未经热处理的组；B-1、B-2：经烘烤的组；C-1、C-2：经水煮的组；D-1、D-2：经热处理的提取物组。
图9显示了图(照片)，其显示了Aβ4-10的重复数目与抗体效价之间的关系的评价。各个泳道中的样品如下。1：反应组，其中使纯化的抗体匙孔血蓝蛋白(key-limpet-hemocyanin，KLH)-P1与底物Aβ42(400皮摩尔)反应；2：反应组，其中使纯化的抗体KLH-P1与底物Aβ42(1000皮摩尔)反应；3：反应组，其中使纯化的抗体KLH-P2与底物Aβ42(400皮摩尔)反应；4：反应组，其中使纯化的抗体KLH-P2与底物Aβ42(1000皮摩尔)反应；5：反应组，其中使纯化的抗体KLH-P3与底物Aβ42(400皮摩尔)反应；和6：反应组，其中使纯化的抗体KLH-P3与底物Aβ42(1000皮摩尔)反应。
具体实施方式
现在将详细描述本发明。
1.编码野生型种子贮藏蛋白的基因
本发明中的野生型种子贮藏蛋白的实例包括构成大豆11S球蛋白的各个亚基、构成大豆7S球蛋白的各个亚基、菜豆中的arcelin、水稻中的谷醇溶蛋白、水稻中的球蛋白，以及其它作物中的种子贮藏蛋白。野生型种子贮藏蛋白的优选的实例包括：大豆中的11S球蛋白的A1aB1b亚基和7S球蛋白的α亚基和β亚基，其中大豆中的11S球蛋白的A1aB1b亚基更为优选。
此外，本发明中的野生型种子贮藏蛋白的实例包括含有SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：37和SEQ ID NO：45所示的氨基酸序列的蛋白，以及含有与这些氨基酸序列具有不少于80％，优选不少于90％，更优选不少于95％的同一性的氨基酸序列的蛋白。
此处，氨基酸序列之间的同一性(％)意思是氨基酸序列之间的最大同一性(％)，其是通过比对两个待比较的氨基酸序列并视需要向其中引入空隙(比对)而获得的。可以使用本领域技术人员熟知的多种方法进行用于确定氨基酸序列之间同一性的目的的比对。例如，可以使用公众可获得的计算机软件，例如BLAST、BLAST-2、ALIGN和Megalign(DNASTAR)软件和商业上可获得的软件，例如Gene Works 2.5.1软件(Teijin System Technology，Inc.)和GENETIX-WIN(Software Development Co.，Ltd)。
本发明中的编码野生型种子贮藏蛋白的基因的实例包括：编码构成大豆11S球蛋白的各个亚基的基因、编码构成大豆7S球蛋白的各个亚基的基因、编码菜豆中的arcelin的基因、编码水稻中的谷醇溶蛋白的基因、编码水稻中的球蛋白的基因，以及编码其它作物中的种子贮藏蛋白的基因。所述基因的优选的实例包括编码大豆中的11S球蛋白的A1aB1b亚基的基因和编码7S球蛋白的α亚基和β亚基的基因，其中编码大豆中的11S球蛋白的A1aB1b亚基的基因更为优选。
此外，本发明中的编码野生型种子贮藏蛋白的基因的实例包括含有SEQID NO：1、SEQ ID NO：36和SEQ ID NO：44所示的核苷酸序列的基因，以及含有与这些核苷酸序列具有不少于80％，优选不少于90％，更优选不少于95％的同一性的核苷酸序列的基因。
此处，核苷酸序列之间的同一性(％)意思是核苷酸序列之间的最大同一性(％)，其是通过比对两个待比较的核苷酸序列并视需要向其中引入空隙(比对)而获得的。可以使用本领域技术人员熟知的多种方法进行用于确定核苷酸序列之间的同一性的目的的比对。例如，可以使用公众可获得的计算机软件，例如BLAST、BLAST-2、ALIGN和Megalign(DNASTAR)软件和商业上可获得的软件，例如Gene Works 2.5.1软件(Teijin SystemTechnology，Inc.)和GENETIX-WIN(Software Development Co.，Ltd)。
2.编码修饰的种子贮藏蛋白的基因
本发明中的编码修饰的种子贮藏蛋白的基因意思是通过将编码阿尔茨海默病疫苗的基因插入编码野生型种子贮藏蛋白的基因的可变区而不发生移码所产生的基因。
此处，“插入编码阿尔茨海默病疫苗的基因而不发生移码”意思是：将编码阿尔茨海默病疫苗的基因插入编码野生型种子贮藏蛋白的基因的可变区，以致除了所述阿尔茨海默病疫苗的氨基酸序列之外，修饰的种子贮藏蛋白的氨基酸序列与对应的野生型种子贮藏蛋白的氨基酸序列是相同的。
此外，“插入编码阿尔茨海默病疫苗的基因”意思是，插入编码阿尔茨海默病疫苗的基因而不引起编码可变区的核苷酸序列的缺失，以及编码可变区的全部或部分核苷酸序列被置换为编码阿尔茨海默病疫苗的基因。
在本发明中，编码野生型种子贮藏蛋白的基因的可变区意思是这样的区域：即使向其中插入异源基因而不发生移码时，该区域也允许从所产生的基因表达而来的蛋白保持与野生型种子贮藏蛋白等同的稳定的空间结构，从而允许维持野生型种子贮藏蛋白的性质。
例如，当编码野生型种子贮藏蛋白的基因是编码含有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的大豆11S球蛋白的A1aB1b亚基的基因时，已知SEQ ID NO：2中有5个部分是可变区，包括：编码氨基酸位置20-28的区域(可变区I)、编码氨基酸位置111-128的区域(可变区II)、编码氨基酸位置198-216的区域(可变区III)、编码氨基酸位置268-315的区域(可变区IV)和编码氨基酸位置490-495的区域(可变区V)(图1)。
此外，当编码野生型种子贮藏蛋白的基因是含有编码与SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列具有一定的同一性的氨基酸序列的核苷酸序列的基因时，即，SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列，只不过其中一个或多个氨基酸被置换、插入、添加和/或删除，可变区是编码对应于氨基酸位置20-28的氨基酸序列的区域、编码对应于氨基酸位置111-128的氨基酸序列的区域、编码对应于氨基酸位置198-216的氨基酸序列的区域、编码对应于氨基酸位置268-315的氨基酸序列的区域和编码对应于氨基酸位置490-495的氨基酸序列的区域。
此处，当两个待比较的氨基酸序列彼此比对以达到氨基酸序列之间的最大同一性(％)并视需要引入空隙时，“对应于特定氨基酸序列的氨基酸序列”意思是对应于其它特定的部分氨基酸序列的部分氨基酸序列。此类氨基酸序列可以由本领域技术人员容易地指定。
当在编码野生型种子贮藏蛋白的基因中存在多个可变区时，可以通过将编码阿尔茨海默病疫苗的基因插入至一个或多个可变区来制备编码修饰的种子贮藏蛋白的基因。
例如，当编码包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列的大豆11S球蛋白的A1aB1b亚基的基因被用作编码野生型种子贮藏蛋白的基因时，可以选择可变区II、III、IV和V中的任一项作为可变区，以向其中插入编码阿尔茨海默病疫苗的基因，更优选将编码阿尔茨海默病疫苗的基因插入至可变区III。此外，作为插入编码阿尔茨海默病疫苗的基因的可变区，可以选择可变区II、III、IV和V中的两个或更多个区域，例如，同时插入至三个可变区II、III和IV，同时插入至四个可变区II、III、IV和V，等类似操作可以进行。此处，编码阿尔茨海默病疫苗的基因的导入需要以在编码野生型种子贮藏蛋白的核苷酸序列中不引起移码的方式进行。
此外，当编码包含SEQ ID NO：37所示的氨基酸序列的菜豆arcelin 5的基因被用作编码野生型种子贮藏蛋白的基因时，由于该基因的可变区是未知的，所以需要将其DNA序列与A1aB1b亚基的DNA序列进行比较以确认混乱的区域，并且将其氨基酸序列及空间结构与其它相似的贮藏蛋白的氨基酸序列及空间结构进行比较以确认序列的空隙中的差异和结构差异，从而假设可变区。优选的是，将编码阿尔茨海默病疫苗的基因插入至编码SEQ ID NO：37中的氨基酸位置149-150的区域(可变区A)和/或编码SEQ ID NO：37中的氨基酸位置250-251的区域(可变区B)，这些区域可以通过此类假设来指定。
此外，当编码野生型种子贮藏蛋白的基因含有编码与SEQ ID NO：37所示的氨基酸序列具有一定的同一性的氨基酸的核苷酸序列时，即，SEQ IDNO：37所示的氨基酸序列，只不过其中一个或多个氨基酸被置换、插入、添加和/或删除，优选将编码阿尔茨海默病疫苗的基因插入至编码对应于SEQ ID NO：37中的氨基酸位置149-150的氨基酸序列的区域，编码对应于SEQ ID NO：37中的氨基酸位置250-251的氨基酸序列的区域。
此外，当编码包含SEQ ID NO：45所示的氨基酸序列的水稻谷醇溶蛋白的基因被用作编码野生型种子贮藏蛋白的基因时，由于该基因的空间结构和可变区是未知的，所以需要将其氨基酸序列与其它类似的贮藏蛋白的氨基酸序列进行比较以确认空隙结构，从而假设可变区。优选的是，将编码阿尔茨海默病疫苗的基因插入至编码SEQ ID NO：45中的氨基酸位置110-111的区域(可变区a)，该区域可以通过此假设来指定。
此外，当编码野生型种子贮藏蛋白的基因含有编码与SEQ ID NO：45所示的氨基酸序列具有一定的同一性的氨基酸的核苷酸序列时，即，SEQ IDNO：45所示的氨基酸序列，只不过其中一个或多个氨基酸被置换、插入、添加和/或删除，优选将编码阿尔茨海默病疫苗的基因插入至编码对应于SEQ ID NO：45中的氨基酸位置110-111的氨基酸序列的区域。
3.编码阿尔茨海默病疫苗的基因
本发明中的编码阿尔茨海默病疫苗的基因是不受限的，只要其是编码具有针对阿尔茨海默病的疫苗的功能的蛋白或肽的DNA，并且优选为编码构成β-淀粉状蛋白的一部分的、包括大约5至25个氨基酸的肽的β-淀粉状蛋白抗原决定簇的DNA。所述DNA的实例包括编码SEQ ID NO：3的氨基酸序列的DNA。
由于编码β-淀粉状蛋白的核苷酸序列是已知的(GenBank登记号AB113349)，所以，可以通过基于该核苷酸序列信息的筛选操作，从cDNA文库中分离编码β-淀粉状蛋白或β-淀粉状蛋白抗原决定簇的DNA。也可以通过化学合成来制备编码β-淀粉状蛋白抗原决定簇的DNA。
此外，在本发明中，也可以将阿尔茨海默病疫苗以多个编码疫苗的基因彼此串联的方式插入至编码种子贮藏蛋白的基因的可变区，从而允许表达所述疫苗。例如，可以将编码β-淀粉状蛋白抗原决定簇的基因，以1至20的整数个、优选1至5的整数个、更优选1至3的整数个、特别优选为2个拷贝的基因彼此连接的方式插入至可变区但不发生移码。
此外，当把编码阿尔茨海默病疫苗的基因插入至编码野生型种子贮藏蛋白的基因时，也可以在编码阿尔茨海默病疫苗的基因的5’-末端和/或3’-末端添加编码被蛋白酶识别的序列的核苷酸序列。由此，可以通过蛋白酶将阿尔茨海默病疫苗从种子中产生的修饰的种子贮藏蛋白中切除。此类蛋白酶的实例包括嗜热菌蛋白酶。
4.用于基因转移的载体
本发明的用于基因转移的载体可以具有这样的结构：其中诱导大豆种子特异性表达的启动子连接于所述基因的上游。此外，终止子也可以连接于所所述基因的下游。
诱导大豆种子特异性表达的启动子的实例包括大豆11S球蛋白启动子和菜豆arcelin启动子，终止子的实例包括大豆11S球蛋白终止子、菜豆arcelin2终止子、花椰菜花叶病毒的35S终止子和NOS终止子。
大豆11S球蛋白启动子的实例包括具有SEQ ID NO：18所示序列的大豆11S球蛋白A1aB1b亚基的启动子，并且大豆11S球蛋白启动子可以是与该序列具有不少于95％的同一性的启动子，只要其具有种子特异性启动子活性。大豆11S球蛋白终止子的实例包括具有SEQ ID NO：21所示序列的大豆11S球蛋白A1aB1b亚基的终止子，并且大豆11S球蛋白终止子可以是与该序列具有不少于95％的同一性的终止子，只要其具有种子特异性终止子活性。
菜豆arcelin启动子的实例包括具有SEQ ID NO：56中核苷酸位置1399-3860的序列的菜豆arcelin 2的启动子，并且菜豆arcelin启动子可以是与该序列具有不少于95％的同一性的启动子，只要其具有种子特异性启动子活性。菜豆arcelin终止子的实例包括具有SEQ ID NO：59所示序列的菜豆arcelin 2终止子，并且菜豆arcelin终止子可以是与该序列具有不少于95％的同一性的终止子，只要其具有种子特异性终止子活性。
可以向本发明的载体中插入用于选择重组体的选择性标志物基因和用于确认所导入的基因之表达的报道基因。选择性标志物基因的实例包括潮霉素抗性基因、膦丝菌素抗性基因等，报道基因的实例包括β-葡糖醛酸酶(GUS)基因、氯霉素乙酰转移酶(CAT)基因、萤光素酶(LUC)基因和GFP基因等。
还可以通过将DNA片段插入至包含上述选择性标志物基因和/或报道基因的载体中来获得本发明的载体，其中所述DNA片段包含用于诱导种子特异性表达的启动子、连接于该启动子下游的编码修饰的贮藏蛋白的基因和连接于更下游的终止子。
5.能够被转化的大豆植物
本发明中的能够被转化的大豆的实例包括一般用于食物、用于饲料或用于生产油的品种。待转化的大豆优选为部分或全部缺失内源性种子贮藏蛋白，大豆的实例包括部分或全部缺失大豆11S球蛋白和/或大豆7S球蛋白的大豆。此处，“部分缺失”意思是指其中的表达水平低于野生型的情况，以及仅有一部分亚基完全缺失的情况，和仅一部分的亚基的表达水平低于野生型的情况。大豆的具体实例包括突变系EnB1，其缺失大豆11S球蛋白；突变系QY2，其缺失大豆7S球蛋白；和突变系QF2，其缺失11S球蛋白和7S球蛋白二者。大豆的另外的实例包括通过此类缺陷型品系和常见品种(例如Jack等)杂交而衍生的子代品系。
可以通过进行从种子制备而来的贮藏蛋白的电泳来确认大豆部分或全部缺失内源性大豆11S球蛋白和/或大豆7S球蛋白的事实。
6.转化的大豆植物的制备
可用于制备转化的大豆植物的材料的实例包括植物组织，例如根、茎、叶、种子、胚、胚珠、子房、茎端、花药和花粉，及其切片；以及植物培养细胞，例如未分化的胼胝体(callus)、不定胚和原生质体等。
可以通过已经报道和建立的多种方法将编码修饰的种子贮藏蛋白的基因导入上述材料，优选使用农杆菌方法、PEG方法、电穿孔方法、基因枪方法、须状物超声法等导入上述的载体以用于基因转移。
使用选择性标志物基因赋予的抗性效应作为指标，可以从材料中选择转化的大豆植物的细胞，所述材料是导入了编码修饰的种子贮藏蛋白的基因的材料。从选择的细胞中，可以通过再生出植物体的步骤获得转化的大豆植物体，已经针对每个植物物种报道了所述步骤。
通过栽培由此获得的转化的大豆植物体以允许种子成熟，可以获得本发明的转化的大豆的种子，可以在转化的种子中获得目标阿尔茨海默病疫苗。
可以通过PCR方法、DNA杂交方法、RNA杂交方法、蛋白质印迹方法等来确认编码阿尔茨海默病疫苗的基因是否已经被导入植物体中。例如，通过从转化的大豆植物体的种子中提取蛋白，进行蛋白质印迹，使用特异于阿尔茨海默病疫苗的一抗和辣根过氧化物酶(HRP)等标记的二抗来进行免疫染色，由此可以确认编码阿尔茨海默病疫苗的基因的适当的导入、阿尔茨海默病疫苗在种子中的积累，以及所积累的疫苗的量。
可以通过例如使用具有阿尔茨海默病的疾病模型小鼠来评价转化的大豆植物的种子中积累的修饰的种子贮藏蛋白中包含的阿尔茨海默病疫苗的性能。更具体而言，通过皮下注射或口服给药方式向上述模型小鼠施用包含阿尔茨海默病疫苗的修饰的种子贮藏蛋白或使用蛋白酶从所述修饰的种子贮藏蛋白中切下来并加以纯化的阿尔茨海默病疫苗。可以通过研究小鼠中的针对阿尔茨海默病疫苗的抗体的产生、β-淀粉状蛋白的量、脑组织、和/或行为异常来评价阿尔茨海默病疫苗的性能。可以作为与佐剂的混合物来施用包含阿尔茨海默病疫苗的修饰的种子贮藏蛋白或使用蛋白酶从所述修饰的种子贮藏蛋白中切下来并加以纯化的阿尔茨海默病疫苗。
可以通过在室外田地或封闭的栽培设施(其中环境是人工控制的)中栽培然后收集积累包含疫苗的修饰的种子贮藏蛋白的转化的大豆的种子来大量生产阿尔茨海默病疫苗。
作为包含阿尔茨海默病疫苗的组合物，其中积累了包含阿尔茨海默病疫苗的修饰的种子贮藏蛋白的种子可用于预防和/或治疗阿尔茨海默病。例如，通过粉碎等加工过的种子可以制成片剂、颗粒、粉末、胶囊、饮料等形式。
此外，上述组合物可以包含在种子中积累的修饰的种子贮藏蛋白，所述蛋白经过了提取和纯化。例如，种子的磨碎产物经过脱脂和加热处理后，可以通过例如液相色谱的装置纯化包含目标阿尔茨海默病疫苗的修饰的种子贮藏蛋白。此外，上述组合物还可以包含通过以蛋白酶处理修饰的种子贮藏蛋白并纯化得到的产物、从而从修饰的种子贮藏蛋白中部分或全部除掉野生型种子贮藏蛋白的部分而制备的阿尔茨海默病疫苗。
现在将通过实施例的方式更具体地描述本发明，但是本发明不限于这些实施例。
除非另有指明，否则以下实施例中实施的实验方法的程序是根据“Molecular Cloning”第二版.(J.Sambrook等人，Cold Spring HarborLaboratory press，1989年出版)。
实施例
实施例1
用于修饰的大豆11S球蛋白A1aB1b的表达质粒的构建
构建了用于在大豆种子中表达编码包含具有SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列的肽的修饰的A1aB1b的基因的表达质粒，SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列(以下简称为Aβ4-10)已知为β-淀粉状蛋白抗原决定簇。该构建的程序显示于图2。
使用FASMAC Co.，Ltd.提供的订制的DNA合成服务来合成具有3个拷贝的编码Aβ4-10的核苷酸序列彼此串联的寡核苷酸(有义链，SEQ ID NO：4)和具有其互补序列的寡核苷酸(反义链，SEQ ID NO：5)(有义链和反义链在下文中分别被称作410F和410R)。除非另有指明，否则下文中提及的寡核苷酸是使用上述生产商提供的订制的DNA合成服务来合成的寡核苷酸。在最终浓度为1mM的ATP的存在下，各100pmol的410F和410R与T4多核苷酸激酶(由TAKARA BIO INC.生产)进行磷酸化反应，将反应后的反应溶液混合在一起，然后将得到的混合物在94℃加热10分钟，然后允许该混合物逐渐冷却至37℃，持续1小时，从而实现退火。通过该过程，获得了编码肽的双链DNA片段，在所述肽中3个拷贝的Aβ4-10彼此串联((Aβ4-10)×3)。
使用质粒pBSK-A1aB1b(获自Kyoto University，其中在pBluescript IISK(-)(由Stratagene生产)的SmaI位点克隆了已知的A1aB1b基因(GenBank登记号AB113349)的cDNA)作为模板，进行PCR以扩增包含载体部分的片段，从而该片段的5’-末端和3’-末端定位于编码A1aB1b基因的特定可变区。将获得的DNA片段与编码(Aβ4-10)×3的双链DNA片段连接，以制备编码修饰的A1aB1b的基因。该方法更具体的叙述见下文。
制备了编码具有SEQ ID NO：1所示序列的A1aB1b的基因的总共5个引物组，即：用于插入至可变区II的由SEQ ID NO：6和7的引物对组成的引物组(PS-1)、用于插入至可变区III的由SEQ ID NO：8和9的引物对组成的引物组(PS-2)、用于插入至可变区IV的由SEQ ID NO：10和11的引物对组成的引物组(PS-3)和由SEQ ID NO：12和13的引物对组成的引物组(PS-4)，以及用于插入至可变区V的由SEQ ID NO：14和15的引物对组成的引物组(PS-5)。合成引物使得导入用于在紧接插入区的下游导入氨基酸置换的核苷酸置换，以允许使用一种蛋白酶即嗜热菌蛋白酶从修饰的A1aB1b蛋白切除(Aβ4-10)×3。
使用各个引物组在显示为SEQ ID NO：1的核苷酸序列中插入了编码(Aβ4-10)×3的DNA的区域在下文中分别被称作PS-1区域、PS-2区域、PS-3区域、PS-4区域和PS-5区域。
使用10ng pBSK-A1aB1b作为模板和50μL/反应的反应溶液，通过以下循环来进行PCR：1个循环的“94℃变性2分钟”；然后25个循环的“94℃变性30秒、57℃退火30秒、68℃延伸5分钟”。所述反应溶液含有200μM dNTP混合物，1.5mM MgSO4溶液，浓度为1μM的上述各引物，和KOD-Plus-Ver.2缓冲液，所述缓冲液含有1个单位的KOD-Plus-(由Toyobo Co.Ltd.生产)。除非另有指明，否则除了引物之外，下文提及的PCR均使用相同的成分进行。
使用DNA连接试剂盒(由TAKARA BIO生产)，使50fmol由此获得的每种DNA片段和150fmol编码上述(Aβ4-10)×3的双链DNA片段在16℃进行连接反应40分钟。反应产物用于转化大肠杆菌DH5α感受态细胞(由TAKARA BIO生产)，以获得多个转化的大肠杆菌细胞。从所获得的大肠杆菌细胞中提取并纯化质粒DNA，然后使用FASMAC Co.，Ltd的DNA测序服务来分析它们的核苷酸序列。在使用PS-1的情况下，转化的大肠杆菌的12个克隆的核苷酸序列分析结果显示：1个克隆具有1分子的编码(Aβ4-10)×3双链DNA片段，其状态为该片段以正向正确地插入。另外，在使用PS-2、PS-3、PS-4和PS-5的情况下，分别分析了24个克隆、54个克隆、30个克隆和12个克隆，并且获得了每种1个克隆，其具有1分子的编码(Aβ4-10)×3双链DNA片段，其状态为该片段以正向正确地插入。可以获得其中正确插入了片段的修饰的A1aB1b基因的概率在插入位点之间是不同的，在使用PS-3的情况下，片段的插入尤其困难。
将所有由此制备的编码修饰的A1aB1b的基因进行关于它们的核苷酸序列的确认。除非另有指明，否则使用FASMAC Co.，Ltd.的DNA测序服务进行下文提及的核苷酸序列的测定。
然后，为了制备在多个可变区中插入了编码(Aβ4-10)×3的DNA的修饰的A1aB1b基因，使用上述制备的编码修饰的A1aB1b的基因作为模板，使用如上所述的相同的引物组进行PCR。重复进行所获得的DNA片段与编码上述(Aβ4-10)×3肽的双链DNA片段的连接反应，以制备编码修饰的A1aB1b的基因。通过该过程，制备了含有编码修饰的A1aB1b的基因的质粒，其中在A1aB1b基因的多个可变区插入了编码(Aβ4-10)×3的DNA。具体的插入区和对应于它们的编码修饰的A1aB1b的基因的名称显示于表1。
表1
  名称   插入编码(Aβ4-10)×3的DNA的区域，以及插入的DNA的数目
  A1aB1bM1   在PS-1区域、PS-2区域和PS-4区域中各插入1个
  A1aB1bM2   在PS-1区域中插入1个
  A1aB1bM3   在PS-2区域中插入1个
  A1aB1bM4-1   在PS-3区域中插入1个
  A1aB1bM4-2   在PS-4区域中插入1个
  A1aB1bM5   在PS-1区域、PS-2区域、PS-3区域、PS-4区域和PS-5区域中各插入1个
为了允许如上所述制备的编码修饰的A1aB1b的基因的大豆种子特异性表达，分离了野生型A1aB1b基因的启动子区域和终止子区域。
使用含有639bp的A1aB1b基因的部分启动子序列的A1aB1b基因(GenBank登记号X15121)的已知的部分基因组序列的启动子区域作为探针，筛选了Misuzudaizu TAC文库(www.kazusa.or.jp/ja/plant/PG2HPTransformation competent bacterial artificial chromosome)，该文库由独立行政法人农业食品产业技术综合研究机构、北海道农业研究中心持有。对所获得的克隆的核苷酸序列的分析结果揭示：该克隆中包含位于A1aB1b基因的翻译起始位点上游2202bp处的启动子区域。基于所获得的核苷酸序列，制备了由SEQ ID NO：16和17的寡核苷酸对组成的引物组，然后该引物组用于进行PCR以分离该启动子区域。
使用Misuzudaizu的基因组DNA作为模板和50μL/反应的反应溶液，通过以下循环进行上述PCR：1个循环的“94℃变性2分钟”；然后25个循环的“94℃变性30秒、57℃退火30秒、68℃延伸2分30秒”。通过该过程，获得了长度为2202bp的A1aB1b基因的启动子片段(Gy1P)(SEQ ID NO：18)。
然后，为了分离A1aB1b基因的终止子区域，基于野生型A1aB1b基因(GenBank登记号X53404)的已知的部分基因组序列，制备了由SEQ ID NO：19和20组成的引物组，然后该引物组用于进行PCR。
使用Misuzudaizu的基因组DNA作为模板和50μL/反应的反应溶液，通过以下循环进行上述PCR：1个循环的“94℃变性2分钟”；然后25个循环的“94℃变性30秒、57℃退火30秒、68℃延伸1分钟”。通过该过程，获得了长度为1052bp的野生型A1aB1b基因的终止子片段(Gy1T)(SEQ IDNO：21)。
为了允许编码修饰的A1aB1b的基因的种子特异性表达，将如上所述获得的编码修饰的A1aB1b的每个基因、Gy1P和Gy1T与已知的pUHG载体(Y.Kita，K.Nishizawa，M Takahashi，M.Kitayama，M.Ishimoto.(2007)Geneticimprovement of somatic embryogenesis and regeneration in soybean andtransformation of the improved breeding lines.Plant Cell Reports 26：439-447)(图3)连接以构建表达质粒。
为了获得编码如上所述的那些之中的5种类型的修饰的A1aB1b的DNA片段，使用如上所述的A1aB1bM2(SEQ ID NO：22)、A1aB1bM3(SEQ IDNO：24)、A1aB1bM4-1(SEQ ID NO：26)、A1aB1bM1(SEQ ID NO：28)和A1aB1bM5(SEQ ID NO：30)作为模板，使用由SEQ ID NO：32和33的寡核苷酸对组成的引物组进行PCR。
使用50μL/反应的反应溶液，通过以下循环进行上述PCR：1个循环的“94℃变性2分钟”；然后25个循环的“94℃变性30秒、57℃退火30秒、68℃延伸2分钟”。通过该过程，获得了每个修饰的A1aB 1b基因的DNA片段。
将修饰的A1aB 1b基因的DNA片段、启动子DNA片段和终止子DNA片段进行磷酸化反应，然后连接进入pUHG载体，该载体经过SmaI初步消化并以CIAP(由TAKARA BIO INC.生产)去磷酸化。通过分析所获得的克隆的核苷酸序列，选择这样的克隆：其中Gy1P启动子、编码修饰的A1aB1b的基因和Gy1T终止子按照这种顺序正确连接。
通过该过程，构建了以种子特异性方式表达编码修饰的A1aB1b基因的下列5种类型的植物转化载体：pUHG A1aB1bM1，pUHGA1aB1bM2，pUHGA1aB1bM3，pUHGA1aB1bM4-1和pUHGA1aB1bM5。
实施例2
用于修饰的菜豆Arcelin的表达质粒的构建
构建了用于在大豆种子中表达编码其中2个拷贝的Aβ4-10彼此串联(下文简写为(Aβ4-10)×2)的修饰的arcelin的基因的表达质粒。
由于尚未揭示出编码已知的菜豆arcelin 5-1的基因(GenBank登记号Z50202)(SEQ ID NO：36)的可变区，所以对该可变区进行了假设。基于通过将DNA序列与A1aB1b的DNA序列进行比较而作出的可变区的假设，揭示出混乱区域仅限于C末端。因此，认为可以将肽序列插入至C末端。为了进一步指定可变区，将该基因的DNA序列与植物血细胞凝集素的DNA序列进行比较，植物血细胞凝集素与arcelin一样属于2S白蛋白，并且揭示出：在赖氨酸(SEQ ID NO：37的氨基酸位置149)的下游缺失存在于植物血细胞凝集素中的8-10个残基的环结构，其为Arc5-1中的对应部分。因此，假设SEQ ID NO：36中的编码该部分(氨基酸位置149-150)的核苷酸序列区域是可变区A。随后，将arcelin 1与菜豆的贮藏蛋白之一菜豆蛋白进行比较。结果，在对应于SEQ ID NO：37的氨基酸位置250的天冬酰胺的下游发现了7个残基的空隙。因此，将编码该部分(氨基酸位置250-251)的核苷酸序列区域假设为可变区B。
为了将编码(Aβ4-10)×2的DNA引入到编码Arc5-1的基因的假设的可变区中，合成了编码(Aβ4-10)×2的寡核苷酸(420F，SEQ ID NO：34)和与其互补的寡核苷酸(420R，SEQ ID NO：35)。
在最终浓度为1mM的ATP的存在下，各100pmol的420F和420R与T4多核苷酸激酶(由TAKARA BIO INC.生产)进行磷酸化反应，将反应后的反应溶液混合在一起，然后将得到的混合物在94℃加热10分钟，然后允许该混合物逐渐冷却至37℃，持续1小时，从而实现退火。通过该过程，获得了编码(Aβ4-10)×2的双链DNA片段。
使用质粒pBSK-Arc5-1(保持于北海道农业研究中心、独立行政法人农业食品产业技术综合研究机构，通过将编码Arc5-1的cDNA插入至pBluescript II SK(-)(由Stratagene生产)的SmaI位点而获得该质粒)作为模板，进行PCR以获得包含载体部分的DNA片段，从而编码Arc5-1的基因的特定可变区的氨基酸部分定位于末端。将该DNA片段与按照上文描述合成的编码(Aβ4-10)×2的双链DNA片段连接在一起，以制备含有编码修饰的Arc5-1的基因的质粒。
以下更具体地描述了该方法。
制备了总共2个引物组，即，用于插入至编码Arc5-1的基因的可变区A的由SEQ ID NO：38和39的引物对组成的引物组(PS-A)，和用于插入至编码Arc5-1的基因的可变区B的由SEQ ID NO：40和41的引物对组成的引物组(PS-B)。合成引物，使得导入用于在紧接插入区的上游和下游导入氨基酸置换的核苷酸置换，以允许使用一种蛋白酶即嗜热菌蛋白酶从修饰的Arc5-1蛋白切除Aβ4-10。
使用各个引物组在SEQ ID NO：36的核苷酸序列中插入了编码(Aβ4-10)×2的DNA的区域在下文中分别被称作PS-A区域和PS-B区域。
使用10ng pBSK-Arc5-1作为模板进行PCR。使用50μL/反应的反应溶液，通过以下循环进行该PCR：1个循环的“94℃变性2分钟”；然后25个循环的“94℃变性30秒、57℃退火30秒、68℃延伸4分钟”。将由此获得的DNA片段和编码如上所述的(Aβ4-10)×2的双链DNA片段进行连接反应。
通过该过程，制备了两种类型的含有编码修饰的Arc5-1的基因的质粒，其中在编码Arc5-1基因的可变区插入了编码(Aβ4-10)×2的DNA。编码(Aβ4-10)×2的DNA的具体插入区和对应于它们的编码修饰的Arc5-1的基因的名称显示于表2。
表2
  名称   插入编码(Aβ4-10)×2的DNA的区域，以及插入的DNA的数目
  Arc5M1   在PS-A区域中插入1个
  Arc5M2   在PS-B区域中插入1个
为了允许修饰的Arc5-1的大豆种子特异性表达，将如上所述获得的Arc5M1和Arc5M2中的每一个以及上文实施例1中的来自A1aB1b基因的Gy1P和Gy1T与pUHG载体连接以构建表达质粒。为了获得编码修饰的Arc5-1的DNA片段，使用如上所述的Arc5M1和Arc5M2作为模板，使用由SEQ ID NO：42和43的寡核苷酸对组成的引物组进行PCR。
使用50μL/反应的反应溶液，通过以下循环进行上述PCR：1个循环的“94℃变性2分钟”；然后25个循环的“94℃变性30秒、57℃退火30秒、68℃延伸1分钟”。通过该过程，获得了每个修饰的Arc5-1基因的DNA片段。
使修饰的Arc5-1基因的DNA片段、Gy1P和Gy1T进行磷酸化反应，然后连接进入pUHG载体，该载体经过SmaI初步消化并进行了去磷酸化。
通过该过程，构建了以种子特异性方式表达修饰的Arc5-1基因的植物转化载体pUHG Arc5M1和pUHG Arc5M2。
实施例3
用于修饰的水稻谷醇溶蛋白的表达质粒的构建
构建了用于在大豆种子中表达编码插入了编码(Aβ4-10)×2的DNA的修饰的谷醇溶蛋白的基因的表达质粒。
由于尚未揭示出编码已知的水稻谷醇溶蛋白10K的RP10的基因(GenBank登记号E09782)(SEQ ID NO：44)的可变区，所以对该可变区进行了假设。将RP10的氨基酸序列与玉米醇溶蛋白δ的氨基酸序列进行比较，玉米醇溶蛋白δ是玉米中的主要贮藏蛋白之一。结果，在对应于SEQ ID NO：45的氨基酸位置110的赖氨酸的下游发现了11个残基的空隙。因此，将编码该部分(氨基酸位置110-111)的核苷酸序列区域假设为可变区a。
随后，使用质粒pBSK-RP10(保持于北海道农业研究中心、独立行政法人农业食品产业技术综合研究机构，通过将编码水稻谷醇溶蛋白10K的RP10的cDNA插入至pBluescript II SK(-)(由Stratagene生产)的SmaI位点而获得该质粒)作为模板，进行PCR以获得包含载体部分的DNA片段，从而编码RP10的基因的特定可变区a的氨基酸部分定位于末端。将该DNA片段与实施例2中合成的编码(Aβ4-10)×2的双链DNA片段连接在一起，以制备含有编码修饰的RP10的基因的质粒。
以下更具体地描述了该方法。
制备了用于插入至编码RP10的基因的可变区a的由SEQ ID NO：46和47的引物对组成的引物组。合成引物，使得导入用于在紧接插入区的上游和下游导入氨基酸置换的核苷酸置换，以允许使用一种蛋白酶即嗜热菌蛋白酶从修饰的RP10蛋白切除Aβ4-10肽。
使用10ng pBSK-RP10作为模板进行PCR。使用50μL/反应的反应溶液，通过以下循环进行该PCR：1个循环的“94℃变性2分钟”；然后25个循环的“94℃变性30秒、57℃退火30秒、68℃延伸4分钟”。将获得的每个DNA片段和编码如上所述的(Aβ4-10)×2的双链DNA片段进行连接反应。
通过该过程，制备了含有编码修饰的RP10的基因的质粒(RP10M1)，其中在编码RP10的基因的可变区插入了编码(Aβ4-10)×2的DNA。
为了允许编码修饰的RP10的基因的种子特异性表达，将编码修饰的RP10的基因以及从上文实施例1中获得的Gy1P和Gy1T与pUHG载体连接以构建表达质粒。为了获得编码修饰的RP10的DNA片段，使用如上所述的RP10M1作为模板，使用由SEQ ID NO：48和49组成的引物组进行PCR。
使用50μL/反应的反应溶液，通过以下循环进行上述PCR：1个循环的“94℃变性2分钟”；然后25个循环的“94℃变性30秒、57℃退火30秒、68℃延伸1分钟”。通过该过程，获得了编码修饰的RP10基因的DNA片段。
使编码修饰的RP10的DNA片段、启动子DNA片段和终止子DNA片段进行磷酸化反应，然后连接进入pUHG载体，该载体经过SmaI初步消化并进行了去磷酸化。
通过该过程，构建了以种子特异性方式表达编码修饰的RP10的基因的植物转化载体pUHG RP10M1。
实施例4
使用Arcelin 2启动子构建用于各个修饰类型的表达质粒
构建了用于在大豆种子中通过源自菜豆的arcelin 2启动子表达实施例1中制备的编码修饰的A1aB1b的基因的表达质粒。
(1)源自菜豆的Arcelin 2启动子的分离
使用DNeasy Plant Maxi试剂盒(由QIAGEN生产)，从菜豆野生品种(品系号：G12866)的1g新鲜叶子中提取50μg基因组DNA。
以限制性酶SauIIIAI消化280ng基因组DNA后，将dGTP加入至得到的消化产物中，然后使用克列诺(klenow)酶(由Promega KK生产)进行单核苷酸延伸反应(第一延伸反应)。然后，使用Ligation high(由Toyobo Co.，Ltd.生产)将反应产物与包含于RightWalk KitTM中的RWA-1接头连接在一起，得到的连接产物用作PCR的模板以分离arcelin 2基因上游区域中的DNA。
然后，基于已知的菜豆arcelin 2基因(GenBank登记号M28470)的cDNA的核苷酸序列，使用FASMAC Co.，Ltd的订制合成服务，制备具有SEQ IDNO：50和51所示的核苷酸序列的寡核苷酸(它们分别被称作引物SP1和引物SP2)。
SEQ ID NO：50(引物SP1)TTGGTTTTGT TGAACGTCTC GAC
SEQ ID NO：51(引物SP2)GGTGAGAAGC ACAAGGAAGA GG
然后，使用如上构建的连接于接头的2.8ng的基因组DNA作为模板，使用包含于RightWalk KitTM中的引物WP-1和引物SP1进行PCR。使用50μL/反应的反应溶液，通过以下循环来进行上述PCR：1个循环的“94℃变性2分钟”；然后35个循环的“94℃变性30秒、65℃退火30秒、68℃延伸5分钟”。所述反应溶液含有200μM dNTP混合物、1.5mM MgSO4溶液、浓度为1μM的上述各引物、和KOD-Plus-Ver.2缓冲液，所述缓冲液含有1个单位的KOD-Plus-(由Toyobo Co.Ltd.生产)。
然后，将反应溶液稀释100倍，使用1μL得到的稀释液作为模板，使用包含于RightWalk KitTM中的引物WP-2和引物SP2进行第二PCR。除了模板和引物之外，所述第二PCR中的溶液组成和温度条件与第一PCR中相同。
在最终浓度为1mM的ATP的存在下，将扩增的DNA片段与T4多核苷酸激酶(由TAKARA BIO INC.生产)进行磷酸化反应，然后与经过SmaI初步处理的pBluescript II SK(-)(由Stratagene生产)连接。
该反应产物被称作Arc2P(i)，通过FASMAC Co.，Ltd的DNA测序服务测定其核苷酸序列。结果确认：该产物在arcelin 2基因的起始密码子上游含有长度为844bp的新的区域。
然后，为了分离位于更上游的区域，制备了新的引物以进行第二延伸反应。
以限制性酶BglII消化280ng基因组DNA后，将dGTP加入至得到的消化产物中，然后使用克列诺酶(由Promega KK生产)进行单核苷酸延伸反应。然后，将反应产物与包含于RightWalk KitTM中的RWA-1接头连接在一起，得到的连接产物用作PCR模板以分离启动子。
然后，基于已知的菜豆arcelin 2基因(GenBank登记号M28470)的cDNA的核苷酸序列，制备具有SEQ ID NO：52所示的核苷酸序列的寡核苷酸(它被称作引物第二SP1)，基于在第一延伸反应中获得的位于起始密码子上游的844bp的区域中的核苷酸序列，制备具有SEQ ID NO：53所示的核苷酸序列的寡核苷酸(它被称作引物第二SP2)。
SEQ ID NO：52(引物第二SP1)CAGATTTTTT GCCCTCAAAATTGATG
SEQ ID NO：53(引物第二SP2)CGGATGTGCG TGGACTACAA GG
然后，使用如上构建的连接于接头的2.8ng的基因组DNA作为模板，使用包含于RightWalk KitTM中的引物WP-1和引物第二SP1进行PCR。除了模板和引物之外，该PCR中的溶液组成和温度条件与上述第一延伸反应相同。
然后，将上述PCR溶液稀释100倍，使用1μL得到的稀释液作为模板，使用包含于RightWalk KitTM中的引物WP-2和引物第二SP2进行第二PCR。除了模板和引物之外，所述第二PCR中的溶液组成和温度条件与第一PCR中相同。
在最终浓度为1mM的ATP的存在下，将扩增的DNA片段与T4多核苷酸激酶(由TAKARA BIO INC.生产)进行磷酸化反应，然后与经过SmaI初步处理的pBluescript II SK(-)(由Stratagene生产)连接。
该反应产物被称作Arc2P(ii)，测定其核苷酸序列。然后，为了分离位于更上游的区域，制备了新的引物以进行第三延伸反应。
以限制性酶XbaI消化280ng基因组DNA后，将dCTP加入至得到的消化产物中，然后使用克列诺酶(由Promega KK生产)进行单核苷酸延伸反应。然后，将反应产物与包含于RightWalk KitTM中的RWA-2接头连接在一起，得到的连接产物用作PCR模板以分离启动子。
然后，基于在第二延伸反应中获得的197bp的核苷酸序列，制备具有SEQ ID NO：54和55所示的核苷酸序列的寡核苷酸(它们分别被称作引物第三SP1和引物第三SP2)。
SEQ ID NO：54(引物第三SP1)CGACCTGAAG AACGCAGCGGCGACC
SEQ ID NO：55(引物第三SP2)TACCAGCAGT TGATGGACAA GATC
然后，使用如上构建的连接于接头的2.8ng的基因组DNA作为模板，使用包含于RightWalk KitTM中的引物WP-1和引物第三SP1进行PCR。除了模板和引物之外，该PCR中的溶液组成和温度条件与上述第一延伸反应相同。
然后，将上述PCR溶液稀释100倍，使用1μL得到的稀释液作为模板，使用包含于RightWalk KitTM中的引物WP-2和引物第三SP2进行第二PCR。除了模板和引物之外，所述第二PCR中的溶液组成和温度条件与第一PCR中相同。
在最终浓度为1mM的ATP的存在下，将扩增的DNA片段与T4多核苷酸激酶(由TAKARA BIO INC.生产)进行磷酸化反应，然后与经过SmaI初步处理的pBluescript II SK(-)(由Stratagene生产)连接。
该反应产物被称作Arc2P(iii)，测定其核苷酸序列。结果确认：产物在Arc2P(ii)上游包含长度为2819bp的新的区域(总共3860bp)。因此，通过三次延伸反应，获得了长度为3860bp的DNA(Arc2P)(SEQ ID NO：56，其中启动子区域对应于核苷酸位置1399-3860)，其在arcelin 2基因的起始密码子上游包含5’非翻译区，其中包括新的启动子序列。
(2)源自菜豆的Arcelin 2终止子的分离
以限制性酶NheI消化上述(1)中提取的280ng基因组DNA后，将dCTP加入至得到的消化产物中，然后使用克列诺酶(由Promega KK生产)进行单核苷酸延伸反应。然后，使用Ligation high(由Toyobo Co.，Ltd.生产)将反应产物与包含于RightWalk KitTM中的RWA-2接头连接在一起，得到的连接产物用作PCR模板以分离终止子基因。
然后，基于已知的菜豆arcelin 2基因(GenBank登记号M28470)的cDNA的核苷酸序列，制备具有SEQ ID NO：57和58所示的核苷酸序列的寡核苷酸(它们分别被称作引物SP3和引物SP4)。
SEQ ID NO：57(引物SP3)CATCAATTTT GAGGGCAAAA AATCTG
SEQ ID NO：58(引物SP4)CGTTCCAACA TCCTCCTCAA CAAGATC
然后，使用如上构建的连接于接头的2.8ng的基因组DNA作为模板，使用包含于RightWalk KitTM中的引物WP-1和引物SP3进行PCR。使用50μL/反应的反应溶液，通过以下循环来进行上述PCR：1个循环的“94℃变性2分钟”；然后35个循环的“94℃变性30秒、65℃退火30秒、68℃延伸5分钟”。所述反应溶液含有200μM dNTP混合物、1.5mM MgSO4溶液、浓度为1μM的上述各引物、和KOD-Plus-Ver.2缓冲液，所述缓冲液含有1个单位的KOD-Plus-(由Toyobo Co.Ltd.生产)。
然后，将反应溶液稀释100倍，使用1μL得到的稀释液作为模板，使用包含于RightWalk KitTM中的引物WP-2和引物SP4进行第二PCR。除了模板和引物之外，所述第二PCR中的溶液组成和温度条件与第一PCR中相同。
在最终浓度为1mM的ATP的存在下，将扩增的DNA片段与T4多核苷酸激酶(由TAKARA BIO INC.生产)进行磷酸化反应，然后与经过SmaI初步处理的pBluescript II SK(-)(由Stratagene生产)连接。
该反应产物被称作Arc2T，测定其核苷酸序列。结果确认：该产物在arcelin 2基因的终止密码子下游包含长度为795bp的新的区域(SEQ ID NO：59)，其中包括3’非翻译区。
(3)多种修饰的表达质粒的构建
为了在种子中表达编码修饰的A1aB1b的基因，将实施例1中获得的编码多种修饰的A1aB1b的基因以及Arc2P和Arc2T与已知的pUHG载体(如上所述，图3)连接，以构建表达质粒。
将每个修饰的A1aB1b基因的DNA片段、启动子DNA片段和终止子DNA片段进行磷酸化反应，然后与pUHG载体连接，该载体经过SmaI初步消化并以CIAP(由TAKARA BIO INC.生产)去磷酸化。通过分析所获得的克隆的核苷酸序列，选择这样的克隆：其中Arc2P启动子、编码修饰的A1aB1b的基因和Arc2T终止子按照这种顺序正确连接。
通过该过程，构建了以种子特异性方式在arcelin 2启动子控制下表达编码修饰的A1aB1b的基因的下列5种类型的植物转化载体：pUHGA2PA1aB1bM1、pUHGA2PA1aB1bM3和pUHGA2PA1aB1bM5。
通过相同的方式，构建了以种子特异性方式表达编码如上所述的RP10M1的基因的植物转化载体pUHGA2PRP10M1。
实施例5
将编码修饰的种子贮藏蛋白的基因导入大豆
通过已知的方法(K.Nishizawa，Y.Kita，M.Kitayama，M.Ishimoto.(2006)A red fluorescent protein，DsRed2，as a visual reporter for transient expressionand stable transformation in soybean.Plant Cell Reports 25：1355-1361)，从大豆品种Jack和缺失主要种子贮藏蛋白11S球蛋白和7S球蛋白的突变系(保持于北海道农业研究中心、独立行政法人农业食品产业技术综合研究机构)(Y.Kita，K.Nishizawa，M Takahashi，M.Kitayama，M.Ishimoto.(2007)Geneticimprovement of somatic embryogenesis and regeneration in soybean andtransformation of the improved breeding lines.Plant Cell Reports 26：439-447)的未成熟种子中诱导产生30个不定胚质(adventitious embryonic mass)(直径不超过3mm)，将这些不定胚质置于1.5ml的管中，然后通过须状物超声法(JP 3312867 B)进行基因转移操作。
在1.5ml的管中放置5mg由钛酸钾LS20(由Titan Kogyo，Ltd.生产)制成的须状物，将该管静置1小时，然后除掉并完全蒸馏乙醇以获得无菌须状物。向含有须状物的管加入1ml无菌水，将得到的混合物搅拌均匀。将须状物与无菌水的混合物离心，弃掉作为上清液的水。通过这种方式，洗涤须状物。将须状物的这种洗涤操作重复3次。此后，向管中加入0.5ml已知的MS液体培养基，以获得须状物悬浮液。
向含有如上所述获得的须状物悬浮液的管中加入上述的30个不定胚质(直径不超过3mm)，搅拌得到的混合物，然后将该混合物以1000rpm离心10秒以沉淀不定胚质和须状物。弃掉上清液，以获得不定胚质和须状物的混合物。
在含有上述混合物的管中，加入20μl(20μg)实施例1至4中制备的用于修饰的种子贮藏蛋白的每种表达载体，通过摇晃将得到的混合物充分混合以获得均一的混合物。
然后，将含有该均一混合物的管以18000xg离心5分钟。将离心后的混合物通过摇晃再次混合。该操作重复3次。
将由此获得的含有不定胚质、须状物和载体的管置于超声发生器的浴槽中，使所述的管在其中充分浸透。向所述管辐射频率为40kHz的超声波，强度为0.25W/cm2，时间为1分钟。此后，将该混合物在4℃静置10分钟。将通过这种方式进行超声处理的混合物在上述MS液体培养基中洗涤。
将经处理的不定胚质在已知的不定胚生长液体培养基中以旋转摇晃方式(100rpm)培养1周，然后在含有潮霉素B(15mg/l)(Roche Diagnostics，Mannheim，Germany)的新鲜不定胚生长液体培养基中培养1周。更进一步地，将不定胚质在含有30ml/l潮霉素B的不定胚生长液体培养基中培养4周(同时每周更换培养基)，然后在含有45mg/l潮霉素B的不定胚生长液体培养基中进行1周的选择培养。每个载体进行12个微管的基因转移。
将潮霉素抗性不定胚质转移至不定胚成熟液体培养基，以摇晃方式(100rpm)继续培养4周以允许不定胚成熟。通过在无菌的皮氏培养皿中静置3至5天使成熟的不定胚干燥，然后转移至已知的萌芽固体培养基。进行萌芽培养7至10天后，将胚转移至已知的生根培养基，从而允许萌芽的幼苗生长。长出根和芽之后，将植物转移到含有土壤的罐子中，保持高湿度直至其适应环境。
实施例6
导入了修饰的种子贮藏蛋白基因的转化的大豆植物的制备
通过该过程，制备了以下植物：通过向Jack品种中导入A1aB1BM1而产生的6个转化的大豆植物个体、通过向Jack品种中导入A1aB1bM2而产生的6个转化体个体、通过向Jack品种中导入A1aB1bM3而产生的5个转化体个体、通过向Jack品种中导入A1aB1bM4-1而产生的5个转化体个体、和通过向Jack品种中导入A1aB1bM5而产生的9个转化体个体。此外，制备了导入了Arc5M1的3个转化的大豆植物个体、导入了Arc5M2的3个转化体个体和导入了RP10M1的2个转化的大豆植物个体。
此外，制备了以下植物：通过向上述的缺失11S球蛋白和7S球蛋白的突变系(以下称作种子贮藏蛋白缺陷型品种)中导入A1aB1bM1而产生的12个转化的大豆植物个体、通过向其中导入RP10M1而产生的6个转化的大豆植物个体。
此外，制备了以下植物：通过向种子贮藏蛋白缺陷型品种中导入A1aB1bM3而制备的5个转化的大豆植物个体。
此外，制备了以下植物：通过向种子贮藏蛋白缺陷型品种中导入A2PA1aB1bM1而产生的8个转化体个体、通过向其中导入A2PA1aB1bM3而产生的33个转化体个体、通过向其中导入A2PA1aB1bM5而产生的32个转化体个体、和通过向其中导入A2PRP10M1而产生的9个转化体个体。
使这些转化的大豆的植物体适应于周围湿度，在每天10000lx和光照16小时的条件下继续栽培，然后从所有个体中收集种子。通过此过程，获得T1代的转化的大豆植物的种子。
实施例7
转化的大豆的种子中积累的Aβ4-10的量的评估
从以上实施例6中获得的转化的大豆的种子中提取总蛋白，使用特异于Aβ4-10的抗体通过蛋白质印迹法评估Aβ4-10的积累量。对于具有大的积累量的品系，进行定量分析。
1)以修饰的A1aB1b表达的Aβ4-10的积累量
通过SDS-PAGE分离从每个转化的大豆的种子中提取的20μg总蛋白，并与特异于Aβ4-10的抗体反应，然后使用ECL Advance Western BlottingDetection Kit(由GE Healthcare Bio-Science KK生产)进行检测。通过LAS4000miniPR(由FUJIFILM Corporation生产)捕获化学发光图像，使用MultiGage进行定量分析，其是该设备中包括的分析软件。作为用于定量的标准样品，使用通过大肠杆菌表达系统制备的His-Tag-连接的重组蛋白A1aB1bM1。
结果为：对于以上实施例6中获得的每种转化的大豆种子品系，都确认了对应于Aβ4-10的信号条带，从而确认了Aβ4-10的积累。在这些品系中，通过向Jack品种中导入A1aB1bM1、A1aB1bM3和A1aB1bM5而制备的转化的大豆种子(品系号No.10-2、No.a-2和No.6-6)和通过向种子贮藏蛋白缺陷型品种中导入A1aB 1bM1而制备的转化的大豆种子(品系号No.16-2)积累了大量Aβ4-10，对它们进行Aβ4-10积累量的测定。结果显示于表3。
表3
Figure BPA00001409019500281
此外，通过蛋白质印迹分析比较了通过向Jack品种和向种子贮藏蛋白缺陷型品种中导入A1aB1BM1(其中插入了3个拷贝的Aβ4-10的基因)而制备的转化的大豆中修饰的种子贮藏蛋白的积累量。结果显示于图4(其中箭头标示了对应于修饰的种子贮藏蛋白的带)。结果确认：通过向Jack品种中导入A1aB1M1而制备的转化体品系10-2(种子No.1至3)中修饰的种子贮藏蛋白的积累量是种子中总蛋白的大约0.1％-0.2％，而通过向种子贮藏蛋白缺陷型品系中导入A1aB1M1而制备的转化体品系16-2(种子No.1至3)中修饰的种子贮藏蛋白的积累量是种子中总蛋白的大约1％-2％，这个值大约是前述情况中数值的10倍。
此外，通过蛋白质印迹分析测定了通过向种子贮藏蛋白缺陷型品种中导入A1aB1BM3(其中插入了单一拷贝的Aβ4-10的基因)而制备的转化的大豆中修饰的种子贮藏蛋白的积累量。结果显示于表4。
表4
Figure BPA00001409019500291
2)以修饰的Arcelin表达的Aβ4-10的积累量
通过SDS-PAGE分离从每种转化的大豆的种子中提取的20μg总蛋白，并与特异于Aβ4-10的抗体反应，然后使用ECL Advance Western BlottingDetection Kit(由GE Healthcare Bio-Science KK生产)进行Aβ4-10的蛋白质印迹检测。结果为：对于导入了Arc5M1的转化的大豆种子(品系2-1)和导入了Arc5M2的转化的大豆种子(品系2-2)，确认了对应于Aβ4-10肽的信号条带，从而确认了Aβ4-10的积累(图5)。
3)以修饰的谷醇溶蛋白表达的Aβ4-10的积累量
通过SDS-PAGE分离从RP10M1-转化的大豆的种子(品系1-1和4-2)中提取的20μg总蛋白，并与特异于Aβ4-10的抗体反应，然后使用ECLAdvance Western Blotting Detection Kit(由GE Healthcare Bio-Science KK生产)进行Aβ4-10的蛋白质印迹检测。结果为：对于导入了RP10M1的各个品系的转化的大豆种子，确认了对应于Aβ4-10肽的信号条带，从而确认了Aβ4-10肽的积累(图6)。
类似地，对于RP10M1-转化的大豆种子，确认了对应于Aβ4-10肽的信号条带，从而确认了Aβ4-10的积累。在这种情况下，品系No.1-1所积累的量是大约380μg/g种子。
4)通过Arcelin 2启动子以修饰的A1aB1b表达的Aβ4-10的积累量
通过SDS-PAGE分离从每种转化的大豆的种子中提取的20μg总蛋白，并按照与实施例7的1)中相同的方式进行检测。
结果为：对于以上实施例6中获得的各种转化的大豆种子的品系，都确认了对应于Aβ4-10的信号条带，从而确认了Aβ4-10的积累(图7)。
此外确认了：在通过将基因导入种子贮藏蛋白缺陷型品种而制备的转化的大豆种子中Aβ4-10的积累量，该积累量是基于信号条带的强度而推断的，对于A2PA1aB1bM1(品系4-6)，该量几乎等同于A1aB1bM1(品系7-1)，并且这些积累量明显高于通过将基因导入Jack品种而制备的A1aB1bM1(品系8-1)中的积累量(图7)。
实施例8
修饰的种子贮藏蛋白的效应测定
通过已知的方法在大肠杆菌中表达以上实施例1中制备的A1aB1bM1，以产生蛋白。
为了获得A1aB1bM1编码的重组蛋白，通过将A1aB1bM1与pET21-d载体(由Novagen生产)连接而制备大肠杆菌表达质粒pETA1aB1bM1。
通过常规方法将上述pETA1aB1bM1导入大肠杆菌AD494(由Novagen生产)，将上述的重组大肠杆菌在50ml已知的TB培养基(补充了终浓度为15mg/l的卡那霉素和终浓度为50mg/l的羧苄青霉素)中在37℃培养18小时，然后将10ml培养物加入到1000ml作为生产培养基的已知的LB培养基(补充了终浓度为15mg/l的卡那霉素、终浓度为50mg/l的羧苄青霉素和终浓度为500mM的氯化钠)中，在37℃培养2小时。此后，加入终浓度为1mM的IPTG，将重组大肠杆菌在20℃培养48小时。培养后，以8000rpm离心15分钟收集大肠杆菌细胞。从收集后的细菌细胞中，使用BugBusterProtein Extraction Reagent(由Novagen生产)提取可溶性蛋白级份。从获得的可溶性蛋白级份中，使用Ni-NTA His-结合树脂(由Novagen生产)纯化由A1aB1bM1编码的重组蛋白(A1aB1bM1蛋白)。
在生理盐水中溶解50μg具有β-淀粉状蛋白抗原决定簇(Aβ4-10)的A1aB1bM1，通过皮下注射方式，以1周的间隔，向4周龄的阿尔茨海默病模型小鼠(TgCRND8)施用5次所得到的溶液(每组3只)。按照与上述相同的方式，通过在大肠杆菌中表达未经修饰的编码野生型A1aB1b的基因来制备对照组，并将得到的野生型A1aB1b施用至小鼠。给药后9周，从小鼠中采集血液，通过已知的夹心法通过ELISA确认针对Aβ4-10的抗体的产生。相对于施用了A1aB1b蛋白的组而言，施用了A1aB1bM1蛋白的组中的抗体效价明显较高，从而确认了A1aB1bM1所编码的重组蛋白的疫苗效应。
实施例9
大豆种子中修饰的种子贮藏蛋白的热稳定性
将上述实施例6中获得的转化的大豆种子进行多种热处理以，测定种子中修饰的种子贮藏蛋白的热稳定性。
1)烘烤组的转化的大豆种子
将A1aB1bM3-转化的大豆种子研磨成粉，将10mg研磨产物在高压蒸汽灭菌设备中在100℃处理10分钟，然后通过上述实施例7中描述的方法提取总蛋白，并使用特异于Aβ4-10的抗体通过蛋白质印迹评估种子中Aβ4-10的积累量。
2)水煮组的转化的大豆种子
将A1aB1bM3-转化的大豆种子研磨成粉，向10mg研磨产物中加入30μl蒸馏水，将得到的物质在高压蒸汽灭菌设备中在100℃处理10分钟，然后通过上述实施例7中描述的方法提取总蛋白，并使用特异于Aβ4-10的抗体通过蛋白质印迹评估种子中Aβ4-10的积累量。
3)来自转化的大豆种子的提取物的热处理组
将A1aB1bM3-转化的大豆种子研磨成粉，通过上述实施例7中描述的方法提取总蛋白，然后在高压蒸汽灭菌设备中在100℃处理总蛋白10分钟。此后使用特异于Aβ4-10的抗体通过蛋白质印迹评估种子中Aβ4-10的积累量。
结果为：在烘烤组和水煮组中确认了对应于Aβ4-10的信号条带。确认了数量与未经热处理的组中的量同等，因此，种子中修饰的种子贮藏蛋白是热稳定性的(图8)。
实施例10
β-淀粉状蛋白抗原决定簇的形态
使用订制的肽合成服务来合成具有编码Aβ4-10的氨基酸序列的肽(P1)、具有其中串联了2个拷贝的P1的氨基酸序列的肽(P2)和具有其中串联了3个拷贝的P1的氨基酸序列的肽(P3)
P1：FRHDSGY(SEQ ID NO：3)
P2：FRHDSGY FRHDSGY(SEQ ID NO：60)
P3：FRHDSGY FRHDSGY FRHDSGY(SEQ ID NO：61)
然后，制备了KLH-P1、KLH-P2和KLH-P3，其中载体蛋白匙孔血蓝蛋白(KLH，Mw.1000000)通过作为交联剂的半胱氨酸(Cys)分别连接于肽P1、P2和P3的N-末端。
在生理盐水中各溶解50μg这些KLH-P1、KLH-P2和KLH-P3中的每一种，通过皮下注射方式，以1周的间隔，向4周龄的小鼠(BALBc)施用5次所得到的溶液(每组3只)。给药后9周，从小鼠中采集血液以收集抗血清。将所得到的抗血清进行亲和纯化以制备纯化的针对KLH-P1、KLH-P2和KLH-P3的抗体。
通过SDS-PAGE进行数量为400pm和1000pm的商售合成的Aβ42的电泳，将上述纯化的针对KLH-P1、KLH-P2和KLH-P3的抗体与Aβ42反应，然后使用ECL Advance Western Blotting Detection Kit(由GE HealthcareBio-Science KK生产)检测。通过LAS4000miniPR(由FUJIFILM Corporation生产)捕获化学发光图像，将信号强度进行比较以推断抗体与Aβ42的结合能力。结果显示：KLH-P2的信号强度明显强于KLH-P1和KLH-P3的信号强度，因此可以通过串联2个拷贝的具有编码Aβ4-10的氨基酸序列的肽而获得具有针对Aβ的高抗体效价的特异性抗体(图9)。
工业实用性
由于通过本发明可以在大豆种子中以与种子贮藏蛋白例如大豆11S球蛋白或7S球蛋白、菜豆arcelin或水稻谷醇溶蛋白的融合蛋白的形式产生并积累阿尔茨海默病疫苗，所以可以生产并提供用于阿尔茨海默病的预防和治疗的大量的阿尔茨海默病疫苗。
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Claims (15)

1.转化的大豆植物，其中导入了编码修饰的种子贮藏蛋白的基因，其中，通过将编码阿尔茨海默病疫苗的基因插入编码野生型种子贮藏蛋白的基因的可变区而不发生移码，从而获得所述的编码修饰的种子贮藏蛋白的基因，并且其中所述修饰的种子贮藏蛋白在种子中表达并积累。
2.根据权利要求1的转化的大豆植物，其中，所述阿尔茨海默病疫苗是β-淀粉状蛋白抗原决定簇。
3.根据权利要求2的转化的大豆植物，其中，所述β-淀粉状蛋白抗原决定簇具有如下序列：含有彼此相连的1至3个拷贝的具有SEQ ID NO：3所示序列的肽。
4.根据权利要求1至3任一项的转化的大豆植物，其中，缺失内源性大豆11S球蛋白和/或大豆7S球蛋白。
5.根据权利要求1至4任一项的转化的大豆植物，其中，所述野生型种子贮藏蛋白是大豆11S球蛋白的A1aB1b亚基、菜豆的arcelin或水稻的谷醇溶蛋白。
6.根据权利要求5的转化的大豆植物，其中，所述野生型种子贮藏蛋白含有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列具有不少于90％同一性的氨基酸序列，并且所述编码阿尔茨海默病疫苗的基因所插入的可变区是编码选自对应于SEQ ID NO：2的氨基酸位置111-128、氨基酸位置198-216、氨基酸位置268-315和氨基酸位置490-495的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸序列的区域。
7.根据权利要求5的转化的大豆植物，其中，所述野生型种子贮藏蛋白含有SEQ ID NO：37所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO：37所示的氨基酸序列具有不少于90％同一性的氨基酸序列，并且所述编码阿尔茨海默病疫苗的基因所插入的可变区是编码对应于SEQ ID NO：37的氨基酸位置149-150和/或氨基酸位置250-251的氨基酸序列的区域。
8.根据权利要求5的转化的大豆植物，其中，所述野生型种子贮藏蛋白含有SEQ ID NO：45所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO：45所示的氨基酸序列具有不少于90％同一性的氨基酸序列，并且所述编码阿尔茨海默病疫苗的基因所插入的可变区是编码对应于SEQ ID NO：45的氨基酸位置110-111的氨基酸序列的区域。
9.根据权利要求1至8任一项的转化的大豆植物，其中，所述编码修饰的种子贮藏蛋白的基因的表达由菜豆arcelin 2的启动子或大豆11S球蛋白的A1aB1b亚基的启动子调节。
10.根据权利要求1至9任一项的转化的大豆植物的细胞。
11.根据权利要求1至9任一项的转化的大豆植物的种子。
12.通过加工根据权利要求11的种子而产生的加工的大豆种子。
13.使用根据权利要求1至9任一项的转化的大豆植物产生阿尔茨海默病疫苗的方法，其中，在所述转化的大豆植物的种子中产生阿尔茨海默病疫苗。
14.载体，其包含：
诱导大豆种子特异性表达的启动子；和
连接于所述启动子下游的编码修饰的种子贮藏蛋白的基因，其中通过将编码阿尔茨海默病疫苗的基因插入编码野生型种子贮藏蛋白的基因的可变区而不发生移码，从而获得所述编码修饰的种子贮藏蛋白的基因。
15.根据权利要求14的载体，其中，所述启动子是菜豆arcelin 2的启动子或大豆11S球蛋白的A1aB1b亚基的启动子。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105164149A (zh) * 2013-01-28 2015-12-16 索莱有限责任公司 具有饱腹感激素释放活性的新型多肽

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2018187754A1 (en) * 2017-04-07 2018-10-11 Alpine Roads, Inc. Milk protein production in transgenic plants
US10894812B1 (en) 2020-09-30 2021-01-19 Alpine Roads, Inc. Recombinant milk proteins
US10947552B1 (en) 2020-09-30 2021-03-16 Alpine Roads, Inc. Recombinant fusion proteins for producing milk proteins in plants
AU2021353004A1 (en) 2020-09-30 2023-04-13 Nobell Foods, Inc. Recombinant milk proteins and food compositions comprising the same
US20220127631A1 (en) * 2020-10-28 2022-04-28 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Leghemoglobin in soybean

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP3312867B2 (ja) 1996-11-08 2002-08-12 北興化学工業株式会社 植物の形質転換方法および形質転換植物の作出方法
JP3030339B2 (ja) 1998-08-07 2000-04-10 農林水産省農業生物資源研究所長 ダイズグリシニンを発現するトランスジェニック植物
ATE514707T1 (de) * 2002-04-19 2011-07-15 Univ Toronto Immunologisches verfahren und zusammensetzungen für die behandlung der krankheit von alzheimer
JP4512816B2 (ja) 2003-04-24 2010-07-28 独立行政法人農業生物資源研究所 アレルゲン特異的ｔ細胞抗原決定基を植物へ集積させる方法、および該抗原決定基を集積させた植物
US7723570B2 (en) * 2004-10-12 2010-05-25 Soymeds, Inc. Edible vaccines expressed in soybeans
JP2006238821A (ja) 2005-03-04 2006-09-14 National Agriculture & Food Research Organization 機能性ペプチド含有ダイズ形質転換体およびその利用
US7479550B2 (en) * 2006-06-02 2009-01-20 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Amyloid β gene vaccines

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HIDENORI TAKAG: "A rice-based edible vaccine expressing multiple T cell epitopes induces oral tolerance for inhibition of Th2-mediated IgE responses", 《PNAS》 *
MARILENA MANEA: "Polypeptide Conjugates Comprising a β-Amyloid Plaque-Specific Epitope as New Vaccine Structures Against Alzheimer’s Disease", 《BIOPOLYMERS (PEPT SCI)》 *
MASAKAZU TAKAHASHI: "Accumulation of high levels of free amino acids in soybean seeds through integration of mutations conferring seed protein deficiency", 《PLANTA》 *
MOTOYASU ADACHI: "crystal structure of soybean proglycinin A1aB1b homotrimer", 《J.MOL.BIOL.》 *
TOMAS MORAVEC: "Production of Escherichia coli heat labile toxin (LT) B subunit in soybean seed and analysis of its immunogenicity as an oral vaccine", 《VACCINE》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105164149A (zh) * 2013-01-28 2015-12-16 索莱有限责任公司 具有饱腹感激素释放活性的新型多肽

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