发明内容
为了解决上述问题,本发明提供了一种新的促进创面愈合的药物组合物。
本发明提供了一种促进创面愈合的药物组合物,它包含角质细胞生长因子-1和纤维蛋白胶,角质细胞生长因子-1和纤维蛋白胶的用量配比为:每1ml纤维蛋白胶中含有50~200μg角质细胞生长因子-1;所述纤维蛋白胶是纤维蛋白原在凝血酶、第VIII因子和Ca2+催化下制备而成的,其中,每1ml纤维蛋白胶由20~30mg纤维蛋白原、160IU凝血酶、4~20IU第VIII因子、0.06~0.18mol Ca2制备而成。
所述纤维蛋白胶每1ml由25mg纤维蛋白原、160IU凝血酶、12IU第VIII因子、0.12mol Ca2制备而成。
所述角质细胞生长因子-1和纤维蛋白胶的用量配比为:每1ml纤维蛋白胶中含有100μg角质细胞生长因子-1。
本发明还提供了一种促进创面愈合的药物制剂,它是以权利要求1~3任意一项所述的角质细胞生长因子-1和纤维蛋白胶为活性成分,加上药学上可接受的辅料制备而成的药物制剂;所述辅料包含油酸钠,十二烷基硫酸钠,胆酸钠或者硬脂酸钠中的一种或两种以上的混合。
所述辅料为胆酸钠。
所述胆酸钠与角质细胞生长因子-1的摩尔比为0.5~4∶1。
所述胆酸钠与角质细胞生长因子-1的摩尔比为2∶1。
所述制剂为外用制剂,优选为喷雾剂、涂膜剂。
本发明最后提供了一种制备前述药物制剂的方法,它包含如下步骤:
a、称取角质细胞生长因子-1、纤维蛋白原、凝血酶、第VIII因子、Ca2+和药学上可接受的辅料;
b、将角质细胞生长因子-1、辅料、纤维蛋白原和第VIII因子溶于0.6ml无菌水/生理盐水中,混合,得主体胶溶液;
c、将凝血酶和Ca2+溶于0.6ml无菌水/生理盐水中,得催化剂溶液;
d、将步骤b所得主体胶溶液与步骤c所得催化剂溶液混匀,即得1ml所述药物组合物。
本发明最后提供了前述药物组合物在制备促进创面愈合的药物中的用途。
本发明提供的药物组合物可促进创面组织快速愈合,提高创面组织蛋白含量和创面组织中羟脯氨酸含量,可用于制备促进创面恢复的药物。
显然,根据本发明的上述内容,按照本领域的普通技术知识和惯用手段,在不脱离本发明上述基本技术思想前提下,还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式,对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
具体实施方式
实施例1本发明药物组合物的制备
1、原料
纤维蛋白胶试剂盒(2.5ml规格),广州倍绣生物工程公司,其中包含纤维蛋白原、凝血酶、第VIII因子、主体胶溶解液(无菌液体状,PH6.5-8.0生理盐水/蒸馏水)和催化剂溶解液(无菌液体状态,含有10-30mg/ml CaCl2的PH6.5-8.0的生理盐水/蒸馏水)。其中,1ml纤维蛋白胶的配比如下:
主体胶溶液:纤维蛋白原20-30mg(优选为15mg),第VIII因子4-20IU(优选为12IU),主体胶溶解液(无菌液体状,PH6.5-8.0生理盐水/蒸馏水0.6ml);
催化剂溶液:凝血酶160IU,催化剂溶解液(无菌液体状态,含有0.06-0.18mol CaCl2的PH6.5-8.0的生理盐水/蒸馏水0.6ml,CaCl2浓度优选为0.12mol)。
角质细胞生长因子-1、辅料均为市售品。辅料处理:精密称取胆酸钠等辅料100mg,加水10mL水浴超声溶解,配制成浓度为10mg/mL的储备液;精密移取1mL储备液,用水稀释成浓度适宜的供试液。
2、制备方法
(1)按照广州倍绣生物工程公司说明书制备纤维蛋白胶(2.5ml规格)
取纤维蛋白原、凝血酶、第VIII因子CaCl2;
取50-75mg纤维蛋白原和10-50IU第VIII因子加入主体胶溶解液(无菌液体状,PH6.5-8.0生理盐水/蒸馏水1.5ml)中,振摇,直至主体胶完全溶解,得主体胶溶液;
用催化剂溶解液(无菌液体状态,含有10-30mg/ml CaCl2的PH6.5-8.0的生理盐水/蒸馏水1.5ml)溶解400IU凝血酶,得催化剂溶液;
取一次性专用双联注射器(其包含双联注射架1件,推杆1件,2ml三件套注射器2支,复式注射座(也称Y型接头)2件,喷嘴2支,平头针2支,备用尖头针2支),一只专用于抽取主体胶溶液,另一只专用于抽取催化剂溶液,分别卡入推液支架上,将两注射器锥头牢固地连接到连接针座上(注意两注射器内的液体体积要相等),再把喷嘴安装到连接针座的锥头,检查无松动渗漏后,同时推动两支注射器,即得纤维蛋白胶。
(2)本发明药物组合物的制备方法
a、称取角质细胞生长因子-1、纤维蛋白原、凝血酶、第VIII因子、Ca2+和药学上可接受的辅料;
b、精密移取胆酸钠等辅料供试液、100μg KGF-1、15mg纤维蛋白原和12IU第VIII因子加入主体胶溶解液中,振摇,直至主体胶完全溶解,得总体积为0.6ml的主体胶溶液;
c、用0.6ml催化剂溶解液溶解400IU凝血酶,得催化剂溶液;
d、严格按不含KGF的纤维蛋白胶配制说明操作。即取一次性专用双联注射器(其包含双联注射架1件,推杆1件,2ml三件套注射器2支,复式注射座(也称Y型接头)2件,喷嘴2支,平头针2支,备用尖头针2支),一只专用于抽取含有KGF的主体胶溶液,另一只专用于抽取催化剂溶液,分别卡入推液支架上,将两注射器锥头牢固地连接到连接针座上(注意两注射器内的液体体积要相等),再把喷嘴安装到连接针座的锥头,检查无松动渗漏后,同时推动两支注射器,即得1ml本发明药物组合物。
实施例2本发明药物组合物的配比筛选试验
1、实验动物
雄性SD大鼠(四川大学华西动物中心提供),体重200g(180-230g)左右,共100只,实验前适应环境一周,自由饮水与摄食。100只大鼠按照随机数字表法分为伤后3,7,10,14,21d组,每组各有5只动物。
实验分组:组合物按实施例1所述方法制备,其中辅料为胆酸钠,且胆酸钠和KGF的复合摩尔比为2∶1。
A组:每1ml本发明组合物中角质细胞生长因子-1、纤维蛋白原、凝血酶、第VIII因子和Ca2+的配比为10μg∶15mg∶160IU∶12IU∶0.12mol
B组:每1ml本发明组合物中角质细胞生长因子-1、纤维蛋白原、凝血酶、第VIII因子和Ca2+的配比为50μg∶15mg∶160IU∶12IU∶0.12mol
C组:每1ml本发明组合物中角质细胞生长因子-1、纤维蛋白原、凝血酶、第VIII因子和Ca2+的配比为100μg∶15mg∶160IU∶12IU∶0.12mol
D组:每1ml本发明组合物中角质细胞生长因子-1、纤维蛋白原、凝血酶、第VIII因子和Ca2+的配比为200μg∶15mg∶160IU∶12IU∶0.12mol
2、实验方法
(1)造模
动物经腹腔注射10g/L戊巴比妥麻醉后,备皮,背位固定,碘伏消毒,无菌条件下在背部肩胛稍靠后脊柱两侧2cm处用特制打孔器切割1个直径约1.5cm的圆形创面,深度及全层皮肤,并破坏少许肌肉组织。
(2)给药
将往A、B、C、D四组药分别喷于不同组大鼠创面上。
(3)结果测定
a、伤口创面的测定
圆形切除全层皮肤后,用消毒的半透明油酸纸贴于创面,沿创缘划线,再贴于坐标纸上计算所测面积,作为伤口原始面积。然后于伤后3,7,10,14,21d测伤口残留面积,计算残留面积百分率=残留面积/原始面积×100%。
b、创面组织中蛋白含量
将创面组织称重后剪碎,匀浆,将组织匀浆液按Lowry法测定,结果以每克创面组织所含蛋白量的毫克数表示。
c、羟脯氨酸测定
将创面组织称重后剪碎,放入20mL玻璃安瓿中,加入6mol/L盐酸2mL,封口,置135摄氏度烤箱内水解3.5h,冷却后打开封口,加入2滴甲基红指示剂使之呈红色,用6mol/L氢氧化钠2mL中和该液至中性呈微黄色,然后用蒸馏水稀释至50mL,过滤,在空白管、标准管和测定管内分别加入1mL双蒸水、羟脯氨酸标准液和创面组织水解液,每管再加入柠檬酸缓冲液0.5mL、氯氨T1mL,混匀,6min后加高氯酸1mL,6min后再于每管加100g/L对二甲氨基苯甲醛溶液1mL,在100摄氏度水浴中加热3min,冰水冷却,分光光度计上比色,以空白管调零,读取标准管和测定管A值,回归校正曲线,按校正曲线计算出测定管的羟脯氨酸含量,再计算创面组织中羟脯氨酸含量(mg/g)。
3、实验结果及结论:
如图1-3所示,伤口愈合速度、创面组织蛋白含量和创面羟脯氨酸含量从小到大依次为:A组<B组<C组<D组。说明随着KGF-1纤维蛋白胶缓释组合物中KGF-1的量增加,创面愈合速度加快、创面平均愈合时间显著缩短、创面蛋白含量和羟脯氨酸均提高,且C组药物组合物与D组药物组合物的疗效无显著差异。因此,KGF-1纤维蛋白胶缓释组合物的最优复配比为角质细胞生长因子-1、纤维蛋白原、凝血酶、第VIII因子和Ca2+的配比为100μg∶15mg∶160IU∶12IU∶0.12mol。
实施例3缓释辅料的筛选实验
1、实验材料
油酸钠,十二烷基硫酸钠,胆酸钠,硬脂酸钠,市售品。分别精密称取油酸钠,十二烷基硫酸钠,胆酸钠和硬脂酸钠各50mg,组合物按实施例1所述方法制备,其中,每1ml本发明组合物中角质细胞生长因子-1、纤维蛋白原、凝血酶、第VIII因子和Ca2+的配比为100μg∶15mg∶160IU∶12IU∶0.12mol。
2、实验方法:
同实施例2所述方法。
3、实验结果
图4为含有不同辅料的KGF-1纤维蛋白胶组合物的体外累积释放曲线,往KGF-1纤维蛋白胶组合物中加入辅料能减小药物突释,减慢药物的释放速度,延长纤维蛋白胶药物的释放时间,其中KGF-1与硬脂酸钠和胆酸钠复合后KGF-1的释放速度最缓慢,综合考虑KGF-1的释放速度和辅料的毒性,KGF-1纤维蛋白胶组合物的最佳辅料为胆酸钠。
实施例4辅料加入量的筛选实验
1、实验材料
组合物按实施例1所述方法制备,其中,角质细胞生长因子-1、纤维蛋白原、凝血酶、第VIII因子和Ca2+的配比为100μg∶15mg∶160IU∶12IU∶0.12mol,其中胆酸钠与KGF-1的摩尔比分别为0.5∶1,1∶1,2∶1,3∶1,4∶1。
2、实验方法
取制备的本发明药物组合物,分别于0.5,1,2,4,6,8,12h精密吸取0.5ml释放液,并立即补充0.5ml生理盐水。将吸取的释放液以15000r/min的速度离心30min,取上层液体,按照购买的Elisa试剂盒中的操作步骤测定上清液中的KGF含量。(Elisa试剂盒:Duoset ELISA Development kit(CatalogNumber:DY251,生产厂家:R&D systems Co.,Ltd)。
3、实验结果
图5为含有不同浓度胆酸钠的KGF纤维蛋白胶组合物的体外累积释放曲线,结果表明,初始,随着胆酸钠与KGF的摩尔比增大,KGF的释放速度减慢,当胆酸钠与KGF的摩尔比为2∶1时,KGF的释放速度最慢;继续增大胆酸钠与KGF的复合摩尔比,KGF的释放速度反而加快。该定结果与肉眼观察的悬液状态变化一致。胆酸钠与KGF的复合摩尔小于2∶1时,增大复合摩尔比,悬液的浊度增加;胆酸钠与KGF的复合摩尔比大于2∶1时,增大复合摩尔比,悬液逐渐变澄清。
实验结果说明胆酸钠与KGF的复合摩尔比为2∶1时,本发明的药物组合物的缓释效果最佳。
实施例5KGF、纤维蛋白胶和缓释辅料的协同增效实验
1、实验动物II
雄性SD大鼠(四川大学华西动物中心提供),体重200g(180-230g)左右,共150只,实验前适应环境一周,自由饮水与摄食。
实验分组:根据不同处理手段分为6个大组,每组25只,照随机数字表法分为伤后处理3,7,10,14,21天组,每组各有5只动物:
I组:纤维蛋白胶(采用广州倍绣生物工程公司生产的2.5ml规格的产品)
II组:KGF-1
III组:纤维蛋白胶+KGF-1IV组:纤维蛋白胶+生长激素(生长激素采用默克雪兰诺公司的重组人生长激素(rhGH)的产品(5IU规格),按实施例1所述方法制备,直接用生长激素代替KGF-1即可,生长激素、纤维蛋白原、凝血酶、第VIII因子和Ca2+的配比为5IU∶15mg∶160IU∶12IU∶0.12mol)
V组:纤维蛋白胶+KGF-1(按实施例1所述方法制备,角质细胞生长因子-1、纤维蛋白原、凝血酶、第VIII因子和Ca2+的配比为100μg∶15mg∶160IU∶12IU∶0.12mol)
VI组:纤维蛋白胶+KGF-1+胆酸钠(按实施例1所述方法制备,角质细胞生长因子-1、纤维蛋白原、凝血酶、第VIII因子和Ca2+的配比为100μg∶15mg∶160IU∶12IU∶0.12mol,胆酸钠与角质细胞生长因子-1的摩尔比为2∶1)
2、实验方法
(1)造模:动物经腹腔注射10g/L戊巴比妥麻醉后,备皮,背位固定,碘伏消毒,无菌条件下在背部肩胛稍靠后脊柱两侧2cm处用特制打孔器切割1个直径约1.5cm的圆形创面,深度及全层皮肤并破坏少许肌肉组织。
(2)给药方法:
I组的大鼠每个创面给予纤维蛋白胶1ml,均匀喷洒于创面上;
II组的大鼠每个创面给予KGF100μg,均匀喷洒于创面上;
III组的大鼠每个创面给予KGF50μg,然后再给予纤维蛋白胶0.5ml;
IV组的大鼠每个创面给予含有生长激素的纤维蛋白胶0.5ml,均匀喷洒于创面上;
V组的大鼠每个创面给予含有KGF的纤维蛋白胶0.5ml,均匀喷洒于创面上;
VI组的大鼠每个创面给予含有KGF、胆酸钠的纤维蛋白胶0.5ml,均匀喷洒于创面上。
(3)结果测定
a、伤口创面的测定
圆形切除全层皮肤后,用消毒的半透明油酸纸贴于创面,沿创缘划线,再贴于坐标纸上计算所测面积,作为伤口原始面积。然后于伤后3,7,10,14,21d测伤口残留面积,计算残留面积百分率=残留面积/原始面积×100%。
b、创面组织中蛋白含量
将创面组织称重后剪碎,匀浆,将组织匀浆液按Lowry法测定,结果以每克创面组织所含蛋白量的毫克数表示。
c、羟脯氨酸测定
将创面组织称重后剪碎,放入20mL玻璃安瓿中,加入6mol/L盐酸2mL,封口,置135摄氏度烤箱内水解3.5h,冷却后打开封口,加入2滴甲基红指示剂使之呈红色,用6mol/L氢氧化钠2mL中和该液至中性呈微黄色,然后用蒸馏水稀释至50mL,过滤,在空白管、标准管和测定管内分别加入1mL双蒸水、羟脯氨酸标准液和创面组织水解液,每管再加入柠檬酸缓冲液0.5mL、氯氨T 1mL,混匀,6min后加高氯酸1mL,6min后再于每管加100g/L对二甲氨基苯甲醛溶液1mL,在100摄氏度水浴中加热3min,冰水冷却,分光光度计上比色,以空白管调零,读取标准管和测定管A值,回归校正曲线,按校正曲线计算出测定管的羟脯氨酸含量,再计算创面组织中羟脯氨酸含量(mg/g)。
3、实验结果及结论:
实验结果如表1-3及图6-8所示:
表1不同药物对伤口残留面积百分比的影响
组别 |
3d |
7d |
10d |
14d |
21d |
I组 |
81.4±3.7 |
53.8±3 |
24.8±2.6 |
17.4±4.5 |
3.4±2.2 |
II组 |
76.1±4.1 |
47.5±4.3 |
19.1±2 |
14.6±2.3 |
2.8±1.7 |
III组 |
69.3±2.8 |
41.6±3.7 |
15.2±3.1 |
9.3±2.4 |
0±0 |
IV组 |
73.3±3.1 |
45.1±2.4 |
17.8±1.9 |
12.2±4.1 |
0±0 |
V组 |
65.5±3.2 |
40.7±2.3 |
13.4±2.7 |
7.8±3.1 |
0±0 |
VI组 |
60.2±2.1 |
32.1±2.5 |
10.6±1.9 |
3.4±2.8 |
0±0 |
表2不同药物对创面组织蛋白含量的影响
组别 |
3d |
7d |
10d |
14d |
21d |
I组 |
11.2±2.5 |
25.3±4.2 |
54.8±4.2 |
97.4±4.7 |
113.5±3.3 |
II组 |
16.9±4.2 |
32.5±3.7 |
63.1±2.8 |
125.3±5.6 |
147.3±4.2 |
III组 |
23.1±2.9 |
40.4±2.1 |
73.5±3.1 |
137.4±2.3 |
187.4±2.7 |
IV组 |
19.6±3.3 |
37.7±2.3 |
67.9±3.5 |
129.7±2.7 |
162.2±3.5 |
V组 |
26.4±2.1 |
45.4±2.7 |
78.3±3.8 |
142.7±4.2 |
196.7±5.4 |
VI组 |
37.7±3.4 |
56.8±3.1 |
89.5±4.4 |
171.4±3.3 |
219.2±3.8 |
表3不同药物对创面组织羟脯氨酸含量的影响
组别 |
3d |
7d |
10d |
14d |
21d |
I组 |
4.1±2.4 |
9.7±4.1 |
12.6±1.8 |
19.6±2.2 |
33.2±4.7 |
II组 |
6.4±1.3 |
12.2±2.5 |
17.3±2.2 |
27.3±3.4 |
41.6±2.8 |
III组 |
9.7±1.9 |
17.1±2.7 |
24.3±3.2 |
39.6±2.5 |
59.9±3.4 |
IV组 |
8.8±3.1 |
14.4±2.4 |
20.8±1.7 |
32.2±2.9 |
48.2±1.4 |
V组 |
12.7±3.1 |
20.4±1.3 |
27.6±3.6 |
45.7±3.7 |
65.3±3.2 |
VI组 |
18.9±2.7 |
28.7±3.1 |
35.8±2.4 |
52.4±4.0 |
76.7±2.4 |
根据SPSS软件计算各组显著性差异水平。
由表1-3可知:
(1)伤口愈合速度、创面组织蛋白含量和创面羟脯氨酸含量从小到大依次为:I组<II组<IV组<III组<V组<VI组;
(2)III组与I组相比有显著性差异(P<0.01),III组与II组相比有显著性差异(P<0.05);
(3)V组与IV组相比有显著性差异(P<0.05),V组与III组相比无显著性差异(P>0.05);
(4)VI组和V组相比有显著性差异(P<0.05)。
实验说明纤维蛋白胶和KGF-1配合使用能有效地提高创面愈合速度,缩短创面平均愈合时间,提高创面组织蛋白含量和创面羟脯氨酸含量,效果均优于单独使用KGF-1或者纤维蛋白胶,证明KGF-1和纤维蛋白胶具有协同增效的作用。同时,本发明提供的KGF-1和纤维蛋白胶的组合物(第V组),其疗效显著优于生长激素和纤维蛋白胶的组合物(第IV组),说明本发明组合物促进伤口愈合的疗效优于其他生长因子与纤维蛋白胶的组合;而且,加入胆酸钠(第VI组)后,本发明组合物的疗效更好,说明胆酸钠可以促进本发明药物组合物发挥疗效。
综上,本发明提供的药物组合物可促进创面组织快速愈合,提高创面组织蛋白含量和创面组织中羟脯氨酸含量,可用于制备促进创面恢复的药物。