CN101721683B - 人角质细胞生长因子1在制备治疗肛裂的药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了人角质细胞生长因子1的一种新的用途，应用于因肛管狭窄、肛门湿疹、排便用力过度、痔疮创伤所引发急慢性肛裂，以及外科手术后残留或者复发肛裂的治疗。本发明利用人角质细胞生长因子1特异性促进上皮细胞增殖的生物活性，促进伤口创面上皮细胞增殖和创面组织的修复，促进肛裂部位的结构恢复，加快肛裂的愈合。

Description

人角质细胞生长因子1在制备治疗肛裂的药物中的应用

技术领域

本发明涉及一种人角质细胞生长因子1的新用途，特别是在制备治疗肛裂的药物中的新用途。具体地说是将人角质细胞生长因子1制备成既能保持生物活性、又适合外部给药的制剂，并经外部给药治疗肛裂。

背景技术

肛裂是常见肛门疾病，多由肛管狭窄、肛门湿疹、排便损伤和痔疮诱发创伤，未得到有效治疗发展而成，肛裂发病率高，肛裂早期如果得不到及时治疗，会出现肛管溃疡(裂口纤维化，又称陈旧性肛裂)、肛乳头肥大(息肉样瘤)、哨兵痔(皮赘增生)等三种病症，继续发展还可出现肛窦炎(肛门慢性炎症)和肛瘘(肛门化脓性炎症)，与前三症合称“肛裂五特征”。也有因长期慢性炎性刺激成肛管癌的可能。

临床上尚无能很好满足需求的治疗方案。最常用手术治疗，但是术后仍旧有大批病人残留肛裂或者肛裂复发。药物治疗多为口服抗生素类、局部用消炎药物等，尚无促进病灶部位创面修复、结构重建的药物。

肛裂出现后，因排便产生创面的反复损伤，以及感染和创面部位的特殊解剖学结构，使肛裂不易治愈。具体来讲，肛管上端齿线处的特殊结构如肛窦、肛门瓣、肛乳头、肛腺等，容易被干硬的粪团下移时所损伤，使局部产生感染和炎症，或导致肛腺阻塞化脓，溃破后形成肛裂，由于局部炎症刺激，括约肌痉挛，血液供应不足，伤口久不愈合，形成慢性溃疡。此外，解剖上的缺陷如肛裂多发生于肛门后位，主要是由于外括约肌浅层在肛管前后方各形成“Y”形薄弱区，排便时容易造成解剖薄弱区受伤撕裂，这是肛裂裂口的位置常发生于后方的原因。另外，干硬粪团通过肛管时，易引起肛管撕裂和括约肌痉挛引起的慢性溃疡也是肛裂不愈合的重要因素。

hKGF1是成纤维细胞生长因子(FGF)家族的一员，KGF1由上皮细胞相邻的间叶细胞所产生，又称FGF7。它通过结合只表达在上皮细胞的KGF受体(KGFR)特异性结合促进不同组织上皮细胞的增殖、分化、减少上皮细胞的凋亡，阻止上皮细胞DNA的损伤，增强能降低细胞外部内部环境有毒物质的酶活，从而促进上皮细胞的更新和增值。KGF1参与组织损伤后的修复。

重组人角质细胞生长因子1已经开发为肿瘤放化疗后口腔溃疡的治疗用药，静脉滴注给药，为冻干生物制品，得到FDA和欧洲EMEA的批准上市，证明重组人角质细胞生长因子1是非常安全的细胞因子，也是目前全球批准体内注射的第一个细胞因子。

肛裂是人体特殊部位的损伤，影响其愈合的原因很多，得到一种疗效显著，使用方便的药物是临床医生努力的目标。目前没有报道将KGF1应用于肛裂的治疗。

本发明利用人角质细胞生长因子1对人上皮细胞的专一性和促进分裂分化和迁移的生物学活性，促进肛裂部位的修复、结构重建，加快肛裂的愈合速度，达到了很好的治疗效果。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种人角质细胞生长因子1在制备治疗肛裂的药物中的应用。所述人角质细胞生长因子1为缺失N端23个氨基酸残基的重组人角质细胞生长因子，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

进一步的，所述的药物是以有效量的人角质细胞生长因子1为活性成分，加上药学上可以接受的辅料制备而成的药剂。所述的药剂是外用固体制剂、半固体制剂或液体制剂。

优选的固体制剂是冻干粉剂或栓剂；优选的半固体制剂是凝胶制剂、乳剂或膏剂；优选的液体制剂为喷雾剂。

本发明的另一目的是提供一种治疗肛裂的药物组合物，它以有效量的人角质细胞生长因子1为活性成分，加上药学上可以接受的辅料制备而成的药剂。所述药物组合物中人角质细胞生长因子1的含量为500ng～50ug/ml，优选的含量范围是5ug～20ug/ml。

所述药剂是外用固体制剂、半固体制剂或液体制剂；优选的外用固体制剂、半固体制剂或液体制剂分别是：冻干粉剂或栓剂；凝胶剂、乳剂或膏剂；以及喷雾剂。

本发明所使用重组人角质细胞生长因子1为用E.coli表达的缺失23氨基酸残基的140氨基酸人角质细胞生长因子。

本发明所用重组人角质细胞生长因子1保存方式为冷冻干燥后4-8℃冷藏保存，使用时用生理盐水或医学上用于溶解冻干生物制品的溶媒溶解后，直接使用于溃疡部位或用适当药物载体将药物送至溃疡部位。

试验证明，重组人角质细胞生长因子1能促进肛裂部位快速修复，完成结构重建；并对痔疮有良好的治疗效果。

下面通过具体实施方式对本发明作进一步描述，但并非对本发明的限制

具体实施方式

实施例1本发明冻干制剂的的制备

活性成分：重组人角质细胞生长因子1(可购买美国安进公司的产品palifermin或kepivance)或者利用常规的基因重组技术生产重组人角质细胞生长因子1，其方法如下：

a、按照生物技术领域技术人员所熟知的方法，人工合成或者用RT-PCR技术克隆重组人角质细胞生长因子1的cDNA序列【fibroblast growth factor7(keratinocyte growth factor)，Homo sapiens，GeneID 2252】，构建重组质粒，并转染工程菌E.coli表达，得到表达重组人角质细胞生长因子1的基因工程菌，并经发酵培养基因工程菌进行重组人角质细胞生长因子1的生产；

b、经过亲和层析、离子交换层析等分离纯化步骤，获得纯度达到95％以上的重组人角质细胞生长因子1，按照Edman法测定蛋白N-末端序列，其序列与SEQ ID NO1N-末端15个氨基酸残基相符合，同时通过质谱法测定分子量，与预期分子量16278Da相吻合证明得到的蛋白为重组人角质细胞生长因子1，并经检测物热源物质和生物活性测定，符合国家注射用蛋白的质量标准。

辅料：甘露醇、组氨酸、蔗糖等

将辅料溶解、与相应的重组人角质细胞生长因子1原液混合，调整pH值到6.5、组成为每毫升液体含1毫克重组人角质细胞生长因子1、50毫克甘露醇、25毫克蔗糖、2毫克组氨酸，经过滤除菌后，冷冻干燥，即为冻干制剂，规格按照需要确定。

实施例2本发明喷雾制剂的制备

为便于运输和保存，重组人角质细胞生长因子1制备成冻干制剂，使用时可根据需要配制为喷雾制剂：将冻干制剂用生理盐水或医学常用溶媒溶解，溶解后的活性物质浓度范围为500ng～50ug/ml，装入符合要求的喷雾器中，即可喷雾使用。

实施例3本发明凝胶制剂的制备

为便于运输和保存，重组人角质细胞生长因子1制备成冻干制剂，使用时可根据需要配制为凝胶制剂，制备方法如下：

用聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物(Pluronic)的低温呈液态，体温凝聚成凝胶的特点，将其配制成重组人角质细胞生长因子1冻干粉的凝胶伴侣，与重组人角质细胞生长因子1冻干粉共同低温(4-8℃)保存，使用时用凝胶伴侣溶解冻干粉，吸出涂抹到患处，体温作用即形成凝胶覆盖患处，并释放重组人角质细胞生长因子1产生治疗作用。

20％Pluronic F-127液制备方法：20mM PBS pH7.0缓冲液，缓慢加入Pluronic F-127搅拌30分钟，4℃下过夜，过滤除菌分装成1ml每支，4-8℃运输或保存。

使用时，凝胶伴侣与重组人角质细胞生长因子1冻干粉溶解配制方法与生理盐水配制方法相同，配制后重组人角质细胞生长因子1浓度为500ng～50ug/ml。

试验例1重组人角质细胞生长因子对醋酸诱导肛门溃疡作用研究

1材料与方法

1.1实验材料

1.1.1实验动物

KM种小鼠，体重18-22g，72只；四川抗菌素工业研究所实验动物中心提供，合格证号：2003-05。

冰醋酸，分析纯，批号：0805011，长征化学试剂厂提供。

1.1.2实验药物

实施例1制备的重组人角质细胞生长因子1冻干制剂：冻干粉，1mg/支；批号20080601。使用时用生理盐水或其他常用医用溶媒溶解，稀释成最终所需浓度。

1.2实验方法

1.2.1实验方法

选用健康昆明种小鼠72只，适应饲养3天。将小鼠分成6组，即正常对照组，模型对照组、溶媒对照组、角质细胞生长因子(20、10、5ug/ml)剂量组。除正常对照组外，向其他小鼠肛门内用无针注射器推入20％醋酸0.05ml/只，保持2分钟后用无菌棉签沾出；正常对照组给予无菌蒸馏水。造模后第2天开始给药，每天1次，用棉签沾取稀释液深入肛门涂抹，连续3天。实验观察11天。

1.2.2观察指标

1.2.2.1一般观察

造模后第2天开始观察，每天1次，包括：

(1)肛周情况，红肿，分泌物；

(2)拖尾，即动物在饲养笼内摩擦肛门部。

1.2.2.2组织病理学检查

观察11天后，脱颈处死小鼠，取直肠及肛门组织，中性福尔马林溶液固定，石蜡包埋，切片，HE染色，光学显微镜观察。

2结果

2.1一般观察

造模后当天，模型组及给药组动物均出现拖尾现象。第二天给药前，正常组肛门无异常，模型组及给药组动物肛门红肿，并有少量脓性物流出。给药后第8天，中、高剂量组红肿消退，少量动物仍有异物流出(结果见表1.)。

表1重组人角质细胞生长因子对一般观察影响

表1重组人角质细胞生长因子对一般观察影响(续)

2.2组织病理学结果

组织学检查表明：模型组大量单柱状上皮细胞脱落，黏膜可见脓灶形成，并大量炎性细胞浸润，可见大量或成片溃疡形成。以上研究结果说明肛门溃疡模型成功。溶媒组大量单柱状上皮细胞脱落，黏膜可见脓灶形成，并大量炎性细胞浸润，可大量或成片溃疡形成。低剂量组少量上皮细胞脱落，偶见炎性细胞浸润，可见少量局灶性溃疡。中、高剂量组残留轻度炎症，固有层仍可见少量炎症细胞浸润，组织处于修复期，可见肉芽组织，复层上皮基本修复，绒毛结构出现；高剂量组可见表皮基底细胞层细胞明显增多。

3结论

重组人角质细胞能促进角质细胞增殖，角质细胞鳞状上皮可以促进黏膜溃疡的愈合。因此，重组人角质细胞对化学物质、细菌感染等诱导黏膜溃疡，以及异物导致肛门创伤具有一定的治疗作用。

试验例2重组人角质细胞生长因子1(rhKGF1)治疗肛裂效果观察

肛裂是最常见的肛门部疾病之一，以周期性肛门疼痛、便秘及间歇性便血为主要特征。肛裂常规保守治疗常经久不愈，而需要手术治疗，侧方内括约肌切开术是目前临床上最常选择的术式，但常发生出血、疼痛、感染、肛门狭窄、瘘管形成和肛门失禁等并发症，患者因肛裂或者手术并发症存在巨大痛苦^【1】。目前肛裂治疗尚是临床的难题，我们使用rhKGF1(重组人角质细胞生长因子1)外用治疗10例急慢性肛裂病人，效果良好，现报道如下。

1资料与方法

1.1临床资料

试验用重组人角质细胞生长因子1为冻干粉，由实施例1制备，规格1mg/支，用生理盐水溶解，配置成5ug/ml的浓度，用在肛门内涂抹。此外外用5ug/mlrhKGF1水凝胶(为实施例3制备的凝胶制剂)外敷于肛门外肛裂处，也可以直接使用按相同方法配制的10ug/ml的rhKGF1水凝胶或水溶液。

本观察入选18名肛裂患者，其中急性肛裂5例，慢性肛裂患者13例，慢性肛裂患者中有4例曾行手术治疗，术后复发，所有患者都试用过肛泰、马应龙痔疮膏等药物治疗，但是均无明显疗效。患者均有疼痛、出血、间歇性便秘等症状，18例患者中有5例合并存在内外痔。

1.2治疗方法

本观察使用rhKGF1(重组人角质细胞生长因子1)于肛门处外敷以及肛门周围内涂。具体方法：用生理盐水溶解rhKGF1冻干粉，浓度为5ug/ml，将无菌棉球蘸湿，带橡胶手套，使用该棉球在肛门内部涂抹，之后另外使用5ug/mlrhKGF1凝胶制剂外敷于肛门处，持续30分钟，早晚各一次。观察期间两组均停用一切药物，于8天后观察结果。

1.3疗效评定标准

临床痊愈：便血及疼痛消失，创面愈合；

显效：便血及疼痛消失，创面愈合2/3以上；

有效：便血减少，疼痛减轻，创面愈合1/3以上；

无效：用药7d，症状及体征无明显改善。

1.4结果

所有患者便血和疼痛症状消失，18例患者中达到临床痊愈的病例有11例，包括4例急性肛裂和7例慢性肛裂患者，急性肛裂患者使用rhKGF1制剂治疗3天内创面愈合，慢性肛裂患者使用1周内创面愈合，(临床治愈率61％)5例有效，创面愈合达2/3以上(显效率28％)2例有效，创面愈合达到1/3。5例合并内外痔的患者，持续使用rhKGF1一月之后，痔核变软、缩小，有3例患者痔核回纳到肛门以内。

1.5不良反应未观察到不良反应。

2讨论

肛裂是指齿状线以下内括约肌表面肛管皮肤全层裂开性溃疡，好发于肛管后、前正中，以周期性肛门疼痛、便秘及间歇性便血为特征，目前临床一致认为与便秘、努力排便造成机械性损伤、局部感染、溃疡等有关。急性肛裂采用保守治疗方法可好转，但是慢性肛裂不易愈合，现在认为与局部感染、肛门括约肌压力增高有关。慢性肛裂手术之后还存在着易复发、病程长等缺点，到目前为止尚无有效的治疗药物，有些人尝试使用肉毒碱局部注射加坐浴的方法，短时间使肛门括约肌处于轻瘫状态，降低肛门括约肌压力和肛内压力，促进肛裂愈合，效果尚可，但是会有短暂的便失禁状态^【2】。

使用KGF1治疗肛裂在国内外尚未见到报道，在我们的观察中，对于急慢性肛裂的愈合十分有效，且使用方法方便、安全，一周内即观察到明显疗效，可促使伤口或溃疡部位快速愈合，减少进一步感染机率，不但可以作为手术疗法的有效补充，甚至可以代替手术的可能性。且使用一个月左右，可观察到缓解内外痔的作用，虽然机理不甚清楚，但是效果是确切的。KGF1对于广大肛裂患者，实是治疗良药。

参考文献：

【1】陈庆生，王淑香。肛门后切术治疗37例陈旧性肛裂临床体会。Proceedingof clinical medicine 2008：17(11)：954

【2】张桂霞。慢性肛裂的诊治进展。现代医药卫生。2008，24(22)：3411

治疗肛裂药物.ST25.txt

SEQUENCE LISTING

<110>成都博发生物技术有限公司

<120>人角质细胞生长因子1在制备治疗肛裂的药物中的应用

<130>CD566-09P108071

<160>1

<170>PatentIn version 3.2

<210>1

<211>140

<212>PRT

<213>重组人角质细胞生长因子1

<400>1

Ser Tyr Asp Tyr Met Glu Gly Gly Asp Ile Arg Val Arg Arg Leu Phe

1               5                   10                  15

Cys Arg Thr Gln Trp Tyr Leu Arg Ile Asp Lys Arg Gly Lys Val Lys

            20                  25                  30

Gly Thr Gln Glu Met Lys Asn Asn Tyr Asn Ile Met Glu Ile Arg Thr

        35                  40                  45

Val Ala Val Gly Ile Val Ala Ile Lys Gly Val Glu Ser Glu Phe Tyr

    50                  55                  60

Leu Ala Met Asn Lys Glu Gly Lys Leu Tyr Ala Lys Lys Glu Cys Asn

65                  70                  75                  80

Glu Asp Cys Asn Phe Lys Glu Leu Ile Leu Glu Asn His Tyr Asn Thr

                85                  90                  95

Tyr Ala Ser Ala Lys Trp Thr His Asn Gly Gly Glu Met Phe Val Ala

            100                 105                 110

Leu Asn Gln Lys Gly Ile Pro Val Arg Gly Lys Lys Thr Lys Lys Glu

        115                 120                 125

Gln Lys Thr Ala His Phe Leu Pro Met Ala Ile Thr

    130                 135             140

Claims (10)

1.人角质细胞生长因子1在制备治疗肛裂的药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征是：所述人角质细胞生长因子1为缺失N端23个氨基酸残基的重组人角质细胞生长因子，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征是：所述的药物是以有效量的人角质细胞生长因子1为活性成分，加上药学上可以接受的辅料制备而成的药剂。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征是：所述人角质细胞生长因子1的含量为500ng～50ug/ml。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征是：所述人角质细胞生长因子1的含量为5μg～20μg/ml。

6.根据权利要求3所述的应用，其特征是：所述的药剂是外用固体制剂、半固体制剂或液体制剂。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征是：所述的固体制剂是冻干粉剂或栓剂。

8.根据权利要求6所述的应用，其特征是：所述的半固体制剂是膏剂。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征是：所述的膏剂是凝胶制剂或乳剂。

10.根据权利要求6所述的应用，其特征是：所述的液体制剂为喷雾剂。