CN102301953A

CN102301953A - 一种规模化高效快速繁殖铁皮石斛试管苗的方法

Info

Publication number: CN102301953A
Application number: CN201110203343A
Authority: CN
Inventors: 席刚俊; 史俊; 徐超; 赵桂华; 杨鹤同
Original assignee: Jiangsu Polytechnic College of Agriculture and Forestry
Current assignee: Jiangsu Polytechnic College of Agriculture and Forestry
Priority date: 2011-07-20
Filing date: 2011-07-20
Publication date: 2012-01-04
Anticipated expiration: 2031-07-20
Also published as: CN102301953B

Abstract

本发明公开了一种规模化高效快速繁殖铁皮石斛试管苗的方法：将铁皮石斛蒴果消毒，漂洗，切开，取种子；将种子播种于液体培养基中振荡培养50～60d，种子萌发形成原球茎并进一步形成小芽；将小芽置于壮苗培养基中培养2～2.5个月，小芽变成具有2～3片叶并带有1～2条幼根的小苗；将小苗转移到壮苗生根培养基中，并将组培瓶瓶口加封口膜，移至有外遮荫的大棚温室苗床上，给予太阳光或自然光，培养2～3个月得到成苗；将成苗从瓶内取出洗净，消毒，晾干，移栽到温室大棚内的栽培基质中，培养24～30个月，即可。本发明工艺可直接用于工厂化规模化的种苗生产，具有污染少，种子萌发率高，变异率低，种苗健壮，生产成本低，移栽成活率高等优势。

Description

一种规模化高效快速繁殖铁皮石斛试管苗的方法

技术领域

本发明属于植物的栽培技术领域，具体涉及一种繁殖铁皮石斛试管苗的方法。

背景技术

铁皮石斛是我国药典中记载的一种极为珍稀名贵中药材，素有“中华仙草”、“药中黄金”之美称，被国际药用植物界称为“药界大熊猫”，现已成为国家二级保护植物，随着野生资源的枯竭，而不断攀升的市场需求，促进了人工栽培产业的发展，而产业发展中优质种苗繁育环节越来越成为产业发展的瓶颈。现有的种苗快繁过程中，通常整个生产阶段采取了种子播种到固体培养基中，继代转接，壮苗生根等阶段，从播种到壮苗生根整个生产阶段完全由日光灯作为光源，导致生产周期长、种子萌发率低、种苗玻璃化及变异率大、能耗高，生产成本大、移栽成活率低等问题，试管苗整个生产阶段耗时长达8～10个月，成苗后还需要经历练苗阶段才能转移到大棚栽培种植。

发明内容

本发明所要解决的技术问题，是提供一种规模化高效快速繁殖铁皮石斛试管苗的方法。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：

一种规模化高效快速繁殖铁皮石斛试管苗的方法，该方法包括以下步骤：

(1)将铁皮石斛蒴果先用酒精浸泡45～60s，再放置于氯化汞水溶液中浸泡12～15min，再用无菌水反复漂洗3～4次，将消毒后的蒴果切开，取种子备用；

(2)将步骤(1)得到的铁皮石斛种子播种于液体培养基中，在22～25℃、转速120～150r/min、光照度300～1000勒克斯、光照时间11～13h/d的条件下，振荡培养50～60d，种子萌发形成原球茎并进一步形成小芽，取小芽备用；其中，所述的液体培养基组成为：6-苄基嘌呤0.2～0.4mg/L+萘乙酸0.1～0.3mg/L+土豆汁60～80g/L+蔗糖25～30g/L+1/4MS培养基+pH 5.4～5.6；通过液体振荡培养，种子萌发率可达90％以上。

(3)将步骤(2)得到的小芽置于壮苗培养基中，在25～28℃、光照度1000～2000勒克斯、光照时间11～13h/d的条件下培养2～2.5个月，小芽变成具有2～3片叶并带有1～2条幼根的小苗；其中，所述的壮苗培养基组成为：萘乙酸0.8～1.0mg/L+香蕉汁80～100g/L+蔗糖25～30g/L+改良的N₆培养基+琼脂4.5～6g/L+pH 5.6～5.8，所述改良的N₆培养基是将N₆培养基中的大量元素中KNO₃和(NH₄)₂SO₄的浓度分别调整为3000mg/L和200mg/L，其余的成分不变；通过改良原有的N₆基础培养基，更利于铁皮石斛幼苗的生长。

(4)将步骤(3)中得到的小苗转移到壮苗生根培养基中，并将组培瓶瓶口加封口膜，移至有外遮荫的大棚温室苗床上，温度控制在25～30℃，利用太阳光或自然光作为光源进行培养，培养2～3个月得到成苗；其中，所述的壮苗生根培养基组成为：奈乙酸1.0～1.5mg/L+香蕉汁80～100g/L+蔗糖25～30g/L+活性炭为0.5～0.8g/L+改良的N₆培养基+琼脂4.5-6g/L+pH 5.6～5.8，所述改良的N₆培养基是将N₆培养基中的大量元素中KNO₃和(NH₄)₂SO₄的浓度分别调整为3000mg/L和200mg/L，其余的成分不变；通过改良原有的N₆基础培养基，更利于铁皮石斛幼苗的生长。将组培苗的培养环境从相对洁净培养室中转移至有外遮荫的大棚温室条件下，利用太阳光或自然光作为光源，用湿水帘和风机降温，不仅符合低碳高效原则，而且也能促进种苗生长健壮，适应性强，省去了组培苗的练苗环节，大大提高了移栽后成活率，一般可达96％以上。

(5)将步骤(4)得到的成苗从瓶内取出用清水冲洗去除培养基后，用高锰酸钾溶液浸泡3～5s，晾干，待其根部泛白后，移栽到温室大棚内的栽培基质中，培养24～30个月，即可采收；所述的栽培基质为碎石子与碎松树皮按体积(1～1.5)∶(3～4.5)组成的混合物。

步骤(1)中，所述的酒精，体积百分浓度为体积百分浓度为70％～75％。

步骤(1)中，所述的氯化汞水溶液中，氯化汞的质量百分含量为0.1％～0.15％。

步骤(2)中，所述的液体培养基优选组成为：6-苄基嘌呤0.2mg/L+萘乙酸0.2mg/L+土豆汁80g/L+蔗糖25g/L+1/4MS培养基+pH 5.4

步骤(3)中，所述的壮苗培养基优选组成为：萘乙酸0.8mg/L+香蕉汁80g/L+蔗糖25g/L+改良的N₆培养基+琼脂5g/L+pH 5.6。

步骤(4)中，所述的壮苗生根培养基优选组成为：奈乙酸1.5mg/L+香蕉汁80g/L+蔗糖30g/L+活性炭为0.5g/L+改良的N₆培养基+琼脂5g/L+pH 5.8。

步骤(4)中，所述的封口膜为聚四氟乙烯(PTFE)细菌滤膜，封口膜层数为一层。加一层封口膜可以防止室外环境造成组培苗的污染。

步骤(5)中，高锰酸钾溶液的浓度为0.1～0.15g/L。

步骤(5)中，碎石子的粒径为1～3cm，碎松树皮的长和宽分别为1～3cm。

有益效果：本发明与现有技术相比，具有如下优点：

1、铁皮石斛蒴果消毒后，将种子播散到步骤(2)中的液体培养基中，进行液体振荡培养，与现有的种子萌发培养方式相比，该方法种子养分吸收更加充分，萌发时间大大缩短20～25d，并且萌发率高达90％以上，变异率小于1％，出芽整齐。

2、步骤(3)所述的壮苗培养基中，将N₆基础培养基进行改良，将其中的大量元素KNO₃和(NH₄)₂SO₄的浓度分别调整为3000mg/L和200mg/L，并配以适当的激素和天然添加物组合，与传统的壮苗培养基相比，该方法能更好更快的促进小芽的生长和生根，平均2～2.5个月，可得到3～5cm长的小苗。

3、步骤(4)中适当的调整生长素的浓度，添加少量的活性碳配成壮苗生根培养基，并将培养环境从室内移至温室大棚中，利用太阳光或自然光进行培养，能充分利用太阳光光谱广、光谱段能量分布均匀等优势促进小苗的生长，与常规的方法相比，该方法可以提高小苗的生长速度、健壮度，并减少能耗，成苗后，移栽适应性好，成活率高98％以上，是一种低碳高效的培养模式。

附图说明

图1为三种不同培养基处理种子萌发和生长情况。

图2为实施例3中处理①和处理④播种50天后得出的试验结果。

具体实施方式

根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的具体的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。

实施例1：

(1)在接种室超净工作台上，将未开裂的铁皮石斛蒴果，放置于广口瓶中，往瓶内倒入70％(v/v)酒精，浸泡50s左右，将酒精滤出，再用0.1％(w/w)的氯化汞水溶液浸泡约12～15min，浸泡过程中反复水平振荡，使蒴果表面消毒彻底，再用无菌水反复漂洗3～4次，将消毒后的蒴果切开，取种子备用。

(2)将铁皮石斛种子播种于1/4MS培养基+6-苄基嘌呤0.2mg/L+萘乙酸0.2mg/L+土豆汁80g/L+蔗糖25g/L，pH 5.4的液体培养基中；并放入恒温振荡培养箱中进行振荡培养，振荡培养箱培养条件设置为温度25℃、转速120～150r/min、光照度300～1000勒克斯、光照时间12h/d，振荡培养50～60d，种子萌发先形成原球茎并进一步形成带一片叶的小芽，取小芽备用。

(3)将得到的小芽转接到改良的N₆培养基+萘乙酸0.8mg/L+香蕉汁80g/L+蔗糖25g/L+琼脂5g/L，pH 5.6的壮苗培养基中；所述改良的N₆培养基是将N₆培养基中的大量元素中KNO₃和(NH₄)₂SO₄的浓度分别调整为3000mg/L和200mg/L，其余的成分不变，以下相同；培养室环境设置为温度25～28℃、光照度1000～1200勒克斯、光照时间12h/d的条件下，培养2～2.5个月，小芽变成具有2～3片叶并带有1～2条幼根的小苗。

(4)将得到的小苗转移到改良的N₆培养基+奈乙酸1.5mg/L+香蕉汁80g/L+蔗糖30g/L+活性炭为0.5g/L++琼脂5g/L+pH 5.8壮苗生根培养基中，并将组培瓶瓶口多加一层PTFE细菌滤膜，能有效的降低组培苗在温室大棚外界环境下污染的问题，移至有外遮荫的大棚温室苗床，温度控制在25～30℃，利用太阳光或自然光作为光源进行培养，培养2个月左右得到成苗。

(5)将得到的成苗从瓶内取出用清水冲洗去除培养基后，用0.1～0.15g/L高锰酸钾溶液浸泡3～5s，晾干，待其根部泛白后，移栽到温室大棚内的栽培基质中，即进入栽培种植环节，24～30个月，即可采收入药；上述的栽培基质为碎石子与碎松树皮按体积(1～1.5)∶(3～4.5)混匀而成。

实施例2：

除实施例1中步骤(2)种子播种于液体培养基振荡培养改为固体培养基萌发、步骤(5)温室大棚自然光和太阳光培养改为培养室日光灯培养外，其它同实施例1；步骤(2)、步骤(3)、步骤(4)中种子萌发、壮苗培养、壮苗生根培养三个阶段分别以表1所列培养基组合进行筛选，以优选最适培养基组合配方。表1说明：①培养基配方优化主要是设计不同的基础培养基、激素浓度、天然添加物、活性炭浓度等对培养基进行了优化设计，本实例中均设计成固体培养基，每种配方中琼脂浓度均为5g/L，蔗糖为25g/L，培养环境为温度25℃、光照度1000～2000勒克斯、光照时间12h/d培养室内。②针对生产，不同的培养阶段设计了三组培养基配方，种子播种阶段主要观察种子萌发的快慢、长势、颜色(翠绿为佳)、原球茎是否增殖(越少越好)等指标判断配方是否合理；壮苗培养阶段，主要通关观察苗的生长势、粗度、玻璃化程度(越低越好)、颜色以及整齐度等指标来判断配方的好坏；壮苗生根阶段，主要通关观察苗的健壮度、根系发达程度、苗的长势、颜色以及整齐度等指标来判断配方的好坏。通过观察和各项指标的测定，并用“★”和“☆”的多少代表配方的好坏，★越多表示越好，☆比★要低一个等次。

表1 培养基配方筛选

试验表明，种子萌发阶段(步骤二)20种配方组合中，基础培养基、激素及天然添加物组合范围为1/4MS+6-苄基嘌呤0.2～0.4mg/L+萘乙酸0.1～0.3mg/L+土豆汁60～80g/L培养基范围内，种子萌发率高，生长快，是较适宜的组合配方组合，种子播种后70d左右即可分化成小芽；壮苗阶段(步骤三)10种配方组合中，基础培养基、激素及天然添加物组合范围为改良的N₆培养基+萘乙酸0.8～1.0mg/L+香蕉汁80～100g/L培养基范围内，苗的生长势良好、健壮度高、玻璃化程度低，2～2.5个月，小芽即可长成具有2～3片叶并带有1～2条幼根的小苗，为较适宜的培养基组合；壮苗生根阶段(步骤四)，结果表明，改良的N₆培养基+奈乙酸1.0～1.5mg/L+香蕉汁80～100g/L+活性炭为0.5～0.8g/L为优选培养基配方组合。

在试验中还发现土豆对种子萌发有较好的促进作用，而香蕉不利用种子的萌发。但香蕉汁对芽后期的长势和健壮度作用更大，另外还发现，活性炭浓度低时，对幼苗生根和壮苗有很好的促进作用，而浓度达到一定的浓度后，反而会抑制苗的生长。

实施例3：

其它同实施例1，将步骤(1)得到的铁皮石斛种子分别播种于以下4种不同的培养基中：①1/4MS培养基+6-苄基嘌呤0.2mg/L+萘乙酸0.2mg/L+土豆汁80g/L+蔗糖25g/L+pH 5.4液体培养基；②1/4MS培养基+6-苄基嘌呤0.2mg/L+萘乙酸0.2mg/L+香蕉汁100g/L+蔗糖25g/L+pH 5.4液体培养基；③MS培养基+6-苄基嘌呤0.2mg/L+萘乙酸0.2mg/L+土豆汁80g/L+蔗糖25g/L+pH 5.4液体培养基；④1/4MS培养基+6-苄基嘌呤0.2mg/L+萘乙酸0.2mg/L+土豆汁80g/L+蔗糖25g/L+琼脂5.0g/L+pH 5.4固体培养基。液体培养基培养环境设置为温度25℃、转速120r/min、光照度1000勒克斯、光照时间12h/d的条件下，振荡培养，固体培养基培养环境设置为温度25℃、光照度1000勒克斯、光照时间12h/d。

比较上述四种配方种子萌发情况，液体培养基振荡培养与固体培养模式相比，种子萌发比后者快20～25d，整齐度更高，播种50天左右，种子萌发经过原球茎阶段并进一步形成1.2cm左右长度的小芽，出芽整齐，变异率低于1％，在相同的培养时间下，固体培养基仅形成了0.5cm直径的原球茎；另外高浓度的大量元素不利于种子萌发，且液体培养基中天然添加物为香蕉同样不利用种子萌发。图1三种不同培养基处理液体培养基中种子萌发和生长情况，从图中可知处理①长势最佳，图2为处理①和处理④播种50d后得出的试验结果，处理①50d后已长成带有1～2片叶的小芽，而处理④仍处于原球茎萌发状态。

实施例4：

其它同实施例1，将步骤(4)转接小苗后的组培瓶分别采取以下3种不同的培养环境：①将组培瓶瓶盖上加一层PTFE细菌滤膜，移至有外遮荫的大棚温室苗床上，通过湿帘和风机将温度控制在25～30℃，利用太阳光或自然光作为光源进行培养；②将组培瓶直接移至有外遮荫的大棚温室苗床上，通过湿帘和风机将温度控制在25～30℃，利用太阳光和自然光作为光源进行培养；③将组培瓶放置于培养室内，培养室环境设置为温度25～28℃、光照度1000～1200勒克斯、光照时间12h/d的条件下进行培养。

三种培养方式同时进行。结果在3种培养方式中①和②培养两个月左右，小苗可长成根系发达、叶片翠绿、健壮，长6～10cm的成苗，与③相比，具有明显的优势；污染率方面，由于外界条件复杂，因②没有添加封口膜，污染率达到50％以上，比①5％左右的污染率明显要高，三种培养模式中③的污染率最低，在2％以下。因③这种培养模式能耗高，生产成本大，而①添加了一层PTFE细菌滤膜，污染率也降到了很低的水平，同时因以太阳光和自然光为光源，成苗后，可直接移栽，不需经过练苗环节，成活率可高达98％以上，明显好于③这种传统的培养模式。

实施例5：

其它同实施例1，将得到的成苗从瓶内取出用清水冲洗去除培养基后，用0.1g/L高锰酸钾溶液浸泡5s左右，晾干，待其根部泛白后，移栽到温室大棚内的栽培基质中，即进入栽培种植环节，栽培基质为碎石子与碎松树皮按体积1∶3混匀而成，出苗后用低浓度的高锰酸钾浸泡既可以对苗进行消毒、同时为小苗补充了一定的养分，提高小苗的抗性，通过上述处理，小苗移栽成活率可达98％以上。

Claims

1.一种规模化高效快速繁殖铁皮石斛试管苗的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

(2)将步骤(1)得到的铁皮石斛种子播种于液体培养基中，在22～25℃、转速120～150r/min、光照度300～1000勒克斯、光照时间11～13h/d的条件下，振荡培养50～60d，种子萌发形成原球茎并进一步形成小芽，取小芽备用；其中，所述的液体培养基组成为：6-苄基嘌呤0.2～0.4mg/L+萘乙酸0.1～0.3mg/L+土豆汁60～80g/L+蔗糖25～30g/L+1/4MS培养基+pH 5.4～5.6；

(3)将步骤(2)得到的小芽置于壮苗培养基中，在25～28℃、光照度1000～2000勒克斯、光照时间11～13h/d的条件下培养2～2.5个月，小芽变成具有2～3片叶并带有1～2条幼根的小苗；其中，所述的壮苗培养基组成为：萘乙酸0.8～1.0mg/L+香蕉汁80～100g/L+蔗糖25～30g/L+改良的N₆培养基+琼脂4.5～6g/L+pH 5.6～5.8，所述改良的N₆培养基是将N₆培养基中的大量元素中KNO₃和(NH₄)₂SO₄的浓度分别调整为3000mg/L和200mg/L，其余的成分不变；

(4)将步骤(3)中得到的小苗转移到壮苗生根培养基中，并将组培瓶瓶口加封口膜，移至有外遮荫的大棚温室苗床上，温度控制在25～30℃，利用太阳光或自然光作为光源进行培养，培养2～3个月得到成苗；其中，所述的壮苗生根培养基组成为：奈乙酸1.0～1.5mg/L+香蕉汁80～100g/L+蔗糖25～30g/L+活性炭为0.5～0.8g/L+改良的N₆培养基+琼脂4.5-6g/L+pH 5.6～5.8，所述改良的N₆培养基是将N₆培养基中的大量元素中KNO₃和(NH₄)₂SO₄的浓度分别调整为3000mg/L和200mg/L，其余的成分不变；

2.根据权利要求1所述的规模化高效快速繁殖铁皮石斛试管苗的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的酒精，体积百分浓度为70％～75％。

3.根据权利要求1所述的规模化高效快速繁殖铁皮石斛试管苗的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的氯化汞水溶液中，氯化汞的质量百分含量为0.1％～0.15％。

4.根据权利要求1所述的规模化高效快速繁殖铁皮石斛试管苗的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述的液体培养基组成为：6-苄基嘌呤0.2mg/L+萘乙酸0.2mg/L+土豆汁80g/L+蔗糖25g/L+1/4MS培养基+pH 5.4。

5.根据权利要求1所述的规模化高效快速繁殖铁皮石斛试管苗的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述的壮苗培养基组成为：萘乙酸0.8mg/L+香蕉汁80g/L+蔗糖25g/L+改良的N₆培养基+琼脂5g/L+pH 5.6。

6.根据权利要求1所述的规模化高效快速繁殖铁皮石斛试管苗的方法，其特征在于，步骤(4)中，所述的壮苗生根培养基组成为：奈乙酸1.5mg/L+香蕉汁80g/L+蔗糖30g/L+活性炭为0.5g/L+改良的N₆培养基+琼脂5g/L+pH 5.8。

7.根据权利要求1所述的规模化高效快速繁殖铁皮石斛试管苗的方法，其特征在于，步骤(4)中，所述的封口膜为聚四氟乙烯细菌滤膜，封口膜层数为一层。

8.根据权利要求1所述的规模化高效快速繁殖铁皮石斛试管苗的方法，其特征在于，步骤(5)中，高锰酸钾溶液的浓度为0.1～0.15g/L。

9.根据权利要求1所述的规模化高效快速繁殖铁皮石斛试管苗的方法，其特征在于，步骤(5)中，碎石子的粒径为1～3cm，碎松树皮的长和宽分别为1～3cm。