CN102293769A - 9-甲基反式链霉戊二酰亚胺抗炎作用的新用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及9-甲基反式链霉戊二酰亚胺抗炎作用的新用途。具体地，本发明涉及以下式I化合物在制备治疗和/或预防炎性疾病或免疫相关疾病及其并发症的药物中的用途。本发明发现，9-甲基反式链霉戊二酰亚胺(S632A3)能显著下调小鼠巨噬细胞中糖原合成酶激酶-3β活性和核转录因子NF-κB的转录活性，能抑制小鼠巨噬细胞中LPS刺激的促炎性细胞因子TNF-α、IL-6等的释放，可增加抗炎性细胞因子IL-10的释放，并抑制炎症介导分子NO和PGE₂的分泌，以及COX-2和iNOS蛋白的表达，此外还可抑制巨噬细胞的增殖，具有明显的抗炎作用，有望将其开发成为防治炎性疾病或免疫相关疾病及其并发症的药物。

Description

9-甲基反式链霉戊二酰亚胺抗炎作用的新用途

技术领域

本发明属于医药技术领域，涉及从由吸水链霉菌S632(Streptomyces hygroscopicus S632)培养并提纯所得到的9-甲基反式链霉戊二酰亚胺(S632A3)用作抗炎的新用途，具体而言，涉及S632A3在制备治疗炎性疾病或免疫相关疾病及其并发症药物中的应用。

背景技术

炎症是机体组织对内外环境的有害刺激所产生的一种复杂的生理和病理反应。它既是一种保护性防御反应，同时也是引起人体多种重要疾病的主要原因之一。炎症在人体感染、肿瘤、心脑血管病、老年痴呆和神经退行性疾病、变态反应疾病等许多重大疾病的发生和发展过程中占有十分重要的地位，它是本发明人防治人类重大疾病的一个最基本、最重要的依据。

巨噬细胞在抗感染、抗肿瘤免疫等疾病中发挥关键的免疫激活和免疫效应作用。当病原体入侵或自身组织出现病理性改变时，组织内的巨噬细胞激活后既可以通过直接吞噬作用清除外来病原微生物，也能够释放多种炎症介质，如肿瘤坏死因子-α于(TNF-α)、白介素-1β(IL-1β)、白介素-6(IL-6)和一氧化氮(NO)、前列腺素E₂(PGE₂)，诱发炎症反应而达到清除病原体、控制疾病的目的。然而，在某些病原体的感染或机体出现病理性改变时，巨噬细胞功能失调可引起机体出现全身性急性炎症反应以及慢性炎症反应。因此，控制巨噬细胞的炎症作用是有效清除病原体、妥善控制炎症反应和减少组织损伤的关键环节。

脂多糖(LPS)为含糖和脂质的化合物，是革兰氏阴性细菌外璧层中特有的一种化学成分，它通过诱导体内单核/巨噬细胞合成并释放多种炎症介质进而参与免疫炎症反应，是一种典型的炎症刺激物。LPS活化巨噬细胞后，通过激活核转录因子NF-κB，上调促炎性因子的转录活性而诱导炎症反应的发生。糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)是一种多功能的丝氨酸/苏氨酸激酶，存在于所有的真核细胞中。新近的研究表明，GSK-3β直接参与炎症反应的发生，对巨噬细胞Toll样受体(TLR)信号通路起重要的调控作用。GSK-3β的促炎性作用可能与其促进NF-κB通路的激活有关。抑制巨噬细胞中GSK-3β活性后，NF-κB的转录活性受到抑制，炎性分子如NO和PGE₂的生成也减少。因此，GSK-3β抑制剂可以抑制巨噬细胞中各种炎性分子的分泌，用于炎症相关疾病的的治疗。

现在已知微生物产物可产生具有广泛结构特征和具有抗炎等药理活性的多种物质。9-甲基反式链霉戊二酰亚胺(S632A3)是由链霉菌S632产生的一种具有多种生物学活性的戊二酰亚胺类化合物。研究表明，抗生素S632A3具有抗真菌、抗原虫、抗病毒、抗肿瘤等多种药理活性。但是尚未发现抗生素S632A3的其它应用领域。

人们仍然期待有治疗炎症例如治疗急性炎症和治疗慢性炎症的新方法。

发明内容

本发明的目的是提供治疗炎症例如治疗急性炎症和治疗慢性炎症的新方法。特别地，本发明的目的是提供以下式I化合物(9-甲基反式链霉戊二酰亚胺(S632A3))抗炎作用的新用途：

具体而言，是提供式I化合物在制备治疗炎性疾病或免疫相关疾病及其并发症药物中的应用。本发明人令人惊奇地发现，具有抗真菌、抗原虫、抗病毒、抗肿瘤等多种药理活性的式I化合物具有有效的抗炎作用。本发明基于上述发现而得以完成。

为此，本发明第一方面提供了式I化合物在制备治疗和/或预防炎性疾病或免疫相关疾病及其并发症的药物中的用途。

根据本发明第一方面任一项的用途，其中所述炎性疾病或免疫相关疾病及其并发症选自关节炎(如风湿性关节炎、风湿性脊椎炎、痛风关节炎、外伤关节炎、风疹关节炎、牛皮癣关节炎、骨关节炎和其它关节炎疾病)、急性滑膜炎、肺部炎性疾病及其并发症(如哮喘、急性呼吸性窘迫综合征、慢性障碍性肺疾病、硅肺病、肺部肉状瘤病等)、移植物抗宿主反应、移植物抗宿主疾病(GVHD)、同种异体移植物排异和麻疯病。

根据本发明第一方面任一项的用途，其中所述炎性疾病或免疫相关疾病及其并发症选自风湿性关节炎、哮喘、炎性肠病、牛皮癣、鳞皮关节炎、慢性阻塞性肺病(COPD)、多发性硬化症(MS)，以及与NF-κB、TNF-α及其中GSK-3β被公知调节其活性的其他途径酶的活性相关的疾病(如阿尔兹海默病、动脉粥样硬化病、2型糖尿病等)。

根据本发明第一方面任一项的用途，其中所述炎性疾病选自急性炎症性疾病、慢性炎症性疾病、及其组合。

根据本发明第一方面任一项的用途，其中所述药物给予受试者(例如哺乳动物，如人)的每日剂量以式I化合物计为0.001～1000mg/kg体重、0.01～100mg/kg体重、0.01～75mg/kg体重、0.01～50mg/kg体重、0.02～20mg/kg体重、或0.1～20mg/kg体重。

由于本发明所述式I化合物可抑制巨噬细胞分泌促炎性细胞因子(例如TNF-α、IL-6)，作为促炎性细胞因子的抑制剂，因此本发明还提供了式I化合物在制备用于体内和/或体外抑制促炎性细胞因子的药物中的用途；由于本发明所述式I化合物可刺激巨噬细胞分泌抗炎性细胞因子(例如IL-10)，作为抗炎性细胞因子的促进剂，因此本发明还提供了式I化合物在制备用于体内和/或体外促进抗炎性细胞因子分泌的药物中的用途；由于本发明所述式I化合物可抑制巨噬细胞分泌炎症介导分子(例如NO和PGE₂)，作为炎症介导分子的抑制剂，因此本发明还提供了式I化合物在制备用于体内和/或体外抑制炎症介导分子的药物中的用途；由于本发明所述式I化合物可抑制炎症反应相关蛋白(例如环氧化酶-2(COX-2)和一氧化氮合成酶(iNOS))的表达，作为炎症反应相关蛋白的抑制剂，因此本发明还提供了式I化合物在制备用于体内和/或体外抑制炎症反应相关蛋白的药物中的用途；由于本发明所述式I化合物可抑制核转录因子(例如核转录因子NF-κB)的转录活性，作为核转录因子转录活性的抑制剂，因此本发明还提供了式I化合物在制备用于体内和/或体外抑制核转录因子转录活性的药物中的用途；由于本发明所述式I化合物可抑制糖原合成酶激酶(例如糖原合成酶激酶-3β)的活性，作为糖原合成酶激酶的抑制剂，因此本发明还提供了式I化合物在制备用于体内和/或体外抑制糖原合成酶激酶活性的药物中的用途；由于本发明所述式I化合物可抑制巨噬细胞(例如RAW264.7细胞)的增殖，作为巨噬细胞增殖的抑制剂，因此本发明还提供了式I化合物在制备用于体内和/或体外抑制巨噬细胞增殖的药物中的用途。由此，本发明第一方面还提供了式I化合物在制备药物中的用途，所述药物用于：在体内和/或体外抑制促炎性细胞因子；在体内和/或体外促进抗炎性细胞因子分泌；在体内和/或体外抑制炎症介导分子；在体内和/或体外抑制炎症反应相关蛋白；在体内和/或体外抑制核转录因子转录活性；在体内和/或体外抑制糖原合成酶激酶活性；和/或在体内和/或体外抑制巨噬细胞增殖。

本发明第二方面提供了用于治疗和/或预防炎性疾病或免疫相关疾病及其并发症的药物组合物，其中包含有效量的式I化合物和任选的药学可接受的载体或赋形剂。

根据本发明第二方面任一项的药物组合物，其中所述炎性疾病或免疫相关疾病及其并发症选自关节炎(如风湿性关节炎、风湿性脊椎炎、痛风关节炎、外伤关节炎、风疹关节炎、牛皮癣关节炎、骨关节炎和其它关节炎疾病)、急性滑膜炎、肺部炎性疾病及其并发症(如哮喘、急性呼吸性窘迫综合征、慢性障碍性肺疾病、硅肺病、肺部肉状瘤病等)、移植物抗宿主反应、移植物抗宿主疾病(GVHD)、同种异体移植物排异和麻疯病。

根据本发明第二方面任一项的药物组合物，其中所述炎性疾病或免疫相关疾病及其并发症选自风湿性关节炎、哮喘、炎性肠病、牛皮癣、鳞皮关节炎、慢性阻塞性肺病(COPD)、多发性硬化症(MS)，以及与NF-κB、TNF-α及其中GSK-3β被公知调节其活性的其他途径酶的活性相关的疾病(如阿尔兹海默病、动脉粥样硬化病、2型糖尿病等)。

根据本发明第二方面任一项的药物组合物，其中所述炎性疾病选自急性炎症性疾病、慢性炎症性疾病、及其组合。

根据本发明第二方面任一项的药物组合物，其中所述药物组合物给予受试者(例如哺乳动物，如人)的每日剂量以式I化合物计为0.001～1000mg/kg体重、0.01～100mg/kg体重、0.01～75mg/kg体重、0.01～50mg/kg体重、0.02～20mg/kg体重、或0.1～20mg/kg体重。

本发明第二方面还提供了一种药物组合物，其中包含有效量的式I化合物和任选的药学可接受的载体或赋形剂，所述药物组合物用于：在体内和/或体外抑制促炎性细胞因子；在体内和/或体外促进抗炎性细胞因子分泌；在体内和/或体外抑制炎症介导分子；在体内和/或体外抑制炎症反应相关蛋白；在体内和/或体外抑制核转录因子转录活性；在体内和/或体外抑制糖原合成酶激酶活性；和/或在体内和/或体外抑制巨噬细胞增殖。

根据本发明第二方面任一项的药物组合物，其是以单位剂量的形式提供的。在一个实施方案中，所述作为单位剂量形式的药物组合物是片剂、包衣片剂、胶囊剂、丸剂、口服液、缓释片剂、或缓释胶囊剂。在一个实施方案中，所述单位剂量形式中包含式I化合物的量为0.01～1000mg、0.1～750mg、0.1～500mg、0.5～500mg、1～500mg、10～500mg、或10～250mg。

本发明第三方面提供了一种药盒产品，其中包括药物组合物和使用说明书，其中：

所述药物组合物包含预防和/或治疗有效量的式I化合物，以及任选的药学可接受的载体或赋形剂；

所述使用说明书记载了使用所述药物组合物以治疗和/或预防炎性疾病或免疫相关疾病及其并发症的信息。

根据本发明第三方面任一项的药盒产品，其中所述炎性疾病或免疫相关疾病及其并发症选自关节炎(如风湿性关节炎、风湿性脊椎炎、痛风关节炎、外伤关节炎、风疹关节炎、牛皮癣关节炎、骨关节炎和其它关节炎疾病)、急性滑膜炎、肺部炎性疾病及其并发症(如哮喘、急性呼吸性窘迫综合征、慢性障碍性肺疾病、硅肺病、肺部肉状瘤病等)、移植物抗宿主反应、移植物抗宿主疾病(GVHD)、同种异体移植物排异和麻疯病。

根据本发明第三方面任一项的药盒产品，其中所述炎性疾病或免疫相关疾病及其并发症选自风湿性关节炎、哮喘、炎性肠病、牛皮癣、鳞皮关节炎、慢性阻塞性肺病(COPD)、多发性硬化症(MS)，以及与NF-κB、TNF-α及其中GSK-3β被公知调节其活性的其他途径酶的活性相关的疾病(如阿尔兹海默病、动脉粥样硬化病、2型糖尿病等)。

根据本发明第三方面任一项的药盒产品，其中所述炎性疾病选自急性炎症性疾病、慢性炎症性疾病、及其组合。

根据本发明第三方面任一项的药盒产品，其中所述药物组合物是以单位剂量的形式提供的。在一个实施方案中，所述单位剂量形式是片剂、包衣片剂、胶囊剂、丸剂、口服液、缓释片剂、或缓释胶囊剂。在一个实施方案中，所述单位剂量形式中包含式I化合物的量为0.01～1000mg、0.1～750mg、0.1～500mg、0.5～500mg、1～500mg、10～500mg、或10～250mg。

根据本发明第三方面任一项的药盒产品，其中所述使用说明书的信息包括受试者使用所述药物组合物治疗和/或预防炎性疾病或免疫相关疾病及其并发症时的每日剂量以式I化合物计为0.001～1000mg/kg体重、0.01～100mg/kg体重、0.01～75mg/kg体重、0.01～50mg/kg体重、0.02～20mg/kg体重、或0.1～20mg/kg体重。

本发明第三方面还提供了一种药盒产品，其中包括药物组合物和使用说明书，其中：

所述药物组合物包含预防和/或治疗有效量的式I化合物，以及任选的药学可接受的载体或赋形剂；

所述使用说明书记载了所述药物组合物使用的信息，所述药物组合物用于：在体内和/或体外抑制促炎性细胞因子；在体内和/或体外促进抗炎性细胞因子分泌；在体内和/或体外抑制炎症介导分子；在体内和/或体外抑制炎症反应相关蛋白；在体内和/或体外抑制核转录因子转录活性；在体内和/或体外抑制糖原合成酶激酶活性；和/或在体内和/或体外抑制巨噬细胞增殖。

本发明第四方面提供了治疗和/或预防炎性疾病或免疫相关疾病及其并发症的方法，其包括给有需要的受试者施用有效量的式I化合物。

本发明第四方面还提供了一种方法，该方法是在体内和/或体外抑制促炎性细胞因子；在体内和/或体外促进抗炎性细胞因子分泌；在体内和/或体外抑制炎症介导分子；在体内和/或体外抑制炎症反应相关蛋白；在体内和/或体外抑制核转录因子转录活性；在体内和/或体外抑制糖原合成酶激酶活性；和/或在体内和/或体外抑制巨噬细胞增殖，所述方法包括给有需要的受试者施用有效量的式I化合物。

根据本发明第四方面任一项的方法，其中所述炎性疾病或免疫相关疾病及其并发症选自关节炎(如风湿性关节炎、风湿性脊椎炎、痛风关节炎、外伤关节炎、风疹关节炎、牛皮癣关节炎、骨关节炎和其它关节炎疾病)、急性滑膜炎、肺部炎性疾病及其并发症(如哮喘、急性呼吸性窘迫综合征、慢性障碍性肺疾病、硅肺病、肺部肉状瘤病等)、移植物抗宿主反应、移植物抗宿主疾病(GVHD)、同种异体移植物排异和麻疯病。

根据本发明第四方面任一项的方法，其中所述炎性疾病或免疫相关疾病及其并发症选自风湿性关节炎、哮喘、炎性肠病、牛皮癣、鳞皮关节炎、慢性阻塞性肺病(COPD)、多发性硬化症(MS)，以及与NF-κB、TNF-α及其中GSK-3β被公知调节其活性的其他途径酶的活性相关的疾病(如阿尔兹海默病、动脉粥样硬化病、2型糖尿病等)。

根据本发明第四方面任一项的方法，其中所述炎性疾病选自急性炎症性疾病、慢性炎症性疾病、及其组合。

根据本发明第四方面任一项的方法，其中所述式I化合物给予受试者(例如哺乳动物，如人)的每日有效剂量以式I化合物计为0.001～1000mg/kg体重、0.01～100mg/kg体重、0.01～75mg/kg体重、0.01～50mg/kg体重、0.02～20mg/kg体重、或0.1～20mg/kg体重。

本发明任一方面或该任一方面的任一实施方案所具有的特征同样适用于其它任一方面或该其它任一方面的任一实施方案，只要它们不会相互矛盾，当然在相互之间适用时，必要的话可对相应特征作适当修饰。在本发明中，例如，提及“本发明第一方面任一项”时，该“任一项”是指本发明第一方面的任一子方面；在其它方面以类似方式提及时，亦具有相同含义。此外，本发明任一方面的任一技术特征同样适用于其它任一方面的相应技术特征。

下面对本发明的各个方面和特点作进一步的描述。

本发明所引述的所有文献，它们的全部内容通过引用并入本文，并且如果这些文献所表达的含义与本发明不一致时，以本发明的表述为准。此外，本发明使用的各种术语和短语具有本领域技术人员公知的一般含义，即便如此，本发明仍然希望在此对这些术语和短语作更详尽的说明和解释，提及的术语和短语如有与公知含义不一致的，以本发明所表述的含义为准。

本发明涉及从链霉菌S632中分离得到的9-甲基反式链霉戊二酰亚胺(S632A3)，用于制备抗炎药物的用途。经实验表明，所述9-甲基反式链霉戊二酰亚胺(S632A3)可抑制脂多糖(LPS)诱导的小鼠巨噬细胞的炎症反应。该化合物可显著下调小鼠巨噬细胞中糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)活性和核转录因子NF-κB的转录活性，能抑制小鼠巨噬细胞中LPS刺激的促炎性细胞因子TNF-α、IL-6等的释放，可增加抗炎性细胞因子IL-10的释放，并抑制炎症介导分子NO和PGE₂的分泌，以及COX-2和iNOS蛋白的表达，此外还能抑制巨噬细胞的增殖，具有明显抑制炎症反应的作用。因此，该化合物具有抗炎活性，可用于制备防治炎性疾病或免疫相关疾病及其并发症的药物。

如本文所述的，术语“有效量”是指可在受试者中实现治疗和/或预防炎性疾病或免疫相关疾病及其并发症的剂量，或者是一种这样的有效剂量，该有效剂量可以用于：在体内和/或体外抑制促炎性细胞因子；在体内和/或体外促进抗炎性细胞因子分泌；在体内和/或体外抑制炎症介导分子；在体内和/或体外抑制炎症反应相关蛋白；在体内和/或体外抑制核转录因子转录活性；在体内和/或体外抑制糖原合成酶激酶活性；和/或在体内和/或体外抑制巨噬细胞增殖。

如本文所述的，术语“药物组合物”，其可与“组合物”互换使用，其中包含活性成分式I化合物以及任选的药学可接受的载体或赋形剂。

如本文所述的，术语“受试者”，亦可指“患者”、服用该药物的“使用者”等，可以指接受本发明药物或组合物以治疗和/或预防炎性疾病或免疫相关疾病及其并发症的动物，特别是哺乳动物，例如人、狗、猴、牛、马等。

在本文中提及，式I化合物可以用于“在体内和/或体外抑制促炎性细胞因子；在体内和/或体外促进抗炎性细胞因子分泌；在体内和/或体外抑制炎症介导分子；在体内和/或体外抑制炎症反应相关蛋白；在体内和/或体外抑制核转录因子转录活性；在体内和/或体外抑制糖原合成酶激酶活性；和/或在体内和/或体外抑制巨噬细胞增殖”，本领域技术人员理解，上述在体外的抑制、促进等，例如可以是进行相关的药物研究、检测、筛选等操作以及为相应处理对象例如细胞、组织、器官、系统甚至动物体进行有目的的操作；上述在体内的抑制、促进等，例如可以是对动物例如人等进行的相关对该动物健康有益的操作。

在本发明中，式I化合物还可以使用其药物可接受的盐，因此式I化合物的药物可接受的盐同样亦包含在本发明的精神和范围内。术语“药物可接受的盐”指在可靠的医学判断范围内，适合用于与人类和低等动物的组织接触而不出现过度的毒性、刺激、过敏反应等，且与合理的效果/风险比相称的盐。药物可接受的盐是本领域公知的。例如，S.M.Berge等在J.Pharmaceutical Sciences，1977，66：1中对药物可接受的盐进行了详细描述。根据本发明，其中所述式I化合物可以以其药学可接受的盐使用。虽然本发明仅通过式I化合物进行试验，但是本领域技术人员理解，根据本发明可以预期式I化合物的药物可接受的盐亦同样是有效的，当然，在确定给药剂量时可以通过克分子量进行换算，以便大致确定作为盐型使用的剂量。

根据本发明，术语“使用说明书”，例如在本发明所述药盒产品中的“使用说明书”，其是用于指导医生或使用者如何按照本发明使用式I化合物，该使用说明书可以是插页的形式，亦可以是小册子的形式，还可以是直接印刷或粘贴在该药盒外面的形式，或者是其它形式。本领域技术人员理解，所述使用说明书并非一定要以实物的形式提供，只要它可以提供本发明所述关于治疗和/或预防炎性疾病或免疫相关疾病及其并发症的信息即可。

根据本发明，术语“单位剂量的形式”或“单位剂量形式”，例如是指单个药片、单个胶囊剂等，该单位剂量形式可以提供例如1/3、1/2、1或2个日剂量。例如对于片剂，其一片中可以含有一天用的日剂量，此种情况是优选的；此外，一个片剂中还可以含有2天用的日剂量，以其可以例如在片剂中间划一刻痕以便于使用者将该片剂分成两半，对于体重较重者对药物耐受者可以一天使用一片，而对于半片剂量即有效的使用者可以每天使用半片。

根据本发明，术语“有效量”，或者“有效剂量”，或者可称为“预防和/治疗或有效量”，可以理解为本发明所述式I化合物以适用于任何医学治疗的合理效果/风险比治疗疾病/病症的足够量。但应认识到，本发明式I化合物的总日用量可以由本领域技术人员在可靠的医学判断范围内作出决定。对于任何具体的受试者，具体的预防有效剂量水平须根据多种因素而定，所述因素包括受试者的年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食；所采用的具体组合物；与式I化合物组合使用或同时使用的药物；及医疗领域公知的类似因素。

根据本发明任一方面的一个实施方案，所述式I化合物给予受试者(例如哺乳动物，如人)的每日剂量为该药物已知用于治疗疾病的剂量的0.001～1000倍，优选0.01～100倍，优选0.1～10倍，优选0.2～5倍。确切的剂量会受一些因素的影响，例如待治疗病症的严重程度和变化过程，待治疗病症的患者分布及临床医生的判断。特定情况下的适当剂量形式的确定是由本领域技术人员进行的。本发明式I化合物或其可药用盐的给药剂量和频率将由临床医生根据上述因素以及其它一些本领域技术人员公知的因素来调节。有经验的技工进行比上述剂量或高或低的调节也是需要的。

本发明还提供包含与一种或多种无毒药物可接受载体配制在一起的式I化合物的药物组合物。所述药物组合物可特别专门配制成以固体或液体形式供口服给药或供直肠给药。

供口服给药的固体剂型包括但不限于胶囊剂、片剂、丸剂、散剂和颗粒剂。在此类固体剂型中，活性化合物可与至少一种惰性的药物可接受赋形剂或载体如柠檬酸钠或磷酸二钙和/或以下物质混合：a)填充剂或增量剂如淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露糖醇和硅酸；b)粘合剂如羧甲基纤维素、海藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯树胶；c)保湿剂如甘油；d)崩解剂如琼脂、碳酸钙、马铃薯或木薯淀粉、海藻酸、某些硅酸盐和碳酸钠；e)溶液阻滞剂如石蜡；f)吸收加速剂如季铵化合物；g)湿润剂如鲸蜡醇和甘油单硬脂酸酯；h)吸附剂如高岭土和膨润土以及i)润滑剂如滑石粉、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、十二烷基硫酸钠和它们的混合物。在胶囊剂、片剂和丸剂的情况下，所述剂型中也可包含缓冲剂。

供口服给药的液体剂型包括药物可接受的乳剂、溶液剂、混悬剂、糖浆剂和酏剂。液体剂型除含有活性化合物外还可含有本领域常用的惰性稀释剂，例如水或其他溶剂，增溶剂和乳化剂例如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苄醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1，3-丁二醇、二甲基甲酰胺、油类(特别是棉籽油、花生油、玉米油、胚芽油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油)、甘油、四氢呋喃醇、聚乙二醇和脱水山梨糖醇的脂肪酸酯及它们的混合物。

本发明化合物被理解为能够提供许多疾病、症状和不适的有效治疗，特别是那些炎性或本质上免疫相关的疾病，包括给药期间合理时间的发作及给药后的合理时间间隔。尽管食物、饮食、已有的情况、酒精及其它系统情况可延长给药后本发明药物的延时，但应当理解为优化的剂量形式可在合理的时间内获得有效的药物治疗效果。

在本发明中，术语“炎性疾病”，亦可称为“炎症性疾病”、“炎症(inflammation)”等，它们可互换使用，通常是指机体对各种物理、化学、生物等有害刺激所产生的一种以防御为主的病理反应。炎症是十分常见而又重要的基本病理过程，体表的外伤感染和各器官的大部分常见病和多发病(如疖、痈、肺炎、肝炎、肾炎等)都属于炎症性疾病。具有血管系统的活体组织对损伤因子的防御性反应称为炎症。血管反应是炎症过程的中心环节。任何能够引起组织损伤的因素都可成为炎症的原因，即致炎因子(inflammatory agent)。可归纳为以下几类：(一)生物性因子：细菌、病毒、立克次体、支原体、真菌、螺旋体和寄生虫等为炎症最常见的原因。由生物病原体引起的炎症又称感染(infection)。细菌产生的外毒素和内毒素可以直接损伤组织；病毒在被感染的细胞内复制导致细胞坏死；某些具有抗原性的病原体感染后通过诱发的免疫反应而损伤组织，如寄生虫感染和结核。(二)物理性因子：高温、低温、放射性物质及紫外线等和机械损伤。(三)化学性因子：外源性化学物质如强酸、强碱及松节油、芥子气等。内源性毒性物质如坏死组织的分解产物及在某些病理条件下堆积于体内的代谢产物如尿素等。(四)异物：通过各种途径进入人体的异物，如各种金属、木材碎屑、尘埃颗粒、及手术缝线等，由于其抗原性不同，可引起不同程度的炎症反应。(五)坏死组织：缺血或缺氧等原因可引起组织坏死，组织坏死是潜在的致炎因子。在新鲜梗死灶边缘所出现的充血出血带和炎性细胞的浸润都是炎症的表现。(六)变态反应：当机体免疫反应状态异常时，可引起不适当或过度的免疫反应，造成组织和细胞损伤而导致炎症。免疫反应所造成的组织损伤最常见于各种类型的超敏反应：I型变态反应如过敏性鼻炎、荨麻疹，II型变态反应如抗基底膜性肾小球肾炎，III型变态反应如免疫复合物沉着所致的肾小球肾炎，IV型变态反应如结核、伤寒等；另外，还有许多自身免疫性疾病如淋巴细胞性甲状腺炎、溃疡性结肠炎等。炎症的基本病理变化通常概括为局部组织的变质、渗出和增生，从炎症的主要的组织变化可分类如下：(1)变质性炎症。(2)渗出性炎症(浆液性炎、纤维素性炎、化脓性炎、出血性炎、坏死性炎、卡他性炎)。(3)增生性炎症。(4)特异性炎症(结核、梅毒、麻疯、淋巴肉芽肿等)。

在本发明中，术语“炎性疾病”包括但不限于，(1)妇科炎症例如(a)盆腔炎，如急性盆腔炎，其并发症如下腹隐痛、肌肉紧张、有压痛及反跳痛，伴有心率快、发热、阴道有大量脓性分泌物；慢性盆腔炎，其并发症如下腹部坠胀、疼痛及腰骶部酸痛，由于慢性炎症而导致盆腔瘀血、月经过多等等；(b)阴道炎，如霉菌性阴道炎、滴虫性阴道炎、细菌性阴道炎，以及它们的并发症如白带增多、尿频、尿急、尿痛、瘙痒等等；(c)宫颈炎；(2)消化道炎性疾病例如胃炎、肠炎，例如急性肠炎和慢性肠炎；(3)全身性炎性疾病例如慢性全身性炎性疾病如类风湿性关节炎、慢性溃疡性结肠炎；等等。

考虑到药理学性能，本发明化合物适用于预防和治疗与炎症有关的任何疾病、不适和/或症状。所述疾病包括，如关节发炎(如风湿性关节炎(RA)、风湿性脊椎炎、痛风关节炎、外伤关节炎、风疹关节炎、牛皮癣关节炎、骨关节炎和其它关节炎疾病)、急性滑膜炎、肺部炎性疾病及其并发症(如哮喘、急性呼吸性窘迫综合征、慢性障碍性肺疾病、硅肺病、肺部肉状瘤病等)、移植物抗宿主反应、移植物抗宿主疾病(GVHD)、同种异体移植物排异和麻疯病。

式I化合物特别适用于治疗炎性和免疫相关的疾病、不适和症状，更特别是炎性疾病类，如RA、哮喘、IBD、牛皮癣、COPD和MS。本发明欣赏将本发明化合物用于治疗与NF-κB、TNF-α及其中GSK-3β被公知调节其活性的其他途径酶的活性相关的疾病(如阿尔兹海默病、动脉粥样硬化病、2型糖尿病等)、不适或症状。

本发明化合物也可用于治疗与骨相关的疾病、症状或不适，其中存在着由于新的骨生成降低或骨的再吸收增强或者这两种情况共存而引起的骨不足或缺乏。特别的实例包括：骨质疏松症、牙周疾病、骨髓炎、风湿性关节炎、无菌关节松动和骨质溶解损伤(典型相关癌症)。人们已经公知，以关节发炎为特征的风湿性关节炎还与软骨和骨的破坏有关。

在本发明一个实施方案中，本发明提供了在需要治疗的患者中治疗或预防炎性或免疫相关生理学不适、症状或疾病的方法，该方法包括对患者给用适量式I化合物，其用量可有效治疗或预防炎性或免疫相关生理学不适、症状或疾病。优选地，炎性疾病、不适或症状为风湿性关节炎、哮喘、牛皮癣、鳞皮关节炎、慢性障碍性肺疾病(COPD)、炎性肠疾病或多发性硬化症。

在本发明中，提及式I化合物，意即具有下式I的化合物：

其在本发明中亦可称为9-甲基反式链霉戊二酰亚胺或者S632A3。

本发明所涉及9-甲基反式链霉戊二酰亚胺(S632A3)在抗炎方面的作用与功效，迄今尚未见有相关的报道。

本发明系参照三步层析分离法工艺(公开号：CN1362407A)制备了9-甲基反式链霉戊二酰亚胺(S632A3)，提供了9-甲基反式链霉戊二酰亚胺(S632A3)抗炎作用的系列生物学实验研究，进而提供了S632A3抗炎作用的新用途。具体生物学实验包括以下方面：

1.S632A3对细菌脂多糖(LPS)诱导的巨噬细胞分泌促炎性和抗炎性细胞因子的影响

在小鼠RAW264.7巨噬细胞中，本发明人用LPS作为一种炎症刺激物检测S632A3的抗炎作用。实验结果表明，5μg/ml和10μg/ml浓度的S632A3能使LPS诱导的RAW264.7细胞分泌促炎性细胞因子TNF-α、IL-6的水平显著性下降(p＜0.01)，而2.5μg/ml、5μg/ml和10μg/ml浓度的S632A3能使LPS刺激的RAW264.7细胞分泌抗炎性细胞因子IL-10的水平显著性升高(p＜0.01)，说明S632A3可抑制巨噬细胞产生促炎性细胞因子，促进其产生抗炎性因子，对炎症反应有抑制作用。

2.S632A3抑制LPS诱导的巨噬细胞中一氧化氮(NO)和前列腺素E₂(PGE₂)的产生

LPS诱导巨噬细胞活化后，除产生多种细胞因子外，还分泌NO和PGE₂等炎症介导分子，促进机体炎症反应的发生。为了观察S632A3对LPS诱导的巨噬细胞分泌炎症介导分子是否有影响，本发明人检测了不同浓度S632A3(2.5μg/ml，5μg/ml，10μg/ml)处理小鼠巨噬细胞后，用LPS刺激的RAW264.7细胞培养上清中NO和PGE₂的浓度变化。实验结果表明，LPS刺激24小时后巨噬细胞分泌NO和PGE₂水平明显升高，而5μg/ml和10μg/ml浓度的S632A3能显著抑制LPS刺激后小鼠巨噬细胞中NO和PGE₂的分泌(p＜0.01)。说明S632A3不仅可抑制LPS诱导的巨噬细胞分泌促炎细胞因子TNF-α、IL-6，对其分泌的炎症介导分子NO和PGE₂也具有抑制作用，具有明显的抗炎活性。

3.S632A3抑制LPS诱导的巨噬细胞中环氧化酶-2(COX-2)和一氧化氮合成酶(iNOS)的表达

为进一步观察S632A3对炎症反应的抑制作用，本发明人用western免疫印记方法检测了不同浓度的S632A3(2.5μg/ml，5μg/ml，10μg/ml)作用巨噬细胞后，两种与炎症反应密切相关的蛋白COX-2和iNOS的变化情况。实验结果表明，当LPS刺激24时后，COX-2和iNOS的表达量明显上升，而用5μg/ml和10μg/ml两个浓度的S632A3预处理巨噬细胞，再用LPS刺激24小时后，COX-2和iNOS的表达量被显著抑制。说明S632A3可通过下调COX-2和iNOS的表达而发挥其抗炎作用。

4.S632A3对RAW264.7细胞NF-κB转录活性的影响

LPS活化巨噬细胞后，可激活NF-κB信号通路，使NF-κB转位进入细胞核内，诱导炎性因子如TNF-α、IL-1、IL-6、IL-12、干扰素(Interferon，IFN)和大量粘附分子的表达，导致炎症反应的发生。本发明人用荧光素酶报告基因法检测了不同浓度S632A3(2.5μg/ml，5μg/ml，10μg/ml)处理小鼠巨噬细胞后，LPS刺激的RAW264.7细胞中NF-κB转录活性的变化。实验结果表明，经S632A3预处理后，LPS诱导的NF-κB报告基因的转录活性水平明显低于DMSO对照组，且受抑制水平也呈S632A3浓度依赖性，在2.5-10μg/ml范围内，S632A3浓度越高，NF-κB报告基因的转录活性受抑制越明显。说明S632A3能抑制LPS刺激导致的RAW264.7细胞中NF-κB的转录活性。

5.S632A3对RAW264.7细胞中糖原合成酶激酶-3β活性的抑制作用

糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)在LPS激活的巨噬细胞炎症反应中发挥重要的调控作用。本发明人用Western免疫印迹的方法检测了不同浓度S632A3(2.5μg/ml，5μg/ml，10μg/ml)处理小鼠巨噬细胞后，LPS刺激的RAW264.7细胞中GSK-3β活性的变化情况。实验结果表明，经S632A3处理后，GSK-3β活性明显低于DMSO对照组，且受抑制水平也呈S632A3浓度依赖性，在2.5-10μg/ml范围内，S632A3浓度越高，GSK-3β活性受抑制越明显。提示S632A3作用细胞后，通过抑制GSK-3β活性，从而抑制RAW264.7细胞的活化。

6.S632A3对小鼠巨噬细胞增殖的影响

用1～20μg/ml S632A3作用RAW264.7细胞一定时间后，采用MTT法测定RAW264.7细胞增殖，结果表明在5～20μg/ml范围内S632A3能剂量依赖性抑制RAW264.7细胞的增殖(p＜0.01)，说明S632A3可通过抑制巨噬细胞的增殖而发挥其抗炎作用。

本发明的优点和积极效果在于，通过系统生物学研究发现并证明，9-甲基反式链霉戊二酰亚胺(S632A3)能显著下调小鼠巨噬细胞中糖原合成酶激酶-3β活性和核转录因子NF-κB的转录活性，能抑制小鼠巨噬细胞中LPS刺激的促炎性细胞因子TNF-α、IL-6等的释放，可增加抗炎性细胞因子IL-10的释放，并抑制炎症介导分子NO和PGE₂的分泌，以及COX-2和iNOS蛋白的表达，此外还可抑制巨噬细胞的增殖，具有明显的抗炎作用，有望将其开发成为防治炎性疾病或免疫相关疾病及其并发症的药物。

附图说明

图1描绘了S632A3对LPS诱导的RAW264.7细胞分泌细胞因子TNF-α的影响。其中：纵坐标表示TNF-α含量(pg/ml)；横坐标分别为：A表示未给药对照，B表示LPS(1μg/ml)作用24小时，C表示S632A3(2.5μg/ml)作用4小时+LPS作用24小时，D表示S632A3(5μg/ml)作用4小时+LPS作用24小时，E表示S632A3(10μg/ml)作用4小时+LPS作用24小时。图中，＊＊表示与B组相比P＜0.01。

图2描绘了S632A3对LPS诱导的RAW264.7细胞分泌细胞因子IL-6的影响。其中：纵坐标表示IL-6含量(pg/ml)；横坐标分别为：A表示未给药对照，B表示LPS(1μg/ml)作用24小时，C表示S632A3(2.5μg/ml)作用4小时+LPS作用24小时，D表示S632A3(5μg/ml)作用4小时+LPS作用24小时，E表示S632A3(10μg/ml)作用4小时+LPS作用24小时。图中，＊＊表示与B组相比P＜0.01。

图3描绘了S632A3对LPS诱导的RAW264.7细胞分泌细胞因子IL-10的影响。其中：纵坐标表示IL-10含量(pg/ml)；横坐标分别为：A表示未给药对照，B表示LPS(1μg/ml)作用24小时，C表示S632A3(2.5μg/ml)作用4小时+LPS作用24小时，D表示S632A3(5μg/ml)作用4小时+LPS作用24小时，E表示S632A3(10μg/ml)作用4小时+LPS作用24小时。图中，＊＊表示与B组相比P＜0.01。

图4描绘了S632A3抑制LPS诱导的巨噬细胞中COX-2的表达。其中：1表示未给药对照，2表示LPS(1μg/ml)作用24小时，3表示S632A3(2.5μg/ml)作用4小时+LPS作用24小时，4表示S632A3(5.0μg/ml)作用4小时+LPS作用24小时，5表示S632A3(10μg/ml)作用4小时+LPS作用24小时。

图5描绘了S632A3抑制LPS诱导的巨噬细胞中iNOS的表达。其中：1表示未给药对照，2表示LPS(1μg/ml)作用24小时，3表示S632A3(2.5μg/ml)作用4小时+LPS作用24小时，4表示S632A3(5.0μg/ml)作用4小时+LPS作用24小时，5表示S632A3(10μg/ml)作用4小时+LPS作用24小时。

图6描绘了S632A3抑制RAW264.7细胞中NF-κB转录活性。其中：纵坐标表示NF-κB相对荧光值；横坐标分别为：A表示未给药对照，B表示LPS(1μg/ml)作用24小时，C表示S632A3(2.5μg/ml)作用4小时+LPS作用24小时，D表示S632A3(5μg/ml)作用4小时+LPS作用24小时，E表示S632A3(10μg/ml)作用4小时+LPS作用24小时。图中，＊＊表示与B组相比P＜0.01。

图7描绘了S632A3抑制RAW264.7细胞中糖原合成酶激酶-3β活性。其中：1表示未给药对照，2表示LPS(1μg/ml)作用24小时，3表示S632A3(2.5μg/ml)作用4小时+LPS作用24小时，4表示S632A3(5.0μg/ml)作用4小时+LPS作用24小时，5表示S632A3(10μg/ml)作用4小时+LPS作用24小时。

具体实施方式

通过下面的实施例可以对本发明进行进一步的描述，然而，本发明的范围并不限于下述实施例。本领域的专业人员能够理解，在不背离本发明的精神和范围的前提下，可以对本发明进行各种变化和修饰。本发明对试验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性和/或具体的描述。虽然为实现本发明目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的，但是本发明仍然在此作尽可能详细描述。

实施例1.9-甲基反式链霉戊二酰亚胺(S632A3)的制备

吸水链霉菌株(Streptom yces hygroscopicus)S632经发酵后，将发酵液抽滤，滤液经Diaion HP-20大孔吸附树脂(5％，V/V)吸附后，去离子水洗涤，50％丙酮洗脱，生物检测后，将具有活性的洗脱液合并，减压蒸馏除丙酮，用乙酸乙酯萃取2次，按6％(g//ml)加无水硫酸钠脱水，过滤，滤液40℃减压蒸馏得淡黄色油状物质。该物质用硅胶进行柱层析，以石油醚-丙酮(4∶1)为洗脱液，可分成活性组分A和B。A组分减压浓缩得到淡黄色油状物质，该物质再经Sephadex LH-20柱层析，甲醇为展开液，可得S2632A粗品。S2632A粗品经反向中压柱(YAMAZEN#11 1.5×52cm)，38％甲醇展开，生物检测(Saccharomyces cerevisiae清酒酵母)收集活性洗脱液，活性洗脱液经HPLC检测，合并含有单一S632A3物质的组分，减压除去有机溶媒后，水溶液进行乙酸乙酯提取2次，减压除去乙酸乙酯，即可得到9-甲基反式链霉戊二酰亚胺(S632A3)物质。上述吸水链霉菌S632已由本申请人以保藏号CGMCC NO.0665保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其详细信息参见CN1362407A。

实施例2.S632A3对LPS诱导的巨噬细胞分泌细胞因子TNF-α、IL-6及IL-10水平的 影响

实验方法：接种1.0×10⁵个RAW264.7细胞于24孔板中，12小时待细胞贴壁后，加入含不同浓度S632A3(2.5μg/ml，5μg/ml，10μg/ml)的新鲜培养基预处理4小时，相应浓度的DMSO作为各自对照。药物作用结束后，加入LPS(1μg/ml)刺激24小时，收集细胞培养上清，分别用小鼠TNF-α、IL-6及IL-10酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒(R&D Systems，Minneapolis，MN，USA)检测上清中细胞因子水平，具体实验方法如下：

1)取冻存的细胞培养液上清，0～4℃冷水解冻；

2)建立标准曲线：设标准孔8孔，每孔各加入样品稀释液100μl，第一孔加标准品100μl，混匀后用加样器吸出100μl，移至第二孔。如此反复作对倍稀释至第七孔，最后，从第七孔中吸出100μl弃去，使之体积均为100μl，第八孔为对照孔。

3)加样：待测样品孔中各加入待测样品100μl，37℃放置120分钟；

4)洗板：用洗涤液将反应板充分洗涤4～6次，向滤纸上印干；

5)每孔加入第一抗体工作液50μl，将反应板充分混匀后置于37℃，放置60分钟；

6)洗板：同第4步；

7)每孔加入底物工作液100μl，置于37℃，避光反应5～10分钟，每孔加入1滴终止液后混匀；

8)酶联免疫检测仪492nm处测定并记录吸光值(OD值)。

实验结果：RAW264.7细胞经不同浓度的S632A3预处理4小时，再用LPS(1μg/ml)刺激24小时后，ELISA方法检测上清中各细胞因子的变化，结果如图1、图2和图3所示。经LPS刺激后细胞分泌的TNF-α、IL-6明显高于未刺激对照组，IL-10的分泌水平有所增加；但5μg/ml和10μg/ml S632A3组RAW264.7细胞分泌TNF-α(图1)、IL-6(图2)的水平明显低于LPS刺激组，而2.5μg/ml、5μg/ml和10μg/ml S632A3组分泌IL-10(图3)的水平则明显高于LPS刺激组，说明S632A3可通过抑制RAW264.7细胞分泌促炎性细胞因子，促进其产生抗炎性因子而发挥其抑制炎症反应的作用。

实施例3.S632A3抑制LPS诱导的巨噬细胞中NO和PGE ₂ 的产生

实验方法：将RAW264.7细胞按每孔2.0×10⁵个细胞接种于24孔培养板，待细胞贴壁后换液，加入含不同浓度S632A3(2.5μg/ml，5μg/ml，10μg/ml)的新鲜培养基作用4小时，相应体积浓度的DMSO作为对照。药物作用结束后加入LPS(1μg/ml)刺激24小时，收集细胞培养上清，按照以下方法测定上清中NO和PGE₂的含量：(1)用Griess试剂测定细胞培养上清中NO分泌的水平。检测方法如下：在96孔板中加入100μl待测上清样品(每样品设3个复孔)，加入混合后的Griess试剂(1％对氨基苯磺酸和0.1％N-1-奈乙二胺盐酸盐，临用前等体积混合)100μl，室温下避光反应10分钟，在酶标仪上检测波长570nm处的OD值。用不同浓度的NaNO₂与Griess试剂反应作标准曲线，求得上清中NO浓度。(2)用ELISA方法检测细胞上清中PGE₂的含量，操作方法同实施例2。

实验结果：在LPS等炎性刺激条件下，巨噬细胞中NO和PGE₂的大量表达可导致炎症反应的发生。实验结果表明，LPS作用巨噬细胞24小时后，上清中NO和PGE₂分泌水平明显升高；用不同浓度的S632A3处理细胞4小时后，再用LPS作用24小时，发现5μg/ml和10μg/ml剂量组S632A3能显著抑制LPS刺激的NO的分泌(表1)，10μg/ml的S632A3可使上清中PGE₂含量显著下降(表2)。说明S632A3不仅可抑制LPS诱导的巨噬细胞分泌促炎细胞因子TNF-α、IL-6，对其分泌的炎症介导分子NO和PGE₂也具有抑制作用，具有明显的抗炎活性。

表1.S632A3对LPS诱导的巨噬细胞产生NO的影响

浓度(μg/ml)	NO浓度(μM)
		空白对照	15.3±2.4
LPS(1)	90.5±4.4
		S632A3(2.5)	88.6±4.7
S632A3(5.0)	72.4±3.1＊＊
		S632A3(10.0)	61.3±2.7＊＊

＊＊与LPS组相比P＜0.01

表2.S632A3对LPS诱导的巨噬细胞产生PGE₂的影响

浓度(μg/ml)	PGE2(ng/ml)
		空白对照	12.8±2.6
LPS(1)	150.5±9.4
		S632A3(2.5)	138.8±8.6
S632A3(5.0)	129.2±8.1
		S632A3(10.0)	108.8±7.7＊＊

＊＊与LPS组相比P＜0.01

实施例4.S632A3抑制LPS诱导的巨噬细胞中COX-2和iNOS的表达

实验方法：接种1.0×10⁷个RAW264.7细胞于6孔板12小时待细胞贴壁后，加入不同浓度的S632A3(2.5μg/ml，5.0μg/ml和10μg/ml)或DMEM分别作用4小时后，加入LPS(1μg/ml)刺激24小时。用适量0.25％胰蛋白酶和0.02％EDTA(1∶1)溶液消化收集细胞，约2×10⁶个，用冷的PBS洗涤细胞2次，800rpm，5分钟离心。加入含蛋白酶抑制剂的细胞裂解液(50mMTris.Cl pH 6.8、15mM NaCl、5mM EDTA、0.5％NP-40、1mMPMSF)，冰上放置30分钟，收集至1.5ml离心管，10,000g离心15分钟，收集上清，BCA蛋白定量试剂盒检测蛋白浓度。加入6X上样缓冲液(0.5M Tris-Hcl，pH6.82.5ml，甘油5ml，20％SDS 2.0ml，5％溴酚蓝0.5ml，临用前每1ml缓冲液加入100μl β-琉基乙醇)，95℃煮5分钟。取50μg蛋白进行SDS-PAGE电泳，然后将蛋白转印到PVDF膜上，室温下用5％的TBST(100mM Tris-Hcl，0.9％NaCl，0.1％Tween 20，pH 7.5)封闭2小时，然后4℃与COX-2抗体或iNOS抗体孵育过夜，TBST洗膜3次，再与HRP标记的抗兔二抗孵育1小时，TBST洗膜3次，最后ECL法显影。

实验结果：Western免疫印迹结果表明，当LPS刺激24时后，两种与炎症密切相关的蛋白COX-2和iNOS的表达量明显上升(图4和图5)，而加入了5μg/ml和10μg/ml两个浓度的S632A3之后，COX-2(图4)和iNOS(图5)的表达量被显著抑制。说明S632A3可通过下调炎症相关蛋白COX-2和iNOS的表达而发挥其抗炎作用。

实施例5.S632A3对RAW264.7细胞NF-κB转录活件的影响

实验方法：将pGL3-NF-κB Luciefares质粒转染入RAW264.7细胞，48小时后加入不同浓度的S632A3(2.5μg/ml，5.0μg/ml和10μg/ml)或DMSO对照，加药4小时后再加入LPS(1μg/ml)刺激6小时，用荧光素酶报告基因检测试剂盒(Promega，USA)测定NF-κB报告基因转录活性。操作步骤如下：

1)弃去96孔板中的培养基。注意：不要刮掉孔底贴壁的细胞。

2)用200μl/孔的磷酸缓冲液(PBS，pH 7.0)轻轻漂洗细胞后，完全弃去PBS。

3)加入25μl/孔的细胞被动裂解液(1×PLB)，室温下振摇15分钟，使细胞完全裂解。

4)将裂解液完全吸出到荧光分析用96孔白板相应孔内。注意：将细胞裂解液彻底转移，转移前将细胞裂解液吹吸均匀。

加入70μl/孔的分析试剂LARII于分析用白板内后，立即(5分钟内)将分析用白板置于Galaxy分光光度计内，读数并记录荧光数值。用每孔荧光数值与蛋白含量的比值作为NF-κB转录活性的相对值。

实验结果：经S632A3预处理后，LPS诱导的NF-κB报告基因的转录活性水平明显低于DMSO对照组，且受抑制水平也呈S632A3浓度依赖性，在2.5-10μg/ml范围内，S632A3浓度越高，NF-κB报告基因的转录活性受抑制越明显(图6)。说明S632A3能抑制LPS刺激导致的RAW264.7细胞中NF-κB的转录活性。

实施例6.S632A3对RAW264.7细胞中糖原合成酶激酶-3β活性的抑制作用

实验方法：接种1.0×10⁷个RAW264.7细胞于6孔板12小时待细胞贴壁后，加入不同浓度的S632A3(2.5μg/ml，5.0μg/ml和10μg/ml)或DMEM分别作用4小时后，加入LPS(1μg/ml)刺激24h。收集并裂解细胞(操作方法同实施例4)，取50μg蛋白进行SDS-PAGE电泳，然后将蛋白转印到PVDF膜上，室温下用5％的TBST(100mM Tris-Hcl，0.9％NaCl，0.1％Tween20，pH 7.5)封闭2小时，然后4℃与p-Glycogen synthase(Ser641)抗体孵育过夜，TBST洗膜3次，再与HRP标记的抗兔二抗孵育1小时，TBST洗膜3次，最后ECL法显影。

实验结果：糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)在LPS激活的巨噬细胞炎症反应中发挥重要的调控作用。Western免疫印迹实验结果表明，经S632A3处理后，GSK-3β活性明显低于DMSO对照组，且受抑制水平也呈S632A3浓度依赖性，在2.5-10μg/ml范围内，S632A3浓度越高，GSK-3β活性受抑制越明显(图7)，提示S632A3作用细胞后，通过抑制GSK-3β活性，从而抑制RAW264.7细胞的活化。

实施例7.S632A3对小鼠巨噬细胞增殖的影响

实验方法：将小鼠巨噬细胞RAW264.7按每孔3×10⁴个细胞接种于96孔平底培养板，每孔100μl，各设3个复孔。待细胞贴壁后换液，加入含不同浓度S632A3(20μg/ml，10μg/ml，5μg/ml，2.5μg/ml，1μg/ml)的新鲜培养基，相应体积浓度的DMSO作为各自对照，继续培养48小时。培养结束前4h时每孔加入10μl MTT(5mg/ml)，37℃继续孵育。结束时小心将培养上清吸弃，每孔加入150μl DMSO，37℃孵育10分钟，摇振使紫色结晶颗粒完全溶解，用酶标仪测定570nm波长处的吸光值(OD)。

实验结果：MTT实验结果表明，S632A3以剂量依赖性方式抑制RAW264.7细胞的增殖，5μg/ml以上浓度作用48小时即能较明显抑制细胞的增殖(表3)，说明S632A3可通过抑制巨噬细胞增殖而下调其导致的炎症反应。

表3.S632A3对RAW264.7细胞增殖的影响

浓度(μg/ml)	OD值(570nm)
		空白对照组	2.035±0.082
S632A3(1)	1.989±0.091
		S632A3(2.5)	1.948±0.079
S632A3(5)	1.722±0.065＊＊
		S632A3(10)	1.606±0.054＊＊
S632A3(20)	1.468±0.042＊＊

＊＊与空白对照相比P＜0.01

Claims (10)

1.以下式I化合物在制备治疗和/或预防炎性疾病或免疫相关疾病及其并发症的药物中的用途：

2.权利要求1的用途，其中所述炎性疾病或免疫相关疾病及其并发症选自关节炎(如风湿性关节炎、风湿性脊椎炎、痛风关节炎、外伤关节炎、风疹关节炎、牛皮癣关节炎、骨关节炎和其它关节炎疾病)、急性滑膜炎、肺部炎性疾病及其并发症(如哮喘、急性呼吸性窘迫综合征、慢性障碍性肺疾病、硅肺病、肺部肉状瘤病等)、移植物抗宿主反应、移植物抗宿主疾病(GVHD)、同种异体移植物排异和麻疯病。

3.权利要求1至2任一项的用途，其中所述炎性疾病或免疫相关疾病及其并发症选自风湿性关节炎、哮喘、炎性肠病、牛皮癣、鳞皮关节炎、慢性阻塞性肺病(COPD)、多发性硬化症(MS)，以及与NF-κB、TNF-α及其中GSK-3β被公知调节其活性的其他途径酶的活性相关的疾病(如阿尔兹海默病、动脉粥样硬化病、2型糖尿病等)。

4.权利要求1至3任一项的用途，其中所述炎性疾病选自急性炎症性疾病、慢性炎症性疾病、及其组合。

5.权利要求1至4任一项的用途，其中所述药物给予受试者(例如哺乳动物，如人)的每日剂量以式I化合物计为0.001～1000mg/kg体重、0.01～100mg/kg体重、0.01～75mg/kg体重、0.01～50mg/kg体重、0.02～20mg/kg体重、或0.1～20mg/kg体重。

6.以下式I化合物在制备药物中的用途：

所述药物用于：在体内和/或体外抑制促炎性细胞因子；在体内和/或体外促进抗炎性细胞因子分泌；在体内和/或体外抑制炎症介导分子；在体内和/或体外抑制炎症反应相关蛋白；在体内和/或体外抑制核转录因子转录活性；在体内和/或体外抑制糖原合成酶激酶活性；和/或在体内和/或体外抑制巨噬细胞增殖。

7.用于治疗和/或预防炎性疾病或免疫相关疾病及其并发症的药物组合物，其中包含有效量的以下式I化合物

和任选的药学可接受的载体或赋形剂。

8.一种药物组合物，其中包含有效量的以下式I化合物

和任选的药学可接受的载体或赋形剂，所述药物组合物用于：在体内和/或体外抑制促炎性细胞因子；在体内和/或体外促进抗炎性细胞因子分泌；在体内和/或体外抑制炎症介导分子；在体内和/或体外抑制炎症反应相关蛋白；在体内和/或体外抑制核转录因子转录活性；在体内和/或体外抑制糖原合成酶激酶活性；和/或在体内和/或体外抑制巨噬细胞增殖。

9.一种药盒产品，其中包括药物组合物和使用说明书，其中：

所述药物组合物包含预防和/或治疗有效量的以下式I化合物

以及任选的药学可接受的载体或赋形剂；

所述使用说明书记载了使用所述药物组合物以治疗和/或预防炎性疾病或免疫相关疾病及其并发症的信息。

10.一种药盒产品，其中包括药物组合物和使用说明书，其中：

所述药物组合物包含预防和/或治疗有效量的以下式I化合物

以及任选的药学可接受的载体或赋形剂；

所述使用说明书记载了所述药物组合物使用的信息，所述药物组合物用于：在体内和/或体外抑制促炎性细胞因子；在体内和/或体外促进抗炎性细胞因子分泌；在体内和/或体外抑制炎症介导分子；在体内和/或体外抑制炎症反应相关蛋白；在体内和/或体外抑制核转录因子转录活性；在体内和/或体外抑制糖原合成酶激酶活性；和/或在体内和/或体外抑制巨噬细胞增殖。

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