CN102288735A - 一种头孢西酮钠杂质及中间体毒性的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种头孢西酮钠杂质毒性的毒性检测方法，采用斑马鱼TU line Zebrafish，Danio rerio Tuebingen作为药物毒理学评价的模式动物。本发明涉及的是头孢西酮钠整个合成工艺中间体杂质、副产物以及各种降解杂质的毒性评价，本发明首席采用药物毒理学评价的新模型动物“斑马鱼”对头孢西酮中所含微量杂质的毒性进行了评估，通过斑马鱼毒性试验可以得到有效控制产品质量，保证了临床使用的安全性，为患者的用药安全提供可靠的依据。

Description

一种头孢西酮钠杂质及中间体毒性的检测方法

技术领域

本发明涉及化学药物毒性检测领域，尤其是一种头孢西酮钠杂质毒性的毒性检测方法。

背景技术

头孢西酮钠，英文名称：Cefazedone Sodium for Injection，类别：β-内酰胺类抗生素，头孢菌素类，化学结构式如下：

头孢西酮钠是由E.Merck，Darmstadt实验室研究开发的一代头孢菌素，1979年由E.默克公司率先在德国上市，其后在其周边及韩国、罗马尼亚、保加利亚、台湾等国家和地区上市。头孢西酮钠对金黄色葡萄球菌、凝固酶阴性葡萄球菌、肺炎链球菌、β-溶血链球菌、流感嗜血杆菌、卡他莫拉菌、不产ESBL的大肠埃希菌和肺炎克雷白杆菌、奇异变形杆菌等有抑制效果。用于呼吸系统、泌尿系统、胃肠道感染及妇科、腹膜、皮肤、软组织和整形外科感染的治疗，具有药效相对较高，毒性相对较小，血药浓度维持时间长的优势。

根据目前国内外耐药监测资料以及临床医师的实际应用情况，一代头孢菌素在治疗国内社区获得性感染，特别是呼吸道感染中革兰阳性菌以及流感嗜血杆菌仍有重要的地位，对门诊患者的有效率可达到79％以上，因此本品在基层医疗机构有着广阔的应用空间。

其次，随着医疗体制改革深化，社区医疗在医疗服务中的比例逐渐增加，国家提倡基本药物治疗，提倡抗菌药分级使用，充分肯定一代头孢菌素对社区感染和围手术期预防的应用，临床上可供选择的一代头孢品种相对较少，需要新品种，而头孢西酮钠的抗菌谱和抗菌活性与头孢唑林相似，药代特征与其它同类产品相比具有一定优势，具有开发的必要性。

安全性评价是新药研发过程中最重要的研究内容之一。药物毒副反应一般来自药品本身的药理活性和药品中杂质的活性。药品本身的毒理活性通常通过严格的药理实验进行评估；而药品中的杂质由于通常几乎不可能完全被去除，故通常通过限度来控制。由于药品中的杂质通常不宜获得，因此很难依据传统的药理实验进行评估。

目前斑马鱼作为一种新的优秀动物模型已愈来愈多的受到关注，斑马鱼作为药物毒理学评价的模式动物具有：①本身为脊椎动物，与人在基因序列、表达规律以及组织器官的形成发育过程相似，可以较好地模拟人类胚胎的体内发育；其组织器官在解剖学、生理学和分子水平上也类似于人类的相应器官。研究表明，哺乳动物90％以上的基因在斑马鱼中具有同源基因，所编码蛋白结构相似而且在生物体内发挥类似的功能；斑马鱼基因组测序工作预计在1-2年内完成，在生物信息学上可与人和小鼠进行比较；因此，以斑马鱼为平台的药物毒理学研究和检测具有较好的代表性和可比性。②斑马鱼可以生存在较小的容器和少量的液体中，通常只需要微克级的化合物便可进行药物毒性筛选，如采用受精卵作为评价对象，实验样品量可进一步降低，因此特别适合对不宜获得大量样品的杂质的评价；③斑马鱼具有较高的产卵量(一对成体鱼可以在一个上午产数百枚受精卵)，可以满足统计学对实验的要求；④斑马鱼的世代周期较短(3-4月)，体外发育迅速(3天完成胚胎的全部发育)且胚体透明，便于随时观察活体胚胎结构，因此适和于快速分析药物对胚胎的多方面的作用，大大提高检测效率；等其他哺乳类模式动物不可及的优点。

目前关于头孢西酮钠杂质的检测方法没有明确一个规定，每个厂家执行的标准也不相同，绝大多数厂家根本不进行杂质毒性的研究，无论对头孢西酮钠的生产还是贮藏都是十分不利的。

发明内容

本发明的目的在提供一种头孢西酮钠杂质毒性的毒性检测方法，头孢西酮钠由于本身结构不稳定，故样品中的杂质含量相对较高，为评价其杂质限度是否合理，我们利用斑马鱼模型对其毒性作用进行了评估。

本发明采用的技术方案是：

一种头孢西酮钠杂质毒性的毒性检测方法，采用斑马鱼TU line Zebrafish，Danio rerioTuebingen作为药物毒理学评价的动物模型。

而且，步骤为：(1)用人工海水分别稀释供试品溶液，稀释成不同梯度；

(2)选择头孢唑林钠为对照样品；

(3)取40-50％外包期胚胎，浸入3-4ml测试药液中，以斑马鱼饲养液-人工海水为正常对照液，标准环境下孵育，持续3天以上，每天观察记录胚胎发育情况，包括统计发育第3天的畸形和死亡数/存活胚数，直至实验结束。

而且，所述头孢西酮钠杂质包括的制备头孢西酮钠的中间体、制备过程中产生的杂质以及降解产生的杂质。

而且，所述头孢西酮钠杂质包括：

DCP	中间体
		DPA	中间体
7-ACA	起始原料
		TDA	中间体
CFZD	主成分
		MMTD	降解杂质

而且，所述MMTD是头孢西酮钠的主要降解毒性杂质，其最低致畸浓度较头孢西酮低10-20倍，如将其含量控制在1％以下，毒性作用基本可以忽略。

本发明的优点和积极效果是：

本发明涉及的是头孢西酮钠整个合成工艺中间体杂质、副产物以及各种降解杂质的毒性评价，本发明首席采用药物毒理学评价的新模型动物“斑马鱼”对头孢西酮中所含微量杂质的毒性进行了评估，通过斑马鱼毒性试验可以得到有效控制产品质量，保证了临床使用的安全性，为患者的用药安全提供可靠的依据。

附图说明

图1为本发明头孢西酮钠的合成工艺流程简图；

图2为本发明斑马鱼胚胎随MMTD浓度的加大，胚卵黄囊及其延伸结构变化图，其中A-C：表示随MMTD浓度的加大，胚卵黄囊及其延伸结构变不透明，体表淡黄色，全身几无黑色素，脊索呈严重S形扭曲，眼无色，体轴弯曲；D：表示系统对照组胚胎，示正常胚胎形态；

图3为本发明中不同浓度MMTD对斑马鱼胚胎的致畸率和致死率(3-dpf)的影响；

图4为本发明斑马鱼胚胎随TDA浓度的加大，胚卵黄囊及其延伸结构变化图，其中A、B：100ug/ml TDA处理胚胎，出现2种表型；C：300ug/ml TDA处理胚胎；D：500ug/ml TDA处理胚胎；E：系统对照组胚胎，示正常胚胎形态；

图5为本发明不同浓度TDA对斑马鱼胚胎的致死率和畸变率统计；

图6为本发明DCP对斑马鱼胚胎发育的毒性，在含DCP的孵化液中，斑马鱼胚胎发育到第3天出现卵黄囊和卵黄囊延伸结构变不透明并较粗，围心囊膨大且腹侧淤血(D图箭头)。部份胚胎脑出血(C图箭头)。A：系统对照组胚胎，示正常胚胎形态；B-D：DCP处理组胚胎形态。胚胎头部朝左，背部向上；

图7为本发明不同浓度DCP对斑马鱼胚胎的致死率和畸变率统计；

图8为本发明不同浓度的DPA对斑马鱼胚胎的致死率和畸变率统计；

图9为本发明头孢西酮钠碱降解产物对斑马鱼胚胎发育的毒性，CFZDA 300μg/ml孵化液处理的胚胎，示胚中轴弯曲，yolk和YE变不透明，体表黄色，全身和眼睛几乎无黑色素，Yolk开始溃烂，4-dpf。碱降解CFZD 100μg/ml，示胚胎表型正常。WT：正常胚胎形态。4-dpf。

图10为本发明头孢西酮钠酸降解产物产物对斑马鱼胚胎发育的毒性，CFZDA/H+300ug/ml孵化液处理胚胎，示胚yolk和YE变不透明，围心囊膨大，心脏索状和无血色，体表黄色，体表和眼黑色素较浅，部分胚胎脑区淤血。WT：正常胚胎形态。4-dpf。

图11为本发明头孢西酮钠氧化降解产物对胚胎发育的影响，CFZDA/H2O2 300ug/ml孵化液处理胚胎，示胚yolk和YE变不透明，心脏无血色，体表色发白；WT：正常胚胎形态。4-dpf

图12为本发明不同浓度的头孢西酮钠的碱强制降解物、酸强制降解物和氧化强制降解物对斑马鱼胚胎的致死率和畸变率统计；

图13为本发明LC-UV测定不同批号不同生产工艺头孢西酮钠的典型HPLC-UV色谱图(278nm)；

图14为本发明LC-UV测定头孢西酮钠各强制降解溶液的典型HPLC-UV色谱图(278nm)；

图15为本发明头孢西酮酸与MMTD的交互作用；

图16-1至图16-3为本发明头孢西酮酸、头孢唑啉以及头孢西酮钠与头孢唑啉钠的斑马鱼胚胎毒性的比较，图中数据均为3-dpf统计数据，其中致畸率不含致死率(下同)；

图17为本发明头孢西酮酸对胚胎发育的影响，将囊胚中期(50％外包)的胚胎放入CFZDA500ug/ml海水发育3天，幼体出现畸形：体表淡黄色，几无黑色素；卵黄囊和卵黄延伸结构(YE)变不透明，围心囊膨大，心脏无血色，眼睛无色且较小，无活动性，体短且前后轴弯曲(A，B)；CFZDA 300ug/ml处理的胚胎中后脑出血，但可见稀而小的黑色斑点(C)；同批正常对照幼体侧面(D)和背面结构(E)；

图18为本发明头孢西酮钠对斑马鱼胚胎发育的影响，将囊胚中期(50％外包)的胚胎放入CFZDANa海水发育4天，幼体出现畸形；WT：同批正常对照幼体侧面。图中幼体多为侧面观。

图19为本发明头孢唑啉不同浓度对斑马鱼胚胎发育的影响，CFZL 3-dpf，胚体黄色、黑色素浅、Y+YE不透明，眼中心区域色素缺陷、心索状、无色、围心囊较膨大、应激和活动度较差；B，C：0.1mg/ml，示多处脑区出血；D：0.5mg/ml；A：系统对照胚，示正常形态。

具体实施方式

下面结合实施例，对本发明进一步说明，下述实施例是说明性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。

本发明实用的人工海水为市售人工海水，无特殊要求。

一种头孢西酮钠的制备方法，工艺路线如下：

第一步：

第二步：

第三步：

二、工艺路线简图及中间体结构式：

1、头孢西酮钠的合成工艺流程图如图1所示。

2、各中间体的结构式

表1头孢西酮已知杂质

三、头孢西酮钠中杂质分析(梯度洗脱系统)

梯度洗脱是指在同一个分析周期中，按一定程度不断改变流动相的浓度配比的洗脱方法。该方法的流动相由几种不同极性的溶剂组成，通过改变流动相中各溶剂组成的比例改变流动相的极性，使每个流出的组分都有合适的容量因子k，并使样品中的所有组分在最短时间内实现最佳分离。梯度洗脱的优点有：提高柱效，提高分离能力；峰型得到改善，减少拖尾；增强检测器的灵敏度。

采用HPLC-UV法，运用磷酸盐缓冲液-乙腈梯度洗脱流动相系统，流速1ml/min，进行线性梯度洗脱，以外标法测定各杂质的含量，试验检测结果见表2。

表2不同批号不同生产工艺头孢西酮钠的有关物质结果

*含量超过0.1％需要对杂质来源进行进一步分析的有关物质

从表中数据可以看出，注射用头孢西酮钠不同批次样品中，所有杂质含量均较低，仅有6个杂质的含量在0.05％-0.09％之间，其他杂质的含量均低于0.05％，总杂质含量在0.42％-0.48％之间，都远远低于企业有关物质限度(最大单一杂质不超过2％，总杂质不超过4％)。

众所周知，头孢类抗生素的稳定性是质量控制的一项重要因素，为了保证产品质量，增强其稳定性，通常的头孢类抗生素对贮藏条件有严格的规定。但从上述头孢西酮钠杂质含量可以明显看出：仅RRT为0.896的杂质峰，2006年生产的产品含量为0.09％，比2009年生产的产品增加了0.05％，提示随着样品放置时间的增加，该杂质含量有增长趋势，但直至产品(2006年生产的样品)超出有效期(本品有效期为二年)时，该杂质含量也仍远低于企业标准(最大单一杂质不超过2％，总杂质不超过4％)。而其余杂质峰显示均无任何增长迹象。

由此说明，本发明制备的头孢西酮钠在存储过程中杂质几乎无增长，产品稳定性好，质量能够得以控制。

四、头孢西酮钠、中间体以及杂质的毒性试验检测方法

通过饲养液中添加药物的给药途径，以无药处理为正常对照，检测头孢西酮及其杂质对斑马鱼胚胎发育的影响。选择与头孢西酮钠结构相似，又经过长期临床观测，具有充分安全性的头孢唑林钠为对照样品，分别用头孢唑啉钠与头孢西酮钠处理胚胎，比较其致畸性和致死率，确定头孢西酮钠的毒性反应现象；在此基础上，比较头孢西酮钠中的各种杂质、头孢西酮钠的各类降解产物对头孢西酮钠毒性反应的影响，进而评价杂质的毒性作用。

β-内酰胺类抗生素在临床中引发的速发型过敏反应通常与药物中存在的杂质密切相关，为了最大程度地减少过敏等不良反应的发生，对药物中杂质进行分析和控制，采用药物毒理学评价的新模型动物“斑马鱼”对头孢西酮钠中所含微量杂质的毒性进行了评估。

取40％-50％的外胚期胚胎侵入到测试药液中，以斑马鱼饲养液-人工海水为正常对照组，标准环境下孵育持续3天以上，每天观察、记录胚胎发育情况，直至试验结束。

1.供试品溶液的配制

母液：均用灭菌的无离子水配制，若不溶，用5 M NaOH溶液助溶；

测试液：用人工海水分别稀释成10、50、100、300、500μg/ml的溶液。

药物交互作用溶液：

注：CFZDA为头孢西酮酸；以上测试液的pH均为6.0-6.5。

2.实验动物

斑马鱼TU line(Zebrafish，Danio rerio Tuebingen)

3.实验方法

取40-50％外包期胚胎(每组至少25枚)浸入3-4ml测试药液中，以斑马鱼饲养液-人工海水为正常对照液，标准环境下孵育，持续3天以上。每天观察记录(必要时拍摄)胚胎发育情况(包括统计发育第3天的畸形和死亡数/存活胚数)，直至实验结束。

(一)、头孢西酮酸对斑马鱼胚胎发育的毒性

头孢西酮酸浓度≤500μg/ml时，对斑马鱼的致死率(从给药开始直至孵化期3-dpf*)低于9％。但在4-dpf或超过4-dpf时，头孢西酮浓度为500μg/ml组的胚胎全部死亡，随后是300μg/ml组的胚胎全部死亡，而系统对照组胚胎继续正常发育。致畸性方面，用10μg/ml和50μg/ml两种浓度处理时，头孢西酮酸致畸率低于5％；当100μg/ml浓度时，头孢西酮酸致畸率为23％；当300μg/ml和500μg/ml浓度时，头孢西酮酸致畸率大于90％。

头孢西酮钠的毒性稍大于头孢西酮酸，头孢西酮钠在100μg/ml浓度下时，出现明显异常表型，约相当于300μg/ml浓度的头孢西酮酸对胚胎的致畸作用。

(二)、头孢西酮中间体对斑马鱼胚胎发育的毒性试验

1、头孢类母环7-ACA分子对斑马鱼胚胎发育的毒性：

当7-ACA浓度与头孢西酮(钠)相同情况下，致畸率和致死率均不超过10％，可以判断7-ACA对斑马鱼胚胎发育没有明显毒性。

2、MMTD对斑马鱼胚胎发育的毒性：

检测了1μg/ml、5μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、300μg/ml、500μg/ml六种浓度的MMTD对胚胎发育的影响，试验结果显示，胚胎明显的致畸作用出现在10μg/ml浓度，胚胎除了出现与头孢西酮(钠)相同的畸形(体表呈透明黄色、无黑色素斑纹、眼无色、胚卵黄囊及其延伸结构不透明、围心囊膨大，心脏无血色，心率缓、体长度变短、前后轴弯曲、应激反应消失，活动度差)外，还发现MMTD可以导致脊索严重S形扭曲，致使幼体体轴扭曲，不能正常游动；胚胎发育停滞于2-dpf；幼体全部在第4天死亡，见图2、图3。

3、TDA对斑马鱼胚胎发育的毒性：

TDA中间产物对斑马鱼胚胎的致畸表型基本与MMTD类似：随浓度的加大，胚体短、Y+YE(短)不透明、尾腹向弯曲、S形扭曲的脊索和神经管、体表黄色；部分胚围心囊下部、眼外缘和尾干腹侧有淤血(图4A-D)；浓度100ug/ml时，畸变率达96％以上，但在10ug/ml浓度时，未见明显毒性，提示TDA的毒性低于MMTD，见图4F、图5

4、DCP对斑马鱼胚胎发育的毒性：

DCP对斑马鱼的胚胎发育的毒性较大，当浓度达到100μg/ml时，其致畸率达到90％，同样可导致胚胎卵黄囊和卵黄囊延伸结构变不透明甚至褐色、卵黄囊膨大、体略短、体表和眼睛的黑色素淡，眼略小；围心囊膨大且局部出血，以及部份胚胎头部出血，应激反应差或无，活动度也随DCP浓度的加大而降低；但未见明显体表黄色和S形脊索，具体见图6、图7。

5、DPA中间产物对斑马鱼胚胎发育的毒性：

同样检测了4种浓度的DPA对胚胎发育的影响，结果显示，其致畸率和致死率均未超过10％；对胚胎形态的延时观察(4-dpf)也未见异常表型，提示DPA对斑马鱼胚胎发育没有明显毒性。

结论：

以上的评估结果显示所含的微量杂质毒性较低，在临床常用剂量下(每日1g-4g，2次/日，严重感染者可用到6g)完全可以确保安全。

(三)、头孢西酮(钠)强制降解杂质测定及其对斑马鱼胚胎发育的毒性

1、头孢西酮钠强制降解杂质对斑马鱼胚胎发育的毒性研究

为了评估头孢西酮降解产物对胚胎发育的毒性，对头孢西酮进行了强制性碱降解、酸降解和氧化降解，用其降解溶液进行胚胎毒性检测。结果表明，碱降解产物和酸降解产物对胚胎的致畸表型相似(图9、10、12)，在低于100μg/ml浓度时，未见明显毒性；当浓度达到300μg/ml，畸形率超过95％(含致死率)。其主要表型为：随浓度的加大，体表变黄色、黑色斑点色淡直至无黑色、瞳仁无色至整个眼睛无色，卵黄囊(yolk)和卵黄囊延伸结构(YE)变不透明，围心囊较大，应激差或无；约20-50％胚胎出现脑淤血；一般在4-dpf时死亡。CFZDA氧化降解物不大于300ug/ml时，未见胚胎异常表型；当浓度达到500μg/ml时，胚胎在3-4-dpf显现眼睛略小，卵黄囊和卵黄囊延伸结构变不透明，围心囊膨大，体表色略偏白色，心脏异常和无血色，体略短，似发育滞后；部份胚胎体轴较弯曲；畸形程度明显低于酸或碱降解物对胚胎的影响(图11、12)。

2、头孢西酮(钠)强制降解杂质测定

采用HPLC法，以磷酸盐缓冲液(pH 5.0)-乙腈梯度洗脱系统，色谱柱为Capcell PAK C18MG II(4.6mmI.D.×250mm，5μm，Col.No.A4AD 02539)，分析头孢西酮强制降解溶液中的各杂质(图13、图14)，以外标法计算各杂质含量(表3)。可见：

①头孢西酮的氧化产物主要有两个氧化降解杂质，其RRT分别为0.572和0.672，含量以头孢西酮计分别为1.75％、6.27％；头孢西酮含量为86.4％，与降解前样品比较，头孢西酮含量约为降解前的86％。

②头孢西酮的酸降解产物主要有一个工艺&降解杂质和一个降解杂质，其RRT分别为0.253和0.326，含量以头孢西酮计分别为0.29％、0.42％；头孢西酮含量为81.0％，与降解前样品比较，头孢西酮含量约为降解前的80％。

③头孢西酮的碱降解产物较多，主要有1个工艺&降解杂质和4个降解杂质，它们的RRT分别为0.186、0.244(头孢西酮酸)、0.725(MMTD)、0.913、1.172，含量以头孢西酮计分别为0.86％、9.27％、4.15％、1.01％、10.07％；头孢西酮含量为62.2％，与降解前样品比较，头孢西酮含量约为降解前的65％。

由于采用相同浓度的溶液进行强制降解，降解后所有的杂质未经分离直接用于斑马鱼胚胎毒性实验，而在图12结果中，所有强制降解溶液的毒性均未明显大于降解前的溶液，提示所产生的降解杂质的毒性作用没有明显大于头孢西酮本身。进一步分析：头孢西酮氧化降解产物的毒性较降解前大大降低，提示RRT为0.572和0.672的杂质在含量低于2％时的毒性作用可以忽略。头孢西酮钠的酸降解产物量较小，图12显示其致畸形率也未明显改变，虽然其致死率在300μl/ml浓度从数据上看似有增加，但500μl/ml浓度的数据变化并不大，故更可能为实验误差所致。头孢西酮钠的碱性降解物，毒性虽然也与降解前的溶液相当，但头孢西酮的含量仅为降解前的约70％，提示其降解物中存在毒性较强的杂质；HPLC分析显示，碱性降解物中存在约4％的MMTD，MMTD的最低致畸浓度较头孢西酮低10倍(图2、图3)，故MMTD应是主要的毒性降解杂质。

表3头孢西酮钠(ZNCFV6002)各强制降解杂质以头孢西酮计的含量

(四)、头孢西酮酸与MMTD的协同作用

为了考察头孢西酮与MMTD协同作用对斑马鱼胚胎发育的影响，将头孢西酮酸与MMTD混合给药，以头孢西酮不致毒的两种浓度(10μg/ml和50μg/ml)与MMTD的两种低致毒浓度(10μg/ml和100μg/ml)的不同组合给药。结果表明，10μg/ml头孢西酮对10μg/ml的MMTD毒性未见明显影响，对100μg/ml的MMTD致死率从9.6％增加到27％；而50μg/ml头孢西酮对两种浓度的MMTD作用未见明显影响(图15)。其毒性表型与MMTD组相同，提示头孢西酮与MMTD没有明显得协同作用。

小结

上述实验表明，头孢西酮钠的毒性反应与头孢唑林钠相当，其在斑马鱼胚胎发育中表现出的畸形与母环7-ACA无关，可能与MMTD的结构关系较大。其畸形表型提示，相关化合物可能主要干扰了胚胎的外胚层(神经系统和表皮色素)组织器官和中胚层的心脑血管系统的发育，也可能还干扰了运动系统(肌肉)的发育。

MMTD是头孢西酮钠的主要降解毒性杂质，其最低致畸浓度较头孢西酮低10-20倍，如将其含量控制在1％以下，毒性作用基本可以忽略。

(五)、头孢西酮(钠)与头孢唑林(钠)斑马鱼胚胎发育毒性的比较

对头孢西酮酸(钠)和头孢唑林(钠)对斑马鱼胚胎发育的毒性进行了比较。结果表明，头孢西酮酸和头孢唑林对斑马鱼胚胎的致死率(观察从给药开始直至孵化期3-dpf*)在不大于500μg/ml时，均低于9％；但在4-dpf或超过4-dpf时，头孢西酮和头孢唑林的500μg/ml组的胚胎均全部死亡，随后是300μg/ml组的胚胎全部死亡，而系统对照组胚胎继续正常发育。在致畸性方面，用10μg/ml和50μg/ml两种浓度处理时，头孢西酮与头孢唑林的差异不大，均低于5％；在100μg/ml浓度时，二者出现差异：头孢西酮酸的致畸率(23％)远低于头孢唑啉(97.1％)，前者除了体表略显淡黄色外，未见其它明显异常，但是在发育4天之后，出现活动性稍差、体表比正常对照胚发黄；当300μg/ml和500μg/ml浓度处理时，二者的致畸率均大于90％。两种药物的钠盐形式比较：头孢西酮钠和头孢唑林钠的毒性类似(图16)。

头孢西酮酸对斑马鱼胚胎发育的致畸表型主要有以下方面(图17)：

①体表颜色由黑色斑点变浅且斑点小，直至无黑色，同时体表变透明黄色，头部为甚；眼睛色素从黑色变浅，随药物浓度的加大，逐渐从眼中心无色扩大到全部眼睛无色，眼变小；

②卵黄囊和卵黄囊延伸结构(Y+YE)从透明变不透明到褐色；

③心脏畸形-无正常结构，常呈索状，无血色，围心囊膨大；

④应激反应变弱直至消失，活动度差；部分胚脑部有出血。

⑤身体长度变短、前后轴由直到弯曲；个别胚胎的脊索局部呈S形或结节。

上述现象随浓度增加，畸形程度明显加重。

头孢西酮钠的毒性稍大于头孢西酮酸，前者在100μg/ml浓度下出现明显异常表型(不稳定)：体表呈淡黄色、黑色素斑小且淡、眼中间区域色素缺陷、胚卵黄囊及其延伸结构不透明、心索状、无色、心率缓、围心囊膨大、应激反应和活动度均较差(图18)。约相当于300μg/ml浓度的头孢西酮酸对胚胎的致畸作用。

头孢唑林(钠)的致畸现象基本同头孢西酮钠(CFZDNa)，脑出血通常发生在3-dpf 100μg/ml浓度处理的胚胎，约三分之一胚胎脑出血；同样出现胚体黄、黑色素变浅、Y+YE不透明，眼中心区域色素缺陷、心索状、无色、围心囊较膨大、应激和活动度较差等异常(图19)。最后胚胎死于头部和卵黄囊溃烂。

上述现象表明，头孢西酮(钠)和头孢唑林(钠)可能主要干扰了胚胎的外胚层(神经系统和表皮色素)组织器官、以及中胚层的心脑血管系统，也可能还涉及运动系统(肌肉)的发育。通过致畸率和畸形表型的严重程度比较，发现头孢西酮酸对斑马鱼胚胎发育的毒性略低于头孢唑林(钠)的毒性。而头孢西酮钠与头孢唑林和头孢唑林钠之间的致畸毒性没有明显差异。

Claims (5)

1.一种头孢西酮钠杂质毒性的毒性检测方法，其特征在于：采用斑马鱼TU line Zebrafish，Danio rerio Tuebingen作为药物毒理学评价的动物模型。

2.根据权利要求1所述的头孢西酮钠杂质毒性的毒性检测方法，其特征在于：步骤为：(1)用人工海水分别稀释供试品溶液，稀释成不同梯度；

(2)选择头孢唑林钠为对照样品；

(3)取40-50％外包期胚胎，浸入3-4ml测试药液中，以斑马鱼饲养液-人工海水为正常对照液，标准环境下孵育，持续3天以上，每天观察记录胚胎发育情况，包括统计发育第3天的畸形和死亡数/存活胚数，直至实验结束。

3.根据权利要求1所述的头孢西酮钠杂质毒性的毒性检测方法，其特征在于：所述头孢西酮钠杂质包括的制备头孢西酮钠的中间体、制备过程中产生的杂质以及降解产生的杂质。

4.根据权利要求1或3所述的头孢西酮钠杂质毒性的毒性检测方法，其特征在于：所述头孢西酮钠杂质包括：

    DCP     中间体     DPA     中间体     7-ACA     起始原料     TDA     中间体     CFZD     主成分     MMTD     降解杂质

5.根据权利要求4所述的头孢西酮钠杂质毒性的毒性检测方法，其特征在于：所述MMTD是头孢西酮钠的主要降解毒性杂质，其最低致畸浓度较头孢西酮低10-20倍，如将其含量控制在1％以下，毒性作用基本可以忽略。

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