CN102286505A - 用于发酵生产l-缬氨酸的重组dna、菌株及方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种用于发酵生产L-缬氨酸的重组DNA、菌株及方法。该重组DNA包括解除了三种支链氨基酸对乙酰羟酸合成酶的反馈抑制的编码乙酰羟酸合成酶的DNA序列、编码二羟基还原异构酶的DNA序列以及编码支链氨基酸转氨酶的DNA序列。该菌株是导入上述重组DNA而转化过的棒杆菌或短杆菌。该方法是培养该菌株而生产L-缬氨酸。本发明采用表达L-缬氨酸产生菌L-缬氨酸生物合成基因，能大大提高L-缬氨酸的产量；且根据L-缬氨酸生物合成酶的最适温度，构建发酵模型，尤其是高温短时发酵模型，菌株的代谢强度得到提高，L-缬氨酸生物合成酶的活性提高，L-缬氨酸的产量和糖酸转化率可得到进一步提高。

Description

用于发酵生产L-缬氨酸的重组DNA、菌株及方法

技术领域

本发明涉及L-缬氨酸的生产方法，特别涉及一种用于发酵生产L-缬氨酸的DNA、菌株及方法，属于微生物工程技术领域。

背景技术

发酵法生产L-缬氨酸，大多采用从自然环境分离的微生物菌株或者由此微生物菌株得到的人工突变株。已知的高产人工突变株大多为α-氨基丁酸(α-AB)、α-氨基-β-羟基戊酸(AHV)和2-噻唑丙氨酸(2-TA)等抗性，并且属于棒杆菌属、短杆菌属和埃希氏属等。

就棒杆菌或短杆菌来说，目前已有公开载体质粒，这些质粒在细菌中是可以自主复制的，并具有药物抗性标记基因(参见US4514502)，并有公开用于把基因引入细菌细胞的方法(例如JP2207791)，以及公开了通过利用前述的技术培养L-缬氨酸产生菌的可能性(例如WO0050624)。

乙酰羟酸合成酶AHAS是L-缬氨酸合成途径上的第一个共用酶也是关键酶，催化2分子丙酮酸脱羧合成1分子乙酰乳酸，即缬氨酸的前体。AHAS受三种支链氨基酸中的任何一种反馈抑制。三种支链氨基酸的半抑制浓度(IC₅₀)分别为：缬氨酸0.9mmol/L、异亮氨酸3.1mmol/L和亮氨酸6.0mmol/L，缬氨酸的抑制能力最强；当某一支链氨基酸浓度达5mmol/L时，该酶受抑制程度分别为：56％(缬氨酸)、49％(异亮氨酸)和48％(亮氨酸)；需要指出的是，任意两种支链氨基酸组合，甚至全部三种支链氨基酸协同抑制，AHAS被抑制程度不超57％。对谷氨酸棒杆菌AHAS调节亚基进行定点突变，获得了解除反馈抑制的突变体。对谷氨酸棒杆菌IlvN上3个相连的氨基酸残基进行替换，得到一不受任何支链氨基酸抑制的突变体。这些结果说明：在谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)IlvN上三种支链氨基酸的结合位点为同一个变构位点，但该位点对三种氨基酸的亲和性不同。

二羟酸还原异构酶AHAIR是L-缬氨酸合成途径上的第二个酶，催化乙酰乳酸生成2，3-二羟基异戊酸。反应包括烷基的异构和还原；发生该反应还需要Mg²⁺(激活剂)和NADPH(氢供体)。

二羟酸脱水酶DHAD是L-缬氨酸合成途径上的第三个酶，催化2，3-二羟基异戊酸生成2-酮异戊酸。

支链氨基酸转氨酶TA是支链氨基酸合成途径上的最后一个共用酶。转氨酶B、转氨酶C和芳香转氨酶(编码基因分别为ilvE、avtA和tyrB)在支链氨基酸的合成中具有催化活性，但主要由转氨酶B催化三种支链氨基酸合成的最后一步反应。

由于L-缬氨酸生产菌株通常通过多次诱变和逐级筛选而获得，耐热性缺失，L-缬氨酸发酵生产一般采用低于35℃发酵，如传统的31℃72h发酵。然而L-缬氨酸生物合成途径的酶的最适温度却在35℃以上，TA：30-35℃，DHAD：37℃，AHAIR：45℃，AHAS：50℃。传统发酵的温度低于L-缬氨酸生物合成途径的酶的最适温度。相反，野生型菌株却能在高温下生长良好，具有较高的代谢强度。

在野生型菌株中表达L-缬氨酸生物合成途径的酶的基因，并采用高温短时发酵的方法并没有建立。高温短时发酵不仅能缩短发酵周期、节约成本和提高设备利用率，而且也能节省大量冷却水，而使用大量冷却水是在传统发酵中必需的，特别是在夏季、热带和亚热带地区。

发明内容

本发明的目的之一是克隆L-缬氨酸产生菌L-缬氨酸生物合成途径的酶的基因，并解析其序列。

本发明的另一目的是获得解除三种支链氨基酸对乙酰羟酸合成酶AHAS。

本发明的又一目的是表达L-缬氨酸生物合成途径的酶的基因，提高L-缬氨酸的产量。

本发明的再一目的是根据L-缬氨酸生物合成途径的酶反应的最适温度，构造高温短时发酵模型。

本发明的目的还在于提供一种耐高温的缬氨酸产生菌株。

此外，本发明的目的还包括提供一种缬氨酸产生菌株，其中如下L-缬氨酸生物合成途径的酶的活性得到增强：

a)ilvBN基因编码的乙酰羟酸合成酶AHAS；

b)ilvC基因编码的乙酰羟酸还原异构酶AHAIR；

c)ilvE基因编码的支链氨基酸转氨酶TA。

以及，本发明的目的是提供一种高温短时发酵L-缬氨酸的方法。

为实现上述发明目的，本发明采用了如下技术方案：

一种用于发酵生产L-缬氨酸的重组DNA，其特征在于：该重组DNA包括解除了三种支链氨基酸对乙酰羟酸合成酶的反馈抑制的编码乙酰羟酸合成酶的DNA序列、编码二羟基还原异构酶的DNA序列以及编码支链氨基酸转氨酶的DNA序列。

具体而言，所述解除了三种支链氨基酸对乙酰羟酸合成酶的反馈抑制的乙酰羟酸合成酶从N端开始计算，该乙酰羟酸合成酶催化亚基的第30位的赖氨酸突变为谷氨酰胺，第156位的天冬酰胺突变为天冬氨酸，第233位的缬氨酸突变为异亮氨酸，其序列见SEQ ID NO：10，且该乙酰羟酸合成酶调节亚基的20位的甘氨酸突变为天冬氨酸，21位的异亮氨酸突变为天冬氨酸，22位的异亮氨酸突变为苯丙氨酸，42位的丙氨酸突变为缬氨酸，47位的组氨酸突变为亮氨酸，其序列见SEQ ID NO：11；

所述二羟酸还原异构酶是来源于棒杆菌或短杆菌的二羟酸还原异构酶，其具有与SEQ ID NO：12实质相同的氨基酸序列；

所述支链氨基酸转氨酶是来源于棒杆菌或短杆菌的支链氨基酸转氨酶，其具有与SEQ ID NO：14实质相同的氨基酸序列。

一种棒杆菌或短杆菌，其特征在于，它包含如上所述的重组DNA。

进一步的讲，该棒杆菌或短杆菌是导入如权利要求1所述重组DNA而转化过的。

如上所述棒杆菌或短杆菌在发酵生产L-缬氨酸工艺中的应用。

一种生产L-缬氨酸的方法，其特征在于，该方法为：在发酵培养基中对如上所述的棒杆菌或短杆菌进行培养，生产L-缬氨酸，所述培养温度在31℃～40℃。

优选的，所述培养温度为31℃，培养时间72h。

优选的，所述培养温度为34℃～40℃，培养时间在48h左右。

根据本发明，在黄色短杆菌中表达L-缬氨酸产生菌种的L-缬氨酸合成基因，根据L-缬氨酸生物合成酶的最适温度，采用高温短时发酵，菌株的代谢强度得到提高，L-缬氨酸生物合成酶的活性提高，L-缬氨酸的产量和糖酸转化率提高。

本发明可被运用于采用黄色短杆菌的L-缬氨酸的生产。

为达到上述目标，本案发明人进行了长期研究和大量实践，并发现与现有技术相比，本发明采用表达L-缬氨酸产生菌L-缬氨酸生物合成基因，能大大提高L-缬氨酸的产量；且根据L-缬氨酸生物合成酶的最适温度，构建发酵模型，尤其是高温短时发酵模型，菌株的代谢强度得到提高，L-缬氨酸生物合成酶的活性提高，L-缬氨酸的产量和糖酸转化率可得到进一步提高。

附图说明

图1是L-缬氨酸生物合成路线图，其中TD-苏氨酸脱氨酶、AHAS-乙酰羟酸合成酶、AHAIR-二羟酸还原异构酶、DHAD-二羟酸脱水酶、TA-支链氨基酸转氨酸和IPMS-异丙基苹果酸合成酶。

图2是pDXW-8-ilvEBN^rC图谱；

图3是L-缬氨酸产生菌和工程菌在不同温度下生长情况的照片；

图4A-4H是在不同发酵条件L-缬氨酸的发酵参数，其中(A)干重DCW，(B)比生长速率μ，(C)残糖浓度，(D)比耗糖速率q_s，(E)L-缬氨酸产量，(F)L-缬氨酸比生产速率q_val，(G)AHAS活性，(H)副产物，并且：

□和曲线1：黄色短杆菌Brevibacteriumflavum ATCC1406731℃、72h发酵；

△和曲线2：黄色短杆菌B.flvumATCC14067/pDXW-8-ilvEBN^rC 31℃、72h发酵；

■和曲线3：黄色短杆菌B.flavum ATCC14067/pDXW-8-ilvEBN^rC 34℃、48h发酵；

和曲线4：黄色短杆菌B.flavum ATCC14067/pDXW-8-ilvEBN^rC 37℃、48h发酵；

*和曲线5：黄色短杆菌B.flavum ATCC14067/pDXW-8-ilvEBN^rC 40℃、48h发酵。

具体实施方式

如下详细说明本发明的实现途径：

用于提供L-缬氨酸生物合成基因的L-缬氨酸产生菌株的筛选

“L-缬氨酸产生菌株”是指在培养基中培养该菌株时，在培养基中有积累L-缬氨酸的能力。L-缬氨酸产生菌株大多为从自然环境分离的微生物菌株或者由此微生物菌株诱变选育得到的人工突变株，如营养缺陷型突变株、结构类似物抗性株或者代谢调节突变株等，且营养缺陷型突变、结构类似物抗性或者代谢调节突变等特性可以单独赋予或者两项或多项联合赋予。已知的高产人工突变株大多为L-亮氨酸渗透缺陷型、α-氨基丁酸(a-AB)、α-氨基-β-羟基戊酸(AHV)和2-噻唑丙氨酸(2-TA)等抗性。

L-缬氨酸产生菌大致有：谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)、黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)和乳糖发酵短杆菌(Brevibacteriumlactofermentum)。

L-缬氨酸产生菌L-缬氨酸生物合成途径的酶的基因的解析和制备

L-缬氨酸生物合成途径的酶来源于上述L-缬氨酸产生菌，具有营养缺陷型突变、结构类似物抗性和代谢调节突变的特性。

(1)用于本发明方法中编码突变体乙酰羟酸合成酶AHAS的ilvBN

用于本发明方法中的编码突变体乙酰羟酸合成酶AHAS具有突变：

(a)从N端开始计算，乙酰羟酸合成酶催化亚基的第30位的赖氨酸突变为谷氨酰胺，第156位的天冬酰胺突变为天冬氨酸，第233位的缬氨酸突变为异亮氨酸；

(b)从N端开始计算，乙酰羟酸合成酶调节亚基的42位的丙氨酸突变为缬氨酸，47位的组氨酸突变为亮氨酸。

(2)用于本发明方法中编码突变体乙酰羟酸合成酶AHAS的ilvBN^r

用于本发明方法中的编码突变体乙酰羟酸合成酶AHAS具有突变，解除了三种支链氨基酸对AHAS的反馈抑制：从N端开始计算，乙酰羟酸合成酶调节亚基的20位的甘氨酸突变为天冬氨酸，21位的异亮氨酸突变为天冬氨酸，22位的异亮氨酸突变为苯丙氨酸。ilvBN^r编码的AHAS的催化亚基序列如SEQID NO：10，AHAS的调节亚基序列如SEQ ID NO：11。

ilvN^r是通过体外定点突变获得的，突变体通过采用突变引物PCR和Dpn I处理获得的，方法参照《Molecular Cloning：ALaboratory Manual》，ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，2001。

(3)用于本发明方法中编码乙酰羟酸还原异构酶AHAIR的ilvC

编码乙酰羟酸还原异构酶AHAIR的ilvC与编码乙酰羟酸合成酶AHAS的ilvBN在基因组上形成一个操纵子。ilvBN^rC序列如SEQ ID NO：9。乙酰羟酸还原异构酶AHAIR序列如SEQ ID NO：12。

(4)用于本发明方法中编码支链氨基酸转氨酶TA的ilvE

用于本发明方法中的编码支链氨基酸转氨酶TA的ilvE具有突变，消除了1082位的EcoR I位点，但支链氨基酸转氨酶TA得序列没有改变。消除了ilvEEcoR I位点的序列如SEQ ID NO：13，支链氨基酸转氨酶TA序列如SEQ IDNO：14。

消除ilvE EcoR I位点是通过体外定点突变获得的，突变体通过采用突变引物PCR和Dpn I处理获得的，方法参照《Molecular Cloning：A LaboratoryManual》，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，2001。

表达质粒的构造

将上述获得的L-缬氨酸产生菌L-缬氨酸生物合成途径的酶的基因与合适的棒杆菌或短杆菌表达载体相连，如pDXW-8(参阅公开号为CN101693901A的发明专利)，其中ilvE在ilvBNC或ilvBN^rC之前，即pDXW-8-ilvEBNC或pDXW-8-ilvEBN^rC。

突变体乙酰羟酸合成酶AHAS抗反馈抑制作用

将pDXW-8-ilvEBNC和pDXW-8-ilvEBN^rC分别转化大肠杆菌JM109，诱导表达，测定其AHAS酶活，并添加抑制物L-缬氨酸、L-亮氨酸和L-异亮氨酸测定其AHAS酶活。

用于构造基因工程菌的棒杆菌或短杆菌宿主菌

用于构造基因工程菌的棒杆菌或短杆菌宿主菌是耐高温的棒杆菌或短杆菌，如：谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum ATCC 13032)、黄色短杆菌(Brevibacterium flavum ATCC 14067)和乳糖发酵短杆菌(Brevibacteriumlactofermentum ATCC 13869)。

构造L-缬氨酸生产菌基因工程菌

将上述构造的表达质粒pDXW-8-ilvEBN^rC转化上述棒杆菌或短杆菌宿主菌，构造L-缬氨酸产生菌基因工程菌。

利用构造的L-缬氨酸产生菌基因工程菌发酵生产L-缬氨酸

可采用常规方法进行培养，采用典型培养基，其中含有碳源、氮源、矿物质以及所需要的诸如氨基酸、维生素等微量有机营养物。另外，合成或天然的培养基均可采用。只要菌株可以利用以进行培养，任何碳源和氮源均可采用。

就碳源而言，诸如葡萄糖、甘油、果糖、蔗糖、麦芽糖、甘露糖、半乳糖、淀粉水解物，糖蜜等糖类，以及诸如醋酸、柠檬酸等有机酸均可采用。另外，乙醇等醇类也可以单独或者与其他碳源组合使用。

就有机微量营养而言，氨基酸、维生素、脂肪酸、核酸，酵母提取物，玉米浆、大豆蛋白分解产物等物质均可采用。当某种营养缺陷型突变株的生长需要一种氨基酸或类似的物质时，优先添加该需要营养物。

就矿物质而言，磷酸盐、镁盐、铁盐和锰盐等等均可采用。

培养条件为通风搅拌，以相对溶氧5％-20％为宜。培养温度控制在20-45℃，pH5-9，培养过程中pH下降时，可以加入碳酸钙、氨水或气氨予以中和。用上述方法培养48-80h后，培养基中就会积累大量的L-缬氨酸。

培养结束后，可以采用常规方法从发酵培养基中收集L-缬氨酸。

利用构造的L-缬氨酸产生菌基因工程菌高温短时发酵生产L-缬氨酸

根据L-缬氨酸生物合成酶的最适温度，采用高温短时发酵，提高菌株的代谢强度，提高L-缬氨酸生物合成酶的活性，提高L-缬氨酸的产量和糖酸转化率。

a)在培养基中采用L-缬氨酸产生菌基因工程菌34℃、48h发酵生产L-缬氨酸；

b)在培养基中采用L-缬氨酸产生菌基因工程菌37℃、48h发酵生产L-缬氨酸；

c)在培养基中采用L-缬氨酸产生菌基因工程菌40℃、48h发酵生产L-缬氨酸。

发酵过程中，检测OD、残糖、L-缬氨酸浓度、AHAS活性和副产物等参数，计算比生长速率、比耗糖速率和比产酸速率等参数。比较不同发酵的效率。

以下结合若干较佳实施例对本发明的技术方案作更为详细的说明：

实施例1构造表达质粒pDXW-8-ilvEBN^rC

a)ilvBNC操纵子和ilvE基因的克隆：黄色短杆菌B.flavum NV128基因组作为模板，SEQ ID NO：1(含SD序列)和SEQ ID NO：2为引物，PCR获得ilvBNC操纵子，ilvBNC操纵子与T载体相连为pUCm-T-ilvBNC；B.flavum NV128基因组作为模板，SEQ ID NO：5(含SD序列)和SEQ ID NO：6为引物，PCR获得ilvE基因，ilvE基因T载体相连为pUCm-T-ilvE。

b)ilvN定点突变解除三种支链氨基酸对乙酰乳酸合成酶的反馈抑制：以pUCm-T-ilvBNC为模板，SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4为引物，PCR获得突变体，DpnI法筛选突变体。测序验证突变体，突变体命名为pUCm-T-ilvBN^rC。确保乙酰乳酸合成酶调节亚基第20-22位的Gly-Ile-Ile突变为Asp-Asp-Phe。

c)消除ilvE基因中的EcoRI位点：以pUCm-T-ilvE为模板，SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8为引物，PCR获得突变体，DpnI法筛选突变体。测序验证突变体，突变体命名为pUCm-T-ilvEM。

d)构建质粒pDXW-8-ilvEBN^rC：从pUCm-T-ilvBN^rC胶回收获得ilvBN^rC，用EcoRI和HindIII位点与pDXW-8相连，形成pDXW-8-ilvBN^rC，长度为13152

bp。从pUCm-T-ilvEM胶回收获得ilvE，用EcoRI位点与pDXW-8-ilvBN^rC，验证其连接方向，命名为pDXW-8-ilvEBN^rC，长度为14,313bp。如图2所示。

实施例2构造大肠杆菌JM109/pDXW-8-ilvEBNC和JM109/pDXW-8-ilvEBN^rC

(1)大肠杆菌JM109感受态制备

a)LB培养基JM109培养至OD值0.3-0.5。

b)4℃3,000g(或6,000r/min)5min。弃上清，收菌。

c)重悬于原培养体积1/10的TSB中。

e)冰上置10min，冰上分装，每管60μL，-70℃保存。

TSB配方(需高压)，LB(pH6.1)含：10％PEG 3350或4000、5％DMSO(二甲亚砜)、10mmol/L MgCl₂、10mmol/L MgSO₄·7H₂O、10％甘油。

5×KCM溶液配方：0.5mol/L KCl、0.15mol/L CaCl₂、0.25mol/L MgCl₂。

(2)转化：

a)质粒pDXW-8-ilvEBNC和pDXW-8-ilvEBN^rC分别5～10μL、5×KCM溶液10μL、双蒸水30μL，(共50μL)混匀，置冰上。

b)从-70℃冰箱中各取1支感受态细胞，置冰上。融化后立即取50μL，加入步骤1中的混合液中，轻轻吹打数次混匀(不可用力过大，不可涡旋)，立即置冰上。

c)冰上放置20min。

d)室温放置10min。

e)加入500μL新鲜LB，150r/min 37℃1h。

f)6,000r/min 5min离心收菌。留150μL上清(其余上清丢弃)，吹打数次重悬菌体，涂布含50μg/mL卡那LB平板。

(3)分别挑取单菌落扩大培养，获得JM109/pDXW-8-ilvEBNC和JM109/pDXW-8-ilvEBN^rC

实施例3构造工程菌B.flavum ATCC 14067/pDXW-8-ilvEBN^rC

(1)单菌落接种于30mL LBG培养基，30℃培养16h。

(2)接种于Epo培养基至OD₆₀₀＝0.3，30℃培养OD₆₀₀＝0.9。

(3)冰上冷却10min，4℃4,000g离心10min。

(4)用15mL 10％甘油洗4次，用0.2mL 10％甘油重悬。

(5)加入适量DNA冰上冷却，0.1cm电击杯1.8kV 10S。

(6)加入1mL LBHIS培养基30℃培养1h。

(7)涂布LBHIS固体卡那平板，培养36h。

前述Epo培养基配方：10g/L trypton(蛋白胨)、5g/L yeast extract(酵母提取物)、10g/L NaCl、4g/L isonicotinic acid hydrazide(异烟肼)、25g/L glycine(甘氨酸)、0.1％Tween 80。

前述LBHIS培养基配方：5g/L trypton(蛋白胨)、5g/L NaCl、2.5g/L yeastextract(酵母提取物)、18.5g/L Brain Heart Infusion powder(脑心浸液)、91g/Lsorbitol(山梨醇)。

实施例4黄色短杆菌的耐热性鉴定

为了证实温度对黄色短杆菌的影响，检验了L-缬氨酸产生菌种黄色短杆菌B.flavum NV 128和工程菌B.flavum ATCC 14067/pDXW-8-ilvEBN^rC在31℃和37℃的生产情况。两株菌分别在LBG(LB培养基中添加了5g/L的葡糖糖)平板上生长36h，B.flavum NV12831℃生长良好但不能再37℃生长，而工程菌B.flavum ATCC14067/pDXW-8-ilvEBN^rC在31℃和37℃都生长良好，如图3所示。

实施例5突变体乙酰羟酸合成酶AHAS抗反馈抑制作用

离心收集细胞，用冰冷的2％KCl洗两次，用破壁缓冲液悬浮细胞，-20℃保存。(pH 7.3含0.5mmol/L二硫苏糖醇DTT和20％的甘油的100mmol/L磷酸二氢钾溶液)粗酶液用超声波破碎法获得(20kHz，200个循环2s间隔3s)。蛋白定量按照Bradford定量方法。

AHAS活性测定基于AHAS催化丙酮酸生产的乙酰乳酸转化为3-羟基丁酮来测定的。反应体系：pH 7.4的60mmol/L的磷酸二氢钾缓冲液，50mmol/L的丙酮酸，10mmol/L MgCl₂，100μmol/L的硫胺素焦磷酸(TPP)，100μmol/L黄素腺礤岭双核苷酸(FAD)。反应体系为2.5mL，添加100μL的粗酶液启动反应，40℃反应1h；添加200μL的3mol/L H₂SO₄酸化乙酰乳酸为3-羟基丁酮，60℃反应15min；添加1mL0.5％肌酸和2mL溶于2.5mol/L NaOH的5％α-萘酚，60℃保温20min形成红色络合物(总体积5.8mL)。525nm测定吸光值。AHAS活性定义为：1min催化丙酮酸形成1μmol乙酰乳酸的酶量为一个活力单位(u)。

表1AHAS活性

“-”表示不添加，“+”表示添加

实施例6工程菌B.flavum ATCC 14067/pDXW-8-ilvEBN^rC 7L罐发酵生产L-缬氨酸

(1)发酵所用培养基

表2种子培养基

表3发酵培养基

(2)7L发酵罐发酵方法

3.5L的装液量，8％(v/v)的接种量，用氨水来调节pH 7.0并提供氮源，80％的葡萄糖提供碳源维持残糖浓度为2-3％，相对溶氧控制在10％和20％之间，12h时IPTG诱导，诱导浓度为1mmol/L。每隔4h取样一次，测定OD、残糖、氨基酸浓度及核对pH。DCW与OD关系为DCW(g/L)＝0.42×OD₅₆₂(R²＝0.9881)。

(3)不同发酵条件L-缬氨酸发酵动力学分析

图4为不同发酵条件L-缬氨酸发酵参数，31℃、72h发酵(32h开始补糖，64h停止补糖)，对B.flavumATCC14067和B.flavum ATCC14067/pDXW-8-ilvEBN^rC分别而言，最大干重DCW是21.24±0.74g/L和20.70±0.72g/L；最大比生长速率到达0.306h^-1(6h)和0.298h^-1(6.5h)；L-缬氨酸产量为0.51±0.03

g/L和30.08±0.92g/L；最大AHAS活力为0.66±0.09u和4.58±0.17u。这些结果表明：过表达ilvEBN^rC对B.flavum ATCC14067生长没有显著影响，但是，因为L-缬氨酸生物合成途径酶活的提高对L-缬氨酸的产量有显著提高。

采用B.flavum ATCC 14067/pDXW-8-ilvEBN^rC菌株高温短时发酵(32h开始补糖，40h停止补糖)，最大干重DCW 34℃为22.05±0.66g/L，37℃为18.02±0.73g/L，40℃为14.42±0.58g/L；最大比生长速率31℃为0.298h^-1，34℃为0.372h^-1，37℃为0.273h^-1，40℃为0.287h^-1。这些结果表明B.flavumATCC14067最适生长温度在34℃左右。而40℃发酵时32h以后DCW减少，表明高温对黄色短杆菌的影响。图4D中曲线，当温度提高时，比耗糖速率变大，表明在高温时具有高的代谢速率，而这也是短时发酵的基础。

37℃、48h发酵获得最大L-缬氨酸产量38.08±1.32g/L、最大L-缬氨酸比生产速率0.133g/g/h、最大AHAS活力5.5±0.16u；34℃、48h发酵获得最大L-缬氨酸产量32.05±1.05g/L、最大L-缬氨酸比生产速率0.078g/g/h、最大AHAS活力4.82±0.14u；40℃、48h发酵获得最大L-缬氨酸产量24.12±1.05g/L、最大L-缬氨酸比生产速率0.112g/g/h、最大AHAS活力5.98±0.15u。这些结果表明很有必要保存适当的温度到达高酶活，进而到达高的L-缬氨酸产量和高的L-缬氨酸生产速率。

(4)不同发酵条件L-缬氨酸发酵效率分析

不同发酵条件的L-缬氨酸发酵参数如表4所示，图4H也表示副产物的分布。L-丙氨酸、L-谷氨酸、L-亮氨酸和L-异亮氨酸仍然是高温短时发酵中的主要副产物，但是随着温度的提高，L-丙氨酸和L-谷氨酸的浓度都在降低，L-丙氨酸和L-谷氨酸的最小浓度分别为0.23±0.012g/L和0.35±0.021g/L。

高温短时发酵在较少耗糖条件获得较高的转化率和较高的L-缬氨酸产量，37℃、48h发酵获得了最大的转化率0.241g/g和最大的L-缬氨酸产率0.793g/L/h。较少的耗糖和较高的转化率大大地降低了生产成本。高温短时发酵也节省了大量的冷却水，而使用大量冷却水是传统发酵必需的，特别是在热带、亚热带地区和夏季。

Claims (8)

1.用于发酵生产L-缬氨酸的重组DNA，其特征在于：该重组DNA包括解除了三种支链氨基酸对乙酰羟酸合成酶的反馈抑制的编码乙酰羟酸合成酶的DNA序列、编码二羟基还原异构酶的DNA序列以及编码支链氨基酸转氨酶的DNA序列。

2.如权利要求1所述的用于发酵生产L-缬氨酸的重组DNA，其特征在于：

所述解除了三种支链氨基酸对乙酰羟酸合成酶的反馈抑制的乙酰羟酸合成酶从N端开始计算，该乙酰羟酸合成酶催化亚基的第30位的赖氨酸突变为谷氨酰胺，第156位的天冬酰胺突变为天冬氨酸，第233位的缬氨酸突变为异亮氨酸，其序列见SEQ ID NO：10，且该乙酰羟酸合成酶调节亚基的20位的甘氨酸突变为天冬氨酸，21位的异亮氨酸突变为天冬氨酸，22位的异亮氨酸突变为苯丙氨酸，42位的丙氨酸突变为缬氨酸，47位的组氨酸突变为亮氨酸，其序列见SEQ ID NO：11；

所述二羟基还原异构酶是来源于棒杆菌或短杆菌的二羟基还原异构酶，其具有与SEQ ID NO：12实质相同的氨基酸序列；

所述支链氨基酸转氨酶是来源于棒杆菌或短杆菌的支链氨基酸转氨酶，其具有与SEQ ID NO：14实质相同的氨基酸序列。

3.一种棒杆菌或短杆菌，其特征在于，它包含如权利要求1所述的重组DNA。

4.根据权利要求3所述的棒杆菌或短杆菌，其特征在于，该棒杆菌或短杆菌是导入如权利要求1所述重组DNA而转化过的。

5.如权利要求3所述棒杆菌或短杆菌在发酵生产L-缬氨酸工艺中的应用。

6.一种生产L-缬氨酸的方法，其特征在于，该方法为：在发酵培养基中对如权利要求3所述的黄色短杆菌进行培养，生产L-缬氨酸，所述培养温度在31℃～40℃。

7.根据权利要求6所述的生产L-缬氨酸的方法，其特征在于，所述培养温度为31℃，培养时间72h。

8.根据权利要求6所述的生产L-缬氨酸的方法，其特征在于，所述培养温度为34℃～40℃，培养时间48h。

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