CN102283286A - 一种多菌株高活性乳酸菌饮料的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种多菌株高活性乳酸菌饮料制备的方法，是将脱脂乳粉复原成12.0%-16.0%的复原脱脂乳，采用95℃/8-10min热处理后，冷却至48-52℃，添加蛋白酶A，50℃酶解8-16h后，然后添加混合果蔬汁，95℃、8-10min灭酶并热处理，接种3%-5%乳酸菌混合发酵剂，42℃发酵20-30h，添加杀菌并冷却后的混合添加物，混合均匀后，采用15－20MPa进行均质灌装制备而成。本发明利用单菌株功能特性作为指标，进行合理组合，以多菌株作为发酵剂发酵含天然果蔬汁的脱脂乳酶解液，制备的乳酸菌饮料不仅活菌数量高，风味好，且产品的功能特性优于其中任一单菌株制备的乳酸菌饮料。
Description
技术领域
本发明属于食品领域，具体是高活性功能乳酸菌饮料的制备方法。
技术背景
乳酸菌饮料是一种深受广大消费者喜爱的健康饮品。近年来我国乳酸菌饮料产量持续保持快速增长，但目前我国市售乳酸菌饮料品质差异较大，且活菌数量普遍不高。市场上销售的乳酸菌饮料生产发酵剂主要分为两类：一类是传统的德士乳杆菌保加利亚亚种和嗜热链球菌混合发酵剂，另一类则是单菌株发酵剂。因此开发多菌株、活性高、功能特性良好的乳酸菌饮料不仅具有重要意义，且具有广阔的市场需求。
不同乳酸菌菌株间存在共生和拮抗作用，因此选择不同菌株间具有共生或非拮抗作用的乳酸菌进行混合，并以细菌生长及功能特性作为指标，合理组合作为发酵剂，与单菌株发酵剂相比有明显的优势，如由于存在多种微生物，有的菌株能够很好的产酸，有的菌株则更易产生香味物质，或者多种菌株之间可以提供生长所需物质，共同促进生长和形成更具有特殊风味的产物。因此，利用多菌株混合发酵剂开发高活性乳酸菌饮料具有十分重要的现实意义。
发明内容
为了克服前述和其它缺点，本发明者试图利用发酵性能和功能特性良好的复合菌株发酵脱脂乳酶解液与天然果蔬汁混合物，制备风味、功能特性良好的乳酸菌饮料。
本发明的目的是开发了一种多菌株混合发酵剂的菌株组合形式及其比例，具体而言，本发明全部使用发酵性能和功能特性良好的混合菌株进行发酵，发酵乳酸菌饮料不仅风味良好，功能特性优异，且易为消费者接受。
本发明所述的多菌株高活性乳酸菌饮料的制备方法，是将脱脂乳粉复原成12.0%-16.0%的复原脱脂乳，采用95℃/8-10min热处理后，冷却至48-52℃，添加蛋白酶A，50℃酶解8-16h后，然后添加混合果蔬汁，95℃/8-10min灭酶并热处理，接种3%-5%乳酸菌混合发酵剂，42℃发酵20-30h，添加杀菌并冷却后的混合添加物，混合均匀后，采用15－20MPa进行均质灌装制备而成。
本发明方法中所述的混合果蔬汁复合添加物的组成为：胡萝卜汁：西红柿汁：豆芽汁：紫薯汁为1：1：0.5：0.2（w/w），其添加比例为脱脂乳酶解液的25%-35%。
本发明方法中所述的乳酸菌混合发酵剂的菌株组成及比例为：嗜热链球菌（Streptococcus thermopilus）grx02，干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）Q，鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus rhamnosus）grx10，嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）CICC 21722，青春双歧杆菌（Bifidobacterium adolescentis）grx066按2:1:1:2:1（w/w）比例组合而成。
本发明方法中所述添加的混合添加物组成及比例为：低聚果糖：蔗糖：单甘酯：果胶：水按 1：8：0.02：0.2：47.6（w/w）混合，添加量为原复原脱脂乳量的1.6-1.8倍。
本发明对分离筛选的5株优良菌株进行组合，分析发酵特性，研究5株单菌株之间的相互作用，筛选出最优组合形式。对选择的最优组合形式的混合菌株制备发酵乳，进行体外功能性(抗氧化、降血压、降胆固醇、抑菌、耐酸耐胆盐)指标测定，进一步确定菌株组合形式。对筛选出的菌株组合进行增菌培养，确定提高混合菌株活菌数量的最佳工艺条件。
本发明利用单菌株功能特性作为指标，进行合理组合后，以多菌株作为发酵剂发酵含天然果蔬汁的脱脂乳酶解液，制备的乳酸菌饮料不仅活菌数量高，风味好，且产品的功能特性优于其中任一单菌株制备的乳酸菌饮料。
附图说明
图1是多菌株高活性乳酸菌饮料工艺流程图。
具体实施方式
本发明中所使用的材料可通过以下途径获得：
嗜热链球菌（Streptococcus thermopilus）grx02（保藏号为CGMCC No：2525）：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；
鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus rhamnosus）grx10（保藏号为CGMCC No：2526）：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；
青春双歧杆菌（Bifidobacterium adolescentis）grx066（保藏号为CGMCC No：2406）：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；
干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）Q：扬州大学乳品研究所保藏；（韩澄，扬州大学硕士论文，2011）；
干酪乳杆菌ACCC 10640：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；
嗜酸乳杆菌CICC 21722：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；
致病性大肠杆菌（E.coliACCC 01628）、沙门氏菌（Salmonella typhi CICC 21913）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus ATCC 25922）：购于中科院微生物所；
蛋白酶A（食品级）：购于日本田野酶制品株式会社；
低聚果糖、单甘脂、果胶、柠檬酸：均购于上海昊岳实业有限公司；
西红柿、胡萝卜、豆芽、紫薯、糖：均购于江苏省扬州市广陵区大润发超市。
本发明利用发酵性能和功能特性良好的乳酸菌菌株混合作为发酵剂发酵脱脂乳酶解液与天然果蔬汁混合物，制备风味、功能特性良好的乳酸菌饮料。具体而言，包括以下几个方面：
1. 发酵剂的制备
1.1 混合菌株的选定
通过对乳酸菌在消化道分布情况以及发酵特性的研究，确定采用5株功能特性良好的菌株（见表1）进行组合作为混合发酵剂（见表3）。
表1. 5株菌株生长特性及其分布
1.2菌株组合对发酵乳不同功能特性的影响
1.2.1功能特性测定方法
1.2.1.1体外抗氧化能力
(1)过氧化氢的耐受能力
在PTYG液体培养基中分别添加过氧化氢溶液，使培养基中的起始过氧化氢浓度分别为0.4，0.7，1.0mmol/L，并按1%的接种量接入乳酸菌发酵乳，37℃恒温培养18h后，分光光度计测其OD600nm值。观察乳酸菌在不同起始过氧化氢浓度下的生长状况。
(2)清除羟自由基(·OH)能力
在具塞试管中依次加入1.0mL的PBS(pH=7.4)，加入1.0mL的O-菲罗琳(浓度为2.5mmol/L)，1.0mL的FeSO4(浓度为2.5mmol/L)，H2O2(浓度为20.0mmol/L)，然后加入0.5mL乳酸菌发酵乳，37℃恒温水浴反应1.5h后，在536nm处测吸光值。每一吸光值平行测3次，取其平均值。
·OH清除率(%)= 
A0：不含样品和H2O2；A1：不含样品，含H2O2；A2：含样品和H2O2。
(3)清除二苯代苦味肼基自由基（DPPH·）能力
取乳酸菌发酵乳1.0mL与0.9mL无水乙醇混匀，再加入体积浓度为30.0mg/L DPPH溶液1.0mL于具塞试管中，摇匀，避光放置30min后用无水乙醇作参比测定其吸光度Ai。同时测定30.0mg/L DPPH溶液与等体积95%乙醇混合液的吸光度Ac，以及待测液与等体积95%乙醇混合液在517nm处的吸光度Aj。根据下列公式计算清除率。
清除率(%)=
Ac：未加待测液时DPPH溶液的吸光度；
Ai：加待测液时DPPH溶液的吸光度；
Aj：待测液在测定波长吸光度；测定波长517nm。
(4)总抗氧化能力
将乳酸菌发酵乳1.0mL与1.0mL pH6.6的磷酸盐缓冲液(0.2mol/L，pH6.6)混合，再加入1%的铁氰化钾1.0mL。混合物于50℃水浴20min后，加入1.0mL10%的三氯乙酸，3000r/min10min，取上清液2.5mL，加双蒸水2.5mL和0.1%的FeCl30.5mL反应10分钟后，700nm处测吸光度。吸光度越高，说明反应混合物的还原性越强，样品的总抗氧化能力越强。
1.2.1.2体外降胆固醇能力
参照GB/T 5009.128-2003食品中胆固醇的测定方法——硫酸铁铵比色法测定复合菌株的体外降胆固醇能力。将乳酸菌发酵乳以5%接种量接种到富胆固醇培养基中，培养48小时后取培养物0.2mL，加4.8mL的无水乙醇，3000r/min离心5min，取上清液2.0mL，加2.0mL硫酸铁铵显色剂，混匀，以便产生高热(大于80 ℃)促进生色，放置15min，待管内反应液冷却至室温，待反应管冷却到室温后，在15-60 min内测定OD560nm值。由标准曲线算出胆固醇浓度；降解率换算如下：
LE=
OD对照：添加2mL无水乙醇和2mL硫酸铁试剂，未添加发酵乳的含胆固醇的PTYG液体培养基OD560nm。
1.2.1.3 ACE抑制能力
ACE抑制活性测定方法具体操作步骤和设计如表2所示。
表2 ACE抑制率体外检测方法
根据表2将各试剂加入到试管中，在37℃水浴中反应30min，反应结束后马上加入1.0moL/L HCl以终止反应(样品c需提前加入HCl)；然后于各试管中加入乙酸乙酯1.5mL，旋涡混合后进行离心(4000r / min，10min)；吸取1.0mL乙酸乙酯于另一试管中，放入烘箱中，100℃挥发溶剂30min，冷却后加入去离子水3.0mL，旋涡混合后在228nm下测定其吸光值，计算公式如下：
ACE抑制率(%)=
Aa：样a的光密度值，样a在反应中加抑制剂，是ACE与HHL同时反应的样品；
Ab：样b的光密度值，样b在反应中不加抑制剂，反应结束后添加抑制剂以维持整个反应体系平衡，是ACE与HHL完全反应的对照；
Ac：样c的光密度值，样c在反应前先失活ACE，再加抑制剂，是ACE与HHL反应的空白。
1.2.1.4对致病菌的抑制能力
采用单层琼脂平板扩散法。将LB培养基，倒入琼脂平板上，待冷凝后，将致泻性大肠杆菌(E.coliSDZC07)菌液0.2mL于培养基平板上，用无菌涂抹棒在超净工作台内将大肠杆菌涂抹均匀，内通无菌空气，放置1h吹干，待表面的菌液固定后打孔，孔直径10mm，孔深3mm，将发酵乳注入孔内至满孔，不可溢出，于37℃微需氧环境培养10h，观察结果、采用十字交叉法测量抑菌圈直径，用空白培养基作阴性对照，用LB培养液做阳性对照，本试验重复三次。判定标准：无明显抑菌圈为不抑菌；直径11-15mm低度抑菌；16-20mm中度抑菌；直径＞20mm为高度抑菌。沙门氏菌（Salmonella typhi CICC 21913）与金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus ATCC 25922）的抑菌试验方法同上。
1.2.2 功能特性比较结果
对混合菌株发酵剂制备的发酵乳的体外功能性(抗氧化、降血压、降胆固醇、抑菌)指标进行测定，比较不同混合菌株各项功能指标，并与单菌株对比，进一步确定菌株组合形式。菌株组合方式如表3所示，不同组合菌株的发酵乳功能特性结果如表4-7所示。
表3 发酵剂菌株组合方式
| 发酵剂 | 组合方式 | 发酵剂 | 组合方式 |
| D1 | 1:1:1:1:1 | D17 | 1:2:2:2:1 |
| D2 | 1:2:1:1:1 | D18 | 1:1:2:2:2 |
| D3 | 1:1:2:1:1 | D19 | 1:2:1:2:2 |
| D4 | 1:1:1:2:1 | D20 | 1:2:2:1:2 |
| D5 | 1:1:1:1:2 | D21 | 2:2:2:1:1 |
| D6 | 2:1:1:1:1 | D22 | 2:2:1:2:1 |
| D7 | 1:2:2:1:1 | D23 | 2:2:1:1:2 |
| D8 | 1:2:1:2:1 | D24 | 2:1:2:2:1 |
| D9 | 1:2:1:1:2 | D25 | 2:1:2:1:2 |
| D10 | 1:1:2:2:1 | D26 | 2:1:1:2:2 |
| D11 | 1:1:2:1:2 | D27 | 2:2:2:2:1 |
| D12 | 1:1:1:2:2 | D28 | 2:2:2:1:2 |
| D13 | 2:2:1:1:1 | D29 | 2:2:1:2:2 |
| D14 | 2:1:2:1:1 | D30 | 2:1:2:2:2 |
| D15 | 2:1:1:2:1 | D31 | 1:2:2:2:2 |
| D16 | 2:1:1:1:2 |
注：其中的组合方式是指将Streptococcus thermopilus grx02、 Lactobacillus casei Q、Lactobacillus rhamnosus grx10、Lactobacillus acidophilus CICC 21722、Bifidobacterium adolescentis grx066分别按不同比例组合而成。
表4 乳酸菌发酵乳的功能特性
表5 乳酸菌发酵乳的功能特性
表6乳酸菌发酵乳的功能特性
表7乳酸菌发酵乳的功能特性
综合抗氧化、体外降胆固醇、体外降血压及抑菌试验可以得出，混合菌株选用组合D15即将S. thermopilus grx02、L. casei Q、L. rhamnosus grx10、L. acidophilus CICC 21722、B. adolescentis grx066采用2:1:1:2:1组合制备的混合发酵剂生产的发酵酸乳，综合功能性指标优于单菌株及其它组合菌株的水平。
2．复原脱脂乳酶解液的制备及对乳酸菌发酵活菌数量影响
将脱脂乳粉复原成12.0%-16.0%（w/w）的复原脱脂乳，采用95℃/8-10min热处理后，冷却至48-52℃，添加蛋白酶A，50℃酶解8-16h后，95℃/8-10min灭酶并热处理，接种3%-5%乳酸菌混合发酵剂，42℃发酵20-30h。通过对发酵液活菌数量的比较发现，酶解脱脂乳发酵液的活菌数量达到 1.56×109CFU/mL，是未经酶解的发酵液活菌数量8.0×108CFU/mL的1.95倍。
3. 天然混合果蔬汁的制备及对乳酸菌发酵活菌数量影响
西红柿汁：西红柿洗净、去皮、称重，利用西红柿与水1:1榨汁，过滤，冷却备用。
胡萝卜汁：胡萝卜洗净、去皮、切碎、称重，利用胡萝卜与水1:1预煮，榨汁、过滤，冷却备用。
紫薯汁：紫薯洗净、去皮、切碎、称重，按水与紫薯3:1预煮，榨汁、过滤，冷却备用。
豆芽汁：绿豆芽洗净、称重，按绿豆芽与水1:1预煮，榨汁、过滤，冷却备用。
将上述制得的天然果蔬汁按西红柿汁：胡萝卜汁：紫薯汁：豆芽汁为1：1：0.5：0.2（w/w）进行混合，制得天然混合果蔬汁。
将酶解脱脂乳添加25%－35%（w/w）上述制备的混合果蔬汁，采用95℃/8-10min的灭酶并热处理后，冷却到42－45℃，并接种3%－5％的乳酸菌混合发酵剂于42℃发酵20－30h，活菌数量达到 7.3×109CFU/mL，是未经酶解的发酵液活菌数量8.0×108CFU/mL的9.13倍，是酶解液发酵活菌数量1.56×109CFU/mL的4.56倍。
4. 混合添加物的添加
以低聚果糖：蔗糖：单甘酯：果胶：水按 1：8：0.02：0.2：47.6（w/w）混合，灭菌后，按原复原脱脂乳量的1.6-1.8倍与发酵液进行混合，用柠檬酸调节，使产品的滴定酸度在55-60°T之间，pH在3.8-4.2之间。
5.均质
采用二级均质(15-20Mpa)，均质温度保持45-50℃，以提高乳酸菌饮料的的乳化稳定性，使产品保持均匀稳定的状态，并且产品口感细腻。
6.灌装、冷藏
产品在无菌条件下灌装，在2-10℃低温条件下冷藏，产品运输及销售过程中也应保持冷链。
实施例
下述实施例阐述了本发明的实践和目前优选的实施方式。
但是，应理解，本领域熟练的技术人员在考虑到本公开内容之后可在本发明的精神和范围内做出改动和改进。
实施例1 高活性多菌株乳酸菌饮料的制备方法
流程如图1：12％（非脂乳固体）的复原脱脂乳100kg→95℃/10min热处理后，冷却至50℃左右→添加15g食品级蛋白酶A→50℃酶解12h→加入30kg混合果蔬汁→混匀，并调节pH至6.6左右→95℃/10min热处理→冷却42℃左右→接入3% 的混合发酵剂（由Streptococcus thermopilus grx02，Lactobacillus casei Q，Lactobacillus rhamnosus grx10，Lactobacillus acidophilus CICC 21722，Bifidobacterium adolescentis grx066采用2:1:1:2:1组合制备而成）→42℃恒温发酵24h→加入170kg灭菌的混合添加物（低聚果糖3kg、蔗糖24kg、单甘酯0.06kg、果胶0.6kg、水143kg），并用柠檬酸调节混合料的pH在3.8-4.2之间，滴定酸度在55-60°T之间→均质（15-20MPa）→灌装、冷藏→制得300kg乳酸菌饮料。
实施例2 高活性多菌株乳酸菌饮料的制备方法
流程如图1：16％（非脂乳固体）的复原脱脂乳100kg→95℃/8min热处理后，冷却至50℃左右→添加18g食品级蛋白酶A→50℃酶解15h→加入25kg混合果蔬汁→混匀，并调节pH至6.6左右→95℃/10min热处理→冷却42℃左右→接入4% 的混合发酵剂（由Streptococcus thermopilus grx02，Lactobacillus casei ACCC 10640，Lactobacillus rhamnosus grx10，Lactobacillus acidophilus CICC 21722，Bifidobacterium adolescentis grx066采用2:1:1:2:1组合制备而成）→42℃恒温发酵20h→加入175kg灭菌的混合添加物（低聚果糖3.1kg、蔗糖24.6kg、单甘酯0.06kg、果胶0.6kg、水146.6kg），并用柠檬酸调节混合料的pH在3.8-4.2之间，滴定酸度在55-60°T之间→均质（15-20MPa）→灌装、冷藏→制得300kg乳酸菌饮料。
Claims (4)
1.一种多菌株高活性乳酸菌饮料的制备方法，该方法特征在于，将脱脂乳粉复原成12.0%-16.0%(w/w)的复原脱脂乳，采用95℃/8-10min热处理后，冷却至48-52℃，添加蛋白酶A，50℃酶解8-16h后，然后添加混合果蔬汁，95℃、8-10min灭酶并热处理，接种3%-5%(w/w)乳酸菌混合发酵剂，42℃发酵20-30h，添加杀菌并冷却后的混合添加物，混合均匀后，采用15－20MPa进行均质灌装制备而成。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，添加的混合果蔬汁的组成为：
胡萝卜汁：西红柿汁：豆芽汁：紫薯汁为1：1：0.5：0.2（w/w），其添加比例为脱脂乳酶解液的25%-35%(w/w)。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，乳酸菌混合发酵剂的菌株组成及比例为嗜热链球菌（Streptococcus thermopilus），干酪乳杆菌（Lactobacillus casei），鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus rhamnosus），嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus），青春双歧杆菌（Bifidobacterium adolescentis）按2:1:1:2:1（w/w）比例组合而成。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的混合添加物组成及比例为：低聚果糖：蔗糖：单甘酯：果胶：水按 1：8：0.02：0.2：47.6（w/w）混合，添加量为原复原脱脂乳量的1.6-1.8倍(w/w)。
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