CN102282170A - 从浆细胞产生抗体的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及产生抗体包括单克隆抗体的方法，包括培养有限数目的浆细胞。本发明还涉及鉴定抗体的方法，其是在由培养的浆细胞产生的抗体上进行测定以确定它们的功能、结合特异性、表位特异性和/或它们中和毒素或者病原体的能力。本发明还涉及由本发明的方法产生的抗体或者和抗体片段以及使用所述抗体或者抗体片段的方法。
Description
本申请要求以下各项申请的优先权：申请日为2008年10月22日的英国专利申请No.0819376.5、申请日为2009年5月27日的美国临时专利申请系列号No.61/181,582、申请日均为2009年7月27日的PCT专利申请No.PCT/US2009/051851和美国专利申请No.12/509,731。
背景技术
浆细胞是终末分化的非增殖性细胞，它们以非常高速率分泌抗体(每秒几千个分子，相应于每天每个细胞大约30-50pg)。
从浆细胞分离抗体例如单克隆抗体依赖于免疫球蛋白基因的克隆及表达。这可以使用分离自浆细胞的混杂的VH和VL基因的噬菌体展示文库进行，或者通过用单细胞PCR从单浆细胞分离成对VH和VL基因而进行。但是，为了筛选由浆细胞产生的抗体，免疫球蛋白基因需要以重组形式克隆及表达以确定编码抗体的特异性和功能性质。这个方法是困难的、昂贵的、耗时的、不适于高通量且不能高效获得由浆细胞所有组成成分(total repertoire)的一小部分产生的稀有抗体。
因此，需要鉴定更高效的适于高通量从浆细胞分离和筛选抗体例如单克隆抗体的方法。
发明概述
本发明部分基于发现了从浆细胞产生抗体的有效及高通量方法，其使得无需依赖于免疫球蛋白基因的克隆及表达便能表征抗体。用本发明产生的抗体可以通过多重筛选进行表征，包括结合、功能和/或中和测定。本发明提供了鉴定由浆细胞产生的稀有抗体的方法。
因此，在本发明一个方面，本发明提供了从浆细胞产生抗体的方法，包括培养有限数目的浆细胞。在一个实施方案中，本发明提供了从浆细胞产生单克隆抗体的方法，包括以单细胞培养物培养浆细胞。本发明的方法可进一步包括表征抗体或者抗体片段。抗体或者抗体片段的表征包括但非限于进行功能测定以确定抗体或者抗体片段的功能，进行结合测定以确定抗体或者抗体片段的结合特异性或者由所述抗体或者抗体片段识别的表位，和/或进行中和测定以确定抗体或者抗体片段中和毒素或者病原体的能力。
在另一个实施方案中，本发明提供了产生抗体或者抗体片段的方法。所述方法包括培养有限数目的浆细胞；鉴定产生具有所需特征的抗体的培养物；分离编码所产生的抗体的核酸；以及在宿主细胞中表达所述核酸。
在本发明另一方面，本发明提供了由本发明的方法产生的分离的抗体或者抗体片段。本发明还提供了用本发明的分离的抗体或者抗体片段诊断和/或治疗各种病症或疾病的方法。
附图简述
图1示出由CD138+浆细胞累积产生的IgG，所述浆细胞分离自外周血并且在间充质基质细胞单层上培养50天。
图2示出由含有分离自(A)外周血和(B)骨髓的单个浆细胞的培养物中的CD138+浆细胞累积产生的IgG。
图3示出测试分离自外周血并在间充质基质细胞单层上培养的CD138-high浆细胞的10天培养物上清液中IgG、IgA、IgM和IgE的存在的结果。
图4示出产生IgG、IgA或IgM抗体的抗体分泌细胞(ASC)当在hMSC-TERT细胞上培养时的平板效率(plating efficiency)，并且表示为存活时间长到足以在上清液中产生可检测量抗体的浆细胞的百分数。
图5示出在破伤风类毒素(TT)加强免疫后7天从收集的外周血分离的浆细胞中鉴定分泌破伤风类毒素特异性IgG的浆细胞。
图6示出由培养的浆细胞回收的VH和VL基因的克隆和表达产生的重组抗体与破伤风类毒素的结合，所述培养的浆细胞分离自用破伤风类毒素免疫接种后10年的供体的血液。
发明详细描述
本发明基于从浆细胞产生抗体的有效及高通量方法的发现，其使得无需依赖于免疫球蛋白基因的克隆及表达便能表征抗体。在一个方面，本发明提供了从浆细胞产生抗体的方法，包括培养有限数目的浆细胞。用本发明产生的抗体可以通过使用多种筛选而方便地表征，所述筛选包括结合、功能和/或中和测定，甚至可以原位进行，即在培养浆细胞的孔中进行。
如本文所用，术语“浆细胞”包括在外周血、骨髓、组织或体液中发现的或者体外从B细胞产生的所有原代抗体分泌细胞(ASC)。新近产生的浆细胞被称为“成浆细胞”。天然产生的成浆细胞通常在血液特别是外周血中发现。成浆细胞也可以在体外通过用各种刺激物包括多克隆激活物如TLR激动剂刺激B细胞而产生。在此，术语“浆细胞”应被认为包括“浆细胞”、“成浆细胞”及ASC。
理论上，可以在培养基中培养任何数目的浆细胞以产生和鉴定具有所需特征的抗体。实践中，可以被培养的浆细胞数目由于现有的用于克隆和表达多克隆细胞培养物中存在的多个VH和VL基因序列及其组合的技术而受到限制。在一个实施方案中，“有限数目的浆细胞”是指浆细胞的数目是大约100或更少，例如90或更少、80或更少、70或更少、60或更少、50或更少、45或更少、40或更少、35或更少、30或更少、25或更少、20或更少、17或更少、15或更少、12或更少、10或更少、9或更少、8或更少、7或更少、6或更少、5或更少、4或更少、3或更少、2或更少、或者1或更少。
在一个实施方案中，本发明提供了从浆细胞产生抗体的方法，包括在培养物中以低浆细胞浓度培养浆细胞。培养物中的低浆细胞浓度通常包括每个培养物大约1至大约10个、或者大约1至大约15个、或者大约1至大约20个、或者大约1至大约25个、或者大约1至大约30个、或者大约1至大约40个、或者大约1至大约50个、或者大约1至大约60个、或者大约1至大约70个、或者大约1至大约80个、或者大约1至大约90个、或者大约1至大约100个细胞。
在另一个实施方案中，本发明提供了从浆细胞产生抗体的方法，包括培养浆细胞，其中所述浆细胞在每个培养物中已被稀释至低细胞浓度。在另一个实施方案中，本发明提供了从浆细胞产生抗体的方法，包括培养降低数目的浆细胞。分离自例如生物学来源的浆细胞数目可以如下所述降低。如本文所用，“降低数目的浆细胞”与上述“有限数目的浆细胞”可互换使用。
在培养物中获得所需细胞数目的技术是本领域公知的。这种技术包括但非限于有限稀释或者细胞分选和沉积。例如，包含有限或降低数目浆细胞的培养物可以通过使用细胞分选仪经单细胞沉积或者用足够培养基稀释浆细胞悬液而实现，从而微滴定培养平板每个孔存在1个、2个、3个或者更多个、例如5个、10个、15个、20个、25个、30个、40个、50个、60个、70个、80个、90个或100个细胞。
在一个实施方案中，培养单个浆细胞。鉴于由单个浆细胞产生的抗体的单克隆性质，以单细胞培养物培养浆细胞会产生单克隆抗体群。因此，在一个实施方案中，本发明提供了从浆细胞产生单克隆抗体的方法，包括以单细胞培养物培养浆细胞。
如本文所用，“单细胞培养物”与“培养单个浆细胞”可互换使用，并且涉及一种培养物，其平均包含单个浆细胞。因此，在多孔板例如96孔板或者1536孔板中，大多数孔含有单个浆细胞，一些孔不含浆细胞，其它一些孔含有一个以上浆细胞。在一些实施方案中，浆细胞可以在其中每孔中有平均少于1个细胞、例如0.8个细胞/孔、0.6个细胞/孔、0.5个细胞/孔、0.3个细胞/孔或者0.1个细胞/孔的培养物中培养浆细胞。获得培养物中单细胞的技术与上述类似，除了微滴定培养平板每孔存在平均1个或者少于1个细胞。
本发明进一步提供了产生抗体或抗体片段的方法。所述方法包括根据本发明任何方法培养有限数目的浆细胞，鉴定产生具有所需特征的抗体的培养物，分离编码所产生的抗体的核酸，以及在宿主细胞中表达所述核酸。
与可以通过永生化扩增成抗体产生细胞克隆的记忆B细胞(Traggiai etal.，2004，Nat Med 10：871-875；Lanzavecchia et al，2007，Curr OpinBiotechnol.18：523-528)不同，浆细胞不分化，并且不能被刺激或者永生化。因此，为了以任何有意义方式利用这些“抗体工厂”，浆细胞必须在培养中保持存活。浆细胞以连续方式产生和分泌抗体，因此抗体群的大小随着时间而增加。尽管浆细胞在体内存活非常长时间，它们在体外存活的时间不比一天长许多(实验数据未示出)。因此，本发明提供了通过在包含延长培养的细胞存活的外源成分的培养基中培养浆细胞(包括但非限于单个浆细胞)而产生抗体的方法。
通常，培养的浆细胞的存活被延长足够时间，由此以表征抗体所需的量产生抗体，即，培养基含有足够的抗体，由此其可以用于筛选测定，包括但非限于结合测定、中和测定或者确定功能或者另外表征抗体的其它测定。含有所需特异性的抗体的培养物然后可以被分离，免疫球蛋白基因可以被克隆、测序及表达以产生单克隆抗体。
培养物中的浆细胞包括但非限于单个浆细胞的存活可以短期或长期延长。如本文所用，“短期”是指至少2天至大约9天时间，即2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天或者大约9天。如本文所用，“长期”是指至少10天时间，例如10天、15天、20天、25天、30天、35天、40天、45天、50天、60天、70天、80天、90天、100天、110天、120天、130天、140天或者大约150天。
尽管短期延长浆细胞的存活不能产生如长期延长浆细胞存活所产生的那样多的抗体，但是如本文所述短期延长浆细胞的存活更简单、更快及更经济，并且特别有用于在敏感测定中筛选抗体。长期延长浆细胞存活特别适于其中抗体表征需要多个筛选测定或者低敏感性测定的情况中。
在一个实施方案中，培养基中存在的外源成分短期延长培养的浆细胞的存活。在另一个实施方案中，外源成分长期延长培养的浆细胞的存活。外源成分可以是一或多种由浆细胞表达的受体的配体或者一或多种非浆细胞。
用于延长培养的浆细胞的存活的由浆细胞表达的受体的配体的例子包括但非限于细胞因子、趋化因子和其它配体。在一个实施方案中，所述配体是IL-5、IL-6、基质细胞衍生因子-1(SDF-1)、TNF-α或者CD44的配体，例如ialuronic acid。在另一个实施方案中，外源成分包括选自由IL-5、IL-6、基质细胞衍生因子-1(SDF-1)、TNF-α、CD44的配体例如ialuronic acid及其组合组成的组的一或多种配体，并用于短期或者长期延长培养的浆细胞的存活。
用于延长培养的浆细胞的存活的非浆细胞的例子包括但非限于间充质基质细胞、成纤维细胞或者破骨细胞。在一个实施方案中，所述非浆细胞是间充质基质细胞、成纤维细胞或者破骨细胞，并且用于短期或者长期延长培养的浆细胞的存活。在另一个实施方案中，所述非浆细胞是间充质基质细胞并且用于短期或者长期延长培养的浆细胞的存活。间充质基质细胞可以是哺乳动物间充质基质细胞，包括但非限于人类间充质基质细胞。间充质基质细胞可以任选地在用于培养物之前永生化。
在本发明的一个实施方案中，浆细胞在由浆细胞表达的受体的一或多种配体存在下以例如单细胞培养物培养大约3天至大约7天，或者大约5天至大约9天。在另一个实施方案中，浆细胞在一或多种类型非浆细胞存在下以例如单细胞培养物培养大约5天至大约7天，或者大约10天，或者大约15天，或者大约20天，或者大约25天，或者大约30天，或者大约35天，或者大约40天，或者大约45天，或者50天以上。在另一个实施方案中，浆细胞在间充质基质细胞存在下以例如单细胞培养物培养大约5-7天，或者大约10天，或者大约15天，或者大约20天，或者大约25天，或者大约30天，或者大约35天，或者大约40天，或者大约45天，或者50天以上。在另一个实施方案中，浆细胞在一或多种类型非浆细胞以及由浆细胞表达的受体的一或多种配体存在下以例如单细胞培养物培养大约5-7天，或者大约10天，或者大约15天，或者大约20天，或者大约25天，或者大约30天，或者大约35或者大约40天，或者大约45或者大约50天，或者大约55或者大约60天，或者大约65天，或者70天以上。
在一个实施方案中，培养细胞的平板效率可以是至少大约30％，在另一个实施方案中平板效率可以是至少大约40％，在另一个实施方案中平板效率可以是至少大约50％，在另一个实施方案中平板效率可以是至少大约55％，在另一个实施方案中平板效率可以是至少大约60％或更多。
如本文所用，术语“平板效率”指的是存活足够长时间以在上清液中产生可检测量的抗体的浆细胞百分比。
培养的浆细胞可以得自任何所需物种。在一个实施方案中，浆细胞是小鼠、大鼠、骆驼或者猴的浆细胞。在另一个实施方案中，培养的浆细胞是人类浆细胞，产生的抗体是人类抗体。在另一个实施方案中，通过以单细胞培养物培养人类浆细胞产生人类单克隆抗体。
浆细胞例如人类浆细胞可以分离自人类外周血。这些人类浆细胞可以被称为“外周血浆细胞”或者“循环浆细胞”。浆细胞例如人类浆细胞也可以分离自骨髓、组织或者分离自体液，包括但非限于人类的滑液、脑脊液和渗出物。术语“组织”意在覆盖存在于人体内的任何组织，并且可以包括心脏组织、神经组织、肌肉组织、上皮、结缔组织和淋巴器官如胸腺、脾和淋巴结。
浆细胞通常特征在于表达CD138，任选地特征在于另外表达CD27、CD38、CD9、CD44和MHC II类分子。在一个实施方案中，细胞可以根据CD138的表达而分离自外周血、组织、骨髓或者体液。除了CD138之外表面标记如CD27、CD38、CD9、CD44和MHC II类分子也可以使用以改善分离程序及鉴定浆细胞亚集(Arce et al.，2004，J Leukoc Biol，75：1022-1028)。在另一个实施方案中，浆细胞可以用磁性微珠分离。在另一个实施方案中，浆细胞可以用包被有固定化抗CD138抗体的磁性微珠分离。在另一个实施方案中，用磁性微珠富集浆细胞可以后接细胞分选。
在一个实施方案中，浆细胞可以分离自免疫接种后的人类供体的外周血。免疫接种是指施用能诱导免疫应答的任何抗原。疫苗可以是现在已知的任何疫苗，或者后来本领域技术人员可以获得的疫苗，并且包括但非限于破伤风类毒素、流感、黄热病、破伤风-白喉、乙型肝炎、天花和癌症疫苗。在另一个实施方案中，免疫接种可以是加强免疫。浆细胞可以在免疫接种后4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天或更多天分离自供体。在一个实施方案中，浆细胞可以分离自应答已知病原体的供体。在另一个实施方案中，浆细胞可以分离自应答未知病原体的供体。在进一步的实施方案中，浆细胞可以分离自具有变态反应的供体。在另一个实施方案中，浆细胞可以分离自稳态条件下的供体。在另一个实施方案中，浆细胞可以分离自具有自身免疫病的供体。
在另一个实施方案中，浆细胞可以通过刺激B细胞体外产生。这个刺激可以用本领域已知任何方法进行，包括原初或者记忆B细胞的多克隆或者抗原特异性刺激(Bernasconi et al，2002，Science，298：2199-2202)。
本发明的方法可以用于培养分泌任何同种型的任何抗体的浆细胞。在一个实施方案中，浆细胞可以是IgG浆细胞，在另一个实施方案中，浆细胞可以是IgA浆细胞，在另一个实施方案中，浆细胞可以是IgM浆细胞，在另一个实施方案中，浆细胞可以是IgD浆细胞，在进一步的实施方案中，浆细胞可以是IgE浆细胞。在另一个实施方案中，分离的浆细胞群可以是包含两个或多个同种型的浆细胞的混合群。
分离的人类浆细胞可以用酶联免疫吸附法斑点(ELISPOT)测定计数(Bernasconi et al，2002，Science，298：2199-2202)。这个测定通过显现由感兴趣细胞分泌的产物而进行，其中测定产生的每个斑点代表一个单细胞。
在一个实施方案中，人类浆细胞可以通过有限稀释或者通过单细胞沉积而作为单细胞接种。在一个方面，人类浆细胞可以在间充质基质细胞存在下作为单细胞接种。在另一个实施方案中，人类浆细胞可以作为多克隆培养物接种。浆细胞可以在间充质基质细胞存在下作为多克隆细胞培养物接种。或者多克隆人类浆细胞培养物可以用有限稀释分离成单细胞培养物。在另一方面，多克隆人类浆细胞培养物可以用单细胞沉积分离成单细胞培养物。
间充质基质细胞是成纤维细胞样细胞，但是具有比成纤维细胞大的分化潜力，并且能分化成成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞。间充质基质细胞作为异质群体被发现，并且形成它们所位于的组织的支持结构。在骨髓中，间充质基质细胞是造血细胞的生长及分化以及白血病细胞的维持所需的。原代间充质基质细胞可以在合适培养基中分离并且培养若干代，但是仅培养有限时间之后经历衰老。使用端粒末端转移酶逆转录酶(TERT)的转导已用于永生化间充质基质细胞，这些细胞在体外无限扩增的同时保持它们的生理学生长速度和功能特征。
用于培养物中的间充质基质细胞可以是骨髓衍生的间充质基质细胞。间充质基质细胞可以是哺乳动物间充质基质细胞，例如人类间充质基质细胞。用于本发明方法中的间充质基质细胞可以通过在合适培养基中培养而分离自贴壁骨髓细胞。这种培养基可含有氢化可的松。间充质基质细胞也可以衍生自其它组织。
为实践的理由，间充质基质细胞可以在用于本发明方法中之前永生化。如本文所用，“永生化”是指间充质基质细胞具有改良的增殖能力，同时保持使它们能维持浆细胞的所有特征，包括经历接触依赖性生长抑制的能力。在一个实施方案中，间充质基质细胞在到达铺满后可以存活至少大约1周。在另一个实施方案中，永生化的间充质基质细胞在到达铺满后可以存活至少大约2周，或者在到达铺满后可以存活至少大约3周，或者在到达铺满后可以存活至少大约4周。
间充质基质细胞可以用本领域已知的任何方式永生化。在一个实施方案中，间充质基质细胞通过用端粒末端转移酶逆转录酶基因转导而永生化。在另一个实施方案中，间充质基质细胞可以根据Mihara et al.，2003 BrJ Haematol 120：846-849所述方法用TERT基因转导而永生化。
如上讨论，本发明提供了产生抗体或者抗体片段的方法。所述方法包括培养有限数目的浆细胞，鉴定产生具有所需特征的抗体的培养物，分离编码所产生的抗体的核酸，以及在宿主细胞中表达所述核酸。
如本文所用，术语“片段”和“抗体”片段可互换使用，是指本发明抗体的任何片段。在一个实施方案中，抗体片段保留抗体的抗原结合活性。在另一个实施方案中，抗体片段可包含10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、300、400、500、600、700、800、900或1000或更多个连续氨基酸。举例的抗体片段可包含Fc、Fab、Fab’、F(ab′)2、Fv、scFv片段、重链、轻链、铰链区、抗原结合位点、单链抗体或其任何部分中的一或多种。
如本文所用，术语“核酸”包括所有形式的核酸，包括但非限于基因组DNA、cDNA和mRNA。抗体或者抗体片段的克隆及异源表达可以用本领域已知的分子生物学和重组DNA常规技术进行(Wrammert et al.，2008Nature 453，667-671&Meijer et al.，2006 J Mol Biol 358，764-772)。这种技术在文献中详细解释，例如Sambrook，1989 Molecular Cloning；A LaboratoryManual，Second Edition。对于VH/VL序列的获取及表达可以使用Tiller etal.，J Immunol Methods 2008329：112-124的方法。
在一个实施方案中，抗体用合适载体或病毒在真核细胞中表达。真核细胞可以是CHO、293T、293F或者酵母细胞。在另一个实施方案中，抗体用合适载体或噬菌体在原核细胞中表达。原核细胞可以是细菌细胞，例如大肠杆菌细胞。在进一步实施方案中，异源表达系统可以是无细胞系统。
本发明的方法产生的抗体和抗体片段可以容易地用公知方法学分离(Coligan et al Eds Current Protocol in Immunology 1：2.7)。在一个实施方案中，本发明的抗体或者抗体片段包括单克隆抗体或者抗体片段可以通过离心或者亲和层析从培养物上清液中分离。在另一个实施方案中，抗体或者抗体片段可以根据它们的结合特异性分离。例如，抗体可以通过施加于包含合适的固定化抗原的固体支持物而分离。在进一步的实施方案中，抗体可以用在一些情况中可以固定化的抗-IgG、抗-IgE、抗-IgA、抗-IgD或抗-IgM抗体分离。
血浆分泌Ig或者特异性抗体可以用免疫亲和方法分离。首先，分泌的产物可以用合适的共价结合的捕获试剂捕获在分泌细胞表面。然后捕获的产物可以用荧光标记的第二抗体或抗原揭示(Manz et al.，1998 Int Immunol10，1703-1711)。
抗体表征
浆细胞不表达表面免疫球蛋白，因此不能根据同种型或者抗原特异性选择。因此浆细胞产生的抗体需要被分离以表征。目前，现有技术主要使用两种方法从浆细胞制备单克隆抗体。第一种方法是筛选从免疫供体的全部骨髓制备的抗体的展示文库(Williamson et al.，1993Proc Natl Acad Sci U SA 90，4141-4145)。但是这种方法受到骨髓样品的可得性限制。
第二种方法涉及在加强免疫后分离循环浆细胞，随后用单细胞PCR从个体浆细胞中回收Ig基因(Wrammert et al.，2008Nature 453，667-671 &Meijer et al.，2006 J Mol Biol 358，764-772)。这个方法基于如下事实：加强免疫后6-8天，相当大部分循环浆细胞特异于免疫抗原。但是这个方法需要在抗体特异性可以评估之前进行大量基因克隆和表达工作，因此当浆细胞应答针对多个抗原如复杂病原体时这个方法不太适用。因此开发人类浆细胞的长期培养系统对于获取足够抗体进行体外结合测定、功能测定和进一步抗体表征是特别有用的，以便能选择产生感兴趣抗体的浆细胞。
从浆细胞或者其它抗体分泌细胞分离抗体的其它方法基于显微操作并且包括第一步，其中细胞铺板于半固体培养基中(Harriman WD et al JImmunol Methods 341；135-1452009)或者微阵列芯片中(Jin A et al NatMedicine 15；10882009)，分泌的抗体用荧光探针原位检测。一旦鉴定，可通过显微操作回收浆细胞，扩增并测序VH和VL基因。这些方法基于短期培养及分泌抗体的局部检测，需要显微操作抗体分泌细胞的专门设备并且不适于测试抗体的功能性质如病毒或毒素中和。本发明的方法不是基于也不需要任何显微操作，本发明的方法使得产生的抗体得以在多种测定中被筛选，包括但非限于结合测定、功能测定和/或中和测定。在一个实施方案中，本发明提供了从浆细胞产生抗体的方法，包括培养有限数目的浆细胞并表征抗体，其中所述方法不包括显微操作获取抗体分泌浆细胞。
本发明包括表征由本发明的方法分离的抗体或者抗体片段。在一个实施方案中，抗体表征可包括确定抗体或者抗体片段的结合特异性。在另一个实施方案中，抗体表征可包括确定由抗体或者抗体片段识别的表位。分离的抗体或者抗体片段的结合特异性和/或由抗体或者抗体片段识别的表位可以用本领域已知的任何方法确定。在一个实施方案中，所述结合特异性和/或识别的表位可以如下确定：标记分离的抗体或者抗体片段，将标记的抗体或者抗体片段呈递给抗原文库，检测与其关联抗原结合的标记抗体或者抗体片段。在另一个实施方案中，标记抗体或者抗体片段可以施加于含有固定化抗原分子的纯化柱，柱上标记抗体或者抗体片段的存在与否可以用作抗体特异性和/或识别的表位的指示。本领域技术人员明了分离自已用特定抗原免疫的或者已暴露于特定病原体的供体的外周血的浆细胞将产生结合该抗原或病原体的抗体或抗体片段。然而，病原体特别是复杂病原体很可能包含许多抗原，特定抗体或者抗体片段的结合特异性和/或识别的表位可能仍是不确定的。
本发明的单细胞培养方法提供了产生特异性抗体的单个浆细胞，从其可以容易地用公知方法学分离编码抗体的核酸(Wrammert et al.，2008Nature453，667-671 & Meijer et al.，2006 J Mol Biol 358，764-772)。在一个实施方案中，抗体表征可涉及测序编码抗体或者抗体片段的核酸。核酸测序可以用本领域已知的任何方法进行。在一个实施方案中，核酸测序可以用链终止进行，其中可以使用放射性染料、荧光染料或者其它染料。在另一个方面核酸测序可以用自动化测序方法进行。
在另一个实施方案中，表征可涉及测序抗体蛋白。抗体蛋白可用本领域已知任何方法测序。在一个实施方案中，抗体蛋白可以通过N-末端分析、C-末端分析或者Edman降解进行测序。N-末端分析可包括：i)将蛋白质与选择性标记氨基末端氨基酸的试剂反应；ii)水解所述蛋白质；及iii)通过层析确定氨基末端氨基酸并与标准进行比较。在这个方面中，可以使用任何标记试剂，包括但非限于Sanger试剂、丹磺酰衍生物如丹磺酰氯及苯基异硫氰酸酯。C-末端分析可包括将蛋白质与羧基肽酶保温并且以固定间隔取样以产生氨基酸浓度对时间的做图。
抗体蛋白测序后，本发明还包括基于鉴定的抗体序列化学合成结合蛋白。化学合成可根据本领域已知任何方法进行。在一个实施方案中，化学合成可以通过将氨基酸的羧基附着于不溶的固体支持物并且将固定化抗体的氨基与序列中下一个抗体的羧基反应而进行。这个方法可以重复直至产生所需氨基酸序列，在此阶段完整蛋白质可以从固体支持物上裂解，并且使其或者诱导其采取正确蛋白质折叠。
本发明还包括用本发明任何方法产生的抗体或抗体片段。
抗体的药物用途
本发明提供了由本发明任何方法产生的抗体或者抗体片段用于治疗、例如用于治疗变态反应、感染性病症或疾病、癌症和自身免疫病症或疾病
术语“变态反应”包括所有形式的由非寄生虫抗原导致的超敏感性反应，包括但非限于变应性皮炎、变应性鼻炎、血管性水肿、过敏反应、阿司匹林敏感性、哮喘、变应性皮炎、禽类过敏、金丝雀过敏、猫哮喘、特应性皮炎、鸟过敏、金丝雀过敏、猫过敏、化学品敏感、鸡过敏、结膜炎、慢性疲劳、接触性皮炎、化妆品过敏、牛奶过敏、皮炎、狗过敏、药物反应、鸭过敏、灰尘过敏、尘螨过敏、湿疹、鹅过敏、草过敏、花粉热、头痛、心律不齐、荨麻疹、儿童多动症(hyperactivity in children)、低血糖、呼吸和接触过敏原、乳糖不耐受、偏头痛、乳品过敏、螨虫过敏、风疹，鹦鹉过敏、长尾小鹦鹉过敏(parakeet allergy)、常年性鼻炎、鸽子过敏、花粉过敏、鼻炎、漆树过敏、水杨酸盐敏感、鼻窦炎、皮疹、麻雀过敏、火鸡过敏、ucaria以及酵母过敏。
术语“感染性疾病”包括因存在病原性微生物而引起的任何具有显著临床表现的疾病，所述病原性微生物包括但不限于病毒、细菌、原生动物、寄生虫和真菌。术语“感染性疾病”包括但不限于AIDS、AIDS相关综合征、水痘、感冒、巨细胞病毒感染、科罗拉多壁虱热、登革热、埃博拉出血热、手-足-口病、肝炎、单纯疱疹、带状疱疹、HPV、流感、拉沙热、麻疹、马尔堡出血热、传染性单核细胞增多症、腮腺炎、诺如病毒(Norovirus)、脊髓灰质炎、进行性多灶性白质脑病、狂犬病、风疹、SARS、天花、病毒性脑炎、病毒性胃肠炎、病毒性脑膜炎、病毒性肺炎、西尼罗河热、黄热病、炭疽、细菌性脑膜炎、肉毒中毒、布鲁氏菌病、弯曲菌病、猫抓病、霍乱、白喉、流行性斑疹伤寒、淋病、脓疱病-军团菌、麻风病、钩端螺旋体病、利斯特菌病、莱姆病、类鼻疽、风湿热；MRSA感染、诺卡菌病、百日咳、瘟疫、肺炎球菌性肺炎、鹦鹉热、Q热、落基山斑疹热(RMSF)、沙门氏菌病、猩红热、志贺菌病、梅毒、破伤风、沙眼、肺结核、兔热病、伤寒、斑疹伤寒-尿路感染、非洲锥虫病、阿米巴病、蛔虫病、巴贝虫病、南美洲锥虫病、支睾吸虫病、隐孢子虫病、囊尾蚴病、裂头绦虫病、龙线虫病、棘球蚴病、蛲虫病、片吸虫病、姜片虫病、丝虫病、自生生活阿米巴虫感染、贾第虫病、腭口线虫病、膜壳绦虫病、等孢球虫病、黑热病、利什曼病、疟疾、后殖吸虫病、蝇蛆病、盘尾丝虫病、虱病、蛲虫感染、疥疮、血吸虫病、绦虫病、弓蛔虫病、弓形体病、旋毛虫病(trichinellosis)、旋毛虫病(trichinosis)、鞭虫病、滴虫病、锥虫病、曲霉病、芽生菌病、念珠菌病、球孢子菌病、隐球菌病、组织胞浆菌病、足癣、可传播性海绵状脑病、牛海绵状脑病、克罗伊茨费尔特-雅各布病、库鲁病、致死性家族性失眠症，以及Alpers综合征。
术语“自身免疫疾病”包括免疫系统与自身抗原反应的所有形式的疾病，包括但不限于类风湿性关节炎、1型糖尿病、桥本氏甲状腺炎、甲状腺功能亢进、硬皮病、乳糜泻、克罗恩氏病、溃疡性结肠炎、干燥综合征、多发性硬化症、急性感染性多发性神经炎、肺出血肾炎综合征、阿狄森氏病、韦格纳肉芽肿病、原发性胆汁性肝硬化、硬化性胆管炎、自身免疫性肝炎、类风湿性关节炎、自身免疫性甲状腺疾病、系统性红斑狼疮、银屑病、银屑病关节炎、交感性眼炎、自身免疫性神经病、自身免疫性卵巢炎、自身免疫性睾丸炎、自身免疫性淋巴细胞增生综合征、抗磷脂综合征、狼疮、多内分泌腺缺陷综合征、1型多内分泌腺缺陷综合征、2型多内分泌腺缺陷综合征、免疫性血小板减少性紫癜、恶性贫血、重症肌无力、混合性结缔组织病、原发性肾小球肾炎、白癜风、自身免疫性色素层炎、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性血小板减少症、乳糜泻、疱疹样皮炎、天疱疮、寻常型天疱疮、落叶型天疱疮、大疱性类天疱疮、自身免疫性心肌炎、自身免疫性脉管炎、自身免疫性眼病、斑秃、自身免疫性动脉粥样硬化、白塞氏病、自身免疫性脊髓病、自身免疫性血友病、自身免疫性间质性膀胱炎、自身免疫性尿崩症、自身免疫性子宫内膜异位症、复发性多软骨炎、强直性脊柱炎、自身免疫性风疹、副肿瘤性自身免疫综合征、皮肌炎、Miller Fisher综合征，以及IgA肾病。
本发明还提供了通过本发明的任何方法产生的抗体或者抗体片段，用于生产治疗变态反应、感染性病症或疾病以及自身免疫性病症或疾病的药物。
本发明进一步提供了治疗变态反应、感染性病症或疾病以及自身免疫性病症或疾病的方法，包括施用通过本发明的任何方法产生的抗体或者抗体片段。
本发明还包括将通过本发明的任何方法产生的抗体或抗体片段或者编码这种抗体或抗体片段的核酸配制成药物可接受的组合物。在一个实施方案中，所述药物组合物可包含通过本发明的任何方法产生的一或多种分离的抗体或抗体片段。在另一个实施方案中，所述药物组合物可包含通过本发明的任何方法产生的2、3、4、5或更多种分离的抗体或抗体片段。
药物组合物也可含有药物可接受的载体以便施用。所述载体其自身应不诱导不利于接受所述组合物的个体的抗体的产生及应是无毒性的。合适的载体可包括大的、缓慢代谢的大分子，如蛋白质、多肽、脂质体、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、聚合氨基酸、氨基酸共聚物及失活的病毒颗粒。
在一些实施方案中，可以使用药物可接受的盐，例如无机酸盐如盐酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐和硫酸盐，有机酸盐如乙酸盐、丙酸盐、丙二酸盐和安息香酸盐。
在一些实施方案中，所述药物组合物也可含有液体如水、盐水、甘油和乙醇。此外，辅助物质如湿润剂或者pH缓冲物质可以存在于所述组合物中，且可使得所述药物组合物被配制成由患者摄取的片剂、药丸、糖衣丸、胶囊、液体、凝胶、糖浆、浆液和悬浮液。
所述药物组合物可以通过任何途径施用，包括但不限于口服、静脉内、肌内、动脉内、髓内、腹膜内、鞘内、心室内、透皮(transdermal)、经皮(transcutaneous)、局部、皮下、鼻内、经肠道、舌下、阴道内或者直肠途径施用。
所述药物组合物的pH可以是在5.5-8.5之间，在一些实施方案中pH在6-8之间，在进一步的实施方案中为大约7。所述pH可以通过使用缓冲液维持。所述组合物可以是无菌和/或无热原的。所述组合物可以是对于人体等渗的。
在另一个实施方案中，通过本发明的任何方法产生的抗体或抗体片段可以与诊断性赋形剂组合形成诊断试剂。在一个实施方案中，所述诊断试剂可包含通过本发明的任何方法产生的一或多种分离的抗体。例如，所述诊断试剂可包含通过本发明的任何方法产生的2、3、4、5或更多种抗体或抗体片段。
所述诊断性赋形剂可包含药物可接受的载体，以使得可以将诊断试剂给予患者。所述载体其自身应不诱导不利于接受所述组合物的个体的抗体的产生及应是无毒性的。合适的载体可包括大的、缓慢代谢的大分子，如蛋白质、多肽、脂质体、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、聚合氨基酸、氨基酸共聚物及失活的病毒颗粒。
在某些实施方案中，可以使用药物可接受的盐，例如无机酸盐如盐酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐和硫酸盐，有机酸盐如乙酸盐、丙酸盐、丙二酸盐和安息香酸盐。
在一些实施方案中，所述药物试剂也可含有液体如水、盐水、甘油和乙醇。此外，可以存在辅助物质如湿润剂或者乳化剂或者pH缓冲物质。
所述诊断试剂可用于在体内、在体外或者离体诊断中。对于在体内应用，所述诊断试剂可以通过任何途径施用，包括但不限于口服、静脉内、肌内、动脉内、髓内、腹膜内、鞘内、心室内、透皮、经皮、局部、皮下、鼻内、经肠道、舌下、阴道内或者直肠途径施用。
诊断试剂的pH可以在5.5-8.5之间，在一些实施方案中pH在6-8之间，在进一步的实施方案中pH为大约7。所述pH可以通过使用缓冲液维持。所述组合物可以是无菌和/或无热原的。所述诊断试剂对于人体可以是等渗的。
在一个实施方案中，所述诊断试剂可包括标记抗体。所述标记可选自荧光标记、放射标记、半抗原和生物标记，包括酶标记。
所述诊断试剂可用于确定特定抗原的存在与否。从这个信息中可以推断确定特定抗原的存在与否，以及因此确定特定病症或疾病的存在与否。在本发明的一方面中，所述疾病可以是变态反应、感染性病症或疾病或者自身免疫性病症或疾病。使用诊断试剂获得的信息可用于确定特定患者的适当疗程。特别地，所述诊断试剂可用于确定变应原的存在与否。
术语“变应原”包含在个体内能刺激超敏反应的任何非寄生虫抗原，包括但不限于猫、毛皮、毛屑、蟑螂萼、羊毛、尘螨、尘螨排泄物、青霉素、磺胺、水杨酸盐、麻醉剂包括局麻药、芹菜、块根芹、谷物、玉米、小麦、蛋、蛋白、水果、南瓜、豆类、菜豆、豌豆、坚果、花生、大豆、牛奶、海产品、芝麻、大豆、树生坚果(tree nuts)、美洲山核桃、杏仁、昆虫刺伤、蜂蜇毒、黄蜂蜇毒、蚊虫叮咬、霉菌孢子、乳胶、金属、植物花粉、牧草包括黑麦草和猫尾草、野草包括豚草、车前草、荨麻、北艾蒿、藜和酸模属、及树木包括桦树、桤木、榛木、角树、七叶树属、柳树、杨树、悬铃木属、椴树、橄榄树、Ashe juniper。
分离的抗体在蛋白质纯化中的应用
本发明还包含将通过本发明的任何方法产生的分离的抗体或抗体片段固定在固体支持物上的方法。术语“固体支持物”包括固体和半固体支持物，以及涵盖可用于在其上固定所述分离的抗体或抗体片段的任何支持物。所述固体支持物可包含凝胶、网状物、珠包括玻璃球或磁珠、柱、管、微滴定平板孔或者塑料片。通过本发明的任何方法产生的固定的抗体或抗体片段可用于蛋白质纯化中。在一个实施方案中，固定的抗体可以用于免疫亲和性层析。包含感兴趣的蛋白质的溶液可用于包含通过本发明的任何方法产生的对于感兴趣的蛋白质具有特异性的固定的抗体或抗体片段的固体支持物中。所述抗体或抗体片段可例如固定在珠上，在一些实施方案中所述珠可置于柱中。
一般概念
术语“包含”涵盖“包括”以及“由……组成”，例如组合物“包含”X是指可以只由X组成或者可包括其它一些事物，例如X+Y。
单词“基本上”不除外“完全”，例如“基本上没有”Y的组合物可以是完全没有Y的组合物。在需要之处，单词“基本上”可以从本发明的定义中删去。
关于数值x的术语“大约”是指例如x±10％。
如本文所用，术语“疾病”是与术语“失调”和“病症”(如在医学病症中)是一般同义词，均反映出人或动物机体或者其一部分正常功能受损的异常状况，典型通过不同的迹象和症状显现，并导致人或动物的生存期或生存质量下降。
如本文所用，关于患者的“治疗”是指包括防止和预防以及治疗。术语“患者”是指包括人的所有哺乳动物。通常地，所述患者是人。
实施例
本发明举例的实施方案在如下实施例中提供。如下实施例只是例证本发明及帮助技术人员使用本发明。所述实施例不以任何形式限制本发明的范围。
实施例1：间充质基质细胞培养物中的浆细胞
本发明人观测到根据标准方法从正常骨髓中建立的人间充质基质细胞的原代培养物(Pittenger et al，1999，Science 284：143-147；Bieback et al，2004Stem cells 22：625-634；Dominici et al，2006，Cytotherapy 8：315-317；Sotiropoulou et al 2006，Stem Cells 24：462-471)含有分泌抗体的细胞。这些细胞通过ELISPOT检测，并鉴定为浆细胞。间充质基质细胞培养物中的浆细胞在3周后在体外仍可检测(数据未示出)。
实施例2：人浆细胞直至50天的培养物
为了开发其中个体浆细胞可以保持存活以便产生的抗体可以随着培养时间积累的培养系统，本发明人检测了根据标准方法制备的不同来源的原代间充质基质细胞。简而言之，将组织培养瓶用FCS预包被1小时。使骨髓细胞在补加30％FCS和10-8M地塞米松的完全IMDM培养基中贴壁培养过夜。洗去未贴壁的细胞，并将贴壁细胞在完全DMEM-10％FCS中培养。检测的7个品系中有3个品系支持人浆细胞存活，但是在几个传代之后终止增殖。在随后的实验中，使用通过端粒酶逆转录酶基因(MSC-TERT)转导固定的间充质基质细胞。这些细胞是由Mihara et al.(Br J Haematol2003，120，846-849)分离的那些细胞。
将周围血单核细胞用PE-标记的抗-CD138单克隆抗体染色，使用抗-PE微珠(Miltenyi)富集，并通过细胞分选进一步纯化以分离CD138-阳性细胞。回收的分泌IgG的浆细胞的数目使用同种型特异性ELISPOT确定。将不同数目的CD138-阳性细胞种植在96孔培养平板的间充质基质细胞单层上，所述96孔培养平板中具有RPMI 1640，且补加10％胎牛血清(Hyclone)、非必需氨基酸、丙酮酸盐和glutamax(GIBCO)。基于在铺板时进行的ELISPOT，图1所示培养物含有7个分泌IgG的细胞。在不同时间点收集一半的培养物上清液并以新鲜培养基更换。此外，在第18天和第34天，完全除去培养基并用新鲜培养基取代。确定每天每个培养物的IgG产生率以及估计的每天每个浆细胞的IgG产生率。如图1所示，大约7个细胞的本发明的培养物产生的IgG的量在50天期间随着培养时间以线性函数方式增加，与676pg/天的产生率和估计的96pg/细胞/天的产生率一致。
实施例3：个体浆细胞的3周培养物
使用PE-缀合的抗-CD138抗体及随后通过抗-PE微珠和细胞分选从周围血或者骨髓中分离浆细胞，并以0.5细胞/孔密度种植在96孔平板中的间充质基质细胞单层上。通过定期取样在22-23天期间监测含有IgG的培养物。在第16天更换培养基。在整个培养期间，单克隆培养物中IgG生产率是恒定的，为72-134pg/细胞/天(图2a，周围血衍生的(4个培养物)；图2b，骨髓衍生的(5个培养物))。
在5个限制稀释的实验中，血液和骨髓浆细胞的平板效率为30％-65％(数据未示出)。此外，从多克隆培养物中回收的浆细胞可以再铺板于单细胞培养物中，其中其维持恒定的Ig分泌率(数据未示出)。IgG的线性积累与以恒定的高比率分泌IgG的个体细胞的保持一致。以完全消除由TLR激动剂刺激的记忆B细胞的增殖和分化的水平照射细胞，这不影响培养的浆细胞的IgG产生(数据未示出)。
实施例4：产生IgG、IgA、IgM和IgE的浆细胞的培养
从健康供体中分离产生IgG、IgA、IgM和IgE的周围血CD138-阳性细胞，并以5个细胞/孔的密度铺板于含有间充质基质细胞单层的384-孔铺板中，617份一式两份培养。使用同种型特异性ELISA检测第10天的培养物上清液中IgG、IgA、IgM和IgE的存在。在培养物上清液中测量4个同种型的总量(见图3)。浆细胞的IgG、IgA、IgM和IgE生产率的平均值在10天内分别为860、770、1100和1800pg，即分别为86、77、110和180pg/细胞/天。
实施例5：体外浆细胞存活的效率
根据CD138表达从7个供体中分离周围血衍生的人浆细胞，并以1或25个细胞/孔的密度种植。在培养开始时分泌IgG-抗体、IgA-抗体和IgM-抗体的细胞的数目通过同种型特异性ELISPOT计算。根据Poisson分布分析计算IgG-抗体、IgA-抗体和IgM-抗体分泌细胞的平板效率，IgG为50％-74％，IgA为31％-78％，IgM为0-26％(见图4)。此外，从多克隆培养物中回收的浆细胞可以再铺板于单细胞培养物中，其中其保持恒定的Ig分泌率(数据未示出)。
实施例6：罕见IgE单克隆抗体的分离
从变态反应个体的周围血肿分离浆细胞，以1个细胞/孔的密度铺板在10个384孔微平板中的hMSC-TERT单层上。5个培养物上清液评分为IgE产生阳性的。对IgE-阳性培养物进行RT-PCR，回收两个成对的VH/VL基因并测序(表1)。将V基因克隆进表达载体中，以表达轻链(κ或者λ)或者人IgG1或IgE重链，根据Wardemann et al.，(Science 301，1374-1377，2003)所述方法进行。IgG或者IgE抗体通过瞬时转染293T细胞产生。这个实施例例证了回收罕见浆细胞及分离代表性IgE单克隆抗体的可能性。
表1.从循环浆细胞回收的两个IgE单克隆抗体
SHM nt：体细胞超变核苷酸；aa：氨基酸
实施例7：从在存在间充质基质细胞条件下培养的浆细胞中分离抗原特异性单克隆抗体
从在用破伤风类毒素(TT)加强接种之后7天的供体周围血中分离浆细胞，在克隆条件中种植于384孔微平板中MSC-TERT单层上。分析第10天培养物上清液中总IgG(ng/培养物)以及TT-特异性IgG抗体(OD405)的存在，并鉴定产生TT-特异性抗体的单克隆培养物(见图5)。这个实施例例证了在加强免疫之后鉴定大量抗原特异性浆细胞的可能性。
实施例8：从在存在IL-6条件下培养的浆细胞中分离强力且广泛反应性流感病毒A中和抗体
将来自用季节性流感疫苗接种之前7天的供体的CD138-阳性细胞以0.5个细胞/孔密度种植在存在10ng/ml IL-6的16个384孔平板中。地第6天和第8天，在三个平行ELISA中检测培养物上清液，使用重组H5或H9杆状病毒衍生的重组血凝素(HA)及不相关的抗原破伤风类毒素(TT)作为抗原。在筛选的4,928个培养物上清液中，12个上清液结合H5HA，25个上清液结合H9 HA，54个上清液结合H5与H9二者。对具有最高OD信号的一些后者进行RT-PCR，回收两个成对的VH/VL基因。这两个单克隆抗体FI6和FI28共有大多数V、D和J基因片段(IGHV3-30*01、IGHD3-9*01、IGHJ4*02和IGKV4-1*01)，但是在N区、在IGKJ使用和体细胞突变模式中有所不同，因此不是克隆相关的。
将FI6和FI28的V基因克隆进表达载体中，通过转染293T细胞产生重组抗体。其特异性通过ELISA使用属于不同亚型的一组重组HA检测(表2)。FI6结合检测的所有流感病毒A HA亚型，包括1组(H1、H5和H9)和2组(H3和H7)，而不结合流感病毒B的HA。相反，FI28只结合1组HA。
表2.浆细胞衍生的人单克隆抗体与流感病毒HA的结合
我们接下来检测了FI6和FI28中和1组和2组流感病毒A亚型的能力，使用假病毒以及感染性病毒进行。显然，FI6中和检测的所有假病毒，包括属于抗原性分歧进化枝(antigenically divergent clades)0、1、2.1、2.2和2.3的六个H5分离株和两个H7禽分离株(表3)。此外，FI6中和检测的所有感染性病毒，包括两个H3N2病毒和四个H1N1病毒，跨越直至最近的70年流行的猪源H1N1分离株A/Cal/04/09(表4)。相反，FI28中和所有H5假病毒，但是不能中和H7假病毒以及检测的所有感染性病毒(表和4)。
表3.人单克隆抗体对H5和H7假型的中和
表4.人单克隆抗体对流感病毒的中和(nd，未进行)
nd，未进行
应注意上述方法在5-10天内以大约8-16ng/ml量给予50μl单克隆抗体。这个体积和抗体浓度足以进行多项测定。这些测定不仅包括结合测定如ELISA(在标准的浅384孔平板中使用5μl进行)，而且还包括功能测定，如假型中和，其在敏感性范围内(见表3)。重要的是，进行多项平行测定的能力是快速鉴定分泌能结合多个抗原变体的抗体的罕见浆细胞所必需的。
实施例9：从分离自接种10年后的周围血的培养的浆细胞中分离破伤风类毒素特异性单克隆抗体
CD138+HLA-DR+CD62L+浆细胞通过细胞分选从破伤风类毒素(TT)接种10年后的供体周围血中分离。将总共1,700个细胞以0.5个细胞/孔的密度种植在384-孔微平板中，在第7天通过ELISA筛选细胞培养物上清液中破伤风类毒素特异性IgG抗体的存在。鉴定到一个破伤风类毒素特异性培养物，在第8天通过RT-PCR回收VH/VL基因并测序(见表5)。将基因克隆进表达载体中，通过瞬时转染293T细胞产生重组抗体(TT14)。通过ELISA检测不同浓度的抗体与破伤风类毒素或者与不相关的抗原(阴性对照物)的结合(见图6)。
表5.接种后10年从循环浆细胞回收的破伤风类毒素特异性单克隆抗体
SHM nt：体细胞超变核苷酸；aa：氨基酸
应注意到存在另外的方式实施本发明，且在不偏离本发明范围和精神的前提下可以对本发明进行各种修改。因此，本发明实施方案只是举例说明本发明而非限制本发明，且本发明非限于本文的描述，在所附权利要求书的范围和相当范围内可以进行修改。
Claims (20)
1.从浆细胞产生抗体的方法，包括：培养有限数目的浆细胞。
2.权利要求1的方法，其中培养的浆细胞的数目是10或以下。
3.从浆细胞产生单克隆抗体的方法，包括：以单细胞培养物培养浆细胞。
4.权利要求1、2或3的方法，其中所述抗体是人抗体并且所述浆细胞是人类浆细胞。
5.权利要求1-4任一项的方法，其中所述浆细胞在包含外源成分的培养基中培养，所述外源成分延长浆细胞的存活。
6.前述任一项权利要求的方法，其中培养的浆细胞的存活被延长足够时间，从而以表征抗体所需的量产生抗体。
7.前述任一项权利要求的方法，进一步包括从培养基分离抗体。
8.权利要求5-7任一项的方法，其中浆细胞的存活被短期或者长期延长。
9.权利要求5-8任一项的方法，其中浆细胞的存活被短期延长，且其中所述短期是大约5天至大约7天。
10.权利要求5-8任一项的方法，其中浆细胞的存活被长期延长，且其中所述长期是至少10天。
11.权利要求5-8或者10任一项的方法，其中浆细胞的存活被延长到至少20天或者至少30天。
12.权利要求5-9任一项的方法，其中增强浆细胞存活的外源成分包含非浆细胞类型或由浆细胞表达的受体的配体。
13.权利要求5-9或12任一项的方法，其中所述外源成分包含选自由IL-5、IL-6、基质细胞衍生因子-1(SDF-1)、TNF-α、CD44的配体及其组合组成的组的一或多种配体。
14.权利要求5-12任一项的方法，其中增强浆细胞的存活的外源成分包括非浆细胞，且其中所述非浆细胞是间充质基质细胞、成纤维细胞或者破骨细胞。
15.前述任一项权利要求的方法，其中所述浆细胞分离自外周血、骨髓、组织或者体液，或者体外从B细胞产生。
16.产生抗体或者抗体片段的方法，包括如下步骤：
a.根据权利要求1-15任一项的方法培养有限数目的浆细胞；
b.鉴定产生具有所需特征的抗体的培养物；
c.分离编码所产生的抗体的核酸；以及
d.在宿主细胞中表达所述核酸。
17.由权利要求16的方法产生的分离的抗体或者抗体片段。
18.权利要求17的抗体或者抗体片段，其用于治疗、作为诊断剂、用于检测过敏原、用于诊断感染性疾病或自身免疫病或者用于药物组合物中。
19.包含权利要求17的抗体或者抗体片段的药物组合物，用于治疗变态反应、自身免疫病或者感染性疾病。
20.权利要求1-16任一项的方法，进一步包括表征抗体或者抗体片段，其中抗体或者抗体片段的表征包括进行功能测定以确定抗体或者抗体片段的功能，进行结合测定以确定抗体或者抗体片段的结合特异性或者由所述抗体或者抗体片段识别的表位，和/或进行中和测定以确定抗体或者抗体片段中和毒素或者病原体的能力。
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