CN102279267A - 一种基于量子点和金属配合物均相免疫检测病毒的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物、医学、材料、化学、病毒学等学科的交叉学科领域，具体公开了一种基于量子点和金属配合物的均相免疫荧光检测病毒的方法。其步骤是：首先将量子点溶解于水或其他溶剂中，得反应液A；其次是将病毒的单克隆抗体与金属配合物偶联，将偶联物溶于水或其他溶剂，得反应液B；第三是取反应液A、反应液B及水或其他溶剂混合，得混合溶液C；第四是在混合溶液C中加入病毒溶液，并将其转移至荧光比色皿中，测量其荧光强度，进行定量分析；或将比色皿放置于紫外分析仪中，用数码相机拍照，通过颜色变化进行病毒检测。本方法简便快速、灵敏度高、特异性强、成本低、可实现高通量检测和远程诊断。

Description

一种基于量子点和金属配合物均相免疫检测病毒的方法

技术领域

本发明涉及生物、医学、材料、化学、病毒学等学科的交叉学科领域，更具体涉及一种基于量子点和金属配合物均相免疫检测病毒的方法。

背景技术

检测病毒常采用酶联免疫吸附分析法(ELISA)，该法虽然选择性好，但是操作步骤多，费时费力，成本高。采用均相免疫反应进行病毒检测和疾病诊断，具有快速、灵敏、特异等优点。近年来，由于量子点技术的兴起，不少研究者将量子点技术引入到病毒检测中，但他们用的大多是有机相量子点，由于有机相量子点合成产量有限，大规模使用受到限制。另外，合成有机相量子点需使用有毒的有机溶剂，容易对人体健康产生危害并对环境造成污染。不仅如此，该量子点在进行水溶性化转化中荧光性能还会受到影响。为解决以上问题，申请人合成了一系列掺杂Zn的CdTe量子点CdTe：Zn²⁺，将此绿色荧光量子点作为荧光敏感材料，用红色荧光的金属配合物标记的抗体作为荧光猝灭剂和荧光强度参照物。由于量子点和金属配合物可用同一激发波长激发，故在同一激发波长激发下，荧光信号表现为绿色和红色的混合色，当加入抗体所对应的抗原(病毒)后，绿色荧光信号不断增强，红色荧光信号保持不变并可作为荧光强度参照，根据绿色荧光信号的强度以及它和红色荧光强度的比值便可实现病毒浓度快速、灵敏、特异的检测。这是一种双色荧光的病毒检测方法，迄今未见有类似报道。文献有关于双色发光氧传感器的报道(Angew.Chem.2008，120，7560-7563)，但正如报道中作者所指出的(Angew.Chem.Int.Ed.2010，49，4907-4909)，该传感器需复杂的设备进行传感和成像，并且在他们的传感器中，所用的荧光参照物是量子点，由于其对环境因素变化很敏感，故不能保证该传感器的定量精度和准确度。而本申请采用金属配合物作为荧光参照物，稳定性好、易于保存，可在不同环境条件下作为良好的荧光参照物。

发明内容

针对现有技术中存在的不足，本发明的目的在于提供一种基于量子点和金属配合物均相免疫检测病毒的方法。采用量子点为荧光信号输出材料，检测灵敏度高；金属配合物作为荧光参照物，稳定性好；金属配合物标记抗体(Ru-Ab)与待测抗原免疫反应进行检测，特异性强。首先将一定量的量子点与Ru-Ab混合，量子点的荧光被猝灭，而Ru-Ab的荧光强度保持不变；加入1.8-210ng/ml病毒后，量子点的荧光回升，而Ru-Ab的荧光强度仍然保持不变，这样既可根据量子点的荧光强度变化对病毒含量进行准确定量，还可以根据量子点与Ru-Ab的荧光强度的比值对病毒含量进行半定量检测，同时还可以在紫外分析仪中用紫外灯激发样品溶液进行拍照，得到可视化的图片，通过颜色变化对病毒进行半定量检测。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术措施：

一种基于量子点和金属配合物均相免疫检测病毒的方法，其步骤如下：

(1)将量子点溶解于溶剂中，得到量子点浓度为1.0×10^-8～1.0×10^-6mol/L的溶液A。

所述量子点为CdSe、CdTe、CdSe/ZnS、CdTe/ZnS、CdTe/CdS/ZnS、CdSe/CdS/ZnS、CdSe：Mn²⁺、CdTe：Mn²⁺、CdSe：Zn²⁺或CdTe：Zn²⁺。

(2)将金属配合物与抗体的偶联物溶解于溶剂中，配制成偶联物浓度为1.0×10^-7～1.0×10^-5mol/L的溶液B。

所述金属配合物为钌(II)配合物、铼(I)配合物或铱(III)配合物。

所述步骤(1)和(2)中的溶剂为水或15mMpH8.0的磷酸盐缓冲溶液(简称“PBS溶液”)。

所述抗体为待测病毒的单克隆抗体。

(3)取6μL溶液A与一定量的溶液B混合，然后用水或0.01mol·L^-1pH8.0的磷酸盐缓冲溶液定容到600μL得溶液C，溶液A和溶液B的比例按量子点和金属配合物与抗体的偶联物的摩尔比1∶10～1∶20计。

(4)取溶液C500～1000μL于微量荧光比色皿中，以激发波长280～480nm激发，测量其在发射波长350～700nm处的荧光强度。

(5)加入不同浓度的待测病毒于前述的溶液C中，以相同的激发波长激发，测量其在同一发射波长处的荧光强度。

(6)将量子点的荧光强度回升值对应于病毒浓度作图，可以得到定量检测病毒的工作曲线；或将比色皿放置于紫外分析仪中，用紫外灯激发样品溶液，观察到不同颜色，用数码相机拍照，通过溶液颜色变化对病毒进行半定量检测。

本方法用于人体肠道病毒EV71的检测，可在1-15分钟内完成。在进行实际样品检测时，将处理好的待测病毒溶液加入到溶液C中，以相同的激发波长激发，测量其在同一发射波长处的荧光强度，以量子点的荧光强度回升值带入工作曲线即可进行定量分析；或用紫外灯激发样品溶液，并用数码相机拍照，通过溶液颜色变化即可实现病毒的半定量检测。

本发明方法与现有技术相比，具有以下优点和效果：

与酶联免疫吸附分析及芯片技术相比，本方法灵敏度高、简便快速、选择性好、通用性强。将本方法应用于抗原-抗体反应检测病毒，将使现有的标准检测技术发生根本性变革。如果一种生物分子如抗体或抗原，既可以作为荧光增强剂或猝灭剂，又可以通过与对应的抗原或抗体的特异性相互作用改变体系的荧光特性，便可以建立一种通用的免疫检测技术。

基于量子点和金属配合物均相免疫荧光检测病毒的方法将实现生物样品如人体肠道病毒EV71，SARS病毒、禽流感病毒、炭疽病毒、艾滋病病毒、出血热病毒、柯萨奇B3病毒的实时、快速、均相、灵敏及选择性检测。

本发明的检测方法响应快，亲水性好，灵敏度高，选择性好，通用性强。

附图说明

图1为CdTe：Zn²⁺量子点(QDs)的紫外吸收和荧光发射光谱图；

其中曲线a为紫外吸收光谱图，曲线b为荧光发射光谱图。

图2为溶液pH变化对QDs(3.2×10^-8mol·L^-1)荧光强度的影响；

(pH3.0～9.0：15mMPBS缓冲溶液)。

图3中曲线a和b分别为实施例1中的钌(II)配合物的荧光激发光谱荧光发射光谱。

图4为本发明方法对人体肠道病毒EV71的响应特异性。

激发波长460nm，发射波长610nm(实施例1)。

图5为人体肠道病毒EV71免疫荧光检测过程的示意图；

量子点受到金属配合物与抗体的偶联物的影响使荧光猝灭，加入抗原EV71后，由于抗体-抗原间的特异性相互作用，使荧光回升。

图6为定量检测人体肠道病毒EV71的荧光图(实施例1)。

图7为定量检测人体肠道病毒EV71的工作曲线(实施例1)。

具体实施方式

下面结合具体的实施例对本发明方法作进一步的描述，以便本领域的技术人员进一步理解本发明，但以下实施例并不以任何形式限制本发明。

实施例1：

一种基于量子点和金属配合物均相免疫检测病毒的方法，其步骤为：

(1)合成CdTe：Zn²⁺量子点

合成方法参照中国专利申请201110070290.3，申请日2011年3月23日，具体步骤为：配制作为碲源的NaHTe或KHTe溶液：将摩尔比为2～5∶1的NaBH₄或KBH₄和Te粉置于水中，0～50℃下搅拌反应5～20h，得到NaHTe或KHTe溶液；在三颈烧瓶中配制Cd²⁺、Zn²⁺和水溶性巯基化合物的混合溶液，其中Cd²⁺浓度为0.001～0.05mol/L，调节溶液的pH值至7～11后，通氩气10～40min除氧气，注入前面制备好的NaHTe或KHTe溶液，混匀后转入水热反应釜中，加热到160～200℃，反应30～150min，得到量子点溶液；向所得CdTe：Zn²⁺量子点溶液中加入3倍体积的异丙醇进行沉淀，离心分离出上清液后，再用异丙醇洗涤、离心3次，得到固体沉淀，将固体沉淀放入真空干燥箱干燥24h后取出，即得CdTe：Zn²⁺量子点，置于4℃下保存。

将制备的CdTe：Zn²⁺量子点溶解于水，得浓度为1.0×10^-6mol/L反应液A；

(2)将钌(II)配合物-双(联吡啶)-4′-甲基-4-羰基吡啶钌-N-琥珀酰亚胺酯双六氟磷酸酯(Ru(bpy)₂(mcbpy-O-Su-ester)(PF₆)₂)与EV71病毒单克隆抗体按照摩尔比30∶1偶联作为荧光猝灭剂溶于水中，得偶联物浓度为2.6×10^-6mol/L的反应液B；

(3)取反应液A6μL，反应液B6μL及588μL水混和，得溶液C；

(4)取溶液C600μL于微量荧光比色皿中，以激发波长280～480nm激发，测量其在发射波长350～700nm处的荧光强度，得到量子点被Ru-Ab猝灭后的荧光强度；

(5)加入3μL不同浓度的被测样品EV71病毒于前述溶液C中，以相同的激发波长激发，测量其在同一发射波长处的荧光强度，得到病毒使量子点荧光回升的荧光强度；

(6)根据量子点的荧光强度回升值对EV71病毒浓度作图，可以得到定量检测EV71病毒的工作曲线。

该荧光均相免疫检测EV71病毒的方法灵敏度达到0.64ng/ml，线性范围为1.8-210ng/ml。加标回收实验表明回收率在98.4％-101.7％之间，重现性好。检测速度快，仅需要15分钟。并且，该病毒检测还可以通过在紫外分析仪中拍照进行半定量检测，可以明显地看到加入不同浓度的病毒EV71后，溶液颜色由红色变成黄色再变成绿色，检测范围为10ng/ml-10μg/ml，检测下限为10ng/ml。

实施例2：

一种基于量子点和金属配合物均相免疫检测病毒的方法，其步骤为：

(1)按照文献Inorg.Chem.2009，48，9723-9731的方法制备出CdTe/CdSe/ZnS量子点，将制备的CdTe/CdSe/ZnS量子点溶解于15mMpH8.0的PBS溶液中，得量子点浓度为1.0×10^-8mol/L反应液A；(2)将铼(I)配合物——双(联吡啶)-4′-甲基-4-羰基吡啶铼-N-琥珀酰亚胺酯双六氟磷酸酯(Re(bpy)₂(mcbpy-O-Su-ester)(PF₆)₂)与柯萨奇B3病毒单克隆抗体按照摩尔比30∶1偶联作为荧光猝灭剂溶于15mMpH8.0的PBS溶液中，得偶联物浓度为1.0×10^-7mol/L的反应液B；

(3)取反应液A6μL，反应液B6μL及0.01mol·L^-1磷酸盐缓冲溶液(pH＝8.0)定容到600μL，得混合溶液C；

(4)取混合溶液C600μL于微量荧光比色皿中，以激发波长280～480nm激发，测量其在发射波长350～700nm处的荧光强度。

(5)加入3μL不同浓度的被测样品柯萨奇B3病毒于前述混合溶液C中，以相同的激发波长激发，测量其在同一发射波长处的荧光强度。

(6)根据量子点回升的荧光强度值对柯萨奇B3病毒浓度作图，可以得到定量检测柯萨奇B3病毒的工作曲线。

该荧光均相免疫检测柯萨奇B3病毒的方法灵敏度达到0.80ng/ml，线性范围为2.0-200ng/ml。加标回收实验表明回收率在97.2％-103.4％之间，重现性好。检测速度快，仅需要15分钟。并且，该病毒检测还可以通过在紫外分析仪中拍照进行半定量检测，可以明显看到加入不同浓度的柯萨奇B3病毒后，溶液颜色由红色变成黄色再变成绿色，检测范围为20ng/ml-200μg/ml，检测下限为20ng/ml。

实施例3

一种基于量子点和金属配合物均相免疫检测病毒的方法，其步骤为：

(1)按照文献J.Phys.Chem.C 2009，113，1293-1300制备CdTe量子点，将制备的CdTe量子点溶解于水，得浓度为5.0×10^-7mol/L得到反应液A；

(2)将铱(III)配合物——双(联吡啶)-4′-甲基-4-羰基吡啶铱-N-琥珀酰亚胺酯双六氟磷酸酯(Ir(bpy)₂(mcbpy-O-Su-ester)(PF₆)₂)与禽流感病毒单克隆抗体按照摩尔比30∶1偶联作为荧光猝灭剂溶于水中，得偶联物浓度为5.0×10^-6mol/L的反应液B；

(3)取反应液A6μL、反应液B6μL混合，然后用水定容到600μL，得混合溶液C；

(4)取混合溶液C600μL于微量荧光比色皿中，以激发波长280～480nm激发，测量其发射波长350～700nm处的荧光强度。

(5)加入3μL不同浓度的被测样品禽流感病毒于前述混合溶液C中，以相同的激发波长激发，测量其在同一发射波长处的荧光强度。

(6)根据量子点回升的荧光强度值对禽流感病毒浓度作图，可以得到定量检测禽流感病毒的工作曲线。

该荧光均相免疫检测禽流感病毒的方法灵敏度达到0.54ng/ml，线性范围为3.0-320ng/ml。加标回收实验表明回收率在93.2％-108.2％之间，重现性好。检测速度快，仅需要15分钟。并且，该病毒检测还可以通过在紫外分析仪中拍照进行半定量检测，可以明显看到加入不同浓度的禽流感病毒后，溶液颜色由红色变成黄色再变成绿色，检测范围为15ng/ml-150μg/ml，检测下限为15ng/ml。

实施例4

一种基于量子点和金属配合物均相免疫检测病毒的方法，其步骤为：

(1)按照文献Chem.Commun.，2008，2106-2108制备CdSe/ZnS量子点，将制备的CdSe/ZnS量子点溶解于15mMpH8.0的PBS溶液中，得量子点浓度为5.0×10^-8mol/L的反应液A；

(2)将钌(II)配合物——双(联吡啶)-4′-甲基-4-羰基吡啶钌-N-琥珀酰亚胺酯双六氟磷酸酯(Ru(bpy)₂(mcbpy-O-Su-ester)(PF₆)₂)与炭疽病毒单克隆抗体按照摩尔比30∶1偶联作为荧光猝灭剂溶于15mMpH8.0的PBS溶液中，得偶联物浓度为5.0×10^-7mol/L的反应液B；

(3)取反应液A6μL、反应液B6μL混合，然后用0.015mol·L^-1磷酸盐缓冲溶液(pH＝8.0)定容到600μL得混合溶液C；

(4)取混合溶液C600μL于微量荧光比色皿中，以激发波长280～480nm激发，测量其在发射波长350～700nm处的荧光强度。

(5)加入3μL不同浓度的被测样品炭疽病毒于前述混合溶液C中，以相同的激发波长激发，测量其在同一发射波长处的荧光强度。

(6)根据量子点回升的荧光强度值对炭疽病毒浓度作图，可以得到定量检测炭疽病毒的工作曲线。

该荧光均相免疫检测炭疽病毒的方法灵敏度达到0.35ng/ml，线性范围为1.2-350ng/ml。加标回收实验表明回收率在95.3％-102.6％之间，重现性好。检测速度快，仅需要15分钟。并且，该病毒检测还可以通过在紫外分析仪中拍照进行半定量检测，可以明显看到加入不同浓度的炭疽病毒后，溶液颜色由红色变成黄色再变成绿色，检测范围为24ng/ml-240μg/ml，检测下限为24ng/ml。

实施例5

一种基于量子点和金属配合物均相免疫检测病毒的方法，其步骤为：

(1)按照文献J.AM.CHEM.SOC.2004，126，1926-1927制备CdTe/ZnS量子点，将制备的CdTe/ZnS量子点溶解于水，得浓度为3.0×10^-8mol/L反应液A；

(2)将钌(II)配合物——双(联吡啶)-4′-甲基-4-羰基吡啶钌-N-琥珀酰亚胺酯双六氟磷酸酯(Ru(bpy)₂(mcbpy-O-Su-ester)(PF₆)₂)与出血热病毒单克隆抗体按照摩尔比30∶1偶联作为荧光猝灭剂溶于水中，得浓度为4.0×10^-7mol/L反应液B；

(3)取反应液A6μL，反应液B6μL并用水定容到600μL中，得混合溶液C；

(4)取混合溶液C600μL于微量荧光比色皿中，以激发波长280～480nm激发，测量其在发射波长350～700nm处的荧光强度。

(5)加入3μL不同浓度的被测样品出血热病毒于前述混合溶液C中，以相同的激发波长激发，测量其在同一发射波长处的荧光强度。

(6)根据量子点回升的荧光强度值对出血热病毒浓度作图，可以得到定量检测出血热病毒的工作曲线。

该荧光均相免疫检测出血热病毒法灵敏度达到0.45ng/ml，线性范围为2.0-200ng/ml。加标回收实验表明回收率在95.2％-102.7％之间，重现性好。检测速度快，仅需要15分钟。并且，该病毒检测还可以通过在紫外分析仪中拍照进行半定量检测，可以明显看到加入不同浓度的出血热病毒后，溶液颜色由红色变成黄色再变成绿色，检测范围为36ng/ml-360μg/ml，检测下限为36ng/ml。

实施例6

一种基于量子点和金属配合物均相免疫检测病毒的方法，其步骤为：

(1)按照文献Adv.Mater.2008，20，3416-3421制备CdTe/CdS/ZnS量子点，将制备的CdTe/CdS/ZnS量子点溶解于水，得量子点浓度为8.0×10^-7mol/L的反应液A；

(2)将铱(III)配合物——双(联吡啶)-4′-甲基-4-羰基吡啶铱-N-琥珀酰亚胺酯双六氟磷酸酯(Ir(bpy)₂(mcbpy-O-Su-ester)(PF₆)₂)与艾滋病病毒单克隆抗体按照摩尔比30∶1偶联作为荧光猝灭剂溶于水中，得偶联物浓度为8.0×10^-6mol/L的反应液B；

(3)取反应液A6μL、反应液B6μL混合，然后用水定容到600μL，得混合溶液C；

(4)取混合溶液C600μL于微量荧光比色皿中，以激发波长280～480nm激发，测量其在发射波长350～700nm处的荧光强度。

(5)加入3μL不同浓度的被测样品艾滋病病毒于前述混合溶液C中，以相同的激发波长激发，测量其在同一发射波长处的荧光强度。

(6)根据量子点回升的荧光强度值对艾滋病病毒浓度作图，可以得到定量检测艾滋病病毒的工作曲线。

该荧光均相免疫检测艾滋病病毒的方法灵敏度达到0.38ng/ml，线性范围为3.4-340ng/ml。加标回收实验表明回收率在96.2％-108.2％之间，重现性好。检测速度快，仅需要15分钟。并且，该病毒检测还可以通过在紫外分析仪中拍照进行半定量检测，可以明显看到加入不同浓度的艾滋病病毒后，溶液颜色由红色变成黄色再变成绿色，检测范围为28ng/ml-280μg/ml，检测下限为28ng/ml。

Claims (6)

1.一种基于量子点和金属配合物均相免疫检测病毒的方法，其步骤如下：

（1）将量子点溶解于溶剂中，得到量子点浓度为1.0×10^-8-1.0×10^-6mol/L的溶液A；

所述的量子点为水溶性量子点；

（2）将金属配合物与抗体的偶联物溶解于溶剂中，配制成偶联物浓度为1.0×10^-7-1.0×10^-5mol/L的溶液B；

所述金属配合物为钌（Ⅱ）配合物、铼（Ⅰ）配合物或铱(Ⅲ)配合物；

所述步骤（1）和（2）中的溶剂为水或15mM pH8.0的磷酸盐缓冲溶液；

所述抗体为待测病毒的单克隆抗体；

（3）取6 mL溶液A与一定量的溶液B混合，然后用水或0.01mol·L^-1 pH8.0的磷酸盐缓冲溶液定容到600mL得溶液C，溶液A和溶液B的比例按量子点和金属配合物-抗体偶联物摩尔比1:10 - 1:20计；

（4）取溶液C 500-1000mL于微量荧光比色皿中，以激发波长280-480nm激发，测量其在发射波长350-700nm处的荧光强度；

（5）加入不同浓度的待测病毒于前述的溶液C中，以相同的激发波长激发，测量其在同一发射波长处的荧光强度；

（6）将量子点的荧光强度回升值对应于病毒浓度作图，得到定量检测病毒的工作曲线；或将比色皿放置于紫外分析仪中，用紫外灯激发样品溶液，观察到不同颜色，并用数码相机拍照，通过颜色变化对病毒进行半定量检测。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述量子点为CdSe、CdTe、CdSe/ZnS、CdTe/ZnS、CdTe/CdS/ZnS、CdSe/CdS/ZnS、CdSe:Mn²⁺、CdTe：Mn²⁺、CdSe:Zn²⁺或CdTe: Zn²⁺。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述金属配合物为铼(Ⅰ)配合物、钌(Ⅱ)配合物或铱(Ⅲ)配合物。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤（2）中金属配合物与抗体按照摩尔比30:1偶联。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述病毒为人体肠道病毒EV71、SARS病毒、禽流感病毒、炭疽病毒、艾滋病病毒、出血热病毒、乙肝病毒或柯萨奇B3病毒。

6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述量子点为CdTe: Zn²⁺量子点。

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