CN102272161A - 免疫原性降低的工程抗体与制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供免疫原性降低的杂交抗体及其抗体结合片段及其制备方法。所述方法包括将已经进行体细胞超突变的杂交抗体或其抗原结合片段的至少一个供体构架区内的一个或多个氨基酸残基用种系构架序列相应位置的氨基酸残基置换。本发明还提供杂交抗体或其抗原结合片段，其含有来源于同一种系基因家族或种系基因家族成员的至少两个供体构架区且其中构架区内的至少一个氨基酸残基被种系构架区相应位置的氨基酸残基置换。杂交抗体或其抗原结合片段可含有人构架区和非人CDR。
Description
相关申请
本申请要求2008年11月6日申请的美国临时申请号61/198,466的权益，所述申请通过引用其整体结合到本文中。
发明背景
抗体是脊椎动物在响应抗原刺激时由称为B细胞的淋巴细胞产生的蛋白质。抗体(亦称免疫球蛋白(Ig))分子的基本结构单元由4条结合在一起的多肽链组成，呈大写字母“Y”形状。4条链中的2条是相同的轻(L)链，2条是相同的重(H)链。有5种不同类型(同种型)的重链，将抗体分成5个类别，即IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。另外，有两种不同的轻链同种型，称为κ和λ。每个类型的重链可与任一种轻链组合。重链和轻链各自含有参与抗原结合的可变区(分别为VH和VL)以及恒定(C)区。抗原结合部位由6个超变区(亦称互补决定区(CDR))组成。重链的3个CDR和轻链的3个CDR分别位于每条链的4个称为构架区(FR1、FR2、FR3和FR4)的相对保守的反平行β-片层之间。按惯例，利用编号系统表示VH和VL链的组成部分的位置。Kabat定义以序列变异性为基础，而Chothia定义以结构环区的位置为基础。
对于由B细胞合成的每种类型Ig链，存在单独的称为种系基因的基因区段库，由其合成单条多肽链。每个库位于不同的染色体上，通常含有较大量的编码V区的基因区段和较少量的编码C区的基因区段。每个轻链V区由两种种系基因区段(即一条长的V基因区段、一条短的连接(J)基因区段)和C区段装配的核酸序列编码。重链由4种种系基因区段编码，3种编码可变区，一种编码恒定区。编码重链可变区的3种种系基因区段为V区段、J区段和多样性D区段。已经表征了人种系V、D和J基因序列。有大约51种人种系VH基因区段(这类“区段”在本文中亦称为种系基因家族成员)，根据至少80％的序列同源性将其分类为7个种系基因家族(VH1-VH7)。参见例如Matsuda等，J.Exp.Med.(1998)188：2151-2162。通过体细胞超突变(somatichypermutation)(或抗体成熟)，每个种系基因家族成员可产生作为指定种系基因家族成员的衍生物的多种免疫球蛋白。可通过将体细胞突变的抗体的序列与种系基因的序列进行比对，以评价与种系基因家族成员的序列同一性，从而确定由其得到体细胞突变抗体的种系基因家族成员。
重链可变区的头两个CDR和三个构架区由VH编码。CDR3由VH的几个核苷酸、全部DH和部分JH编码，而FR4由JH基因区段的其余部分编码。同样，对于轻链，V Kappa(Vκ)或V lambda(Vλ)基因区段(例如种系基因家族成员)编码V区的头两个CDR和3个构架区以及CDR3的几个残基。J Kappa(Jκ)和J Lambda(Jλ)区段分别编码Vκ或Vλ区中的CDR3区的其余部分。编码κ链的DNA包括大约40种Vκ区段(种系基因家族成员)，根据序列同源性将其分成6个家族(VκI-VκVI)。编码λ链的DNA包括分成10个家族的大约31种Vλ区段(种系基因家族成员)。参见图1、2、3和4。
抗体和抗体片段已成为急性和慢性各种人类疾病的有前景的治疗药物。可利用若干方法产生抗体，包括杂交瘤技术、细菌展示、核糖体展示、酵母展示和人抗体片段在复制噬菌体表面的重组表达。可通过杂交瘤产生的单克隆抗体(mAb)多年来成功用作诊断剂，但其作为治疗药物的应用才刚刚兴起。绝大多数的mAb是非人类(主要为啮齿动物)来源的mAb，对人的免疫原性带来了问题。当把啮齿动物源的抗体给予人时，便产生抗啮齿动物抗体，导致从血清中清除啮齿动物抗体增加，阻碍了其治疗效果和超敏反应。这些局限性促使发展了称为“人源化”的工程技术。
最早的人源化策略基于重链和轻链可变结构域负责结合抗原，而恒定结构域负责效应子功能的知识。例如，通过将啮齿动物mAb的可变结构域移植到人抗体的恒定结构域上来产生嵌合抗体(例如Neuberger M S等，Nature 314，268-70，1985和Takeda等，Nature 314，452-4，1985)。虽然这些嵌合抗体在人体内引起更好的效应子功能，而且免疫原性降低，但是啮齿动物可变区仍具有诱导免疫应答的风险。当认识到可变结构域由β片层构架和覆盖其上的抗原结合环(互补决定区，即CDR)组成时，便将人源化抗体设计成含有移植到人构架上的啮齿动物CDR。通常使用其中整个人构架区与啮齿动物序列同源性最接近的抗体，将若干不同的抗原结合部位成功转移到单一人构架上(例如Jones P T等，Nature 321，522-5，1986；Riechmann L.等，Nature332，323-327，1988；以及Sato K.等，Mol.Immunol.31，371-8，1994)。或者，根据若干人重链构建了共有人构架(例如Carter P.等，Proc.Nat.Acad.Sci.USA 89，487-99，1992)。然而，单纯的CDR移植常常导致抗原亲和力的丧失。不得不考虑β-片层构架与抗原环之间的其它可能的相互作用以重建抗原结合部位(Chothia C等，Mol.Biol.196，901-917，1987)。
若干抗体人源化所必需的基本构架残基的比较以及基于抗体晶体结构的计算机建模披露了很可能对结合部位的完整性产生影响的称为“Vernier区残基”的一组构架残基(Foote J.等，Mol Biol 224，487-99，1992)。另外，VH-VL界面区的若干残基可能对维持抗原的亲和力十分重要(Santos A D等，Prog.Nucleic Acid Res Mol Biol 60，169-94 1998)。最初，将构架残基逐步突变成啮齿动物序列(Kettleborough C A等，Protein Engin.4，773-783，1991)。然而，这种突变方法非常耗时，而且不能覆盖所有重要的残基。
对于任何具体抗体，少部分的改变可满足结合最优化的需要，但是仍难以从Vernier和VH/VL残基组中选择。组合文库法(combinatorial library approach)结合选择技术(例如噬菌体展示)通过产生人源化分子文库，对人源化技术进行了彻底的改革，所述人源化分子文库表示在所有重要的构架残基中啮齿动物与人序列之间的替代，并允许同时测定所有人源化形式的结合活性(例如Rosok M J，J BiolChem，271，22611-8，1996和Baca M等，J Biol Chem 272，10678-84，1997)。
显然，本领域需要产生免疫原性降低而同时保持最适结合特征、可以给予目标物种用于治疗和诊断目的的人源化抗体的改进方法。
发明概述
一方面，本发明提供用于产生杂交抗体可变结构域或其片段的方法，其中所述方法包括(i)从对靶标具有特异性的初始抗体可变区内的FR1、FR2和FR3中选择构架区；(ii)将选定构架区与所述目标物种的候选供体构架序列进行比较，以鉴定与选定构架区具有高度同源性的第一供体构架序列；(iii)对第一供体构架序列与所述目标物种的种系序列进行比较，以鉴定与第一供体构架序列具有高度同源性的第一种系构架序列；(iv)在第一供体构架序列内鉴定出至少一个氨基酸残基，其不同于第一种系构架序列相应位置上的氨基酸残基；和(v)构建包含初始抗体的互补决定区(CDR)和第一供体构架序列的杂交抗体可变结构域或其片段，其中第一供体构架序列内的至少一个氨基酸残基被第一种系构架序列相应位置上的氨基酸残基置换。
在某些实施方案中，所述方法还包括从初始抗体的FR1、FR2和FR3中选出第二构架区，将选定构架区与所述目标物种的候选供体构架序列进行比较，以鉴定与选定构架区具有高度同源性的第二供体构架序列，并且构建包含初始抗体的CDR和供体构架序列的杂交抗体可变结构域或其片段。
在某些实施方案中，所述方法还可无特定顺序地包括将第二供体构架序列与所述目标物种的种系序列进行比较，以鉴定与第二构架序列具有高度同源性的第二种系构架序列，并且将第二供体构架序列内的至少一个氨基酸残基用第二种系构架序列相应位置上的氨基酸残基置换。
在某些实施方案中，所述第一和第二供体序列来源于属于同一种系基因家族的两种不同的抗体。
在某些实施方案中，所述方法还包括从初始抗体的FR1、FR2和FR3中选择第三构架区，将选定构架区与所述目标物种的候选供体构架序列进行比较，以鉴定与选定构架区具有高度同源性的第三供体构架序列；并且构建包含初始抗体的CDR和供体构架序列的杂交抗体可变结构域或其片段。
在某些实施方案中，所述方法还可无特定顺序地包括将第三供体构架序列与所述目标物种的种系序列进行比较，以鉴定与第三构架序列具有高度同源性的第三种系构架序列，并且将第三供体构架序列内的至少一个氨基酸残基用第三种系构架序列相应位置上的氨基酸残基置换。
在某些实施方案中，所述第三供体序列与第一和第二种系基因家族属于相同的种系基因家族。
在某些实施方案中，所述方法还包括选择初始抗体的FR4的第四构架区，将选定构架区与所述目标物种的候选供体构架序列进行比较，以鉴定与选定构架区具有高度同源性的第四供体构架序列，并且构建包含初始抗体的CDR和供体构架序列的杂交抗体可变结构域或其片段。
在某些实施方案中，所述方法还可无特定顺序地包括将第四供体构架序列与所述目标物种的种系序列进行比较，以鉴定与第四构架序列具有高度同源性的第四种系构架序列，并且将第四供体构架序列内的至少一个氨基酸残基用第四种系构架序列相应位置上的氨基酸残基置换。
另一方面，本发明提供用于产生杂交抗体可变结构域或其片段的方法，其中所述方法包括(i)从对靶标具有特异性的初始抗体可变区内的FR1、FR2和FR3中选择构架区；(ii)将初始抗体的选定构架区与所述目标物种的候选供体可变区序列进行比较，以鉴定与选定构架区具有高度同源性的第一供体构架序列；(iii)构建包含初始抗体的互补决定区(CDR)和第一供体构架序列的杂交抗体可变结构域或其片段；(iv)将第一供体构架序列与所述目标物种的种系可变区序列进行比较，以鉴定与第一供体构架序列具有高度同源性的第一种系构架序列；和(v)将第一供体构架序列内的至少一个氨基酸残基用第一种系构架序列相应位置上的氨基酸残基选择性取代。
在某些实施方案中，所述方法还包括从初始抗体的FR1、FR2和FR3中选择第二构架区，将选定构架区与所述目标物种的候选供体构架序列进行比较，以鉴定与选定构架区具有高度同源性的第二供体构架序列；并且构建包含初始抗体的CDR和供体构架序列的杂交抗体可变结构域或其片段。
在某些实施方案中，所述方法还可无特定顺序地包括将第二供体构架序列与所述目标物种的种系序列进行比较，以鉴定与第二构架序列具有高度同源性的第二种系构架序列，并且将第二供体构架序列内的至少一个氨基酸残基用第二种系构架序列相应位置上的氨基酸残基置换。
在某些实施方案中，所述第一和第二供体序列来源于属于同一种系基因家族的两种不同的抗体。
在某些实施方案中，所述方法还包括从初始抗体的FR1、FR2和FR3中选择第三构架区，将选定构架区与所述目标物种的候选供体构架序列进行比较，以鉴定与选定构架区具有高度同源性的第三供体构架序列；并且构建包含初始抗体的CDR和供体构架序列的杂交抗体可变结构域或其片段。
在某些实施方案中，所述方法还可无特定顺序地包括将第三供体构架序列与所述目标物种的种系序列进行比较，以鉴定与第三构架序列具有高度同源性的第三种系构架序列，并且将第三供体构架序列内的至少一个氨基酸残基用第三种系构架序列相应位置上的氨基酸残基置换。
在某些实施方案中，所述第三供体序列与第一和第二供体序列属于相同的种系基因家族。
在某些实施方案中，所述方法还包括选择初始抗体的FR4的第四构架区，将选定构架区与所述目标物种的候选供体构架序列进行比较，以鉴定与选定构架区具有高度同源性的第四供体构架序列；并且构建包含初始抗体的CDR和供体构架序列的杂交抗体可变结构域或其片段。
在某些实施方案中，所述方法还可无特定顺序地包括将第四供体构架序列与所述目标物种的种系序列进行比较，以鉴定与第四构架序列具有高度同源性的第四种系构架序列，并且将第四供体构架序列内的至少一个氨基酸残基用第四种系构架序列相应位置上的氨基酸残基置换。
在某些实施方案中，本文所述方法还可包括测定包含本文所述的任何杂交抗体可变结构域或其片段的杂交抗体或其抗原结合片段，以测定相对于其中第一供体构架序列内的至少一个氨基酸未被第一种系构架序列相应的氨基酸残基置换的包含杂交抗体可变结构域或其片段的杂交抗体或其抗原结合片段的免疫原性、或结合亲和力、或者免疫原性和结合亲和力两者。
在一个实施方案中，杂交抗体或其抗原结合片段的相对结合亲和力是初始抗体对所述靶标的亲和力的至少60％。
在另一个实施方案中，当暴露于目标物种的免疫系统时，与其中第一供体构架序列内的至少一个氨基酸未被第一种系构架序列相应的氨基酸残基置换的杂交抗体或其抗原结合片段相比，杂交抗体或其抗原结合片段的免疫原性降低。
在某些实施方案中，杂交抗体可变结构域或其片段是选自以下的抗体片段的可变结构域：scFv、Fab、Fab′、F(ab′)2、Fd、双抗体、抗体轻链和抗体重链。在不同的实施方案中，目标物种可为人。
又一方面，本发明提供用于产生杂交抗体可变结构域或其片段的方法，其中所述方法包括(i)从对靶标具有特异性的初始人源化抗体的可变区内的FR1、FR2和FR3选择构架区；(ii)将选定构架区序列与人种系序列进行比较，以鉴定与第一构架序列具有高度同源性的第一种系构架序列；和(iii)在一个或多个位置上修饰选定构架区，以引入将选定构架区的氨基酸残基改变成种系构架序列相应位置上的氨基酸残基的突变。
在某些实施方案中，所述方法还包括(i)从初始人源化抗体的FR1、FR2和FR3中选出第二构架区；(ii)将选定构架区序列与人种系序列进行比较，以鉴定与第二构架序列具有高度同源性的第二种系构架序列；和(iii)在一个或多个位置上修饰选定构架区，以引入将选定构架区的氨基酸残基改变成种系构架序列相应位置上的氨基酸残基的突变。
在某些实施方案中，所述第一和第二构架序列属于同一种系基因家族。
在另一个实施方案中，所述方法还包括(i)从初始人源化抗体的FR1、FR2和FR3中选择第三构架区；(ii)将选定构架区序列与人种系序列进行比较，以鉴定与第三构架序列具有高度同源性的第三种系构架序列；和(iii)在一个或多个位置上修饰选定构架区，以引入将选定构架区的氨基酸残基改变成种系构架序列相应位置上的氨基酸残基的突变。
在某些实施方案中，所述第三构架序列与第一构架序列属于相同的种系基因家族。
在又一个实施方案中，所述方法还包括(i)选择初始人源化抗体可变区内的FR4的第四构架区；(ii)将选定构架区序列与人种系序列进行比较，以鉴定与第四构架序列具有高度同源性的第四种系构架序列；和(iii)在一个或多个位置上修饰选定构架区，以引入将选定构架区的氨基酸残基改变成种系构架序列相应位置上的氨基酸残基的突变。
在某些实施方案中，所述方法还可包括测定包含本文所述杂交抗体可变结构域或其片段的杂交抗体或其抗原结合片段，以确定相对于初始人源化抗体的免疫原性、或结合亲和力、或者免疫原性和结合亲和力两者。
在某些实施方案中，杂交抗体或其抗原结合片段的相对结合亲和力是初始抗体对所述靶标的亲和力的至少60％。
在某些实施方案中，当暴露于目标物种的免疫系统时，与初始人源化抗体相比，杂交抗体或其抗原结合片段的免疫原性降低。
另一方面，本公开内容提供对靶标特异性的杂交抗体或其抗原结合片段，其包含(i)初始抗体的互补决定区(CDR)，其中所述初始抗体对所述靶标是特异性的，(ii)第一抗体的第一重链构架区，和(iii)第二抗体的第二重链构架区，其中(a)第一和第二抗体属于同一种系基因家族，(b)第一和第二重链构架区选自FR1、FR2和FR3，(c)至少一个重链构架区包含体细胞超突变，(d)至少一个所述第一或第二重链构架区包含成为种系构架序列相应位置上的氨基酸残基的至少一个突变，和(e)对所述靶标特异性的杂交抗体或其抗原结合片段。
在某些实施方案中，所述杂交抗体或其抗原结合片段还包含选自FR1、FR2和FR3的第三重链构架区，其中第三重链构架区来源于选自以下的抗体：第一抗体、第二抗体和既不是第一抗体又不是第二抗体的第三抗体。
在某些实施方案中，第三重链构架区与第一重链构架区属于相同的种系基因家族。
在某些实施方案中，杂交抗体或其抗原结合片段还包含选自以下抗体的FR4重链构架区：第一抗体、第二抗体、第三抗体和既不是第一、第二抗体又不是第三抗体的第四抗体。
在某些实施方案中，第三重链构架区和第四重链构架区中的任一个或两个与第一重链构架区属于相同的种系基因家族。
在某些实施方案中，杂交抗体或其抗原结合片段的构架区是人源的，而CDR是非人源的。
另一方面，本公开内容提供对靶标特异性的杂交抗体或其抗原结合片段，其包含(i)初始抗体的互补决定区(CDR)，其中所述初始抗体对所述靶标是特异性的，(ii)第一抗体的第一轻链构架区，和(iii)第二抗体的第二轻链构架区，其中(a)第一和第二抗体属于同一种系基因家族，(b)第一和第二轻链构架区选自FR1、FR2和FR3，(c)至少一个轻链构架区包含体细胞超突变，(d)至少一个所述第一或第二轻链构架区包含成为种系构架序列相应位置上的氨基酸残基的至少一个突变，和(e)对所述靶标特异性的杂交抗体或其抗原结合片段。
在某些实施方案中，所述杂交抗体或其抗原结合片段还包含选自FR1、FR2和FR3的第三轻链构架区，其中第三轻链构架区来源于选自以下的抗体：第一抗体、第二抗体和既不是第一抗体也不是第二抗体的第三抗体。
在某些实施方案中，第三轻链构架区与第一轻链构架区属于相同的种系基因家族。
在某些实施方案中，杂交抗体或其抗原结合片段还包含选自以下抗体的FR4轻链构架区：第一抗体、第二抗体、第三抗体和既不是第一、第二抗体又不是第三抗体的第四抗体。
在某些实施方案中，第三轻链构架区和第四轻链构架区的任一个或两个与第一轻链构架区属于相同的种系基因家族。
在某些实施方案中，杂交抗体或其抗原结合片段的构架区是人源的，而CDR是非人源的。
在某些实施方案中，所述杂交抗体或其抗原结合片段的轻链构架来自VL轻链。在其它实施方案中，所述杂交抗体或其抗原结合片段的轻链构架来自VK轻链。
在某些实施方案中，与不含突变的杂交抗体相比，杂交抗体或抗原结合片段的至少一个氨基酸残基突变成本文所述种系序列相应位置上的氨基酸残基使免疫原性降低。
在某些实施方案中，对于给定靶标，杂交抗体或其抗原结合片段的相对结合亲和力为初始抗体的亲和力的至少60％。
附图简述
图1图示Vκ基因基因座的种系基因。显示了Vκ外显子氨基酸序列比对。比对、编号和环区按照Chothia定义的结构标准而定。CDR按照Kabat等人的定义而定。
图2图示VH基因基因座的种系基因。显示了VH外显子氨基酸序列比对。比对、编号和环区按照Chothia定义的结构标准而定。CDR按照Kabat等人的定义而定。
图3图示Vλ基因基因座的种系基因。显示了Vλ外显子氨基酸序列比对。比对、编号和环区按照Chothia定义的结构标准而定。CDR按照Kabat等人的定义而定。
图4图示根据氨基酸序列比对的翻译后的JH、JK和JL基因基因座的种系基因。
发明详述
1.用于产生杂交抗体的方法
一方面，本申请提供产生杂交抗体或其抗原结合片段的方法，其包括通过将供体构架区的一个或多个氨基酸残基用构架种系序列相应位置上的氨基酸残基置换，从而改变供体构架区的序列。杂交抗体或其抗原结合片段是指在选自目标物种的一个或多个抗体的构架区的功能情况下，含有第一物种起始(初始)抗体的互补决定区(CDR)的抗体或其抗原结合片段。杂交抗体或其抗原结合片段对被初始抗体识别的靶标保留至少部分结合亲和力。当给予目标物种时，杂交抗体及其抗原结合片段具有比对照抗体低的免疫原性。杂交抗体的一个示例性实施方案是人源化抗体。
在产生杂交抗体时，该方法可以利用给定靶标的已知抗体作为初始抗体或起始抗体。或者，可以使用现有已知技术来产生所需靶标的抗体。用于产生针对所需靶标的单克隆抗体的各种技术为本领域技术人员所熟知。这类技术的实例包括但不限于包括展示文库、xeno或huMAb小鼠、杂交瘤等的技术。靶标包括能够显示抗原性的任何物质，且通常为蛋白质、碳水化合物或糖基化蛋白。靶标的实例包括受体、酶、激素、生长因子、肽等。应理解的是，按照本公开内容，不仅天然存在的抗体适用，而且针对预确定靶标的工程抗体和抗体片段也适于作为初始抗体。
按照本文提供的技术，用作初始抗体的抗体(Ab)和抗原结合片段包括单克隆和多克隆Ab及抗体片段，例如Fab、Fab′、F(ab′)2、Fd、scFv、双抗体、抗体轻链、抗体重链和/或得自噬菌体或噬菌粒展示技术的抗体片段，以及按照本领域任何已知方法产生的任何人源化杂交抗体。
起始物种是用于产生起始抗体或从中得到起始抗体的文库的任何物种。示例性起始物种包括例如大鼠、小鼠、兔、鸡、猴、人等。
可采用分子生物学的标准技术获得对靶标抗原具有特异性的起始物种抗体的轻链、重链或两者的可变部分的核酸或氨基酸序列。在获得所需抗体后，可采用任何已知的CDR定义(例如Kabat、Chothia、Kabat和Chothia结合型定义、以及本领域技术人员已知的任何其它定义)，确定可变区(VH和VL)的构架(FR)区和CDR区。一旦确定起始抗体的FR区和CDR区，便可从目标物种的一种或多种抗体中选择FR用于构建包含起始抗体的CDR和得自目标物种的一种或多种抗体的构架区的杂交抗体或其抗原结合片段。
可通过将初始抗体序列的一个或多个构架区与目标物种的可变氨基酸序列或抗体基因序列进行对比，评价同源性和/或同一性，选出用于构建杂交抗体的目标物种构架区。用于比对检索的程序是本领域众所周知的，例如BLAST等。例如，如果目标物种是人，则这类氨基酸序列或基因序列(种系抗体序列或重排抗体序列)的来源可存在于任何合适的参比数据库，例如Genbank、NCBI蛋白质数据库、VBASE(一种由医学研究委员会MRC蛋白质工程中心(Medical ResearchCouncil；MRC Centre for Protein Engineering)维护的人抗体基因数据库)以及免疫球蛋白或其翻译产物的Kabat数据库。如果根据核苷酸序列进行比对，则应分析选定基因，以确定该亚群的那些基因与起始物种抗体具有最接近的氨基酸同源性。
同源性的程度衡量两个多肽序列之间的关系。总的来讲，同源性是指基于残基/残基的两条多肽链的氨基酸之间的比较，其不仅仅考虑残基对(即所比较序列的各残基对)之间的准确一致性(即同一性)，还要考虑，如果不是准确的一致性，是否因为进化从而一个残基可能取代了另一个残基。这种可能性具有相关的“分值”，然后由此可确定两个序列的同源性的％或程度。比较两个或更多个序列的同一性或同源性的方法是本领域众所周知的。
合适的目标物种包括要向其给予杂交抗体或其抗原结合片段的任何物种。示例性目标物种是人。然而，目标物种不限于人，可包括例如猴或其它物种。
构架比对和杂合体构建概况
一方面，本申请提供用于产生杂交抗体或其抗原结合片段的方法，该方法包括按照已知方法修饰已被人源化(即预先人源化)的初始抗体。在最简单的实例中，这可以是含有第一非人抗体的CDR和第二人抗体的构架区的初始人源化抗体。如本文所述，选出初始抗体的构架区(即FR1、FR2、FR3或FR4)，与参比数据库的人种系序列进行比对，以鉴定与所述构架序列具有高度同源性的种系序列。与构架序列具有高度同源性的种系序列可用来鉴定与种系序列相比已进行体细胞超突变的构架序列内的氨基酸位置。一旦鉴定出这类位置，则反映体细胞超突变的一个或多个氨基酸残基可用种系构架序列相应位置上的氨基酸残基选择性置换。该方法可包括进行至少一个修饰以在初始抗体的至少一个、至少两个、至少三个或全部四个构架区中引入种系氨基酸残基。在不同的实施方案中，为了产生杂交抗体，可在初始人源化抗体的可变区序列中引入至少一个、至少两个、至少三个、至少四个、至少五个或更多个种系氨基酸残基的修饰。
另一方面，本申请提供用于产生杂交抗体或其抗原结合片段的方法，其包括将初始抗体的一个或多个选定构架区用目标物种的构架区置换，其中通过将构架区的至少一个氨基酸残基改变成构架序列内相应位置上的种系构架序列的氨基酸残基，来修饰目标物种的构架区。
在一个实施方案中，用于产生杂交抗体或其抗原结合片段的方法包括从起始物种选择初始抗体的单个构架区(未预先人源化)，即FR1、FR2、FR3或FR4，将选定构架区与参比数据库中的目标物种的候选可变氨基酸序列或基因序列进行比对，以鉴定供体构架序列。然后将供体构架序列与同一目标物种的种系构架序列进行比较。通过将供体构架序列与种系构架序列比对，供体构架序列内哪些氨基酸位置与种系构架序列相比已进行体细胞超突变将是显而易见的。一旦鉴定出这类位置，便将涉及体细胞超突变的位置上的一个或多个氨基酸残基用种系构架序列中相应位置上的氨基酸残基置换。可以在含有初始抗体的互补决定区(CDR)和供体构架序列的杂交抗体可变结构域或其片段装配之前或之后进行供体构架序列的修饰。
在另一个实施方案中，用于产生杂交抗体或其抗原结合片段的方法包括从目标物种选出供体构架序列，构建杂交抗体可变结构域或其片段，然后通过将构架区的至少一个氨基酸残基用种系构架序列中相应位置上的氨基酸残基改变，从而进一步修饰杂交抗体可变结构域或其片段。在这种方法中，选出起始物种初始抗体(未预先人源化)的单个构架区，即FR1、FR2、FR3或FR4，与参比数据库中目标物种的候选可变序列(氨基酸序列或基因序列)进行比对以鉴定供体构架序列。然后将鉴定出的供体构架序列用于构建包含初始抗体的CDR和供体构架序列的杂交抗体可变结构域。然后将供体构架序列与同一目标物种的种系序列进行比对。通过将鉴定出的供体构架序列与种系构架序列进行比对，供体构架序列内哪些氨基酸位置与种系构架序列相比已进行体细胞超突变将是显而易见的。一旦鉴定出这类位置，将体细胞超突变位置上的一个或多个氨基酸残基用种系构架序列相应位置上的氨基酸残基置换。
根据不同标准选出目标物种的供体构架区，包括起始抗体构架区的同源性程度、与起始抗体相比构架区对杂交抗体的抗原结合亲和力的影响以及与对照抗体相比构架区对杂交抗体的免疫原性的影响。通常，合适的目标物种的供体构架区与起始抗体的构架区可具有高度同源性(例如氨基酸或基因序列同源性)。在某些实施方案中，高度同源性为至少80％、85％、90％、95％或98％同源性。还可根据起始抗体构架区和目标物种构架区之间的同一性程度(例如氨基酸或基因序列同一性)来鉴定合适的构架区。在某些实施方案中，高度同一性为至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、97％或98％同一性。
当比较目标物种的供体构架序列与种系序列时，用于比较的合适种系序列可以至少两种方式确定。例如，根据从中获得供体构架序列的抗体的有关知识，本领域技术人员可确定从中获得抗体的种系序列。或者，可将供体构架序列(氨基酸序列或核酸序列)与目标物种的种系序列数据库进行比较，以鉴定与供体构架序列有高度同源性(例如至少80％、85％、90％、95％或98％同源性)或同一性(例如至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％或98％)的种系序列。在一个示例性实施方案中，使用与供体构架序列具有最高程度同源性或同一性的种系构架序列进行比较。
如上所述，用于产生杂交抗体或其抗原结合片段的方法可包括将初始抗体的至少一个构架区用目标物种的供体抗体构架区置换。在某些实施方案中，所述方法可包括将初始抗体的至少两个、三个或全部四个构架区用一个或多个供体抗体的构架区置换。当进行本文所述方法时，两个或更多个构架区可被相继或同时置换。此外，供体构架区可来自一种抗体或来自不同抗体。例如，在一个实施方案中，全部四个供体构架序列可获自同一抗体。在另一个实施方案中，全部四个供体构架序列可获自不同抗体。本文还包括这两种极端情况之间的各种变化。
在一个示例性实施方案中，杂交抗体或其抗原结合片段包含至少两个供体构架序列，其得自属于同一种系基因家族的不同抗体或来源于同一种系基因家族成员的两种不同抗体。下文进一步描述了使用来自同一种系基因家族的供体抗体进行构架拼接(framework patching)的方法。
当置换两个或更多个构架区时，可以独立选择用于置换各构架区的特定方法。例如，如果第一构架区采用上述第一实施方案置换，则第二构架区可采用上述第一实施方案或第二实施方案置换。同样，如果第一构架区采用上述第二实施方案置换，则第二构架区可采用上述第一实施方案或第二实施方案置换。
下文描述了用于产生杂交抗体或杂交抗体可变结构域或其抗原结合片段的说明性方法。仅为清楚起见，在这些实例中使用下面的标记法：FR1、FR2、FR3和FR4表示初始抗体的构架区；*FR1*、*FR2*、*FR3*和*FR4*表示选自目标物种序列数据库的供体构架区；而fr1、fr2、fr3和fr4表示在已被种系构架序列相应位置上的氨基酸残基置换的体细胞超突变位置上含有一个或多个氨基酸残基的供体构架区。
在第一个实例中，FR1选自初始抗体的可变结构域FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4，用于与参比数据库中的目标物种的候选可变氨基酸序列或基因序列进行比对，以鉴定与FR1具有高度同源性的所需供体构架区。然后，将选定的供体构架序列*FR1*与种系序列相比，以鉴定与*FR1*具有高度同源性的种系序列。然后对*FR1*序列和种系构架序列进行比对，并鉴定体细胞超突变的位置。然后将*FR1*内体细胞超突变的某一位置上的至少一个氨基酸残基用种系构架序列中相应位置的氨基酸置换形成fr1，从而修饰*FR1*。然后可以构建杂交抗体以产生包含fr1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4的杂交抗体可变区或其片段。或者，可先产生包含*FR1*-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4的杂交抗体可变区。然后，杂交抗体可变区可通过将已进行体细胞超突变的*FR1*内的一个或多个残基用相应的种系氨基酸进行选择性置换进行修饰，以产生fr1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。
其它构架区可采用上述方法相继或同时置换。例如可以置换2、3或全部4个构架区。在一个示例性实施方案中，分别置换全部4个构架区以产生包含fr1-CDR1-fr2-CDR2-fr3-CDR3-fr4的杂交抗体可变区或其片段。
当采用上述方法时，初始抗体的全部构架区不一定用供体构架序列置换。此外，不一定对杂交抗体的全部构架区内的种系氨基酸进行选择性置换。例如，按照本发明的标记法，虽然fr1-CDR1-fr2-CDR2-fr3-CDR3-fr4形式的杂合体可以是合适的杂合产物，但是fr1-CDR1-fr2-CDR2-*FR3*-CDR3-*FR4*形式的杂合体可能同样合适。
在第二个实例中，FR1选自初始抗体的可变结构域FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。然后，将FR1(氨基酸或核酸序列)与参比数据库的目标物种的候选可变氨基酸序列或基因序列进行比对，以鉴定与FR1具有高度同源性的所需供体构架区。然后产生包含*FR1*-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4的杂交抗体可变结构域。然后将*FR1*与种系序列进行比对，以鉴定与*FR1*具有高度同源性的种系序列。然后比对*FR1*序列和种系构架序列，鉴定出体细胞超突变的位置。随后通过将*FR1*内体细胞超突变位置上的至少一个氨基酸残基用种系构架序列中相应位置的氨基酸置换，以对*FR1*进行修饰，从而产生fr1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。可采用上述方法，相继或同时置换其它构架区。
在第三个实例中，产生杂交抗体或其抗原结合片段的步骤可用已经过人源化(即预先人源化)的初始抗体开始。同样，在这种情况下，采用上述标记法，可将初始抗体标记为*FR1*-CDR1-*FR2*-CDR2-*FR3*-CDR3-*FR4*。一个或多个*FR*区与种系数据库的比对、选择同源种系序列、选择性置换产生所需要的“fr”区以及构建最终的杂交抗体或其片段的方法类似于上述方法。应当清楚的是，当应用于预先人源化初始抗体时，“供体”构架区是指在预先人源化抗体中存在的构架区。最终产物的1、2、3或全部4个构架区中，氨基酸残基可被选择性置换成种系残基。
在某些实施方案中，与对照抗体相比，按照本文所述方法产生的杂交抗体及其抗体结合片段保持至少部分对靶标的结合亲和力。合适的杂交抗体或其抗原结合片段可保持对照抗体的结合亲和力的至少50％、60％、75％、80％、85％或90％。对照抗体是用作对用于产生杂交抗体的杂交方法对结合亲和力的影响进行评价的基础抗体。示例性对照抗体为初始抗体。然而，根据特定情况，其它对照抗体也可能是适当的。例如，在某些实施方案中，可能需要确定构架置换成种系氨基酸残基的影响。在这种情况下，应评价所得杂交抗体(例如具有种系置换)与缺乏种系置换的等同杂交抗体的结合亲和力。根据本文的公开内容，本领域技术人员将能够确定合适的对照抗体。在某些实施方案中，本文所述方法还可包括评价杂交抗体或其抗原结合片段相对于对照抗体的结合亲和力的步骤。按照众所周知的方法，可以测定抗体或其抗原结合片段的结合亲和力、缔合速率常数和解离速率常数。示例性方法参见例如Rother等(美国专利7,399,594和7,393,648)和Queen等(美国专利5,693,762、6,180,371和7,022,500)。
按照本文所述方法产生的杂交抗体及其抗原结合片段的免疫原性降低。可以测定杂交抗体或抗原结合片段的免疫原性与目标物种的合适对照抗体相比是否降低。免疫原性降低是指与对照抗体相比，杂交抗体或其抗原结合片段的免疫原性降低至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、90％或以上。合适的对照抗体包括初始抗体或不含种系氨基酸残基的一个或多个构架置换的杂交抗体或其抗原结合片段。在某些实施方案中，本文所述方法还可包括评价杂交抗体或其抗原结合片段相对于对照抗体的免疫原性的步骤。目标物种中抗体的免疫原性可采用本领域已知方法评价，例如人抗小鼠抗体(HAMA)ELISA测定法。
当整体考虑时，可通过使杂交抗体或其片段的生理和结构特征最优化的选择因素，从而确定供体构架序列内一个或多个氨基酸位置的选择性置换。在某些实施方案中，在评价供体构架内的位置是否应当用种系构架区相应位置的氨基酸残基置换时，可考虑对杂交抗体或其抗原结合片段的结合亲和力和免疫原性的影响。可用计算机芯片预测或凭经验确定供体构架区内给定氨基酸残基的取代对亲和力和免疫原性的影响。通常使用计算机模型来鉴定很可能与CDR或者特定抗原或者两者相互作用的构架区的氨基酸位置(参见例如Whitelegg，N.R.& A.R.Rees：WAM：an improved algorithm for modeling antibodieson the WEB.Protein Eng.，13，819-24(2000))。可利用该资料来确定构架取代是否可能对结合亲和力产生影响。同样，可获得可预测某一序列是否可能被当作T细胞抗原识别的计算机程序(参见例如WO00/34317和US 2007/0292416；通过引用结合到本文中)。可以使用该资料来确定构架取代是否可能对免疫原性产生影响。在某些实施方案中，可采用计算机芯片和经验技术的组合来评价是否应将构架区内某一氨基酸残基改变成种系氨基酸残基。
本文所述方法包括将供体构架区的至少一个氨基酸残基用种系构架区内相应位置的氨基酸残基置换。在某些实施方案中，给定供体构架区中至少2、3、4、5个或以上的氨基酸残基可用相应位置上的种系残基置换。在某些实施方案中，可将不同于种系构架序列的所有供体构架氨基酸残基在相应位置上改变成种系氨基酸残基。在某些实施方案中，可在单一供体构架区使供体构架区突变成为种系氨基酸残基，或者可以在给定可变结构域中对2、3或全部4个构架区进行突变。
应理解的是，可以采用上述步骤的任何组合以任何顺序构建杂合体。还要注意的是，对于上述任何方法，初始抗体内第一构架区的选择不必以FR1开始；相反，选择用于比对的第一构架区可以是FR2、FR3或FR4。同样，构架区的各连续选择和比对不必按构架编号的顺序进行。此外，显而易见的是，可以选择包含单一构架区以外的部分，将其与参比数据库序列进行比对，以鉴定具有高度同源性的供体构架序列。例如，可将FR1和部分或全部的相邻CDR1序列用于比对，或者甚至所述选择还可包括初始抗体的FR2区。
可按照本文所述方法产生的杂交抗体或其抗原结合片段包括全长重链和轻链或其任何片段，例如Fab、Fab′、F(ab′)2、Fd、scFv、抗体轻链和抗体重链。还设计了具有本文所述的可变区和不同物种的恒定区的嵌合抗体。
用于构架拼接的种系基因家族因素
在示例性的实施方案中，用于产生本文所述杂交抗体或其抗原结合片段的方法可包括同一种系基因家族的不同抗体或同一种系基因家族成员的不同抗体进行构架拼接。考虑有关种系基因家族用于构架拼接的方法参见美国专利号7,393,648和7,399,594，其通过引用结合到本文中。
考虑种系基因家族的构架拼接首先包括选择候选供体构架序列。具体地讲，在将起始物种初始抗体的选定的单个构架区，即FR1、FR2、FR3或FR4，与参比数据库中的目标物种的候选可变氨基酸序列或基因序列比对后，鉴定出一组供体构架序列。经所采用的数据库测定，该组已鉴定出的供体构架序列可包含头100个命中(hits)、头75个命中、头50个命中、头25个命中、头10个命中或头5个命中。或者，该组供体序列可包含与初始抗体的选定序列有至少80％、85％、90％、95％、98％或100％同源性的供体构架序列。在其它实施方案中，该组供体序列可包含与初始抗体的选定序列有至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、97％或100％同一性的供体构架序列。可使用核酸或氨基酸序列的任一个来确定同源性和同一性。按照本发明的方法，可采用若干选择标准从任何给定组中鉴定出所需要的供体构架用于进一步操作。
就FR1、FR2和FR3而言，将该组成员归类为起始种系基因家族，即VH1、VH2、VH3等；VκI、VκII、VκIII等和Vλ1、Vλ2、Vλ3等，可能时，进一步归类为种系基因家族成员。种系基因家族和种系基因家族成员更完整的列表参见图1、2和3。在某些实施方案中，每个供体构架序列FR1、FR2和FR3可来源于不同的种系基因家族。然而，虽然并不总是这样，每一单个构架区的最相似的序列匹配可来自不同的抗体或抗体片段。在一个实施方案中，两个或更多个构架区来自同一种系基因家族的不同抗体。在另一个实施方案中，两个或更多个构架区来自从同一种系基因家族成员获得(例如通过体细胞超突变)的不同抗体。在另一个实施方案中，至多3个构架区可来自同一抗体。预期即使在数据库中可能有来源于具有较高程度同源性的不同种系基因家族的构架序列，但是更优选实际上可具有较低程度同源性但来源于与其它选定的构架相同种系基因家族的候选序列。同样，数据库中可能有来源于具有高同源性的同一种系基因家族，但优选来源于同一种系基因家族的不同种系基因家族成员的构架序列。在某些实施方案中，更优选供体构架候选者可来源于与其它选定的构架相同的家族成员。
例如，如果FR1供体构架序列来源于重链，则可使来源于目标物种的供体抗体具有重链的7个种系基因家族之一的性质。举例来说，可使来源于数据库的构架区具有含有11个种系基因家族成员的VH1种系基因家族的特征。然后将来源于初始抗体的第二构架区(例如FR2)与数据库进行比较，以鉴定含有适于用作FR2的供体构架序列的构架区的抗体。FR2供体构架优选来源于同一种系基因家族的目标物种的抗体，或者甚至来源于与从中得到FR1供体构架序列的抗体相同的种系基因家族成员。因此，同样使用作FR2供体构架序列来源的抗体具有与FR1供体构架来源相同的VH1种系基因家族的特征。
FR4区在FR1、FR2和FR3的家族和家族成员之间并不匹配。实际上，FR4由J区段编码(参见图4)，合适FR4序列的选择可根据初始抗体FR4序列和参比数据库中最相似的FR4供体序列之间的同源性确定。在一个实施方案中，根据初始抗体和存在于重排抗体序列参比数据库中的初始抗体之间的最大同源性程度选择FR4。在某些实施方案中，优选来自初始抗体的FR4和选自目标物种参比数据库的FR4之间为100％同源性。
在本发明的某些实施方案中，供体构架区的选择还包括评价CDR中的氨基酸位置，参见US 2003/0040606，其通过引用结合到本文中。
在某些实施方案中，预期至少两个选定的供体构架序列可来源于数据库中的不同抗体。例如，FR1可来自第一抗体；FR2可来自第二抗体；FR3可来自第一抗体或第二抗体，或者既不是第一抗体又不是第二抗体的第三抗体；而FR4可来自第一、第二或第三抗体，或者不同于第一、第二和第三抗体的第四抗体，要注意的是至少两个FR来自不同抗体。作为另一个实例，FR1可来自第一抗体；FR3可来自第二抗体；FR2可来自第一抗体或第二抗体，或者既不是第一抗体又不是第二抗体的第三抗体；而FR4可来自第一、第二或第三抗体，或者不同于第一、第二和第三抗体的第四抗体，要注意的是至少两个FR来自不同抗体。作为另一个实例，FR1可来自第一抗体；FR4可来自第二抗体；FR2可来自第一抗体或第二抗体，或者既不是第一抗体又不是第二抗体的第三抗体；而FR3可来自第一、第二或第三抗体，或者不同于第一、第二和第三抗体的第四抗体，要注意的是至少两个FR来自不同抗体。在选出合适的构架区候选者后，如下文进一步论述的一样，通过将来自起始物种的CDR移植到杂交构架区，以产生任一个或两个重链和轻链可变区。
杂合体的装配
在按照本文所述方法选出合适的供体构架区候选区后，将来自起始物种的CDR移植到杂交构架区，以产生任一个或两个重链和轻链可变区。至于上述方面的任一方面，可采用本领域技术人员已知的常规方法，完成具有杂交可变链区的杂交抗体或杂交抗体片段的装配。例如，编码本文所述杂交可变结构域的DNA序列(即基于目标物种的构架和来自起始物种的CDR)可通过寡核苷酸合成和/或PCR产生。也可使用合适的限制性内切酶，从起始物种抗体中分离编码CDR区的核酸，并通过合适的连接酶连接，以与目标物种构架连接。
可按照重组DNA技术的标准方法，将供体构架区内的残基用种系氨基酸残基置换。例如，编码具有修饰序列说明种系置换的供体构架序列的核酸可通过寡核苷酸合成技术制备。或者，编码供体构架区的核酸内的选定位置可通过位点定向诱变(例如PCR位点定向诱变或盒式诱变)置换(即突变)。例如，使用盒式诱变，可用一种或多种选定的限制性内切酶将供体构架区内的片段切除，将所需要的相应种系片段与供体构架区在同一位点连接。根据需要，种系片段序列的这种连接可导致不同于种系构架序列的供体构架序列中一个或多个位置的置换。或者，如果需要将供体构架区完全改变成相应的种系序列，则可通过PCR扩增种系序列，并将所得产物用来装配杂交抗体或其抗原结合片段。显而易见的是，可采用本领域已知方法的任何组合来产生杂交抗体。这类种系突变可与杂交可变区的构建同时进行，或者可在杂交可变区构建后进行。例如，在一个实施方案中，首先可修饰供体构架区以将一个或多个改变引入种系氨基酸残基中。然后，可使用初始抗体的CDR和修饰的供体构架构建杂交可变区。或者，可首先构建包含初始抗体的CDR和未修饰的供体构架的杂交可变区。然后对杂交可变区进行修饰以将一个或多个突变引入种系氨基酸残基中。还设想了这些方法的组合，例如，某些供体构架在构建杂交可变区前进行修饰，以及某些供体构架在构建杂交可变区后进行修饰。
由于可在每个构架区相应的多个候选区中进行选择以构建杂合体，因此存在适于按照本文所述原理进行构建的许多序列组合。因此，可以装配具有各个构架区的不同组合的成员的杂合体文库。这类文库可以是序列的电子数据库集合体或杂合体的实体集合体。
实体抗体或抗体片段文库的装配优选使用合成寡核苷酸实现。在一个实例中，将寡核苷酸设计成具有重叠区，使得它们可以通过聚合酶退火和补平，例如用聚合酶链式反应(PCR)。为了产生VL和VH基因插入片段，进行重叠延伸的多个步骤。用与人恒定结构域重叠的区设计这些片段，使得它们可通过重叠延伸融合以产生全长轻链和Fd重链片段。轻链Fd区和重链Fd区可通过重叠延伸连接在一起以产生要克隆至展示载体的单一Fab文库插入片段。还可采用装配人源化文库基因的替代方法。例如，使用连接酶链式反应(LCR)方法，由重叠寡核苷酸装配文库。参见例如Chalmers and Curnow，Biotechniques(2001)30-2，第249-252页。
可产生各种形式的抗体片段，并将其克隆到合适载体中，以产生杂交抗体文库或杂交抗体片段文库。例如可将可变基因克隆至载体中，该载体含有符合读框的必需恒定结构域的其余部分。可以克隆的其它片段的实例包括整个轻链、重链的Fd部分或含有轻链和重链Fd编码序列两者的片段。或者，用于人源化的抗体片段可以是单链抗体(scFv)。
按照本公开的内容，任何选出的展示系统都可与文库联用。本领域已知分离大型文库所需成员的选择方案，以噬菌体展示技术为典型方法。已经证实其中不同肽序列在丝状噬菌体表面上的展示的这类系统(Scott and Smith(1990)Science，249：386)可用于创建抗体片段(和编码抗体片段的核苷酸序列)文库，用于结合靶标抗原的特定抗体片段的体外选择和扩增。将编码VH和VL区的核苷酸序列与引导其进入大肠杆菌(E.coli)周质空间的编码前导区信号的基因片段连接，因此使所得抗体片段在噬菌体表面上展示，通常为噬菌体外壳蛋白融合物(例如pIII或pVIII)。或者，抗体片段在λ噬菌体或T7衣壳(phagebodies)外表展示。噬菌体型展示系统的优势是，由于该系统是生物系统，所以仅仅通过使含有选定文库成员的噬菌体在细菌细胞中生长，便可扩增选定的文库成员。此外，由于编码多肽文库成员的核苷酸序列包含在噬菌体或噬菌粒载体中，测序、表达和随后的遗传操作都相对简单。用于构建噬菌体抗体展示文库和λ噬菌体表达文库的方法是本领域众所周知的(参见例如McCafferty等(1990)Nature，348：552；Kang等(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，88：4363)。
一种展示方法是使用scFv噬菌体文库(参见例如Huston等，1988，Proc.Natl.Acad.Sci U.S.A.，85：5879-5883；Chaudhary等(1990)Proc.Natl.Acad.Sci U.S.A.，87：1066-1070)。已经披露了在噬菌体外壳蛋白上展示scFv文库的各种实施方案。对噬菌体展示方法的各种改进也是已知的，例如参见WO96/06213和WO92/01047(Medical ResearchCouncil等)和WO97/08320(Morphosys)，其均通过引用结合到本文中。Fab文库的展示也是已知的，例如参见WO92/01047(CAT/MRC)和WO91/17271(Affymax)。
可针对合适抗原选择克隆至展示载体的杂交抗体或杂交抗体片段，以鉴定保持良好结合活性的变体，因为抗体或抗体片段将存在于噬菌体或噬菌粒颗粒的表面上。参见例如Barbas III等(2001)PhageDisplay，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，其内容通过引用结合到本文中。例如，在Fab片段的情况下，轻链和重链Fd产物在lac启动子的控制下，且每条链具有与之融合的前导区信号，以引入细菌宿主的周质空间中。正是在此空间，抗体片段才能够适当地进行装配。重链片段表达成为与噬菌体外壳蛋白结构域的融合物，使得装配的抗体片段掺入新制成的噬菌体或噬菌粒颗粒的外壳中。新噬菌粒颗粒的产生需要加入含有全部必需的噬菌体基因的辅助噬菌体。一旦抗体片段的文库出现在噬菌体或噬菌粒表面上，接着进行称为淘选的过程。这种方法包括：i)展示在噬菌体或噬菌粒颗粒表面的抗体与所需抗原结合，ii)冲洗掉非结合体，iii)结合颗粒从抗原中洗脱出来，和iv)洗脱颗粒暴露于新的细菌宿主以扩增用于另一轮选择的富集库。通常在筛选特异性结合的抗体克隆前，进行三轮或四轮淘选。这样，噬菌体/噬菌粒颗粒使结合表型(抗体)与基因型(DNA)联系起来，使得抗体展示技术的应用非常成功。然而，该人源化过程可以使用其它载体形式，例如将抗体片段文库克隆至用于选择和/或筛选的溶解性噬菌体载体(修饰的T7或λZap系统)中。
在选出所需要的杂交抗体和/或杂交抗体片段后，预期可通过本领域技术人员已知的任何技术进行大量生产，例如原核细胞或真核细胞表达等。例如，可以如下产生杂交抗体或片段：采用常规技术构建编码抗体重链的表达载体，该重链中保持起始物种抗体结合特异性(按照本文所述技术进行工程改造)所必需的CDR和必要时最少部分的可变区构架来源于起始物种抗体，抗体的其余部分来源于可按本文所述操作的目标物种免疫球蛋白，从而产生用于表达杂交抗体重链的载体。
另外，可以构建编码抗体轻链的表达载体，该轻链中保持起始物种抗体结合特异性(可按照本文提供的方法操作)所需要的一个或多个CDR和必要时最少部分的可变区构架来源于起始物种抗体，而抗体的其余部分来源于可通过本文提供的方法操作的目标物种免疫球蛋白，从而产生用于表达杂交抗体轻链的载体。
然后，可按常规技术将表达载体转移到合适的宿主细胞中以产生用于表达最优化工程抗体或抗体片段的转染宿主细胞。然后，采用本领域技术人员已知的任何合适技术，培养转染或转化宿主细胞以产生杂交抗体或杂交抗体片段。
在某些实施方案中，宿主细胞可用两个表达载体共转染，第一载体编码重链来源的多肽，第二载体编码轻链来源的多肽。两个载体可含有不同的选择标记，但是除重链和轻链编码序列以外，优选是相同的标记。该方法为重链和轻链多肽提供同等表达。或者，可使用编码重链和轻链多肽两者的单一载体。重链和轻链的编码序列可包含cDNA或基因组DNA或者cDNA和基因组DNA两者。
在某些实施方案中，用于表达杂交抗体或杂交抗体片段的宿主细胞可以为细菌细胞(例如大肠杆菌)，或优选为真核细胞。优选可以使用哺乳动物细胞，例如中国仓鼠卵巢细胞或NSO细胞。表达载体的选择依赖于宿主细胞的选择，可以如此选择以在选定的宿主细胞中具有所需要的表达和调节性质。
杂交抗体或杂交抗体片段一旦产生，便可通过本领域的标准方法纯化，包括交叉流过滤、硫酸铵沉淀、亲和柱层析法(例如蛋白A)、凝胶电泳等。
2.杂交抗体
另一方面，本发明提供在构架区中含有至少一个残基在相应位置是已改变成为种系构架序列的氨基酸残基的杂交抗体及其抗原结合片段。示例性的杂交抗体及其抗原结合片段包括通过本文所述方法产生的杂交抗体及其抗原结合片段。
在示例性的实施方案中，杂交抗体或其抗原结合片段既包含重链又包含轻链，其中重链构架区的至少一个氨基酸残基和/或轻链构架区的至少一个氨基酸残基已在相应位置改变成为种系构架区的氨基酸残基。在其它实施方案中，给定构架区的至少2、3、4、5个或更多个残基已在相应位置上改变成为种系氨基酸残基。在某些实施方案中，不同于种系序列的给定构架区中的所有氨基酸残基均可改变成为相应的种系氨基酸。在任何给定的杂交抗体或其抗原结合片段中，种系氨基酸残基的改变可在重链的1、2、3或全部4个构架中和/或轻链的1、2、3或全部4个构架区中进行。在一个实施方案中，全部4个重链构架区和全部4个轻链构架区包含在相应位置上至少一个突变成为种系氨基酸残基。
在示例性的实施方案中，本文所述杂交抗体或其抗原结合片段是由至少两个来自同一种系基因家族的不同抗体或至少两个来源于同一种系基因家族成员的不同抗体拼接的构架。
在某些实施方案中，本文所述杂交抗体或抗原结合片段包含具有至少一个残基是体细胞突变的至少一个构架区，例如，不同于种系序列相应位置上的氨基酸残基的位置的体细胞突变。例如，至少一个构架区包含在相应位置上不同于种系氨基酸残基的氨基酸残基，其中种系构架序列和供体构架序列有至少70％、80％、85％、90％、95％、97％或98％同一性。其它杂交抗体或其抗原结合片段在重链构架区包含至少一个体细胞突变，且在轻链构架区包含至少一个体细胞超突变。而其它杂交抗体或其抗原结合片段在2、3或全部4个轻链构架区包含至少一个体细胞超突变，和/或在2、3或全部4个重链构架区包含至少一个体细胞超突变。应理解的是，任何给定的构架区可包含至少一个体细胞超突变和不同位置的至少一个突变，使得原来不同于种系序列的氨基酸残基在相应位置改变成为种系氨基酸残基。
在其它实施方案中，杂交抗体或其抗原结合片段对靶标是特异性的，并且保持CDR来源于其中的初始抗体的至少部分结合亲和力。与在构架区相应位置上不含种系氨基酸改变的杂交抗体或其抗原结合片段相比，杂交抗体或其抗原结合片段的免疫原性降低。
在示例性的实施方案中，杂交抗体或其抗原结合片段是人源化的，例如，其包含人抗体的供体构架区和非人类物种的CDR。
3.杂交抗体组合物和其使用方法
杂交抗体或杂交抗体片段可用作治疗药物或诊断试剂，并且可进一步与其它蛋白质(或其部分)(例如人或人源化单克隆抗体)联用或连接。这些其它的蛋白质可与抗体针对的疾病所特有的其它标记(表位)反应，或者可具有所选的例如募集目标物种的分子或细胞(例如受体、靶蛋白、患病细胞等)的不同特异性。可作为分开给予的组合物或者作为具有通过常规化学方法或通过分子生物学方法连接的两种成分的单一组合物，与这类蛋白质(或其部分)一起给予杂交抗体或抗体片段。另外，可通过用产生可检测信号(体外或体内)的标记或者用具有治疗性质的标记标记抗体来增强抗体的诊断和治疗价值。一些标记(例如放射性核素)可产生可检测信号并具有治疗性质。放射性核素标记的实例包括125I、131I和14C。其它可检测标记的实例包括荧光发色团，例如绿色荧光蛋白、荧光素、藻胆蛋白或用于荧光显微镜的四乙基罗丹明、用于通过荧光、吸光度、可见光检测的产生荧光或有色产物的酶，或者产生电子致密产物用于通过电子显微镜显示的凝集；或用于直接或间接电子显微镜观察的电子致密分子，例如铁蛋白、过氧化物酶或金珠粒。
通常可将本文的杂交抗体或杂交抗体片段以包含药物载体的组合物给予患者。药物载体可以是任何适于将单克隆抗体递送给患者的相容的无毒物质，载体可包括无菌水、醇、脂肪、蜡和惰性固体。还可将药学上可接受的辅助剂(缓冲剂、分散剂)掺入药物组合物中。
可以各种方式将杂交抗体或杂交抗体片段组合物给予患者。优选可胃肠外给予药物组合物，例如皮下、肌内或静脉内。因此，用于胃肠外给药的组合物可包括溶于可接受载体(优选水性载体)中的抗体、抗体片段或其混合物的溶液剂。可以使用各种水性载体，例如水、含缓冲剂的水、0.4％盐水、0.3％甘氨酸等。这些溶液是无菌的并且一般不含颗粒物质。这些组合物可通过众所周知的常规灭菌技术灭菌。组合物可根据需要含有接近生理条件的药学上可接受的辅助物质，例如pH调节剂和缓冲剂、毒性调节剂等，例如乙酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、乳酸钠等。这些制剂中抗体或抗体片段的浓度可大幅变化，例如小于约0.5％，通常为约1％或至少约1％至高达15％或20％重量，并且主要根据液体体积、粘度等、根据所选择的具体给药方式进行选择。
制备可胃肠外给予的组合物和给予患者所必需的调整的实际方法是已知的或对本领域技术人员是显而易见的，更多详情可参见例如，Remington′s Pharmaceutical Science，第17版，Mack PublishingCompany，Easton，Pa.(1985)，其通过引用结合到本文中。
本文使用的科技术语具有本教导所属领域普通技术人员通常理解的含义，除非本文另有说明。本文参考本领域技术人员已知的各种方法。提及的记载这类已知方法的出版物和其它材料通过引用其整体(就像以全文给出一样)结合到本文中。除非另有说明，否则实践本文所述方法将应用属于本领域技术的化学、分子生物学、微生物学、重组DNA和免疫学的常规技术。文献对这类常规技术作了全面描述。参见例如Sambrook，Fritsch，and Maniatis，Molecular Cloning；Laboratory Manual，第2版(1989)；DNA Cloning，Volumes I and II(D.NGlover主编1985)；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait主编，1984)；Nucleic Acid Hybridization(B.D.Hames & S.J.Higgins eds.1984)；Methods in Enzymology系列(Academic Press，Inc.)，特别是第154卷和第155卷(Wu and Grossman主编)；PCR-A Practical Approach(McPherson，Quirke，and Taylor主编，1991)；Immunology，第2版，1989，Roitt等，C.V.Mosby Company，and New York；Advanced Immunology，2d Edition，1991，Male等，Grower Medical Publishing，New York；DNACloning：A Practical Approach，第I和第II卷，1985(D.N.Glover主编)；Oligonucleotide Synthesis，1984，(M.L.Gait主编)；Transcription andTranslation，1984(Hames and Higgins主编)；Animal Cell Culture，1986(R.I.Freshney主编)；Immobilized Cells and Enzymes，1986(IRL Press)；Perbal，1984，A Practical Guide to Molecular Cloning；以及Gene TransferVectors for Mammalian Cells，1987(J.H.Miller and M.P.Calos主编，Cold Spring Harbor Laboratory)；WO97/08320；美国专利号5,427,908、5,885,793、5,969,108、5,565,332、5,837,500、5,223,409、5,403,484、5,643,756、5,723,287、5,952,474；Knappik等，2000，J.Mol.Biol.296：57-86；Barbas等，1991，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：7978-7982；Schaffitzel等，1999，J.Immunol.Meth.10：119-135；Kitamura，1998，Int.J.Hematol.，67：351-359；Georgiou等，1997，Nat.Biotechnol.15：29-34；Little等，1995，J.Biotech.41：187-195；Chauthaiwale等，1992，Microbiol.Rev.，56：577-591；Aruffo，1991，Curr.Opin.Biotechnol.2：735-741；McCafferty(Editor)等，1996，Antibody Engineering：APractical Approach，所述文献的内容均通过引用结合到本文中。
可以采用本领域技术人员已知的任何合适的材料和/或方法来实施本文所述的方法；然而，优选本文描述的材料和/或方法。说明书和实例中提及的材料、试剂等可获自商业来源，除非另有说明。
要理解的是，可对本文所述实施方案作各种修饰。因此，上述说明书不应解释为限制性的，而仅仅是优选实施方案的实例。本领域技术人员可以设计属于本文随附权利要求书的范围和精神内的其它修饰。
Claims (48)
1.一种用于产生杂交抗体可变结构域或其片段的方法，所述方法包括：
(i)从对靶标具有特异性的初始抗体可变区内的FR1、FR2和FR3中选择构架区；
(ii)将选定构架区与所述目标物种的候选供体构架序列进行比较，以鉴定与选定构架区具有高度同源性的第一供体构架序列；
(iii)对第一供体构架序列与所述目标物种的种系序列进行比较，以鉴定与第一供体构架序列具有高度同源性的第一种系构架序列；
(iv)在第一供体构架序列内鉴定出至少一个氨基酸残基，其不同于第一种系构架序列相应位置上的氨基酸残基；和
(v)构建包含初始抗体的互补决定区(CDR)和第一供体构架序列的杂交抗体可变结构域或其片段，其中第一供体构架序列内的至少一个氨基酸残基被第一种系构架序列相应位置上的氨基酸残基置换。
2.权利要求1的方法，所述方法还包括：
从初始抗体的FR1、FR2和FR3中选择第二构架区，
将选定构架区与所述目标物种的候选供体构架序列进行比较，以鉴定与选定构架区具有高度同源性的第二供体构架序列；和
构建包含初始抗体的CDR和所述供体构架序列的杂交抗体可变结构域或其片段。
3.权利要求2的方法，所述方法还包括：
将第二供体构架序列与所述目标物种的种系序列进行比较，以鉴定与第二构架序列具有高度同源性的第二种系构架序列；和
将第二供体构架序列内的至少一个氨基酸残基用第二种系构架序列相应位置上的氨基酸残基置换。
4.权利要求2的方法，其中所述第一和第二供体序列来源于属于同一种系基因家族的两种不同的抗体。
5.权利要求2的方法，所述方法还包括：
从初始抗体的FR1、FR2和FR3中选择第三构架区，
将选定构架区与所述目标物种的候选供体构架序列进行比较，以鉴定与选定构架区具有高度同源性的第三供体构架序列；和
构建包含初始抗体的CDR和所述供体构架序列的杂交抗体可变结构域或其片段。
6.权利要求5的方法，所述方法还包括：
将第三供体构架序列与所述目标物种的种系序列进行比较，以鉴定与第三构架序列具有高度同源性的第三种系构架序列；和
将第三供体构架序列内的至少一个氨基酸残基用第三种系构架序列相应位置上的氨基酸残基置换。
7.权利要求5的方法，其中所述第三供体序列与第一和第二种系基因家族属于相同的种系基因家族。
8.权利要求5的方法，所述方法还包括：
选择初始抗体的FR4的第四构架区，
将选定构架区与所述目标物种的候选供体构架序列进行比较，以鉴定与选定构架区具有高度同源性的第四供体构架序列；和
构建包含初始抗体的CDR和所述供体构架序列的杂交抗体可变结构域或其片段。
9.权利要求8的方法，所述方法还包括：
将第四供体构架序列与所述目标物种的种系序列进行比较，以鉴定与第四构架序列具有高度同源性的第四种系构架序列；和
将第四供体构架序列内的至少一个氨基酸残基用第四种系构架序列相应位置上的氨基酸残基置换。
10.一种用于产生杂交抗体可变结构域或其片段的方法，所述方法包括：
(i)从对靶标具有特异性的初始抗体可变区内的FR1、FR2和FR3中选择构架区；
(ii)将初始抗体的选定构架区与所述目标物种的候选供体可变区序列进行比较，以鉴定与选定构架区具有高度同源性的第一供体构架序列；
(iii)构建包含初始抗体的互补决定区(CDR)和第一供体构架序列的杂交抗体可变结构域或其片段；
(iv)将第一供体构架序列与所述目标物种的种系可变区序列进行比较，以鉴定与第一供体构架序列具有高度同源性的第一种系构架序列；和
(v)将第一供体构架序列内的至少一个氨基酸残基用第一种系构架序列相应位置上的氨基酸残基选择性取代。
11.权利要求10的方法，所述方法还包括：
从初始抗体的FR1、FR2和FR3中选择第二构架区，
将选定构架区与所述目标物种的候选供体构架序列进行比较，以鉴定与选定构架区具有高度同源性的第二供体构架序列；和
构建包含初始抗体的CDR和供体构架序列的杂交抗体可变结构域或其片段。
12.权利要求11的方法，所述方法还包括：
将第二供体构架序列与所述目标物种的种系序列进行比较，以鉴定与第二构架序列具有高度同源性的第二种系构架序列；和
将第二供体构架序列内的至少一个氨基酸残基用第二种系构架序列相应位置上的氨基酸残基置换。
13.权利要求11的方法，其中所述第一和第二供体序列来源于属于同一种系基因家族的两种不同的抗体。
14.权利要求11的方法，所述方法还包括：
从初始抗体的FR1、FR2和FR3中选择第三构架区，
将选定构架区与所述目标物种的候选供体构架序列进行比较，以鉴定与选定构架区具有高度同源性的第三供体构架序列；和
构建包含初始抗体的CDR和供体构架序列的杂交抗体可变结构域或其片段。
15.权利要求14的方法，所述方法还包括：
将第三供体构架序列与所述目标物种的种系序列进行比较，以鉴定与第三构架序列具有高度同源性的第三种系构架序列；和
将第三供体构架序列内的至少一个氨基酸残基用第三种系构架序列相应位置上的氨基酸残基置换。
16.权利要求14的方法，其中所述第三供体序列与第一和第二供体序列属于相同的种系基因家族。
17.权利要求11的方法，所述方法还包括：
选择初始抗体的FR4的第四构架区，
将选定构架区与所述目标物种的候选供体构架序列进行比较，以鉴定与选定构架区具有高度同源性的第四供体构架序列；和
构建包含初始抗体的CDR和供体构架序列的杂交抗体可变结构域或其片段。
18.权利要求17的方法，所述方法还包括：
将第四供体构架序列与所述目标物种的种系序列进行比较，以鉴定与第四构架序列具有高度同源性的第四种系构架序列；和
将第四供体构架序列内的至少一个氨基酸残基用第四种系构架序列相应位置上的氨基酸残基置换。
19.权利要求1或10的方法，所述方法还包括测定包含杂交抗体可变结构域或其片段的杂交抗体或其抗原结合片段，以确定与包含其中第一供体构架序列内的至少一个氨基酸未被第一种系构架序列的相应氨基酸残基置换的杂交抗体可变结构域或其片段的杂交抗体或其抗原结合片段相比的免疫原性、或结合亲和力、或者免疫原性和结合亲和力两者。
20.权利要求19的方法，其中所述杂交抗体或其抗原结合片段的相对结合亲和力是初始抗体对所述靶标的亲和力的至少60％。
21.权利要求19的方法，其中当暴露于目标物种的免疫系统时，与其中第一供体构架序列内的至少一个氨基酸未被第一种系构架序列的相应氨基酸残基置换的杂交抗体或其抗原结合片段相比，所述杂交抗体或其抗原结合片段的免疫原性降低。
22.权利要求1或10的方法，其中所述杂交抗体可变结构域或其片段是选自以下的抗体片段的可变结构域：scFv、Fab、Fab′、F(ab′)2、Fd、双抗体、抗体轻链和抗体重链。
23.权利要求1或10的方法，其中所述目标物种是人。
24.一种用于产生杂交抗体可变结构域或其片段的方法，所述方法包括：
(i)从对靶标具有特异性的初始人源化抗体可变区内的FR1、FR2和FR3选择构架区；
(ii)将选定构架区序列与人种系序列进行比较，以鉴定与第一构架序列具有高度同源性的第一种系构架序列；和
(iii)在一个或多个位置上修饰选定的构架区，以引入将选定构架区的氨基酸残基改变成种系构架序列相应位置上的氨基酸残基的突变。
25.权利要求24的方法，所述方法还包括：
(i)从初始人源化抗体的FR1、FR2和FR3中选出第二构架区；
(ii)将选定构架区序列与人种系序列进行比较，以鉴定与第二构架序列具有高度同源性的第二种系构架序列；和
(iii)在一个或多个位置上修饰选定构架区，以引入将选定构架区的氨基酸残基改变成种系构架序列相应位置上的氨基酸残基的突变。
26.权利要求24的方法，其中所述第一和第二构架序列属于同一种系基因家族。
27.权利要求25的方法，所述方法还包括：
(i)从初始人源化抗体的FR1、FR2和FR3中选择第三构架区；
(ii)将选定构架区序列与人种系序列进行比较，以鉴定与第三构架序列具有高度同源性的第三种系构架序列；和
(iii)在一个或多个位置上修饰选定构架区，以引入将选定构架区的氨基酸残基改变成种系构架序列相应位置上的氨基酸残基的突变。
28.权利要求27的方法，其中所述第三构架序列与第一构架序列属于相同的种系基因家族。
29.权利要求27的方法，所述方法还包括：
(i)选择初始人源化抗体可变区内的FR4的第四构架区；
(ii)将选定构架区序列与人种系序列进行比较，以鉴定与第四构架序列具有高度同源性的第四种系构架序列；和
(iii)在一个或多个位置上修饰选定构架区，以引入将选定构架区的氨基酸残基改变成种系构架序列相应位置上的氨基酸残基的突变。
30.权利要求24的方法，所述方法还包括测定包含杂交抗体可变结构域或其片段的杂交抗体或其抗原结合片段，以确定与初始人源化抗体相比的免疫原性、或结合亲和力、或者免疫原性和结合亲和力两者。
31.权利要求30的方法，其中所述杂交抗体或其抗原结合片段的相对结合亲和力是初始抗体对所述靶标的亲和力的至少60％。
32.权利要求30的方法，其中当暴露于目标物种的免疫系统时，与初始人源化抗体相比，所述杂交抗体或其抗原结合片段的免疫原性降低。
33.一种对靶标特异性的杂交抗体或其抗原结合片段，其包含：
(i)初始抗体的互补决定区(CDR)，其中所述初始抗体对所述靶标是特异性的，
(ii)第一抗体的第一重链构架区，和
(iii)第二抗体的第二重链构架区，
其中第一和第二抗体属于同一种系基因家族，
其中第一和第二重链构架区选自FR1、FR2和FR3，
其中至少一个重链构架区包含体细胞超突变，
其中至少一个所述第一或第二重链构架区包含成为种系构架序列相应位置上的氨基酸残基的至少一个突变，和
其中所述杂交抗体或其抗原结合片段对所述靶标是特异性的。
34.权利要求33的杂交抗体或抗原结合片段，其还包含选自FR1、FR2和FR3的第三重链构架区，其中所述第三重链构架区来源于选自以下的抗体：第一抗体、第二抗体和既不是第一抗体也不是第二抗体的第三抗体。
35.权利要求34的杂交抗体或抗原结合片段，其中第三重链构架区与第一重链构架区属于相同的种系基因家族。
36.权利要求34的杂交抗体，其还包含选自以下抗体的FR4重链构架区：第一抗体、第二抗体、第三抗体和既不是第一、第二抗体又不是第三抗体的第四抗体。
37.权利要求36的杂交抗体或抗原结合片段，其中第三重链构架区和第四重链构架区中的任一个或两个与第一重链构架区属于相同的种系基因家族。
38.权利要求33的杂交抗体或抗原结合片段，其中所述构架区是人源的，而CDR是非人源的。
39.一种对靶标特异性的杂交抗体或其抗原结合片段，其包含
(i)初始抗体的互补决定区(CDR)，其中所述初始抗体对所述靶标是特异性的，
(ii)第一抗体的第一轻链构架区，和
(iii)第二抗体的第二轻链构架区，
其中第一和第二抗体属于同一种系基因家族，
其中第一和第二轻链构架区选自FR1、FR2和FR3，
其中至少一个轻链构架区包含体细胞超突变，
其中至少一个所述第一或第二轻链构架区包含成为种系构架序列相应位置上的氨基酸残基的至少一个突变，和
其中所述杂交抗体或其抗原结合片段对所述靶标是特异性的。
40.权利要求39的杂交抗体或抗原结合片段，其还包含选自FR1、FR2和FR3的第三轻链构架区，其中所述第三轻链构架区来源于选自以下的抗体：第一抗体、第二抗体和既不是第一抗体也不是第二抗体的第三抗体。
41.权利要求40的杂交抗体或抗原结合片段，其中第三轻链构架区与第一轻链构架区属于相同的种系基因家族。
42.权利要求40的杂交抗体或抗原结合片段，其还包含选自以下抗体的FR4轻链构架区：第一抗体、第二抗体、第三抗体和既不是第一、第二抗体又不是第三抗体的第四抗体。
43.权利要求42的杂交抗体或抗原结合片段，其中第三轻链构架区和第四轻链构架区的任一个或两个与第一轻链构架区属于相同的种系基因家族。
44.权利要求33的杂交抗体或抗原结合片段，其中所述构架区是人源的，而CDR是非人源的。
45.权利要求39的杂交抗体或抗原结合片段，其中所述轻链构架来自VL轻链。
46.权利要求39的杂交抗体或抗原结合片段，其中所述轻链构架来自VK轻链。
47.权利要求33或39的杂交抗体或抗原结合片段，其中与不含突变的杂交抗体相比，至少一个氨基酸突变为相应种系序列赋予降低的免疫原性。
48.权利要求33或39的杂交抗体或抗原结合片段，其中所述杂交抗体或其抗原结合片段的相对结合亲和力是初始抗体对所述靶标的亲和力的至少60％。
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