CN102271690A

CN102271690A - 包含蛋清胆矾的用于预防和治疗癌的组合物

Info

Publication number: CN102271690A
Application number: CN2009801535345A
Authority: CN
Inventors: 崔恩儿
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2008-12-30
Filing date: 2009-08-12
Publication date: 2011-12-07
Anticipated expiration: 2029-08-12
Also published as: BRPI0918325B1; US20100166882A1; JP5547748B2; WO2010076937A1; CA2750877A1; AU2009334202A1; KR101090505B1; CA2750877C; JP2012514031A; BRPI0918325B8; KR20100078574A; MX2011007073A; SG172364A1; US9446128B2; EP2386307A4; CN102271690B; EP2386307A1; IN2011KN02836A; RU2473353C1; BRPI0918325A2

Abstract

本发明涉及一种包含蛋清胆矾的用于预防和治疗癌的组合物，更具体地说，涉及一种单独包含将胆矾与蛋清混合而制造的除去毒性的蛋清胆矾、或者包含其与竹盐的混合物的用于预防和治疗癌的组合物及其制造方法，本发明的包含蛋清胆矾的用于预防和治疗癌的组合物抗癌活性优异，可有效利用于预防和治疗癌用药物制剂或健康功能性食品的制造。

Description

包含蛋清胆矾的用于预防和治疗癌的组合物

技术领域

本发明涉及一种包含蛋清胆矾的用于预防和治疗癌的组合物，更具体地说，涉及一种单独包含将胆矾与蛋清混合而制造而除去毒性的蛋清胆矾、或者包含其与竹盐的混合物的用于预防和治疗癌的组合物及其制造方法。

背景技术

癌是指：从不能控制的细胞的增殖开始，侵入并破坏周围的正常组织或器官，创建新的生长部位，而可以夺走个人生命的疾病的总称。在过去10多年里，为了征服癌，在调控细胞周期和细胞凋亡、以及寻找包含致癌基因或抑癌基因的新靶的方面取得了显著的进展，但是癌发生率随着文明发展而增加。

目前，治疗癌患者的方法依赖于外科手术、放射线疗法、施用40多种显示出强的细胞毒性的抗癌物质的化学疗法，但这些治疗方法也大部分局限于早期癌患者或特殊癌，因此癌死亡率呈持续增长趋势。

此外，大部分抗癌剂为毒性强的化学制剂，因此对毒性弱的抗癌剂、特别是天然物质来源的抗癌剂的开发还在持续。

胆矾是由硫酸铜构成的硫酸盐矿物的一种，作为主成分包含CuSO₄·5H₂O，由于是天然矿物，因此混合有其他微量矿物，是一种蓝色结晶。胆矾属于三斜晶系，显示玻璃光泽并且呈半透明的蓝色。已知胆矾被用于催吐剂、杀虫剂、颜料、固定剂和电解质等。胆矾由于是矿物生药而担忧其具有毒性，因此实际上其在药物中的应用有限，并且其作为抗癌剂的用途从未为人所知。

竹盐是Il-hoon Kim(1909～1992，笔名为In-san)先生的发明品，其是使用竹子和盐通过烘焙法而合成的，通过在炉中以高热反复多次处理具有可产生新细胞的细胞新生作用的竹子与具有杀菌和防腐作用的盐而除去它们所具有的毒素，最大程度上增进药效，从而竹盐被已知为妙药。

竹盐能够强壮作为人体的根源的胃而具有治疗炎症疾病的病因的药理作用，而且起到净化血液的清血作用、清除积累在体内的废物和解毒作用，并且具有使酸性体质转换成碱性体质的效果。另外，已知与一般的盐相比，竹盐的抗炎作用以及对细菌的杀伤力强3～4倍，并且通过杀菌作用而在体内起到解热作用。

本发明人确认了，用蛋清来中和胆矾毒性的蛋清胆矾通过诱导癌细胞的凋亡而抑制癌细胞的增殖，从而可用作天然抗癌剂，并且确认了，单独包含蛋清胆矾或包含其与竹盐的混合物的组合物可广泛用作抗癌剂，从而完成了本发明。

发明内容

技术问题

本发明的目的在于提供一种作为有效成分包含蛋清胆矾的用于预防和治疗癌的组合物。

本发明的另一个目的在于提供一种作为有效成分包含蛋清胆矾的用于预防和治疗癌的健康功能性食品。

本发明的再另一个目的在于提供一种制造蛋清胆矾的方法，其包括：(a)将作为天然矿物性生药的胆矾加热至该胆矾全部变成灰色或褐色而使其脱水的步骤；(b)冷却脱水的胆矾后进行粉末化的步骤；以及(c)将所述步骤(b)的胆矾粉末与蛋清混合的步骤。

解决问题所采用的手段

作为一个方式，本发明涉及一种作为有效成分包含蛋清胆矾的用于预防和治疗癌的组合物。

在本发明中，“蛋清胆矾”是指将蛋清和胆矾混合的物质，优选的是，通过将胆矾(以CuSO₄·5H₂O为主成分的天然矿物)烘烤以使其脱水并进行粉末化后，混合蛋清进行反应而制造。在这样制造的蛋清胆矾中，胆矾特有的毒性被蛋清中和，由此减少或去除毒性而增强药性。

此外，本发明的上述组合物可进一步包含竹盐。

利用于本发明的竹盐可以使用市售产品或者可以直接制造，此时优选使用通过In-san先生的传统的9次熔融竹盐制造方法制造的竹盐，所述9次熔融竹盐制造方法为：按照竹盐发明家Il-hoon Kim(笔名为In-san)先生的书籍“宇宙与神药(1980年)”和“神药(1986年)”中所记载的制造方法，将韩国西海岸的日晒盐放入竹子中，用黄土封住入口后，整齐地放入铁罐内，然后使用松树来烧火，在竹子被燃烧后磨碎所剩的盐柱，然后采用与第一次相同的方法，重新放入新的竹子中，用黄土封住入口后，在铁罐内，使用松树来烧火，将该操作反复8次后，在最后的第9次操作中，添加松脂以提高火力，从而使盐融化下来。但是，竹盐的制造方法并不限于此。

本发明的组合物中所包含的蛋清胆矾和竹盐优选为粉末状。另外，蛋清胆矾和竹盐都包含在本发明的组合物的情况下，可以包含在1∶99至99∶1的重量比的范围内以不同比例混合的粉末状的蛋清胆矾和竹盐，优选以1∶5至1∶50的重量比包含，最优选以1∶5、1∶10、1∶15、1∶25以及1∶30的重量比包含。

在上述组合物用于口服制剂的情况下，优选的是，与蛋清胆矾粉末相比，以相同或更高的含量包含竹盐粉末，当年纪小、体力弱、衰老或病弱时，增加竹盐的比例，当体力较好时，可以逐渐增加蛋清胆矾的比例，可以服用的蛋清胆矾∶竹盐的比例为1∶10至1∶5左右。

另外，在上述组合物用作具有涂在身上、清洗或喷射用途的涂敷制剂或者用作灌肠剂的情况下，可以提高蛋清胆矾的比例，也可以单独使用蛋清胆矾。

本发明的包含蛋清胆矾的组合物具有通过改进半胱天冬酶3(caspase3)活性的抗癌能力。

在本发明的具体实施例中，当用蛋清胆矾来处理HepG2(肝癌细胞)、SW480(大肠癌细胞)、MCF-7(乳癌细胞)和NCI-H460(肺癌细胞)时，确认了浓度依赖性地抑制癌细胞的增殖。另外，当用蛋清胆矾来处理肝癌细胞和肺癌细胞时，确认了诱导细胞凋亡(apoptosis)而发生核断裂和染色质凝聚。另外，在蛋白质水平上观察本发明的蛋清胆矾组合物所具有的抑制癌细胞增殖的能力的结果，确认了其激活半胱天冬酶3蛋白质，由此诱导细胞凋亡而抑制癌细胞增殖。

本发明的蛋清胆矾组合物可应用于预防和治疗癌的用途。在本申请中，“预防”是指通过施用组合物可以抑制疾病的形成或者延迟发病的所有行为，“治疗”是指通过施用组合物可以改善或者有利地改变上述疾病的症状的所有行为。

上述本发明的组合物的可以适用于大部分癌。例如可适用于肝癌、乳癌、肺癌、大肠癌、胃癌、胰腺癌、子宫癌、前列腺癌、骨癌、神经胶质瘤和白血病等，优选适用于肝癌、大肠癌、乳癌和肺癌，但并不限于此。

本发明的作为有效成分包含蛋清胆矾的组合物可以进一步包含可药用的载体而用作可药用的组合物，可与载体一起制成制剂。另外，本发明的上述组合物可以用作单一制剂，也可以与能够增强药效的其他有效成分一起用作复合制剂。

在本发明中，术语“可药用的载体”是指在不刺激生物体的情况下不阻碍所施用化合物的生物学活性和特性的载体或稀释剂。在制成液态溶液的组合物中，可药用的载体可以使用适于活体的盐水、灭菌水、林格液、缓冲盐水、白蛋白注射液、葡萄糖溶液、麦芽糊精溶液、甘油、乙醇，并且可以将这些成分中的一种以上成分混合使用，可根据需要添加抗氧化剂、缓冲液、抑菌剂等其他通常的添加剂。而且，可另外添加稀释剂、分散剂、表面活性剂、粘合剂和润滑剂，制成如水溶液、悬浮液、乳液等注射用剂型、丸药、胶囊、颗粒或片剂。

本发明的上述组合物可适用于作为有效成分包含该组合物的任意剂型，可以制成口服或非口服剂型。本发明的药物剂型包括适合施用于口腔、直肠、鼻子、局部、皮下、阴道或非口服(非肠道；包括肌肉内、皮下和静脉内)的形态。

作为包含本发明的组合物的口服剂型，可以制成例如片剂、锭剂、糖锭、水溶性或亲油性悬浮液、粉末制剂或颗粒、乳液、硬胶囊或软胶囊、糖浆或酏剂等。为了制造成片剂和胶囊等剂型，可以包含诸如乳糖、蔗糖、山梨糖醇、木密糖、淀粉、支链淀粉、纤维素或凝胶等粘合剂；诸如磷酸二钙等赋形剂；诸如玉米淀粉或红薯淀粉等崩解剂；诸如硬脂酸镁、硬脂酸钙、硬脂富马酸钠或聚乙二醇腊等润滑剂，在胶囊剂型的情况下，除了上述提及的物质之外，可进一步包含诸如脂肪油等液体载体。

作为包含本发明组合物的非口服施用的剂型，可以制成皮下注射、静脉注射或肌肉注射等注射用剂型；通过栓剂注入方式或可通过呼吸器吸入的气溶胶剂等喷雾用剂型。为了制造成注射用剂型，可以将本发明的组合物与稳定剂或缓冲剂在水中一起混合而制成溶液或悬浮液，并将其制成安瓶和玻璃瓶的单位剂量用剂型。为了以栓剂注入，可以制成包含可可脂或其他的甘油酯等通常的栓剂基质的栓剂或者诸如体疗灌肠剂等施用于直肠的组合物。在制成气溶胶剂等喷雾用剂型的情况下，可以与水分散的凝缩物或可使湿润的粉末分散的推进剂等添加剂配合。

作为另一个方式，本发明涉及利用上述蛋清胆矾组合物来预防和治疗癌的方法。

在本发明中，上述疾病的治疗可以包括施用包含蛋清胆矾的药物组合物的步骤。在本发明中，术语“施用”是指用任何适当的方法给患者导入本发明的药物组合物。

本发明的组合物的施用途径可以是通过经口或非经口的各种途径，只要组合物能够到达靶器官即可。具体地说，可以通过口腔、直肠、局部、静脉内、腹腔内、肌肉内、动脉内、经皮、鼻腔内、吸入、眼球内或皮内途径以通常的方式进行施用。优选的是，经口施用或通过涂于皮肤进行施用。

本发明的治疗方法包括以药学有效剂量施用本发明的组合物。对于本领域技术人员显而易见的是，适当的1天总剂量在正确的医学判断范围内可由担当医生来决定。优选的是，对于特定患者的具体治疗有效量可根据各种各样的因素和医学领域中众所周知的类似因素的不同而不同，其中所述各种各样的因素例如为所要实现的反应的种类和程度、具体组合物(包括根据情况是否使用其他制剂)、患者的年龄、体重、一般健康状态、性别和饮食、施用时间、施用途径和组合物的配比、治疗时间、与具体组合物一起使用或者同时使用的药物。因此优选的是，适合于本发明的目的的药物组合物的1天有效剂量应根据上述的因素来决定，最优选的是，以蛋清胆矾粉末重量为基准服用时为0.1g至30g左右，以灌肠剂或涂敷剂等外用剂使用时没有量的限制。

此外，本发明的治疗方法可适用于有可能发生癌的任意动物，动物不仅包括人类和灵长类而且包括牛、猪、羊、马、狗和猫等家畜。

特别是，在经口施用本发明的组合物时，可以使用用水或者将生姜和甘草混合熬成的水吞服的方法、用榆根皮的水等吞服的方法、用唾液吞服的方法。另外，作为摄取方法，除了直接食用的方法，还有放入胶囊后使用上述各种方法服用的方法，但将胶囊用唾液吞服比用水或饮料吞服更有效。也可以在食物或饮料中少量混合食用。例如还有在粥或烤蒜等中添加上述混合物后食用的方法、在竹盐酱油中混合蛋清胆矾后服用的方法。

在本发明的具体实施例中，将本发明的蛋清胆矾连同竹盐一起给癌患者服用后观察抗癌效果的结果，确认了对大肠癌、肺癌、骨癌、子宫颈不典型增生、甲状腺癌等具有疗效。

作为再另一个方式，本发明涉及一种作为有效成分包含蛋清胆矾的用于预防和改善癌的健康功能性食品。

本发明的上述健康功能性食品可以提供为除了蛋清胆矾之外还包括竹盐。

本发明的组合物可以进一步包含可食用的食品添加剂而制成制剂，可用作用于预防和治疗癌的健康功能性食品。本发明的健康功能性食品包括片剂、胶囊剂、丸剂、液剂等剂型。

作为可以添加本发明的组合物的食品，例如有各种食品类、饮料、口香糖、茶、复合维生素、健康功能性食品类等。

本申请中所定义的“健康功能性食品”是指使用具有对人体有用的功能的原料或成分进行制造和加工的食品，“功能性”是指，为了对人体的构造和功能进行营养素的调节或者对生理学作用等保健用途带来有用的效果而摄取。

为了预防和改善癌，可以将本发明的组合物添加到食品或饮料中，此时，可以添加到食品或饮料中的上述组合物的量为食品总重量的0.01重量％至10重量％，例如，在健康饮料组合物中，以总组合物100为基准，可以添加0.01g至5g，优选添加0.5g至1g。

作为再另一个方式，本发明涉及一种制造蛋清胆矾的方法，其包括：(a)将作为天然矿物性生药的胆矾加热至该胆矾全部变成灰色或褐色而使其脱水的步骤；(b)冷却脱水的胆矾后进行粉末化的步骤；(c)将所述步骤(b)的胆矾粉末与蛋清混合的步骤。

下面，按各步骤说明本发明的制造蛋清胆矾的方法。

步骤(a)是将胆矾(包含CuSO₄·5H₂O的天然矿物)加热并使其脱水的步骤。作为加热胆矾的方法，可以利用本领域中公知的通常的加热方法，优选的是，可以将胆矾放入锅里后，用煤气火、柴火或炭火烘烤的方法进行加热。加热时，以3～5小时的间隔观察颜色的变化，同时上下混合以均匀受热。加热时间可根据1次使用的量进行调整，但适当的是，加热10小时至24小时，优选的是，加热至胆矾全部变成灰色或褐色而形成脱水盐的状态。

步骤(b)是冷却步骤(a)中被加热而脱水的胆矾后进行粉末化的步骤。被加热而脱水的胆矾必须冷却至完全放完热，此时胆矾的水分含量优选为0％至5％左右。优选的是，完全冷却脱水的胆矾，然后将其磨碎进行粉末化，并将粉末化的胆矾放入塑料袋或密闭容器后保管在干燥的地方，以防止吸收水分。

步骤(c)是将所述步骤(b)的胆矾粉末与蛋清混合以使胆矾和蛋清发生反应而减少或去除胆矾的毒性并增强药性的步骤。

将鸡蛋的蛋黄和蛋清分离后仅利用蛋清，并且鸡蛋优选使用土鸡蛋，更优选使用韩国乌骨鸡的鸡蛋。在上述步骤(b)中所准备的脱水状态的胆矾粉末中混合蛋清时，优选以下述比例进行混合：在每600g的胆矾粉末中混合7个至20个鸡蛋的蛋清(140g至400g)，更优选混合300g。在混合时，根据状态调节蛋清的量，优选使用木铲等几乎没有反应性的工具来进行混合。此外，优选的是，使用不发生化学反应的容器，例如使用瓦器、陶器、或麦饭石容器等进行混合。在混合过程中会发生由反应热导致的高热，因此需要注意。

另外，在混合时，如果蛋清的量过少，则难以充分地中和脱水的胆矾粉末的毒性，反之，如果过多，则在混合时反应热微弱或者不产生热，而难以获得充分的混合效果，因此应注意调节蛋清的量。优选的是，在充分混合上述的混合物之后，冷却至反应时所产生的反应热完全消失。

此外，本发明的上述指标蛋清胆矾的方法在所述步骤(c)之后，可以进一步包括(d)步骤：冷却所述步骤(c)的混合物后进行粉末化。

步骤(d)是冷却步骤(c)的混合物至热完全消失后将混合物状态的蛋清胆矾磨碎进行粉末化的步骤。通过将蛋清胆矾进行粉末化，可以有效利用于药学或食品学制剂，可以增大蛋清胆矾的反应性面积，使治疗疾病的活性最大化。

对于通过这样的制造方法而制造的蛋清胆矾而言，胆矾所具有的毒性被除去，药性增强，从而可用作以预防和治疗癌为目的的药学或食品学组合物。

发明效果

本发明的包含蛋清胆矾的组合物被制成除去胆矾的毒性、药学活性最大化的状态，而显示出优异的抗癌活性，因此可用作预防和治疗癌的组合物。

附图说明

图1是概略显示微生物回复突变试验的试验过程的图。

图2、3、4和图5是用烤胆矾(IS3)、蛋清胆矾(IS4)和生胆矾(IS5)处理HepG2(肝癌细胞)、NCI-H460(肺癌细胞)、SW480(大肠癌细胞)和MCF-7(乳癌细胞)这4种癌细胞后对各细胞进行MTT分析的结果。

图6和图7是用浓度为50μg/ml的IS3和IS4分别处理NCI-H460和HepG2细胞后对这些细胞进行DAPI染色的结果。箭头表示凋亡细胞核。

图8是用各种浓度的蛋清胆矾(IS4)处理NCI-H460细胞后为了观察这些细胞的蛋白质表达水平而进行蛋白质印迹分析的结果。

具体实施方式

下面，根据实施例详细说明本发明。但是，下述实施例仅例示本发明，本发明的内容并不限于下述实施例。

实施例1.试验物质(生胆矾、烤胆矾和蛋清胆矾)的制造

制造了将生胆矾用火烘烤而使其脱水的烤胆矾(烘烤胆矾)和配制的蛋清胆矾，并在试验中使用了生胆矾、烤胆矾和蛋清胆矾。

首先，烤胆矾是通过将生胆矾加热并使其脱水而制造的，具体地说，当对生胆矾加热24小时而进行烘烤时，生胆矾脱水而变成灰色或褐色，将这种脱水盐状态的胆矾称作烤胆矾。烤胆矾完全冷却后，磨碎进行粉末化，备用。

蛋清胆矾是通过在烤胆矾粉末中混合蛋清并进行反应而制造的，具体地说，分离13个土鸡蛋的蛋清，将300g的蛋清与600g的烤胆矾粉末混合，此时烤胆矾与蛋清中的水分进行反应而产生高热(反应热)，变成绿色并且形成粉末团，将该状态的胆矾称作蛋清胆矾。

为了将这样制造的烤胆矾(IS3)、蛋清胆矾(IS4)和生胆矾(IS5)分别用作试验物质，各称取100mg，并溶解于D.D.W，使总量为1ml。在试验物质完全溶解后，以600rpm进行离心分离，然后将上清液用0.8μm的针头式过滤器进行过滤(表1)。

表1

实施例2.为了检验遗传毒性的微生物回复突变试验

为了测定烤胆矾(烘烤胆矾)和蛋清胆矾的遗传毒性程度，进行了可以判别细胞致突变物的微生物回复突变试验。

试验原理是利用了需要组氨酸的菌株如果没有组氨酸就不能生长的性质，在突变试验中，根据致突变物来检测作为原来的菌株特性的组氨酸的利用恢复。在该试验中，当与未处理组(阴性对照组)相比菌株数显示2倍以上、或者菌株数呈试验物质的浓度依赖性增加时，可以将结果判定为阳性并将试验物质确认为致突变物。

为了进行微生物回复突变试验，首先，使用预培养法，以试验标准菌株-鼠伤寒沙门氏菌TA98、TA100、TA1535和TA1537为对象进行试验。首先，进行耐性试验，然后在对胆矾显示耐性的菌株中选择鼠伤寒沙门氏菌TA100和TA102这2个菌株用作试验菌株。鼠伤寒沙门氏菌TA100是关于基因中的鸟嘌呤和胞嘧啶的回复的试验菌株，鼠伤寒沙门氏菌TA102是关于腺嘌呤和胸腺嘧啶的回复的试验菌株。

使用5000μg/平板的蛋清胆矾、2500μg/平板的烘烤胆矾进行细胞抗菌试验时，观察到菌株生长被抑制。因此以不能抑菌的下述浓度进行遗传毒性(回复突变)试验(图1)。

作为处理组，使用蛋清胆矾时，所采用的浓度为1250、625、313、156和78μg/平板，最大浓度为2500μg/平板。另外，使用烤胆矾时，所采用的浓度为625、313、156和78μg/平板，最大浓度为1250μg/平板。

作为阳性对照组，使用了1μg/平板的叠氮化钠(用于处理鼠伤寒沙门氏菌TA100)和1μg/平板的丝裂霉素C(用于处理鼠伤寒沙门氏菌TA102)，作为阴性对照组，使用了蒸馏水。

用各试验物质、阳性对照组化合物和蒸馏水来处理平板之后，测定回复突变的菌株数。其结果如下(表2至表5)。

表2

表3

表4

表5

对于鼠伤寒沙门氏菌TA100来说，采用不诱发微生物生长抑制的最大浓度时，蛋清胆矾和烤胆矾处理组的菌株数与阳性对照组相比显著小，与阴性对照组相比时也显示类似的水平。另外，菌落数不呈浓度依赖性增加。由此可以判定蛋清胆矾和烤胆矾不是回复致突变物。

同样，对于鼠伤寒沙门氏菌TA102来说，采用不诱发微生物生长抑制的最大浓度时，蛋清胆矾和烤胆矾处理组中几乎不生成菌落，与阳性对照组相比，处理组的菌株数显著小，与阴性对照组相比时也显示类似的水平。另外，菌落数不呈浓度依赖性增加。由此可以判定蛋清胆矾和烤胆矾不是回复致突变物。

实施例3.癌细胞的培养

使用放入有10％FBS、100U/ml青霉素和100U/ml链霉素的RPMI 1640培养基(含有L-谷氨酰胺)，在5％CO₂培养箱中培养NCI-H460(肺癌细胞)。

在与NCI-H460(肺癌细胞)相同的条件下，培养SW480(大肠癌细胞)和MCF-7(乳癌细胞)。使用放入有10％FBS、100U/ml青霉素和100U/ml链霉素的DMEM培养基(含有L-谷氨酰胺)，在5％CO₂培养箱中培养HepG2(肝癌细胞)。

NCI-H460、MCF-7、SW480和HepG2细胞是从韩国细胞系银行获得后进行使用的。

实施例4.通过MTT分析法测定细胞存活率

为了观察烤胆矾(IS3)、蛋清胆矾(IS4)和生胆矾(IS5)对癌细胞增殖的影响，用各种浓度的这些物质来处理癌细胞，通过MTT((3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)2，5-二苯基四氮唑嗅盐)分析法测定细胞存活率，由此评价是否抑制癌细胞的增殖。

对HepG2(肝癌细胞)、SW480(大肠癌细胞)、MCF-7(乳癌细胞)和NCI-H460(肺癌细胞)这4种癌细胞进行MTT分析。首先，在96孔平板中，将各细胞以1x10⁵细胞/ml的浓度接种100μl，在37℃、5％CO₂培养箱中培养24小时。然后，用不同浓度(0、3.125、6.25、12.5、25和50μg/ml)的试验物质(IS3、IS4和IS5)100μl分别处理各孔24小时。

准备浓度为2mg/ml的MTT(噻唑兰，SIGMA公司)，将其以15μl添加到各孔中，并进行反应3小时至4小时。从各孔中除去115μl的试验物质，只留下30μl的紫色物质，然后添加150μl的DMSO(二甲基亚砜)，在微孔板混匀器上充分混合10分钟，溶解沉淀物之后，在酶标仪中以540nm的吸光度测定OD(光密度)值。所有的试验结果是对在未培养细胞的孔中测定的吸光度进行校正的值。

在所有的试样中，随着浓度增加显示出抑制增殖的效果，其中，用IS4(蛋清胆矾)处理时，最有效地抑制癌细胞的增殖(图2、3、4和5)。

实施例5.通过DAPI染色确认细胞的凋亡

为了观察烤胆矾(IS3)、蛋清胆矾(IS4)和生胆矾(IS5)是否通过引起癌细胞(NCI-H460和HepG2)的凋亡而抑制细胞增殖，用各试样处理癌细胞后，进行DAPI染色，用荧光显微镜观察细胞形态。具体的实验过程如下。

在8孔腔室载玻片中，分别放入1x10⁵细胞/ml的细胞400μl，培养24小时后，用试样(浓度为50μg/ml)处理，然后进行反应24小时，反应结束后，弃去培养基，放入500μl的75mM KCL，并进行反应5分钟。这是为了使细胞膨胀以便于观察核。接着，将醋酸和甲醇以1∶3混合形成寒冰状态之后，放入500μl左右的该混合物，并进行反应5分钟以固定细胞。该操作反复进行2次。结束固定后，在空气中完全干燥该细胞，然后滴落100μl左右的DAPI染色溶液，进行染色10分钟后，用PBS洗涤。盖上滴有甘油的盖玻片，用荧光显微镜(x100、或者x200)进行观察。计数300个细胞，其中，将显示出核片段化和染色质凝聚的细胞根据细胞凋亡形态学判断标准来检测并观察。

已有报道，细胞凋亡是程序性细胞死亡，其伴有细胞皱缩、染色质凝聚、DNA断裂、线粒体功能障碍、半胱天冬蛋白酶激活等特征。DAPI是蓝色荧光染料，其是与DNA的具有AT簇的小沟结合而增加荧光的物质，根据这样的特性，通过显微镜简单确认断裂并凝聚的凋亡小体，从而可以以肉眼观察DNA片段化程度。

对分别用浓度为50μg/ml的IS3和IS4处理的H460和HepG2细胞进行DAPI染色，与对照组(未用胆矾试样进行处理)相比时，都能观察到核断裂和染色质凝聚，特别是在IS4(蛋清胆矾)组中，可以观察到很多凋亡小体(图6和图7)。

实施例6.通过蛋白质印迹分析确认细胞凋亡相关蛋白质表达

为了在蛋白质水平上观察蛋清胆矾对癌细胞的影响，确认了作为细胞凋亡相关蛋白质的半胱天冬酶3、Bax和Bcl-2蛋白质表达调控程度。

已知，bax通过从细胞溶质转移到线粒体，促进线粒体分泌细胞色素C，最终具有诱导细胞凋亡的功能，与此相对，bcl-2起到传递细胞外或细胞内的情况的重要的信号传递系统的作用，并抑制bax转移至线粒体而起到抑制细胞凋亡的作用(Nomura et al.，1999；Murphy et al.，2000)。

半胱天冬酶(caspase)-3是与细胞凋亡最直接相关的半胱天冬酶，其作用于细胞凋亡的初期阶段，并通过35kDa酶原的分离而诱导17kDa和19kDa的异型二聚体，该异型二聚体以激活的形式(Fernandes-Alnemri et al.，1994)放大半胱天冬酶-8和半胱天冬酶-9的初期信号。

细胞凋亡分为外因和内因途径，在这两种情况下，都通过半胱天冬酶-3的激活诱导细胞凋亡。如果想观察到激活形式的半胱天冬酶-3，则未激活形式的35kDa的半胱天冬酶-3表达应该相对减少或者能够检测到作为其激活形式的17kDa和19kDa分子量的蛋白质(Kang et al.，2002；Ahn et al.，2004)。

为了观察蛋清胆矾(IS4)是否调控已知诱导细胞凋亡的几种蛋白质(半胱天冬酶3、Bax和Bcl-2蛋白质)的表达，进行了蛋白质印迹分析。由此确认了蛋清胆矾在细胞内通过什么途径诱导细胞凋亡。具体的实验过程如下。

用浓度为0、25、50和100μg/ml的IS4分别处理NCI-H460(肺癌细胞)后，在37℃下培养24小时。然后，用刮棒收集细胞，将所收集的细胞与容纳有这些细胞的培养基一起以1000rpm进行离心分离，弃去上清液，然后用2ml的冷PBS洗涤2次。向其中加入50μl至100μl的裂解缓冲液，充分搅拌后，在4℃下溶解2小时，所述裂解缓冲液由50mM Tris pH 8.0、150mM NaCl、0.02％叠氮化钠、0.2％SDS、100μg/Ml的PMSF(苯甲基磺酰氟)、50μl/Ml的抑肽酶、1％Igapel 630(或NP-40)、100mM NaF，0.5％脱氧胆酸钠、0.5mM EDTA(乙二胺四乙酸--Sigma E-4884)和0.1mM EGTA(乙二醇双(2-氨基乙基)四乙酸--sigma E-4378)组成。反应结束后，将试样放入1.5ml管，搅拌30秒，并在4℃、以23,000g进行离心分离1小时。仅收集离心分离的上清液。使用Bio-rad蛋白分析试剂盒，测定最终提取物的蛋白质量。在定量的蛋白质中，混合裂解缓冲液和5X上样缓冲液，使蛋白质的量相同，接着在100℃的恒温金属浴中煮沸5分钟，然后进行短暂的离心分离，从而收集试样。制造分离胶(12.5％)和浓缩胶(5％)之后，进行电泳、转膜。将转膜结束后的胶浸泡在染色液(考马斯蓝染色液)中10分钟后，将其转移至脱色液中，以确认剩余的蛋白质，并用TBS-T溶液洗涤转膜后，去除一些水分，使用以TBS-T溶液稀释的约5％脱脂奶，封闭约2小时左右后，用TBS-T溶液洗涤几次。与第一抗体(bax、bcl-2、激活型(cleaved)半胱天冬酶-3；cellsignaling)和第二抗体(抗兔)进行反应后，在ECL溶液中反应1分钟左右，然后将胶片放在暗盒上照相之后显影并观察。

用IS4处理H460细胞的结果，激活型半胱天冬酶-3的表达在25μg/ml和50μg/ml下显示出增加的倾向，但在100μg/ml下显示出略减少的倾向。该原因认为是，用过高的浓度的试样处理而显示出毒性。在用IS4处理的组中，bcl-2的表达略增加，而bax的表达减少(图8)。

由此可以确认，作为本发明组合物的主要有效成分的蛋清胆矾通过在癌细胞中激活半胱天冬酶-3蛋白质，从而诱导细胞凋亡，还可知，通过与bax/bcl-2途径不同的其他途径激活半胱天冬酶-3蛋白质，从而诱导细胞凋亡。

实施例7.抗癌效果的确认

将人肺癌细胞NCI-H460皮下移植到裸鼠的前腿上，以形成一定大小的实体癌，经口施用在活体试验中显示出对人肺癌细胞株的细胞杀伤能力最好的蛋清胆矾(IS4)4周，从而进行蛋清胆矾对抗癌效果的研究。即，使用数显卡尺，1周2次测定实体癌的大小，并与体重一起确认经时变化，由此检测抗癌效果，在最后测定日，计算实体癌抑制率并进行比较。在试验结束日，测定取出的实体癌的重量，并利用体积测量仪测定实体癌的实体积，确认通过在试验期间观察每天的症状显示出中心性坏死的个体和在测定各实体癌的大小的结果中实体癌的体积为1500mm³以上的个体，将在这两个条件中符合其中一个条件的个体看作死亡个体，对每个组求出平均存活日，在试验结束后，计算相对于阳性对照组的存活增加率(％)。在试验结束后进行尸检时，用肉眼确认是否有内脏器官异常后，采血分析血中的ALP、CRE、BUN、TG、ALT、AST、Ca水平、GLU和总胆固醇，摘出器官(心脏、脾脏、睾丸)并测定器官的重量。

<7-1>材料和方法

1.移植癌细胞的准备

在260ml的细胞培养瓶中，放入含有100U/ml青霉素、100g/ml链霉素、10％加热灭火的胎牛血清的RPMI-1640(Gibco BRL)，向其中放入将要移植的人肺癌(NCL-H460)细胞，在95％CO2、37℃培养箱(MCO-20AIC、Sanyo)中进行培养。细胞粘附之后，用Hanks平衡盐溶液(HBSS)(Gibco BRL)洗涤2次，用含有0.2％胰蛋白酶的HBSS洗涤后使用。

2.检疫和驯化

获得试验动物时，对所有动物的一般健康状态进行兽医学检疫。选出适于做试验的健康的动物，并为了使它们适应环境，经过了一周的驯化期间。

3、组的分离

经过驯化期间后，对健康的传代组皮下移植肿瘤块(tumor lump)，摘出培养后的肿瘤块，去除分布在表面的血管和脂肪层后，只选出新鲜的肿瘤组织并皮下移植到未处理动物内。移植后，个体肿瘤体积达到100mm³时，测定体重和肿瘤大小，用随机方法分离组。

4.个体识别

在饲养箱上，粘贴记载了试验类型、试验编号、试验物质、组编号、个体编号、性别、施用量、试验期间和试验责任者的个体识别卡。个体识别使用了尾标(tail marking)法。处理组和施用量示于下述表6。

表6

5.施用方法

将试验物质溶解于生理盐水中，使用zonde，1天1次强制经口施用4周。

6.评价方法

1)体重的测定

为了在试验期间观察体重的变化，试验开始后，每7天测定体重。

2)含肿瘤模型的制作

注射1x10⁷细胞/裸鼠/100μl而获得肿瘤株之后，给传代组进行传代培养。通过3次反复传代，获得恢复了原来实体癌的性质的肿瘤块之后，将该肿瘤块移植到5只传代组。

处死含有处于下述阶段的肿瘤的动物，将主要发生迅速分裂的轮廓部位切成一定的大小(3x3x3mm)，制作了肿瘤片，其中所述阶段为：在发生肿瘤的中心性坏死之前通过充分的血液供给而迅速生长的阶段。在套管针的尖端放上肿瘤片，将动物的左后肢的前侧方切开4mm左右，通过此处插入已准备的套管针，使尖端达到左前肢的后方的躯体侧面部。将套管针轻轻地且迅速地旋转360度的同时拔出，使肿瘤片位于目标位置，并消毒切开部位。触摸皮肤上方以确认肿瘤片的位置，并且1周2次以上观察肿瘤的生长。移植后，分离体积达到100mm³的组，然后施用试验物质。

3)抗癌试验(平均肿瘤体积)

用卡尺1周2次测定肿瘤的长轴和短轴，并测定体重。从最初施用药物开始经过28天后，结束试验，整理试验资料，从而判定试验物质引起的抑制实体癌的效果，经时性实体癌的体积和抑制率是利用下面的公式来计算的。

V(平均肿瘤体积)＝(A x B²)/2(A＝长轴长度，B＝短轴长度)

IR(抑制率)＝[CV-TV/TV]x 100

(CV＝对照组肿瘤体积，TV＝处理组肿瘤体积)

4)平均存活时间和生命延长率(％ILS)

确认通过在试验期间观察每天的症状显示出中心性坏死的个体和在测定各实体癌的大小的结果中实体癌的体积为1500mm³以上的个体，将这两个条件中符合其中一个条件的个体看作死亡个体，并根据如下公式计算生命延长率。

％ILS＝[T-C]/C]x 100

(其中，C和T是指对照组和处理组的平均存活时间)

7.血中的脂质水平的检查和一般血液检查

尸检时，通过腹主动脉采血得到血清，利用全自动血液生化分析仪(HITACHI，Tokyo，JAPAN)，分析碱性磷酸酶(ALP)、肌酸酐(CRE)、Ca、葡萄糖(GLU)，谷丙转氨酶(ALT)和AST.UN。

8.病理组织学检查

在试验结束时放血致死后，摘出肝脏、肾脏、脾脏，测定重量，并用肉眼进行观察。将组织用10％中性福尔马林溶液固定后，经过石蜡包埋，制作厚度为4μm的组织切片，然后用苏木精和伊红染色，并用光学显微镜观察。

9.统计学分析

对各试验结果，进行用于比较分散同质性的Levene检验，当分散具有同质性时，进行单向方差分析(ANOVA)，如果观察到显著性，则为了发现具有显著性差异的试验组而进行Dunnett-t检验(p＜0.05或p＜0.01)。

<7-2>结果和考察

1.体重变化

在本试验期间的体重的变化、饲料和饮水摄取量的变化中，与仅用NCI-H460细胞的组相比，施用IS4的组在施用初期体重和饲料的摄取量减少，但是1周后恢复正常(图9、10、11)。在试验期间，各组没有出现需要注意的情况。

2.肿瘤(实体癌)体积变化

从用卡尺1周2次测定在试验期间的实体癌体积的结果来看，与仅用NCI-H460细胞的组相比，施用45,90mg/kg的IS4组的肿瘤体积浓度依赖性地被抑制(图12)。观察各组的经时性变化时，施用IS412天左右后抑制NCI-H460肿瘤生长，在15天后，与仅用NCI-H460细胞的组相比，显示抑制实体癌生长的倾向。从数值上看抑制实体癌的倾向，在第22天(试验后半日)与仅用NCI-H460细胞的组的2806.47mm³相比，施用45mg/kg的IS4组为2221.74mm³、施用90mg/kg的IS4组为1517.07mm³。

3.肿瘤(实体癌)体积抑制率的测定

以仅用NCI-H460细胞的组的实体癌体积作为100％基准，对上述测定的实体癌体积进行生长抑制率分析，其结果，在施用试验物质的组中，在8天后至25天出现剂量依赖性抑制倾向(在第22天，IS4 45mg/kg I.R 82.47％＜IS490mg/kg I.R 59.99％)。施用90mg/kg的IS4的组在施用22天后显示实体癌生长抑制率减少(表7)。

表7

4.肿瘤(实体癌)重量和体积的测定

从在试验结束日摘出的实体癌的重量以及用体积测量仪(体积变化记录)测定的体积测定结果来看，与阳性对照组(仅用NCI-H460细胞)实体癌的重量(2.52±0.75g)和体积(4.67±1.18cm³)相比，IS445mg/kg组减少至2.24±0.78g和4.03±1.28cm³，IS490mg/kg组减少至2.17±0.60g，3.79±0.85cm³，显示出具有显著性差异的减少(p＜0.05)(表8)。

表8

	仅用NCI-H460肿瘤	IS445mg/kg	IS490mg/kg
				肿瘤重量(g)	2.52±0.75	2.24±0.78	2.17±0.60
肿瘤体积(cm³)	4.67±1.18	4.03±1.28	3.79±0.85

5.平均存活时间和生命延长率的测定

确认通过在试验期间观察每天的症状显示出中心性坏死的个体和在测定实体癌的大小的结果中实体癌的体积为1500mm³以上的个体，将符合两个条件的个体看作死亡个体，用这样获得的结果来计算平均存活时间，阳性对照组(仅用NCI-H460细胞的组)为18.29±3.59天，施用45mg/kg的IS4组为20.71±2.61天，生命延长率增加10.68％。并且，施用90mg/kg的IS4组为22.33±2.44天，生命延长率增加22.08％。(表9，图13)。

表9

6.组织病理学观察(光学显微镜)和器官重量的测定

在尸检时确认器官重量的变化，其结果，与仅用NCI-H460细胞的组相比，施用IS4的组(45mg/kg)的肝脏的相对重量显著减少(p＜0.01)，除此之外，其他器官的重量未显示出显著性变化。从详细结果来看，尸检时肝脏重量与1.76±0.07g的仅用NCI-H460细胞的组相比，IS445mg/kg组为1.54±0.07g，呈显著性减少(p＜0.01)。然而，IS490mg/kg组为1.69±0.10g，虽然有减少的倾向，但无显著性差异(表10)。在组织病理学方面，也未观察到各组的显著发现(图14)。

表10

7.血液生化分析

从尸检时血液生化分析来看，血中ALP、CA、CRE、ALT、AST水平未示出施用试验物质导致的显著性差异(表11)。

另一方面，血中UN水平在所有的施用试验物质的组中显示出具有显著性差异的减少结果(IS445mg/kg，IS490mg/kg，p＜0.01)。此外，与仅用NCI-H460细胞的组的9.27±0.99mg/dl相比，IS445mg/kg组的PHOS数值为7.79±0.82mg/dl，呈显著性减少(IS445mg/kg组，p＜0.05)。

表11

实施例8.治疗事例

将蛋清胆矾和竹盐粉末以1∶20的重量比混合，制造蛋清胆矾竹盐后，分别将0.5g的蛋清胆矾竹盐粉末放入胶囊后提供给患者，采用以唾液吞服或者以饮用水吞服的方法来每1天服用10至20个(按成人基准，1天施用总量为5g至10g，或者每10kg的体重为1个至3个胶囊)。患者将上述施用量的蛋清胆矾竹盐粉末间隔1小时至2小时、分成2次至10次服用，根据情况，除了蛋清胆矾竹盐之外，还一起服用了通常的用于增强气力的汤药和Sari-Jang(四利酱)。

<8-1>事例1.子宫颈不典型增生的治疗

高某某，35岁，女：患有子宫颈不典型增生，服用了结核药2年并且携带B型肝炎病毒，在这种状态下，服用汤药、蛋清胆矾竹盐和Sari-Jang 3个月，并且进行了将蛋清胆矾竹盐水注入到子宫的治疗。之后进行检查的结果，得到处于细胞几乎都恢复正常、仅有核略大这样的状态的诊断之后，中断服用而再发，但在进行再治疗(服用汤药和蛋清胆矾竹盐并且注入蛋清胆矾竹盐)1个月后，完全治愈。

<8-2>事例2.大肠癌、肺癌和骨癌的治疗

全某某，57岁，男：患有大肠癌、肺癌、骨癌(颈椎癌)，在该状态下进行大肠癌、肺癌转移手术(当时因排尿问题而检查时膀胱无异常，但神经被压迫而切除一部分膀胱)后，再发而重新转移到脊椎，患有颈椎癌，第9脊椎因癌细胞增殖而被破坏，压迫肋神经，因此疼痛严重。虽然接受了抗癌治疗6次，但结果一点也没见好，癌细胞仍然存在，无治疗可能性，服用镇痛剂忍受每一天，连抗癌治疗也难以接受，在这样的状态下，服用了汤药、蛋清胆矾竹盐和Sari-Jang 5个月。其后，在医院检查的结果，诊断为完全治愈。

<8-3>事例3.甲状腺癌的治疗

金某某，46岁，男：有在12年前因急性肝炎接受治疗的病历，目前肝脏出现石灰化现象，在诊断为甲状腺癌之后，未在医院接受抗癌治疗，而服用了汤药、蛋清胆矾竹盐和Sari-Jang。服用1个月后拍摄CT，结果5.1mm的癌细胞缩小至4.6mm。服用6个月后，完全治愈。

工业实用性

根据本发明的作为有效成分包含蛋清胆矾的组合物被制成胆矾的毒性被去除、药学活性最大化的状态，其抗癌活性优异，可以有效利用于制造预防和治疗癌用药学制剂或者健康功能性食品。

Claims

1.一种用于预防和治疗癌的组合物，其作为有效成分包含蛋清胆矾。

2.根据权利要求1所述的用于预防和治疗癌的组合物，其特征在于，进一步包含竹盐。

3.根据权利要求1或2所述的组合物，其特征在于，所述蛋清胆矾和竹盐为粉末状。

4.根据权利要求2所述的组合物，其特征在于，所述组合物以1∶5至1∶50的重量比包含蛋清胆矾和竹盐。

5.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述蛋清胆矾是将胆矾加热以使其脱水并进行粉末化后混合蛋清而制造的。

6.根据权利要求1或2所述的组合物，其特征在于，进一步包含可药用的载体。

7.根据权利要求1或2所述的组合物，其特征在于，所述癌选自由肝癌、乳癌、肺癌、大肠癌、胃癌、胰腺癌、子宫癌、前列腺癌、骨癌、神经胶质瘤和白血病组成的组中。

8.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述组合物具有通过改进半胱天冬酶3活性的抗癌能力。

9.一种用于预防和治疗癌的健康功能性食品，其作为有效成分包含蛋清胆矾。

10.根据权利要求9所述的用于预防和治疗癌的健康功能性食品，其进一步包含竹盐。

11.一种制造蛋清胆矾的方法，其包括：

(a)将作为天然矿物性生药的胆矾加热至该胆矾全部变成灰色或褐色而使其脱水的步骤；

(b)冷却脱水的胆矾后进行粉末化的步骤；

(c)将所述步骤(b)的胆矾粉末与蛋清混合的步骤。

12.根据权利要求11所述的制造蛋清胆矾的方法，其在所述步骤(c)之后，进一步包括(d)步骤：冷却所述步骤(c)的混合物后进行粉末化。

13.根据权利要求11所述的制造蛋清胆矾的方法，其特征在于，在所述步骤(c)中，在每600g的胆矾粉末中混合7个至20个鸡蛋的蛋清(140g至400g)。

14.一种预防和治疗癌的方法，其利用权利要求1所述的蛋清胆矾组合物。