BR112015002156B1 - Processo para determinação não destruidora do gênero e/ou etapa de desenvolvimento de um embrião de ave em um ovo - Google Patents
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Abstract
determinação do gênero, viabilidade e/ ou etapa de desenvolvimento de embriões de aves in ovo. a presente invenção se relaciona com um processo para a determinação não destruidora do gênero, etapa de desenvolvimento e/ ou viabilidade de um embrião de ave em um ovo, compreendendo (a) deteção pelo menos de um primeiro composto marcador do desenvolvimento selecionado de açúcares e/ ou aminoácidos, seus precursores e metabolitos em um ovo a um período de tempo do início da incubação do ovo até à eclosão; (b) medição da quantidade do pelo menos primeiro composto marcador do desenvolvimento detetado, e (c) comparação da quantidade com uma linha de base estabelecida para machos e fêmeas, etapa de desenvolvimento do embrião, e/ ou embrião vivo e doente ou não desenvolvido, para se determinar se o embrião é viável, macho e/ ou fêmea, e/ ou a etapa de desenvolvimento do embrião.
Description
[0001] A presente invenção se relaciona com um processo para a determinação do gênero, etapa de desenvolvimento e/ou viabilidade de um embrião de ave in ovo, por determinação da presença de marcadores do desenvolvimento no ovo, mais especificamente no fluido alantoico. O presente processo se refere adicionalmente a um processo para a determinação da viabilidade de um embrião de ave, e a seleção de ovos machos e ovos fêmeas, e à produção de vacinas e/ou pintos usando estes ovos selecionados.
[0002] Os ovos fertilizados da maioria das espécies de aves, em particular aquelas criadas comercialmente, tais como galinhas domesticadas (Gallus gallus domesticus), patos, gansos e perus, tendem a resultar após eclosão em uma distribuição aproximadamente igual de pintos machos e fêmeas. Na gestão de centros de incubação pode ser desejável separar pássaros com base em várias características, em particular gênero. Pode ser por exemplo desejável inocular pássaros machos e fêmeas com diferentes vacinas, ou separar as populações para ganhar eficácias alimentares, melhorar uniformidade de processamento, e reduzir custos de produção onde existem diferenças na taxa de crescimento e requisitos nutricionais de pássaros machos e fêmeas. Ainda adicionalmente, para produção comercial de ovos, a incubação e criação de pintos machos são altamente indesejáveis, levando ao abate de mil milhões de pintos machos em cada ano.
[0003] Além do mais existe uma percentagem de ovos que não são fertilizados, ou não compreendem um embrião viável no início do período de incubação, o que reduz grandemente a capacidade das incubadoras nos centros de incubação. Até agora, a determinação de embriões viáveis, i.e., vivos, era tipicamente realizada empregando uma técnica conhecida como “miragem”, como por exemplo divulgado em EP-A-2369336 e US 7950349.
[0004] Aqui, um ovo é inspecionado usando uma fonte de luz emitindo luz de um comprimento de onda que permita que passe pelo menos em parte através do ovo.
[0005] Embora isto permita identificar se um ovo contém um embrião vivo, no entanto, de modo a originar resultados confiáveis, requererá que o ovo tenha progredido pelo menos até ao dia 11, ou mesmo até uma etapa tardia do seu desenvolvimento. Além do mais, embora esta técnica consiga discriminar entre ovos vivos e não vivos, não permite determinar confiavelmente o gênero e outras características dos pássaros não eclodidos.
[0006] Como resultado é requerida uma capacidade de incubação de quintas de pintos presentes que seja pelo menos duas vezes tão grande como necessário se uma seleção inicial do gênero estivesse disponível, permitindo a seleção de principalmente somente embriões de pintos fêmeas.
[0007] Conformemente seria de grande valor para o ambiente, por redução da quantidade de energia e outros recursos requeridos, mas igualmente para a eliminação do abate desnecessário de pintos machos, bem como redução de estresse para os pássaros recém-eclodidos, se estivesse disponível um método de etapa inicial que permitisse determinar o gênero de embriões de aves antes da fase de incubação, permitindo também aumentar fortemente a capacidade dos centros de incubação.
[0008] Um benefício adicional seria se o método permitisse também selecionar embriões viáveis em detrimento de ovos não fertilizados e/ou de outro modo não viáveis, aumentando adicionalmente a eficácia do processo de eclosão.
[0009] Y. Feng et al. divulgam em Appl. Magn. Reson. (2007), 32, 257-268 a análise de metabolitos no fluido alantoico de ovos de galinha ao dia 9 por espectroscopia de NMR a força de campo superelevada de 900 MHz.
[0010] Gu D.-C. et al., Chinese Journal of Animal Science, Vol. 7, 23-25, divulgam a análise das concentrações livres de ácido aspártico, ácido glutâmico, arginina e leucina em fluidos alantoicos e amniônicos durante incubação de reprodução de ovos de por HPLC. No entanto, o processo divulgado não vai para além da produção de uma linha de base para comparação de ovos de uma data de postura não especificada, mas estabelece simplesmente uma linha de base para quatro aminoácidos. Além do mais, o método de exame divulgado é destruidor na medida em que não era permitido que os ovos com embriões vivos maturassem para recém-nascidos após exame, ou usados para outros propósitos, tais como produção de vacinas.
[0011] US-A-2003/0096319 e WO-A-2006124456 divulgam métodos de determinação do gênero de um embrião de ave em um ovo por determinação da presença de um composto esteroide estrogênico em uma amostra de fluido embriônico, tal como fluido alantoico ou sangue do ovo de ave. Embora isto pode ser praticável sem destruição do ovo, as quantidades de esteroide estrogênico são mínimas, e o teste será somente bem-sucedido após desenvolvimento das gônadas, logo a um ponto comparativamente tardio no desenvolvimento do embrião. Ainda adicionalmente, o método de WO-A- 2006124456 requereria também provavelmente a modificação de marcadores de fluorescência para cada espécie e seu subgrupo, ou a modificação genética de tal espécie.
[0012] Ohta Y et al., Poultry Science, Vol. 80, Nr. 10, 1430-1346, divulgam o efeito da administração in ovo de aminoácidos, para ver como isto afeta as concentrações de aminoácidos de embriões e outros conteúdos dos ovos de ovos de matrizes. Este não é no entanto um método para determinar o gênero, viabilidade e/ou etapa de desenvolvimento de um ovo de ave.
[0013] Conformemente, a presente invenção se relaciona com um processo para a determinação do gênero, etapa de desenvolvimento e/ou viabilidade de um embrião de ave em um ovo, compreendendo (a) deteção pelo menos de um primeiro composto marcador do desenvolvimento selecionado de açúcares e/ou aminoácidos, seus precursores e metabolitos em um ovo a um período de tempo do início da incubação do ovo até à eclosão; (b) medição da quantidade do pelo menos primeiro composto marcador do desenvolvimento detetado, e (c) comparação da quantidade com uma linha de base estabelecida para machos e fêmeas, etapa de desenvolvimento do embrião, e/ou embrião vivo e doente ou não desenvolvido, para se determinar se o embrião é viável, macho e/ou fêmea, e/ou a etapa de desenvolvimento do embrião.
[0014] Em um aspeto adicional, o presente processo se relaciona também com um processo para a determinação do gênero e/ou viabilidade de um embrião de ave em um ovo, compreendendo (a) deteção pelo menos de um primeiro composto marcador do desenvolvimento selecionado de açúcares e/ou aminoácidos, seus precursores e metabolitos em um ovo a um período de tempo do início da incubação do ovo até à eclosão; (b) medição da quantidade do pelo menos primeiro composto marcador do desenvolvimento detetado, e (c) comparação da quantidade com uma linha de base estabelecida para machos e fêmeas, e/ou embrião vivo e doente ou não desenvolvido, para se determinar se o embrião é viável, macho e/ou fêmea.
[0015] Ainda em um aspeto adicional, a presente invenção se relaciona com um processo para a determinação da etapa de desenvolvimento de um embrião de ave em um ovo, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, compreendendo (a) deteção pelo menos de um primeiro composto marcador do desenvolvimento selecionado de açúcares e/ou aminoácidos, seus precursores e metabolitos em um ovo; (b) medição da quantidade do pelo menos primeiro composto marcador do desenvolvimento detetado, e (c) comparação da quantidade com uma linha de base estabelecida para a etapa de desenvolvimento da postura à eclosão, para se determinar a etapa de desenvolvimento do embrião e o tempo até ser provável que a eclosão ocorra.
[0016] A Figura 1 ilustra a modelação de mínimos quadrados parciais, uma análise de dados multivariada não supervisionada, para dados de 1H NMR para agrupar amostras com base em todos os metabolitos detetados em 1H NMR de um conjunto laboratorial de ovos de galinha. F representa fêmeas, M representa Machos.
[0017] A Figura 2 ilustra a modelação de mínimos quadrados parciais, uma análise de dados multivariada não supervisionada, para dados de 1H NMR para agrupar amostras com base em todos os metabolitos detetados em 1H NMR de um conjunto de teste maior de um centro de incubação comercial. F representa fêmeas, M representa Machos.
[0018] A presente invenção é agora descrita mais completamente doravante com referência ao desenho acompanhante, na qual uma forma de realização preferencial da invenção é mostrada. Esta invenção pode, no entanto, ser exemplificada de muitas formas diferentes e não deve ser interpretada como limitada às formas de realização apresentadas aqui; ao invés, estas formas de realização são proporcionadas tal que esta divulgação seja precisa e completa, e transmita completamente o escopo da invenção àqueles peritos na técnica. A não ser que de outro modo definido, todos os termos técnicos e científicos usados aqui têm o mesmo significado como comummente entendido por um com perícia ordinária na técnica à qual esta invenção pertence. A terminologia usada na descrição da invenção aqui é para o propósito somente da descrição de formas de realização particulares e não se destina a ser limitante da invenção.
[0019] Os termos “ave” e “pássaro”, como usados aqui, incluem machos ou fêmeas de qualquer espécie de ave, mas se destinam principalmente a englobar aves domésticas que são comercialmente criadas para ovos ou carne. Conformemente, os termos “pássaro” e “ave” se destinam particularmente a englobar galinha, perus, patos, gansos, codorniz e faisão.
[0020] O termo “incubação” aqui se refere ao processo pelo qual os pássaros chocam seus ovos, e ao desenvolvimento do embrião dentro do ovo após deixar o trato da galinha. O período de incubação aqui se refere ao tempo ininterrupto durante o qual um ovo particular é sujeito a condições simulando o choco até a eclosão, i.e., emergência dos pássaros, incluindo qualquer manuseamento ou transferências de, p.ex., uma incubadora para uma unidade de centro de incubação, contanto que o desenvolvimento de um pássaro não seja estagnado.
[0021] O termo “in ovo”, como usado aqui, se refere a embriões de pássaros contidos dentro de um ovo antes da eclosão. A presente invenção pode ser praticada com qualquer tipo de ovo de pássaro, incluindo, mas não se limitando a, ovos de galinha (domesticada), peru, pato, ganso, codorniz, e faisão.
[0022] O termos “injeção” e “injetar” aqui englobam métodos de inserção de um dispositivo (tipicamente um dispositivo alongado) em um ovo ou embrião, incluindo métodos de distribuição ou descarga de uma substância em um ovo ou embrião, métodos de remoção de uma substância (i.e., uma amostra) de um ovo ou embrião, e/ou métodos de inserção de um dispositivo detetor em um ovo ou embrião.
[0023] Preferencialmente, a determinação de acordo com a presente invenção é realizada como um método não destruidor, i.e., permitindo que os embriões de aves assim testados cresçam, se assim desejado, ou sua sujeição a passos adicionais tais como produção de vacinas in ovo, contanto que o embrião seja viável.
[0024] O termo “fluido alantoico” aqui engloba fluido alantoico com ou sem a presença de outros materiais do ovo. Por exemplo, o termo fluido alantoico pode incluir uma mistura de sangue e fluido alantoico. Formas de realização da presente invenção não estão limitadas a extração de material do fluido alantoico ou de áreas próximas da superfície superior de um ovo. A remoção de material do fluido alantoico como descrito aqui é proporcionada como meramente um exemplo de possíveis formas de realização da presente invenção. Vários materiais incluindo mas não se limitando a âmnio, gema, casca, albúmen, tecido, membrana e/ou sangue podem ser extraídos de um ovo e avaliados para identificar um ou mais marcadores do desenvolvimento, como descrito em baixo. O material pode ser extraído de ovos tendo virtualmente qualquer orientação.
[0025] O termo “localização pré-determinada” aqui indica uma posição ou profundidade fixa dentro de um ovo. Por exemplo, um dispositivo pode ser injetado em um ovo até uma profundidade fixa e/ou posição fixa no ovo. Em formas de realização alternativas, a injeção pode ser levada a cabo com base em informação obtida do ovo, p.ex., dizendo respeito à posição do embrião ou da cavidade subgerminal dentro do ovo.
[0026] O termo “comparação da quantidade” pode vantajosamente incluir uma análise univariada ou preferencialmente multivariada dos metabolitos medidos, e uma determinação da associação de um embrião de ave com uma certa população. O passo pode compreender determinação da presença dos analitos, i.e., metabolitos, no material de amostra por análise estatística multivariada dos espectros de massa, NMR, ou dados adequados medidos de outro modo. O programa de análise estatística multivariada compreende preferencialmente um programa de análise de componentes principais, e/ou um programa de análise de regressão por mínimos quadrados parciais. A presente invenção diz respeito assim também a um processo, dispositivo e sistema para determinação do gênero, etapa de desenvolvimento e/ou viabilidade de um embrião de ave in ovo, compreendendo programa de análise estatística multivariada, bem como um processo implementado de microprocessador para a sua determinação.
[0027] Processos e dispositivos de acordo com formas de realização da presente invenção podem ser utilizados para identificação de uma ou mais características de um ovo em qualquer momento durante o período de desenvolvimento embriônico, também referido como o seu período de incubação. As formas de realização da presente invenção não estão limitadas a um dia particular durante o período de desenvolvimento embriônico.
[0028] No presente processo, os marcadores do desenvolvimento podem ser preferencialmente analisados invasivamente ou não invasivamente.
[0029] Se a análise for realizada invasivamente, isto inclui tipicamente a extração de uma amostra de material de ovo. A amostra é preferencialmente tirada de um fluido embriônico, preferencialmente do fluido alantoico, uma vez que é menos provável que isto danifique o embrião. O fluido alantoico é tipicamente um meio excretor para os metabolitos azotados de um embrião de ave. O fluido alantoico começa a se formar em torno do dia 3 de incubação, como divulgado por Hamburger, V e Hamilton, HL (1951). “A series of normal stages in the development of the chick embryo”. Journal of Morphology 88 (1): 49-92.
[0030] Aqui é indicado que o alantoide era distinguível às 65 horas após incubação, como uma bolsa de paredes espessas, curta; ainda não vesicular. Após 72 horas, a alantoide era vesicular, variável em tamanho; na média do tamanho do mesencéfalo, indicando que o alantoide e o fluido alantoico estão presentes a partir do dia 3.
[0031] Atinge um volume máximo cerca do dia 13 de incubação e depois diminui de volume à medida que a incubação continua devido a perda de umidade e reabsorção de fluido, mas está ainda presente em volumes significativos ao dia 18 da incubação.
[0032] O fluido alantoico é separado da casca de ovo pelas membranas internas e externas da casca e pelas membranas corioalantoicas. Embora o fluido alantoico englobe a periferia inteira de um ovo embrionado, o fluido alantoico se acumula tipicamente no topo de um ovo diretamente por debaixo das membranas sobrepostas à célula de ar.
[0033] O acúmulo do fluido alantoico no topo do ovo é devido à gravidade e deslocalização pelo embrião e saco vitelino densos. A tentativa de amostrar precisamente o fluido alantoico através do topo de um ovo enquanto o ovo está virado para cima pode ser difícil devido à variabilidade do espaço de ar de ovo para ovo. A gravidade pode ser usada para agrupar o fluido alantoico em um local localizado. Quando um ovo é virado sobre o seu eixo longitudinal, o fluido alantoico se irá agrupar no lado do topo do ovo, diretamente por debaixo da casca. A colocação do ovo sobre o seu eixo longitudinal torna o fluido alantoico útil para extração de uma amostra.
[0034] A extração de material, tal como fluido alantoico, de ovos pode ser realizada de várias maneiras, incluindo penetração da casca de ovo, e inserção de uma cânula de amostragem através das membranas. Uma amostra do fluido a ser amostrado pode ser depois coletada, enquanto a membrana e/ou casca são ativamente selados com um selante adequado, ou se permite que selem elas próprias.
[0035] Métodos e dispositivos adequados para a penetração de ovos e amostragem invasiva de material de ovo são divulgados por exemplo em US-A-20070137577, WO-A- 00/22921 ou WO-A-99/34667. A amostra assim tirada é depois preferencialmente sujeita a um protocolo adequado para permitir a deteção dos marcadores do desenvolvimento, e uma análise das quantidades relativas e/ou absolutas dos marcadores do desenvolvimento presentes.
[0036] A amostra pode ser analisada por qualquer método adequado para detetar e quantificar o marcador ou marcadores do desenvolvimento. Preferencialmente, a análise é realizada por um método de imagiologia de ressonância magnética incluindo métodos de ressonância nuclear; métodos de ressonância espectral incluindo espectroscopia de infravermelhos ou Raman, e/ou métodos analíticos tais como GC ou HPLC acoplado a detetores adequados, espectroscopia de fluorescência, e/ou ensaio imunoabsorvente ligado a enzima, incluindo métodos a seco e úmido, tais como uso de um método de aferição. Embora os métodos invasivos permitam tirar uma amostra diretamente, e sujeitar o fluido amostrado a uma análise, preferencialmente a análise é realizada não invasivamente devido à eficácia de tal método de análise, e ao fato de que a casca do ovo e membranas aí permanecem não perfuradas.
[0037] Pode ser empregue qualquer método para realizar tal análise não invasiva. Tipicamente podem ser empregues métodos de ressonância espectral quantitativa incluindo espectroscopia de infravermelhos ou Raman, preferencialmente usando espectros secundários para a determinação da presença e quantidades absolutas e/ou relativas de marcadores do desenvolvimento presentes em um ovo. Embora várias publicações tenham divulgado o uso de métodos não invasivos, p.ex., US-A-2011/144473 e US-A- 7950349, estas publicações descrevem somente vagamente espectros de emissão globais; o que na prática não permite selecionar a etapa de desenvolvimento, a viabilidade e/ou o gênero de um embrião. O presente processo difere em particular dos métodos divulgados na medida em que é determinada a presença de componentes específicos no ovo, o que pode ser vantajosamente feito por uso de espectros derivados secundários que permitam procurar seletivamente pelas quantidades absolutas e relativas de um ou mais composto(s) marcador(es) do desenvolvimento.
[0038] Em particular pode ser vantajosamente empregue espectroscopia de infravermelhos com segunda derivada da transformada de Fourier (FTIR) e FT-Raman, ou sua combinação, para alcançar a precisão e repetibilidade necessárias, enquanto métodos de ressonância magnética nuclear podem ser adequadamente empregues para determinar a natureza dos marcadores do desenvolvimento, e para estabelecer uma linha de base para calibrar o sistema.
[0039] O presente processo permite vantajosamente determinar a viabilidade, e/ou gênero de um embrião, e/ou preferencialmente as etapas de desenvolvimento do início da incubação do ovo até à eclosão.
[0040] Preferencialmente, a determinação é realizada a um período de 1 a 15 dias, mais preferencialmente de 2 a 14 dias, ainda mais preferencialmente de 3 a 13, e ainda mais preferencialmente de 4 a 12 dias após a incubação se ter iniciado, tal como realização do passo a) preferencialmente a um período de tempo de 6 a 12 dias após o início da incubação do ovo.
[0041] Isto permite evitar os custos envolvidos na incubação de ovos que sejam não viáveis e/ou não do gênero desejado. Além do mais, a etapa de desenvolvimento real de um ovo pode ser determinada. Para espécies com tempos de incubação mais curtos ou mais longos do que aqueles de galinha domesticada podem se aplicar outros períodos, como adequado.
[0042] Os marcadores do desenvolvimento de acordo com a invenção assunto são preferencialmente selecionados de açúcares, aminoácidos, e seus respectivos metabolitos e/ou precursores.
[0043] Destes, marcadores do desenvolvimento de importância particular incluíram Glucose, Colina e Valina, cada um dos quais teve uma influência estatisticamente significativa na determinação do gênero do embrião de ave.
[0044] Sem desejar estar limitado a qualquer teoria particular, Colina e trimetilglicina, seu derivado de aminoácido, são consideradas como sendo particularmente usadas para apoiar o sistema nervoso em desenvolvimento do feto. Se descobriu que as razões de colina e trimetilglicina (betaína) diferem fortemente entre embriões machos e fêmeas, enquanto ao mesmo tempo as quantidades absolutas de colina eram mais elevadas no fluido alantoico de embriões fêmeas. Geralmente, a colina e seus metabolitos são necessários para três principais propósitos fisiológicos: integridade estrutural e papéis de sinalização para membranas das células, neurotransmissão colinérgica (síntese de acetilcolina), e uma grande fonte de grupos metila através do seu metabolito, Trimetilglicina (betaína), que participa nas vias de síntese de S- adenosilmetionina (SAMe). Se descobriu também que Valina e Glucose, por outro lado, variam significativamente entre embriões machos e fêmeas.
[0045] Onde a espécie de ave é Gallus gallus domesticus, preferencialmente um primeiro marcador ou marcador adicional do desenvolvimento é glucose em quantidade absoluta para um embrião fêmea na gama de 30 μM/mL a 7 0 μM/mL, e para um embrião macho de 1 μM/mL a 30 μM/mL no fluido alantoico.
[0046] Um primeiro marcador adicional ou marcador do desenvolvimento preferencial adicional preferencial adicional para embriões de Gallus gallus domesticus é Colina, em uma quantidade absoluta para um embrião fêmea na gama de 110 μM/mL a 130 μM/mL, e para um embrião macho de 90 μM/mL a, mas não incluindo, 110 μM/mL, no fluido alantoico.
[0047] Ainda um primeiro ou marcador do desenvolvimento adicional adicional para embriões de Gallus gallus domesticus é Valina, em uma quantidade absoluta para um embrião fêmea na gama de 110 μM/mL a 130 μM/mL, e para um embrião macho de 90 μM/mL a, mas não incluindo, 110 μM/mL, no fluido alantoico.
[0048] Preferencialmente, no presente processo, pelo menos um segundo marcador é detetado no passo (a), e em que os pelo menos primeiro e segundo marcadores são analisados e comparados com a linha de base, e uns com os outros para estabelecer uma razão entre marcadores do desenvolvimento.
[0049] Por correlação da análise de dois ou três marcadores, a seletividade da determinação da viabilidade e gênero pode ser vantajosamente adicionalmente melhorada. Conformemente, preferencialmente pelo menos um primeiro e um segundo marcadores e/ou marcador do desenvolvimento adicional são detetados e analisados, em que as quantidades absolutas e a razão do pelo menos primeiro em relação ao segundo marcadores e/ou marcadores adicionais são empregues para determinar o gênero e/ou viabilidade.
[0050] O presente processo compreende adicionalmente vantajosamente determinação de se um embrião em um ovo é viável e macho, ou viável e fêmea, e separação de uma multitude de ovos machos viáveis de uma multitude de ovos fêmeas viáveis, para formar uma seleção de ovos predominantemente machos ou predominantemente fêmeas.
[0051] As seleções de ovos fêmeas ou machos viáveis assim formadas podem ser vantajosamente sujeitas a um processo de incubação e eclosão para formar uma população de pintos predominantemente fêmeas ou machos.
[0052] O presente processo compreende adicionalmente preferencialmente injeção de um vírus ou material tipo vírus em cada ovo identificado como contendo um embrião vivo e macho ou fêmea, e, preferencialmente, após incubação compreende isolamento da vacina obtida dos ovos incubados.
[0053] Após injeção com um inóculo de vírus, os ovos contendo embriões vivos são preferencialmente transferidos para uma incubadora durante um período de tempo pré- determinado. No final deste período de tempo, os ovos são transferidos para uma estação de coleta de vacinas onde material de cada ovo, p.ex., fluido amniótico é extraído.
[0054] Conformemente, o presente processo compreende também preferencialmente os passos de eutanização de um embrião no ovo infetado, e coleta de fluido amniótico de cada ovo eutanizado, em que o fluido amniótico compreende vacina; e preferencialmente isolamento de uma vacina do fluido amniótico. Preferencialmente, o vírus compreende vírus da gripe humana, e consequentemente o fluido amniótico coletado compreende vacina contra a gripe humana.
[0055] Os marcadores do desenvolvimento de acordo com a invenção assunto podem ser também preferencialmente empregues para se determinar a idade de um embrião, ou podem ser adequadamente aplicados outros marcadores.
[0056] Marcadores do desenvolvimento úteis para a determinação da idade do embrião são preferencialmente selecionados de aminoácidos, e seus respectivos metabolitos e/ou precursores. Os requerentes descobriram em particular que as quantidades absolutas e relativas de aminoácidos, mais preferencialmente Trimetilglicina, também conhecida como Betaína, Aspartato e Asparagina, Glutamato e Glutamina e Prolina poderiam ser diretamente relacionadas com a etapa de desenvolvimento de um embrião de ave in ovo. Isto é altamente relevante, uma vez que existem poucas características que permitam determinação da etapa de desenvolvimento, ou idade, de um embrião de ave, em particular a etapas iniciais do desenvolvimento.
[0057] O presente processo permite também conformemente preferencialmente selecionar ovos essencialmente da mesma etapa de desenvolvimento, ou idade real, e combinar uma multitude de ovos essencialmente da mesma idade, sujeitar os ovos a uma incubação controlada. O período de eclosão resultante deve ser mais uniforme, resultando em uma população de pintos mais uniforme, de qualidade mais elevada devido a estresse reduzido, e redução do número de pássaros precocemente eclodidos que são sujeitos a exposição prolongada às condições de incubação artificiais.
[0058] A população de pássaros eclodidos resultante mostrará uma qualidade mais elevada, resultando em um rendimento mais elevado, e requisitos de acompanhamento reduzidos para a população de pintos, p.ex., através de quantidades reduzidas de tratamentos.
[0059] Similarmente, o uso de populações de ovos selecionadas quanto à idade irá também permitir preparar vacinas mais eficazmente, uma vez que aqui a etapa de desenvolvimento de um embrião de ovo é relevante para o ponto no tempo quando um vírus é mais eficazmente injetado, e uma vacina coletada.
[0060] A presente invenção se relaciona também com seleções de ovos, e, após eclosão, com um pinto ou população de pintos obtenível pelo processo.
[0061] Os seguintes exemplos não limitantes são proporcionados para ilustrar a invenção.
[0062] Ovos de gallus gallus domesticus foram incubados a 37,8 °C, virando a cada hora, em uma incubadora industrial modelo 50, comercialmente disponível da MS Broedmachines V.O.F..
[0063] Um grupo de 12 ovos foi incubado durante 9 dias, um segundo grupo de 12 ovos durante 10 dias, e um terceiro grupo de 12 ovos durante 11 dias.
[0064] Os ovos foram retirados da incubadora, colocados em um suporte de papel, sob um microscópio, com a bolsa de ar para cima. A casca e membranas foram perfuradas e partidas em torno da bolsa de ar, deixando as membranas internas intactas. Usando luz, os vasos sanguíneos correndo sobre a membrana interna da casca foram localizados, e uma pequena punção evitando os vasos sanguíneos foi feita através das membranas internas e externas até à cavidade alantoica.
[0065] O ovo foi torcido e uma pipeta de 1 mL foi depois usada para soprar ar para a cavidade, após o que 1,5 a 2 mL de fluido alantoico foram extraídos usando a pipeta. Isto foi transferido para um criofrasco, que foi imediatamente mergulhado em nitrogênio líquido. As amostras foram depois retiradas e armazenadas em -80 °C.
[0066] O embrião foi retirado do ovo, por corte das membranas e por uso de uma pequena colher. Foi colocado em um tubo falcon cheio com etanol a 96 % e em gelo e armazenado em um local escuro à temperatura ambiente.
[0067] O fluido alantoico foi retirado de -80 °C, descongelado e uma amostra de 1 mL foi retirada e colocada em um frasco de vidro.
[0068] 1 mL de clorofórmio e 1 mL de uma mistura de metanol e água (1:1) foram adicionados à amostra, usando pipetas Pasteur de plástico. Os frascos foram fechados usando uma tampa e depois agitados durante 20 segundos, depois colocados a 4 °C durante 10 minutos. Usando uma pipeta Pasteur de vidro, 1 mL da parte superior da mistura foi retirado e transferido para um criofrasco. A tampa deste criofrasco foi perfurada e foi liofilizado durante a noite. Este produto liofilizado foi empregue como amostra de NMR.
[0069] Ovos de gallus gallus domesticus foram incubados a 37,8 °C em um centro de incubação comercial, virando a cada hora, em uma incubadora industrial comercialmente disponível da Petersime NV. Um grupo de 50 ovos foi incubado durante 8 dias, um segundo grupo de 50 ovos durante 9 dias, e um terceiro grupo de 50 ovos durante 10 dias.
[0070] Os ovos foram retirados da incubadora, colocados em um suporte de papel, sob um microscópio, com a bolsa de ar para cima.
[0071] A casca e membranas foram perfuradas e partidas em torno da bolsa de ar, deixando as membranas internas intactas. Usando luz, os vasos sanguíneos correndo sobre a membrana interna da casca foram localizados, e uma pequena punção evitando os vasos sanguíneos foi feita através das membranas internas e externas até à cavidade alantoica.
[0072] O ovo foi torcido e uma pipeta de 1 mL foi depois usada para soprar ar para a cavidade, após o que 1,5 a 2 mL de fluido alantoico foram extraídos usando a pipeta. Isto foi transferido para um criofrasco, que foi imediatamente mergulhado em nitrogênio líquido. As amostras foram depois retiradas e armazenadas em -80 °C.
[0073] O embrião foi retirado do ovo, por corte das membranas e por uso de uma pequena colher. Foi colocado em um tubo falcon cheio com etanol a 96 % e em gelo e armazenado em um local escuro à temperatura ambiente.
[0074] O fluido alantoico foi retirado de -80 °C, descongelado e uma amostra de 0,5 mL de foi colocada em criofrasco. A tampa deste criofrasco foi perfurada e foi liofilizado durante a noite. Este produto liofilizado foi empregue como amostra de NMR.
[0075] O embrião de galinha foi retirado do etanol e deixado a secar durante 10 minutos à temperatura ambiente. Uma pequena porção da perna esquerda foi cortada e isto foi usado para extrair DNA, usando um estojo de extração de DNA (comercialmente disponível como Qiagen DNeasy kit), após o que a quantidade foi medida usando um dispositivo de nanogotas.
[0076] PCR usando o par de iniciadores 1272H e 1237L, comercialmente disponível da Sigma, foi usada para se determinar o gênero do embrião. O programa de PCR usado foi 95 °C durante 5 minutos, depois 36 vezes 95 °C durante 45 segundos, 56 °C durante 45 segundos, 72 °C durante 1 minuto, após o que uma operação foi feita a 72 °C durante 5 minutos. O gênero do embrião foi determinado com base no produto de PCR resultante, identificado por uso de um gel de ágar a 2 %.
[0077] 50-100 mg de material de amostra obtido como descrito acima foram sujeitos a medições de NMR resolvidas por 1H-1H-J de duas dimensões (2D), usando ácido 3- (trimetilsilil)propiônico-2,2,3,3-d4 (TSP) como um padrão interno, como divulgado em Nature Protocols, Vol. 5, No. 3, 2010, páginas 536-549, e Phytochemistry 71, 2010, 773-784.
[0078] Os dados obtidos para o Exemplo 1 são ilustrados na Tabela 1: Tabela 1: Dados Medidos para embriões Machos e Fêmeas
[0079] Uma modelação de mínimos quadrados parciais, uma análise de dados multivariada não supervisionada, foi empregue para os dados de 1H NMR para agrupar amostras com base em todos os metabolitos detetados em 1H NMR. A informação mais importante obtida foi a correlação entre dois conjuntos de dados, i.e., os sinais de 1H NMR medidos (metabolitos) e a classificação da amostra (informação do grupo).
[0080] A análise não só revelou as quantidades absolutas de marcadores do desenvolvimento para embriões machos ou fêmeas, mas também as quantidades relativas. Quando um segundo marcador e um terceiro marcador foram adicionados, respectivamente, a seletividade do teste aumentou adicionalmente. As Figuras 1 e 2 divulgam os resultados de uma análise multivariada do Exemplo 1, e 2, respectivamente, e se sobrepõem com a determinação do gênero.
[0081] O Exemplo 1 foi repetido, analisando no entanto os seguintes marcadores do desenvolvimento que se descobriu que eram relevantes para a determinação da etapa de desenvolvimento, ou idade dos embriões. Tabela 2: Dados Mec idos para os Dias 9 a 11
[0082] Os dados acima indicam claramente que a etapa de desenvolvimento de um embrião pode ser determinada a partir de um ou mais marcadores do desenvolvimento.
[0083] Uma modelação de mínimos quadrados parciais, uma análise de dados multivariada não supervisionada, foi empregue para os dados de 1H NMR para agrupar amostras com base em todos os metabolitos detetados em 1H NMR. A informação mais importante obtida foi a correlação entre dois conjuntos de dados, i.e., os sinais de 1H NMR medidos (metabolitos) e a classificação da amostra (informação do grupo).
[0084] O modelo multivariado demonstrou a associação entre gênero, idade e/ou viabilidade de um embrião e as quantidades relativas de metabolitos presentes. O uso de métodos analíticos alternativos, tais como por exemplo GCMS, deu resultados similares, corroborando deste modo os resultados.
[0085] A análise não só revelou as quantidades absolutas de marcadores do desenvolvimento para a etapa de desenvolvimento, mas também as quantidades relativas. Quando um segundo, terceiro e quarto marcadores foram adicionados, respectivamente, a seletividade do teste aumentou adicionalmente.
[0086] Os exemplos acima mostram claramente as vantagens do processo e materiais da presente invenção. Embora várias formas de realização específicas da presente invenção tenham sido descritas na descrição detalhada acima, esta descrição não se destina a limitar a invenção à forma ou formas de realização particulares divulgadas aqui uma vez que são para serem reconhecidas como ilustrativas em vez de restritivas, e será óbvio àqueles peritos na técnica que a invenção não está limitada aos exemplos.
Claims (13)
1. Processo para determinação não destruidora do gênero e/ou etapa de desenvolvimento de um embrião de ave em um ovo, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) detectar pelo menos um primeiro marcador de desenvolvimento para a determinação do estágio de desenvolvimento selecionado de Betaína, Aspartato, Arginina, Glutamato, Glutamina e Prolina e/ou pelo menos um primeiro marcador de desenvolvimento para a determinação do gênero selecionado entre Glicose, Colina e/ou Valina no fluido alantóico de um ovo em um período de tempo desde o início da incubação do ovo até a eclosão; (b) medir a quantidade do pelo menos primeiro composto marcador de desenvolvimento detectado para a determinação do estágio de desenvolvimento e/ou gênero; e (c) comparar a quantidade a uma linha de base estabelecida para macho e fêmea e/ou estágio de desenvolvimento do embrião, para determinar se o embrião é masculino ou feminino e/ou o estágio de desenvolvimento do embrião.
2. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que (c) inclui uma análise univariada ou multivariada dos metabólitos medidos e uma determinação da associação do embrião aviário com uma determinada população compreendendo um programa de análise de componentes principais e/ou um programa de análise de regressão de mínimos quadrados parciais.
3. Processo, de acordo com as reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que pelo menos um segundo marcador é detectado na etapa (a), e em que o pelo menos o primeiro e segundo marcadores são analisados e comparados com a linha de base, e uns com os outros para estabelecer uma razão entre marcadores do desenvolvimento.
4. Processo, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que a espécie de ave é Gallus gallus domesticus, e em que um primeiro marcador ou marcador do desenvolvimento adicional é Glucose em quantidade absoluta para um embrião fêmea na faixa de 30 μM/mL a 7 0 μM/mL, e para um embrião macho de 1 μM/mL a 30 μM/mL.
5. Processo, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que um primeiro marcador ou marcador do desenvolvimento adicional é Colina em uma quantidade absoluta para um embrião fêmea na faixa de 110 μM/mL a 130 μM/mL, e para um embrião macho de 90 μM/mL até, mas não incluindo, 110 μM/mL.
6. Processo, de acordo com a reivindicação 4 ou 5, caracterizado pelo fato de que um primeiro marcador ou marcador do desenvolvimento adicional é Valina em uma quantidade absoluta para um embrião fêmea na faixa de 110 μM/mL a 130 μM/mL, e para um embrião macho de 90 μM/mL até, mas não incluindo, 110 μM/mL.
7. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 a 6, caracterizado pelo fato de que pelo menos um primeiro e segundo marcadores do desenvolvimento são detectados e analisados, e em que as quantidades absolutas e a razão de pelo menos o primeiro em relação ao segundo marcador são empregados para se determinar o gênero.
8. Processo, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que a análise é realizada por um método de imagiologia de ressonância magnética incluindo métodos de ressonância nuclear; por um método de ressonância espectral incluindo espectroscopia de infravermelhos ou Raman; e/ou um método analítico tal como CG ou HPLC acoplado a detectores adequados, espectroscopia de fluorescência e/ou um ensaio imunoabsorvente ligado a enzima.
9. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que compreende ainda, pelo menos, um de: (1) determinação se um embrião em um ovo é macho ou fêmea, e separação de uma multitude de ovos machos de uma multitude de ovos fêmeas para formar uma seleção de ovos predominantemente machos ou predominantemente fêmeas, (ii) determinação se um embrião em um ovo é macho ou fêmea, e separação de uma multitude de ovos machos de uma multitude de ovos fêmeas para formar uma seleção de ovos predominantemente machos ou predominantemente fêmeas e submeter o ovo macho ou fêmea selecionados à um processo de incubação e eclosão para formar uma população de pintos predominantemente fêmeas ou machos.
10. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que compreende (iii) determinação da etapa de desenvolvimento do embrião e o tempo até que seja provável que a eclosão ocorra, e separação dos ovos em multitude de ovos com etapa de desenvolvimento similar ou igual.
11. Processo, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que compreende ainda a submissão das seleções de ovos a um processo de incubação e eclosão em linha com a data de eclosão esperada, para formar uma população de pintos predominantemente da mesma etapa de desenvolvimento.
12. Processo, de acordo com a reivindicação 9 ou 10, caracterizado pelo fato de que compreende ainda (vi) injeção de um vírus ou material tipo vírus em cada ovo identificado como contendo um embrião vivo e macho ou fêmea, e/ou de uma certa etapa de desenvolvimento, e (vii) isolamento da vacina obtida dos ovos incubados.
13. Processo, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que a espécie de ave é Gallus gallus domesticus, e em que os marcadores do desenvolvimento são selecionados de Trimetilglicina; Aspartato e/ou Asparagina; Glutamato e/ou Glutamina, e/ou Prolina.
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| Date | Code | Title | Description |
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| B06F | Objections, documents and/or translations needed after an examination request according [chapter 6.6 patent gazette] | ||
| B06F | Objections, documents and/or translations needed after an examination request according [chapter 6.6 patent gazette] | ||
| B06I | Publication of requirement cancelled [chapter 6.9 patent gazette] |
Free format text: ANULADA A PUBLICACAO CODIGO 6.6.1 NA RPI NO 2462 DE 13/03/2018 POR TER SIDO INDEVIDA. |
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| B06U | Preliminary requirement: requests with searches performed by other patent offices: procedure suspended [chapter 6.21 patent gazette] | ||
| B25D | Requested change of name of applicant approved |
Owner name: IN OVO HOLDING B.V. (NL) |
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| B25G | Requested change of headquarter approved |
Owner name: IN OVO HOLDING B.V. (NL) |
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| B09A | Decision: intention to grant [chapter 9.1 patent gazette] | ||
| B16A | Patent or certificate of addition of invention granted [chapter 16.1 patent gazette] |
Free format text: PRAZO DE VALIDADE: 20 (VINTE) ANOS CONTADOS A PARTIR DE 30/07/2013, OBSERVADAS AS CONDICOES LEGAIS. PATENTE CONCEDIDA CONFORME ADI 5.529/DF, QUE DETERMINA A ALTERACAO DO PRAZO DE CONCESSAO. |