MX2015001297A - Determinacion de genero, viabilidad y/o etapa de desarrollo de embriones aviares in ovo. - Google Patents
Determinacion de genero, viabilidad y/o etapa de desarrollo de embriones aviares in ovo.Info
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- G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
- G01N33/6806—Determination of free amino acids
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Abstract
La presente invención se refiere a un proceso para la determinación no destructiva de género, de etapa de desarrollo y/o viabilidad de un embrión aviar en un huevo, que comprende (a) detectar por lo menos un primer compuesto marcador de desarrollo seleccionado de azúcares y/o aminoácidos, precursores y metabolitos de los mismos en un huevo en un período de tiempo desde el inicio de la incubación del huevo hasta la eclosión; (b) medir la cantidad de por lo menos un primer compuesto o marcador de desarrollo detectado, y (c) comparar la cantidad a una línea base establecida para macho y hembra, etapa de desarrollo del embrión, y/o embrión vivo y fallecido o no desarrollado, para determinar si el embrión es viable, macho y/o hembra, y/o la etapa de desarrollo del embrión.
Description
DETERMINACIÓN DE GÉNERO, VIABILIDAD Y/O ETAPA DE DESARROLLO
DE EMBRIONES AVIARES IN OVO
CAMPO DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere a un proceso para la determinación de género, etapa de desarrollo y/o viabilidad de un embrión aviar in ovo, al determinar la presencia de marcadores de desarrollo en el huevo, más específicamente en el fluido alantoideo. El presente proceso se refiere además a un proceso para la determinación de la viabilidad de un embrión aviar, y la selección de huevos machos y huevos hembras, y a la producción de vacunas y/o pollos utilizando estos huevos seleccionados.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
Los huevos fertilizados de la mayoría de especies aviares, en particular aquellas comercialmente criadas, tales como pollos domesticados (Gallus gallus domesticus) , patos, gansos y pavos tienden a dar por resultado la eclosión en una distribución aproximadamente igual de pollos machos y hembras. En el manejo del criadero, puede ser deseable separar las aves basado en varias características, en particular género. Por ejemplo puede ser deseable inocular aves machos y hembras con diferentes vacunas, o separar las
poblaciones para obtener eficiencias de alimentación, mejorar la uniformidad del procesamiento, y reducir los costos de producción donde existen diferencias en la tasa de crecimiento y requisitos nutricionales de las aves machos y hembras. Aún más, para la producción comercial de huevos, la incubación y crianza de pollos machos es sumamente indeseable, conduciendo al sacrificio selectivo de miles de millones de pollos machos cada año.
Adicionalmente, existe un porcentaje de huevos que no se fertilizan, o no comprenden un embrión viable en el comienzo del periodo de incubación, lo cual reduce en gran medida la capacidad de las incubadoras en los criaderos. Hasta ahora, la determinación de embriones viables, es decir vivos, se llevó a cabo típicamente empleando una téenica conocida como "inspección a trasluz", como por ejemplo descrita en EP-A-2369336 30 y US 7950349.
En la presente, un huevo es inspeccionado utilizando una fuente de luz que emite luz de una longitud de onda que permite pasar por lo menos en parte a través del huevo.
Aunque esto puede permitir identificar si un huevo contiene un embrión vivo, sin embargo, a fin de producir resultados confiables, requerirá que el huevo haya progresado por lo menos hasta el dia 11, o aún a una etapa posterior de su desarrollo. Adicionalmente, aunque esta técnica puede
discriminar entre huevos vivos y no vivos, no permite determinar confiablemente el género y otras características de las aves no eclosionadas.
Como resultado, se requiere una capacidad de incubación de las presentes granjas de pollos que es por lo menos dos veces tan grande como sea necesario y una selección de género temprana seria disponible, permitiendo la selección principalmente solo embriones de pollos hembras.
Por consiguiente, sería de gran valor para el medio ambiente, mediante la reducción de la cantidad de energía y de las otras fuentes requeridas, pero igualmente para la eliminación de sacrificio selectivo de pollos machos innecesario, así como la reducción de estrés para las aves recientemente eclosionadas, si un método de etapa temprana fuera disponible que permitiera determinar el género de los embriones aviares antes de la fase de incubación, y también de permitir incrementar en gran medida la capacidad de los criaderos.
Un beneficio adicional sería si el método también permitiera seleccionar embriones viables sobre los huevos no fertilizados y/o de otra manera no viables, incrementar la eficiencia del proceso de incubación adicionalmente.
Y. Feng y colaboradores describen en Appl. Magn. Reson.
(2007), 32,257-268 el análisis de metabolitos en un fluido
alantoideo de huevos de pollo en el día 9 por espectroscopia RMN en resistencia de campo súper alta de 900 MHz.
Gu D.-C. y colaboradores, Chínese Journal of Animal Science, Vol.7, 23-25 describe el análisis de presentaciones de ácido aspártico libre, ácido glutámico, arginina y leucina en los fluidos alantoideos y amnióticos durante la incubación de reproducción de huevos por HPLC. Sin embargo, el proceso descrito no va más allá de la producción de una línea base para comparación de huevos de una fecha de puesta no especificada, sino simplemente establecer una línea base para cuatro aminoácidos. Adicionalmente, el método de examinación descritos es destructivo en que los huevos con embriones vivos no se dejaron madurar para eclosionar después de la examinación, utilizados para otros propósitos, tales como producción de vacunas.
US-A-2003/0096319 y WO-A-2006124456 describen métodos para determinar el género de un embrión aviar en un huevo al determinar la presencia de un compuesto esteroide estrogénico en una muestra de fluido embriónico, tal como fluido alantoideo o sangre del huevo aviar. Mientras que esto puede ser factible sin la destrucción del huevo, las cantidades de esteroides estrogénicos son mínimas, y la prueba no sería exitosa después del desarrollo de las gónadas, por consiguiente en un punto comparativamente posterior en el
desarrollo del huevo del embrión. Todavía además, el método de WO-A-2006124456 también requeriría probablemente la modificación de marcadores de fluorescencia para cada especie y subgrupo del mismo, o la modificación genética de tal especie.
Ohta Y. y colaboradores, Poultry Science, Vol. 80, Nr. 10, 1430-1346, describe el efecto de la administración in ovo de aminoácidos, para ver como esto afecta a las concentraciones de aminoácidos de los embriones y otros contenidos de los huevos de reproducción de pollos para consumo. Esto sin embargo no es un método para determinar, el género, viabilidad y/o etapa de desarrollo de un huevo aviar.
SUMARIO DE LA INVENCIÓN
Por consiguiente, la presente invención se refiere a un proceso para la determinación de género, de etapa de desarrollo y/o viabilidad de un embrión aviar en un huevo, que comprende (a) detectar por lo menos un primer compuesto marcador de desarrollos seleccionado de azúcares y/o aminoácidos, precursores y metabolitos de los mismos en un huevo en un período de tiempo desde el inicio de la incubación del huevo hasta la eclosión; (b) medir la cantidad de por lo menos un primer compuesto o marcador de desarrollo detectado, y (c) comparar la cantidad a una línea base
establecida para macho y hembra, etapa de desarrollo del embrión, y/o embrión vivo y fallecido y no desarrollado, para determinar si el embrión es viable, macho y/o hembra, y/o la etapa de desarrollo del embrión.
En un aspecto adicional, el proceso objetivo también se refiere a un proceso para determinación de généro y/o viabilidad de un embrión aviar en un huevo, que comprende (a) detectar por lo menos un primer compuesto o desarrollo seleccionado de azúcares y/o aminoácidos, precursores y metabolitos de los mismos en un huevo en un periodo de tiempo desde el inicio de la incubación del huevo hasta la eclosión; (b) medir la cantidad de por lo menos un primer compuesto o marcador de desarrollo detectado, y (c) comparar la cantidad a una linea base establecida para macho y hembra, y/o embrión vivo y fallecido y no desarrollado, para determinar si el embrión es viable, macho y/o hembra.
En todavía un aspecto adicional, la invención objetivo se refiere a un proceso para la determinación de la etapa de desarrollo de un embrión aviar en un huevo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones previas, que comprende (a) detectar por lo menos un primer compuesto marcador de desarrollo seleccionado de aminoácidos, precursores y metabolitos de los mismos en un huevo; (b) medir la cantidad de por lo menos el primer compuesto marcador de desarrollo
detectado, y (c) comparar la cantidad a una línea base establecida para la etapa de desarrollo de la puesta hasta la eclosión, para determinar la etapa de desarrollo del embrión y el tiempo hasta que la eclosión es probable que se presente.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
La Figura 1 representa el modelado de mínimos cuadrados parcial, un análisis de datos multivariado no supervisado, para datos RMN-1!! para agrupar muestras basadas en todos los metabolitos detectados en RMN-1H de un conjunto de laboratorio de huevos de pollo. F representa hembra, M representa Macho.
La Figura 2 representa el modelado de mínimos cuadrados parciales, un análisis de datos multivariado no supervisado, para datos RMN-1H para agrupas muestras basados-en todos los metabolitos detectados en RMN-1H de un conjunto de pruebas más grande de un criadero de pollos comerciales. F representa hembra, M representa Macho.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
Ahora la presente invención se describe más completamente a partir de ahora con referencia a la figuras acompañantes, en las cuales se muestra una modalidad
preferida de la invención. La invención, sin embargo, se puede incorporar en muchas formas diferentes y no se debe considerar como limitada a las modalidades expuestas en la presente; más bien, estas modalidades se proporcionan para que esta descripción deba ser minuciosa y completa, y llevé completamente el alcance de la invención a aquellas persona experta en el campo. A menos que se defina de otra manera, todos los términos téenicos y científicos utilizados en la presente tienen el mismo significado como es entendido comúnmente por una persona de experiencia ordinaria en el campo a la cual esta invención pertenece. La terminología utilizada en la descripción de la invención en la presente es para el propósito de describir modalidades particulares solamente y no se propone para ser limitante de la invención.
Los términos "aviar" y "ave" como se utiliza en la presente, incluye machos o hembras de cualquier especie aviar, pero se proponen principalmente para abarcar aves de corral que se crían comercialmente para huevos o carne. Por consiguiente, lo términos "ave" y "aviar" se proponen particularmente para abarcar pollos, pavos, patos, gansos, codornices y faisanes.
El término "incubación" se refiere en la presente al proceso por el cual las aves eclosionan sus huevos, y al desarrollo del embrión dentro del huevo después de salir del
tracto de la gallina. El periodo de incubación en la presente se refiere al tiempo ininterrumpido durante el cual el huevo particular se somete a las condiciones que emulan el empollado hasta la eclosión, es decir el surgimiento de las aves, incluyendo cualquier manejo o transferencia de por ejemplo una incubadora a una unidad de crianza, con la condición de que el desarrollo de un ave no se detenga.
El término "in ovo" como se utiliza en la presente, se refiere a embriones de aves contenidos dentro de un huevo antes de la eclosión. La presente invención se puede practicar con cualquier tipo de huevo de ave, incluyendo, pero no limitado a, huevos de pollo (domesticados), pavo, pato, ganso, codorniz y faisán.
Los términos "inyección" y "que inyecta" abarca en la presente métodos para insertar un dispositivo (típicamente un dispositivo alargado) en un huevo o embrión, incluyendo métodos para suministrar o descargar una sustancia en un huevo o embrión, métodos para remover una sustancia (es decir, una muestra) de un huevo o embrión, y/o métodos para insertar un dispositivo detector en un huevo o embrión.
De manera preferente la determinación de acuerdo con la presente invención se lleva a cabo como un método no destructivo, es decir que permite que los embriones aviares de esta manera sometidos a prueba se desarrollen, si se desea
de esta manera, o someterlo a etapas adicionales tales como producción de vacunas in ovo, con la condición de que el embrión sea viable.
El término "fluido alantoideo" en la presente abarca fluido alantoideo con o sin la presencia de otros materiales de huevo. Por ejemplo, el término fluido alantoideo puede incluir una mezcla de sangre y fluido alantoideo. Las modalidades de la presente invención no se limitan a la extracción de material del fluido alantoideo o de áreas cerca de la superficie superior de un huevo. La remoción del material del fluido alantoideo como se describe en la presente se proporciona como simplemente un ejemplo de posibles modalidades de la presente invención. Varios materiales incluyendo pero no limitado a liquido amniótico, yema, cascarón, clara de huevo, tejido, membrana y/o sangre, se puede extraer de un huevo y somete a ensayo para identificar uno o más marcadores de desarrollo, como se describe a continuación. El material se puede extraer de huevos que tienen virtualmente cualquier orientación.
El término "ubicación predeterminada" en la presente indica una posición o profundidad fija dentro de un huevo. Por ejemplo, un dispositivo se puede inyectar e.n un huevo a una profundidad fija y/o posición fija en el huevo. En modalidades alternativas, la inyección se puede llevar a cabo
basado en la información obtenida del huevo, por ejemplo, con respecto a la posición del embrión o la cavidad sub-germinal dentro del huevo.
El término "que compara la cantidad" puede incluir ventajosamente un análisis no variado o de manera preferente multivariado de los metabolitos medidos, y una determinación de la asociación de un embrión aviar con una cierta población. La etapa puede comprender determinar la presencia de los analitos, es decir metabolitos, en el material de muestra por análisis estadístico multivariado del espectro de masa, RMN, o de otra manera datos adecuados medidos. El programa de análisis estadístico multivariado comprende de manera preferente un programa de análisis de componentes principales, y/o un programa de análisis de regresión de mínimos cuadrados parciales. La invención objetivo también se refiere de esta manera a un proceso, aparato y sistema para la determinación de género, etapa de desarrollo y/o viabilidad de un embrión aviar in ovo, que comprende un programa de análisis estadísticos multivariado, así como un proceso implementado con microprocesador para la determinación del mismo.
Los procesos y aparato de acuerdo con las modalidades de la presente invención se pueden utilizar para identificar una o más características de un huevo en cualquier momento
durante el período de desarrollo embriónico, también referido como el período de incubación del mismo. Las modalidades de la presente invención no se limitan a un día particular durante el período de desarrollo embriónico.
En el presente proceso, los marcadores de desarrollo se pueden analizar de manera preferente invasiva o no invasivamente.
Si el análisis se lleva a cabo invasivamente, esto incluye típicamente la extracción de una muestra de material de huevo. La muestra se toma de manera preferente de un fluido embriónico, de manera preferente de fluido alantoideo, puesto que esto será menos probable que dañé al embrión. El fluido alantoideo típicamente es un medio excretor para los metabolitos nitrogenosos de un embrión aviar. El fluido alantoideo comienza a formarse alrededor del día 3 de incubación, como se describe por Hamburger, V and Hamilton, HL (1951). "A series of normal stages in the development of the chick embryo". Journal of Morphology 88 (1): 49-92.
En la presente se indica que la alantoides fue distinguible a 65 horas después de la incubación, como una bolsa de pared delgada, corta; todavía no vesicular. Después de 72 horas, la alantoides fue vesicular, variable en tamaño; en el promedio del tamaño de cerebro medio, indicando que la alantoides y el fluido alantoideo están presentes a partir
del día 3.
Logra un volumen máximo en aproximadamente el día 13 de incubación y luego disminuye en volumen conforme la incubación continua debido a la pérdida de humedad y resorción de fluido, pero todavía está presente en volúmenes significativos en el día 18 de incubación.
El fluido alantoideo se separa del cascarón del huevo por las membranas del cascarón interiores y exteriores y las membranas corioalantoideas. Aunque el fluido alantoideo abarca la periferia completa de un huevo embrionario, el fluido alantoideo se acumula típicamente en la parte superior de un huevo directamente por debajo de las membranas que traslapan la celda de aire.
La acumulación del fluido alantoideo en la parte superior del huevo es debido a la gravedad y desplazamiento por el embrión y el saco vitelino denso. El intento para muestrear con precisión el fluido alantoideo a través de la parte superior de un huevo mientras que el huevo está derecho puede ser difícil debido a la variabilidad del espacio de aire de huevo a huevo. La gravedad se puede utilizar para acumular el fluido alantoideo en un sito localizado. Cundo un huevo se voltea sobre su eje longitudinal, el fluido alantoideo se acumulará en el lado superior del huevo, directamente por debajo del cascarón. La colocación del huevo
sobre su eje longitudinal hace útil el fluido alantoideo para extracción de una muestra.
La extracción del material, tal como fluido alantoideo, de los huevos se puede llevar a cabo en varias formas, incluyendo penetración del cascarón del huevo, e inserción de una cánula de muestreo a través de las membranas. Una muestra de fluido que se muestrea entonces se puede recuperar, mientras que la membrana y/o cascarón se sellan activamente con un sellante adecuado o se dejan sellar por si mismos.
Los métodos y aparato adecuados para la penetración de huevos y muestreo invasivo del material del huevo se describe por ejemplo en US-A- 20070137577, WO-A-OO/22921 o WO-A- 99/34667. De esta manera la muestra tomada entonces se somete de manera preferente a un protocolo adecuado para permitir la detección de los marcadores de desarrollo, y un análisis de las cantidades relativas y/o absolutas de los marcadores de desarrollo presentes.
La muestra se puede analizar por cualquier método adecuado para detectar y para cuantificar el marcador o marcadores de desarrollo. De manera preferente, el análisis se lleva a cabo por un método de formación de imágenes de resonancia magnética que incluye métodos de resonancia nuclear; métodos de resonancia espectral que incluyen espectroscopia infrarroja o Raman, y/o métodos analíticos
tales como GC o HPLC acoplados con detectores adecuados, espectroscopia de fluorescencia y/o ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas, incluyendo métodos húmedos y secos, tal como utilizando un método de varilla. Mientras que los métodos invasivos permiten tomar una muestra directamente, y someter el fluido muestreado a un análisis, de manera preferente el análisis se lleva a cabo no invasivamente debido a la eficiencia de tal método de análisis, y al hecho de que el cascarón del huevo y las membranas permanecen sin perforar.
Cualquier método adecuado se puede emplear para llevar a cabo tal análisis no invasivo. Típicamente, los métodos de resonancia espectral cuantitativos incluyendo espectroscopia infrarroja o Raman se pueden emplear, de manera preferente utilizando espectros secundarios para determinación de la presencia y cantidades absolutas y/o relativas de marcadores de desarrollo presentes en un huevo. Aunque varias publicaciones han descrito el uso de métodos no invasivos, por ejemplo US-A-2011/144473 y US-A-7950349, estas publicaciones solo describen vagamente los espectros de emisión completos; los cuales en la práctica no permiten seleccionar la etapa de desarrollo, la viabilidad y/o el género de un embrión. El presente proceso difiere en particular de los métodos descritos en que la presencia de
los componentes específicos en el huevo se determina, lo cual se puede hacer ventajosamente al utilizar espectros derivados secundarios que permiten buscar selectivamente las cantidades absolutas y relativas de una o más compuesto(s) marcadores de desarrollo.
En particular la espectroscopia infrarroja transformada de Fourier de segundo derivado diferencial (FTIR) y FT-Raman, o combinación de las mismas se puede emplear ventajosamente para lograr la precisión y capacidad de repetición necesarias, mientras que los métodos de resonancia magnética nuclear se puede emplear adecuadamente para determinar la naturaleza de los marcadores de desarrollo, y para establecer una línea base para calibrar el sistema.
El presente proceso permite ventajosamente determinar la viabilidad, y/o género de un embrión, y/o de manera preferente las etapas de desarrollo desde el inicio de la incubación del huevo hasta la eclosión.
De manera preferente la determinación se lleva a cabo en un período de 1 a 15 días, de manera más preferente de 2 a 14, todavía de manera más preferente de 3 a 13, y aun de manera más preferente de 4 a 12 días después de la incubación se inicia, tal como al llevar a cabo una etapa a) de manera preferente en un periodo de tiempo de 6 a 12 días después del inicio de la incubación del huevo.
Esto permite evitar los costos implicados en la incubación de huevos que ya sea no son viables y/o no son del género deseado. Adicionalmente, la etapa de desarrollo actual de un huevo se puede determinar. Para especies con tiempos de incubación más cortos o más prolongados que aquellos de pollos domesticados, otros periodos pueden aplicar, como sea adecuado.
Los marcadores de desarrollo de acuerdo con la invención objetivo se seleccionan de manera preferente de azúcares, aminoácidos, y sus metabolitos respectivos y/o precursores.
De estos, los marcadores de desarrollo de importancia particular incluyeron Glucosa, Colina y Valina, cada una de las cuales tuvo una influencia estadísticamente significativa en la determinación del género del embrión aviar.
Sin que se desee limitarse por ninguna teoría particular, la Colina y trimetilglicina, su derivado de aminoácido, se consideran que se utilizan particularmente para soportar el sistema nervioso del desarrollo del feto. Se descubrió que la relación de colina y trimetilglicina (betaína) difiere en gran medida entre los embriones machos y hembras, mientras que también las cantidades absolutas de colina son más altas en el fluido alantoideo de embriones hembras. Generalmente, la colina y sus metabolitos son necesarios para los tres propósitos fisiológicos principales:
integridad estructural y funciones de señalización para las membranas celulares, neurotransmisión colinérgica (síntesis de acetilcolina),·y una fuente principal de grupos metilo a través de su metabolito, Trimetilglicina (betaína) que participa en las rutas de síntesis de S-adenosilmetionina (SAMe). La Valina y Glucosa por otra parte también se descubrió que varían significativamente entre los embriones machos y hembras.
Donde la especie aviar es Gallus gallus domesticus , de manera preferente un primer marcador de desarrollo o adicional es glucosa en una cantidad absoluta para un embrión hembra en el intervalo de 30 pM/ml a 70 pM/ml, y para un embrión macho de 1 pM/ml a 30 pM/ml en el fluido alantoideo.
Un primer marcador de desarrollo adicional o preferido adicional para embriones de Gallus gallus domesticus es Colina, en una cantidad absoluta para un embrión hembra en el intervalo de 110 pM/ml a 130 pM/ml, y para embrión macho de 90 pM/ml hasta, pero no incluyendo 110 pM/ml, en el fluido alantoideo.
Todavía un primer marcador de desarrollo o adicional para embriones de Gallus gallus es de manera preferente Valina, en una cantidad absoluta para un embrión hembra en el intervalo de 110 mM/ml a 130 mM/ml, y para un embrión macho de 90 mM/ml hasta, pero no incluyendo 110 mM/ml, en el fluido
alantoideo.
De manera preferente, en el proceso objetivo por lo menos un segundo marcador se detecta en la etapa (a), y en donde el por lo menos un primero y segundo marcadores se analizan y se comparan con la linea base, y entre si para establecer una relación de marcador de desarrollo.
Al correlacionar el análisis de dos o tres marcadores, la selectividad de la determinación de la viabilidad y género se puede mejorar ventajosamente de manera adicional. Por consiguiente, de manera preferente por lo menos un primero y un segundo y/o marcador de desarrollo adicional se detectan y se analizan, en donde las cantidades absolutas y la relación del por lo menos un primero a segundo y/o marcadores adicionales se emplea para determinar el género y/o viabilidad.
El presente proceso comprende ventajosamente además determinar si un embrión en un huevo es viable y macho, o viable y hembra, y separar una multitud de huevos machos viables de una multitud de huevos hembras viables, para formar una selección de huevos predominantemente machos o predominantemente hembras.
Las selecciones de huevos hembras o machos viables formados de esta manera se pueden someter ventajosamente a un proceso de incubación y eclosión para formar una población de
pollos predominantemente hembras o machos.
El presente proceso comprende de manera preferente además inyectar un virus o material similar a virus en cada huevo identificado por contener un embrión vivo y macho o hembra, de manera preferente, después de la incubación comprende aislar la vacuna obtenida de los huevos incubados.
Después de la inyección con un virus sembrando, los huevos que contienen embriones vivos se transfieren de manera preferente a una incubadora por un periodo de tiempo predeterminado. Al final de este periodo de tiempo, los huevos se transfieren a una estación de recolección de vacuna donde el material de cada huevo, por ejemplo, fluido amniótico se extrae.
Por consiguiente, el presente proceso también comprende de manera preferente las etapas de sacrificar un embrión·en el huevo infectado, y recolectar el fluido amniótico de cada huevo sacrificado, en donde el fluido amniótico comprende vacuna; y de manera preferente aislar una vacuna del fluido amniótico. De manera preferente, el virus comprende virus de influenza humana, y por consiguiente el fluido amniótico recolectado comprende vacuna para la influenza humana.
Los marcadores de desarrollo de acuerdo con la invención objetivo también se pueden emplear de manera preferente para determinar la edad de un embrión, u otros marcadores se
pueden aplicar de manera adecuada.
Los marcadores de desarrollo útiles para la determinación de la edad del embrión se seleccionan de manera preferente de aminoácidos, y sus metabolitos respectivos y/o. precursores. Los solicitantes descubrieron que en partículas las cantidades absolutas y relativas de los aminoácidos, de manera más preferente Trimetilglicina, también conocida como Betaína, Aspartato y Asparagina, Glutamato y Glutamina y Prolina se podrían relacionar directamente con la etapa de desarrollo de un embrión aviar in ovo.. Esto es sumamente relevante, puesto que existen algunas características que permiten determinar la etapa de desarrollo, o edad, de un embrión aviar, en particular en etapas tempranas del desarrollo.
El presente proceso por consiguiente también permite de manera preferente seleccionar huevos de esencialmente la misma etapa de desarrollo, o edad actual, y combinar una multitud de huevos de esencialmente la misma edad, para someter los huevos a una incubación controlada. El período de incubación resultante debe ser más uniforme, dando por resultado una población de pollos más uniforme, de mayor calidad debido al estrés reducido, y reducir el número de aves eclosionadas tempranas que se someten a exposición prolongada a las condiciones de incubación artificiales.
La población de aves eclosionadas resultantes mostrará una mayor calidad, dando por resultado una mayor producción, y requisitos de seguimiento reducidos para la población de pollos, por ejemplo a través de cantidades de tratamiento reducidas.
Similarmente, el uso de poblaciones seleccionadas por edad de huevos también permitirá preparar vacunas más eficientemente, puesto que en la presente la etapa de desarrollo de un embrión aviar es relevante para el punto en el tiempo cuando se inyecta más eficientemente un virus y una vacuna se recolecta.
La presente invención también se refiere a selecciones de huevos, y después de la eclosión, a un pollo o una población de pollos obtenibles por el proceso.
EJEMPLOS
Los siguientes, ejemplos no limitantes se proporcionan para ilustrar la invención.
Ejemplo 1
Protocolo de perfil metabólico in ovo
Huevos de Gallus gallus domesticus se incubaron a 37 .8°C, volteándolos cada hora, en una incubadora modelo 50, comercialmente obtenible de MS Broedmachines V.O.F.
Un grupo de 12 huevos se incubaron durante 9 días, un segundo grupo de 12 huevos durante 10 días, y un tercer grupo de 12 huevos durante 11 días.
Los huevos se sacaron de la incubadora, se colocaron en un soporte de papel, bajo un microscopio con el saco de aire hacia arriba. El cascarón y las membranas se puncionaron y se rompieron alrededor del saco de aire, dejando las membranas interiores intactas. Utilizando luz, los vasos sanguíneos que corren sobre la membrana del cascarón interior se situaron, y se hizo una punción pequeña evitando los vasos sanguíneos, hecha a través de las membranas interiores y exteriores en la cavidad alantoica.
El huevo se inclinó y entonces se utilizó una pipeta de 1 mi para soplar aire dentro de la cavidad, después de lo cual 1.5 a 2 mi de fluido alantoideo se extrajo utilizando la pipeta. Este se transfirió en un criovial, el cual se sumergió inmediatamente en nitrógeno líquido. Las muestras luego se sacaron y se almacenaron a -80°C.
El embrión se sacó del huevo, al cortar las.membranas y al utilizar una cuchara pequeña. Se colocó en un tubo falcon rellenado con 96% de etanol y sobre hielo y se almacenó en un lugar oscuro a temperatura ambiente.
El fluido alantoideo se sacó de -80°C, se descongeló y se tomó una muestra de 1 mi y se colocó en un vial de vidrio.
1 mi de cloroformo y 1 mi de una mezcla de metanol y agua (1:1) se agregaron a la muestra, utilizando pipetas Pasteur de vidrio. Los viales se cerraron utilizando una tapa y luego se agitaron durante 20 segundos, luego se colocaron a 4°C durante 10 minutos. Utilizando una pipeta Pasteur de vidrio, 1 mi de la parte superior de la mezcla se tomó y se transfirió a un criovial. La tapa de este criovial se perforó y se secó por congelación durante la noche. Este producto secado por congelación se empleó como una muestra RMN.
Ejemplo 2
Protocolo del perfil metabólico in ovo
Huevos de Gallus gallus domesticus se incubaron a 37.8°C en un criadero comercial, volteándolos cada hora, en una incubadora industrial comercialmente disponible de Petersime NV. Un grupo de 50 huevos se incubó durante 8 dias, un segundo grupo de 50 huevos durante 9 dias, y un tercer grupo de 50 huevos durante 10 días.
Los huevos se sacaron de la incubadora, se colocaron en un soporte de plástico, bajo un microscopio con el saco de aire hacia arriba.
El cascarón y las membranas se perforaron y se rompieron alrededor del saco de aire, dejando las membranas interiores intactas. Utilizando luz, los vasos sanguíneos que corren
sobre la membrana del cascarón interior se situaron, y se hizo una punción pequeña evitando los vasos sanguíneos a través de las membranas interiores y exteriores en la cavidad alantoica.
El huevo se inclinó y una pipeta de 1 mi entonces se utilizó para soplar aire dentro de la cavidad, después de lo cual 1.5 a 2 mi de fluido alantoideo se extrajo utilizando la pipeta. Este se transfirió en un criovial, que se sumergió inmediatamente en nitrógeno líquido. Las muestras luego se sacaron y se almacenaron a -80°C.
El embrión se sacó del huevo, al cortar las membranas y al utilizar una cuchara pequeña. Se colocó en un tubo falcon rellenado con 96% de etanol y sobre hielo y se almacenó en un lugar oscuro a temperatura ambiente.
El fluido alantoideo se sacó de -80°C, se descongeló y una muestra de 0.5 mi del mismo se colocó en un criovial. La tapa de este criovial se perforó y se secó por congelación durante la noche. Este producto secado por congelación se empleó como muestra RMN.
Determinación - Verificación del Género:
El embrión de pollo se sacó del etanol y se dejó secar durante 10 minutos a temperatura ambiente. Una porción pequeña de la pata izquierda se cortó y esta se utilizó para extraer ADAN, utilizando un kit de extracción de ADN
(comercialmente obtenible como kit Qiagen DNeasy), después de lo cual la cantidad se midió utilizando un dispositivo de nanogota.
La PCR que utiliza el par de cebadores 1272H y 1237L, comercialmente disponible de Sigma, se utilizó para determinar el género del embrión. El programa PCR utilizado fue, 95°C durante 5 minutos, luego 36 veces a 95°C durante 45 segundos, 56°C durante 45 segundos, 72°C durante 1 minuto, después de lo cual una corrida se hizo a 72°C durante 5 minutos. El género del embrión se determinó basado en el producto de PCR resultante, identificado al utilizar un gel de agar al 2%.
Preparación de la Muestra de RMN
50-100 mg del material de muestra obtenido como se describe en lo anterior se sometieron a mediciones de RMN-1!!-1H-J-reseulto bidimensional (2D), utilizando ácido 3- (trimetilsilil)propiónico-2,2,3,3-d4 (TSP) como un estándar interno, como se describe en Nature Protocols, Vol.5, No.3, 2010, páginas 536-549, and Phytochemistry 71, 2010, 773-784.
Los datos obtenidos para el Ejemplo 1 se representan en la Tabla 1:
Tabla 1: Datos Medidos para Embriones Machos y Hembras
Análisis de Datos Multivariado
Un modelado de mínimos cuadrados parcial, un análisis de datos rr.ultivariados no supervisado, se empleó para los datos
RMN-1H para agrupar las muestras basado en los metabolitos detectados en RMN-1H. La formación más importante obtenida fue la correlación entre los dos conjuntos de datos, es decir las señales RMN-1H medidas (metabolitos) y la clasificación de la muestra (información del grupo).
El análisis no solo reveló las cantidades absolutas de los marcadores de desarrollo para cualquiera de los embriones machos o hembras, sino también las cantidades relativas. Cuando un segundo marcador y un tercer marcador se agregaron, respectivamente, la selectividad de la prueba se incrementó adicionalmente. Las Figuras 1 y 2 describen los resultados de un análisis multivariado del Ejemplo 1, y 2, respectivamente, y el solapamiento con la determinación del género.
Ejemplo 3
Determinación de la Edad del Embrión
El Ejemplo 1 se repitió, sin embargo analizando los siguientes marcadores de desarrollo que se descubrieron relevantes para la determinación de la etapa de desarrollo, o edad de los embriones.
Tabla 2: Datos Medidos para los Días 9 a 11
Los datos anteriores indican claramente que la etapa de desarrollo de un embrión se puede determinar de uno o más marcadores de desarrollo.
Un modelado de mínimos cuadrados parcial, un análisis de datos multivariado no supervisado, se empleó para los datos RMN-1!! para agrupar las muestras basado en todos los
metabolitos detectados en KMN-1?!. La información más importante obtenida fue la correlación entre los dos conjuntos de datos, es decir las señales. RMN-1!! medidas (metabolitos) y la clasificación de la muestra (información del grupo).
El modelo multivariado mostró la asociación entre el género, edad y/o viabilidad de un embrión y las cantidades relativas de metabolitos presentes. Utilizando métodos analíticos alternativos, tal como por ejemplo GCMS, dio resultados similares, corroborando de esta manera los resultados.
El análisis no solo reveló las cantidades absolutas de los marcadores de desarrollo para la etapa de desarrollo, sino también las cantidades relativas. Cuando se agregó un segundo, tercero y cuarto marcador, respectivamente, la selectividad de la prueba se incrementó adicionalmente.
Los ejemplos anteriores muestran claramente las ventajas del proceso y materiales de la presente invención. Aunque varias modalidades específicas de la presente invención se han descrito en la descripción detallada anterior, esta descripción no se propone para limitar la invención a la forma particular o modalidades descritas en la presente puesto que se van a reconocer como ilustrativas antes que restrictivas, y será obvio para aquellas personas expertas en el campo que la invención no se limita a los ejemplos.
Claims (34)
1. Un proceso para la determinación no destructiva de género, etapa de desarrollo y/o viabilidad de un embrión aviar en un huevo, caracterizado porque comprende (a) detectar por lo menos un primer compuesto marcador de desarrollo seleccionado de azúcares y/o aminoácidos, precursores y metabolitos de los mismos en un periodo de tiempo desde el inicio de la incubación del huevo hasta la eclosión; (b) medir la cantidad del por lo menos el primer compuesto o marcador de desarrollo detectado, y (c) comparar la cantidad a la linea base establecida para macho y hembra, etapa de desarrollo del embrión, y/o embrión vivo y fallecido o no desarrollado, para determinar si el embrión es viable, macho y/o hembra, y/o la etapa del desarrollo del embrión.
2. El proceso de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el por lo menos el primer compuesto marcador de desarrollo se detecta en un fluido embriónico de un huevo.
3. El proceso de conformidad con la reivindicación 1 o reivindicación 2, caracterizado porque el fluido embriónico es el fluido alantoideo.
4. El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, caracterizado porque el por lo menos un segundo marcador se detecta en la etapa (a), y en donde el por lo menos el primero y segundo marcadores se analizan y se comparan con la linea base, y entre sí para establecer una relación de marcador de desarrollo.
5. El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque los marcadores de desarrollo se seleccionan de Glucosa, Colina y/o Valina.
6. El proceso de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque la especie aviar es Gallus gallus domesticus, y en donde un primer marcador de desarrollo o adicional es glucosa en cantidad absoluta de un embrión hembra en el intervalo de 30 mM/ml a 70 mM/ml, y para un embrión macho de 1 mM/ml a 30 mM/ml.
7. El proceso de conformidad con la reivindicación 5 o 6, caracterizado porque un primer marcador de desarrollo o adicional es colina en una cantidad absoluta para un embrión hembra en el intervalo de 110 mM/ml a 130 mM/ml, y para un embrión macho de 90 mM/ml hasta, pero no incluyendo 110 mM/ml.
8. El proceso de conformidad con las reivindicaciones 5 a 7, caracterizado porque el primer marcador de desarrollo o adicional es Valina en una cantidad absoluta para un embrión hembra en el intervalo de 110 mM/ml a 130 mM/ml, y para un embrión macho de 90 mM/ml hasta, pero no incluyendo 110 mM/ml.
9. El proceso de conformidad con la reivindicaciones 5 a 8, caracterizado porque por lo menos un primero y un segundo marcador de desarrollo se detectan y se analizan, y en donde las cantidades absolutas y la relación del primero al segundo marcadores se emplea para determinar el género y/o viabilidad.
10. El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque comprende la etapa de analizar el fluido embriónico de manera invasiva o no de manera invasiva.
11. El proceso de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque el análisis se lleva a cabo por un método de formación de imágenes de resonancia magnética que incluye métodos de resonancia nuclear; por un método de resonancia de espectros que incluye espectroscopia infrarroja o Raman; y/o un método analítico tal como GC o HPLC acoplado con detectores adecuados, espectroscopia de fluorescencia y/o un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas.
12. El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque además comprende determinar si un embrión en un huevo es viable y macho, y viable y hembra y separar una multitud de huevos machos viables de una multitud de huevos hembras viables, para formar una selección de huevos predominantemente machos o predominantemente hembras.
13. El proceso de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque además comprende someter las selecciones de huevos hembras o machos viables a un proceso de incubación y eclosión para formar una población de pollos predominantemente machos o hembras.
14. El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque además comprende determinar la etapa de desarrollo del embrión y el tiempo hasta que la eclosión sea probable que se presente, y separar los huevos en multitudes de huevos con etapa de desarrollo similar o igual.
15. El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque además comprende determinar la viabilidad del embrión, y separar los huevos en multitudes de huevos viables y huevos no viables .
16. El proceso de conformidad con la reivindicación 12 a 15, caracterizado porque además comprende someter las selecciones de huevos viables a un proceso de incubación y eclosión en línea con los datos de incubación esperados, para formar una población de pollos de predominantemente la misma etapa de desarrollo.
17. El proceso de conformidad con la reivindicación 12 o 15, caracterizado porque además comprende inyectar un virus o material similar a virus en cada huevo identificado por contener un embrión vivo y macho o hembra, y/o de una cierta etapa de desarrollo.
18. El proceso de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque además comprende aislar la vacuna obtenida de los huevos incubados.
19. Un pollo o población de pollos, caracterizada porque es obtenible por el proceso de conformidad con la reivindicación 13 o 16.
20. El proceso para la determinación de la etapa de desarrollo de un embrión aviar en un huevo, de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones previas, caracterizado porque comprende (a) detectar por lo menos un primer compuesto marcador de desarrollo seleccionado aminoácidos, precursores y metabolitos de los mismos en un huevo; (b) medir la cantidad de por lo menos un primer compuesto o marcador de desarrollo detectado, y (c) comparar la cantidad a una linea base establecida para la etapa de desarrollo la puesta hasta la eclosión, para determinar la etapa de desarrollo del embrión y el tiempo hasta que la eclosión es probable que se presente.
21. El proceso de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque el por lo menos un segundo marcador se detecta en la etapa (a), y en donde el por lo menos primero y segundo marcadores se analizan y se comparan con la linea base, y entre si para establecer una relación de marcador de desarrollo.
22. El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 20 o 21, caracterizado porque la especie aviar es Gallus gallus domesticus, y en donde los marcadores de desarrollo se seleccionan de Trimetilglicina; Aspartato y/o Asparagina; Glutamato y/o Glutamina, y/o Prolina.
23. El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 19 a 22, caracterizado porque el por lo menos un primero y un segundo marcadores de desarrollo se detectan y se analizan, y en donde las cantidades absolutas y la relación del por lo menos primero y segundo marcadores se emplea para determinar la etapa de desarrollo .
24. El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque comprende la etapa de analizar el fluido embriónico de manera invasiva o no de manera invasiva.
25. El proceso de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado porque el análisis se lleva a cabo por un método de formación de imágenes de resonancia magnética que incluye métodos de resonancia nuclear; métodos de resonancia espectral que incluye espectroscopia infrarroja o Raman, y/o métodos analíticos tales como GC o HPLC acoplados con detectores adecuados, espectroscopia de fluorescencia y/o ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas.
26. El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque además comprende seleccionar huevos de esencialmente la misma etapa de desarrollo.
27. El proceso de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado porque además comprende someter la selección de huevos a un proceso de incubación y eclosión en línea con la etapa de desarrollo, para formar una población de pollos de esencialmente la misma edad.
28. El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 19 .a 26, caracterizado porque además comprende determinar si un embrión en un huevo es viable, y separar los huevos no viables antes de la eclosión y/o etapas de inyección de la vacuna.
29. El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque además comprende determinar si el embrión es macho, o hembra, y separar una multitud de huevos machos de una multitud de huevos hembras, para formar una selección de huevos predominantemente·machos o predominantemente hembras.
30. El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 28 o 29, caracterizado porque además comprende inyectar un virus o material similar a virus en un huevo identificado por contener un embrión vivo y macho o hembra, en linea con la etapa de desarrollo del embrión.
31. El proceso de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado porque además comprende aislar la vacuna obtenida de los huevos incubados.
32. Un pollo o una población de pollos, caracterizado porque es obtenible mediante el proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 19 a 31.
33. Una multitud de huevos, caracterizada porque es obtenible de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 12 a 15, o 25.
34. Uso de una multitud de huevos obtenibles a partir del proceso para producción de alimentación animal y/o humana, para la producción y/o aislamiento de compuestos cosméticos, médicos, y/o nutricionales, para la producción de metano a través de fermentación y/o producción de fertilizantes de alta calidad.
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