脱端基纤维蛋白原及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及蛋白质药学领域,特别是一种脱端基纤维蛋白原及其制备方法与应用。
背景技术
纤维蛋白原(Fibrinogen)又称为凝血因子I,在血浆中的含量为2~4mg/ml,其分子量为34万道尔顿,由3对多肽链组成,多肽链由二硫键连接,形成对称的二体结构,通常用(αβγ)2表示,其α链、β链和γ链分别由610个氨基酸残基、461个氨基酸残基和411个氨基酸残基组成。人纤维蛋白原3条肽链的氨基酸序列已经完成测定(R.F.Doolittle,K.W.K.Watt,1979,Nature.280(9):464~468)。
一般将纤维蛋白原的结构划分为中心区(E区)和外围区(D区),6条肽链的氨基末端(N末端)组成E区。D区和E区之间由三条肽链组成的螺旋结构连接(John W Weisel,2005,Advances in Protein Chemistry.70:247~299)见附图1。
在血液凝固的最后阶段,凝血酶(Th rombin)催化纤维蛋白原的α链和β链分别水解释放纤维蛋白肽A(FPA)和纤维蛋白肽B(FPB),从而暴露出结合位点A和B,与相邻的纤维蛋白分子上的互补位点a和b结合,形成纤维蛋白网络。
据文献研究(J Biol Chem 1993,268(18):13577~13585;Biochemistry.2007,46(31):9133-9142)纤维蛋白原α链的羧基末端(C末端)(α链392~610)与E区存在特异性作用,FPA(Fibrinopeptides A,纤维蛋白原α链N末端的16个氨基酸残基组成的多肽,其氨基酸序列为:ADSGE GDFLA EGGGV R)和FPB(Fibrinopeptides B,纤维蛋白原β链N末端的14个氨基酸残基组成的多肽,其氨基酸序列为:QGVND NEEGF FSAR)参与了二者之间的相互作用,当FPA释放后,二者的作用减弱;进一步当FPB释放后,二者的作用更加变小,从而使C末端与E区分开,C末端呈游离状态。游离的α链C末端易于形成两个相邻纤维蛋白分子间的连接。见附图2和附图3。
目前,一般采用凝血酶(包括人类和哺乳动物来源)或类凝血酶(蛇毒来源)催化水解纤维蛋白原释放FPA和/或FPB后,形成纤维蛋白交联物。由于纤维蛋白交联物为生物来源,具有生物吸收,生物相容和生物降解的优势,常用来制备生物胶,用于止血,组织填充,并且可作为缓控释制剂的包埋剂等。但现有的技术存在以下缺点:
1.纤维蛋白原溶液不稳定,需要制成冻干粉,冻干粉在使用时溶解缓慢,不利于临床应用。
2.需要与凝血酶联合应用。人们已经了解牛凝血酶可能携带牛海绵状组织脑炎病原体以及其它使哺乳动物致病的病毒,而且牛凝血酶是一种强抗原,使用牛凝血酶后会在人体引起各种免疫反应。牛凝血酶引发交叉免疫反应所产生的抗体,可能会因其削弱抗凝血酶I(AT-I)的正常抑制作用而导致血栓形成。目前市场上,牛凝血酶都混有牛凝血因子V,进入人体后可发生交叉免疫反应,所产生的免疫复合物经血循环被清除,由此可导致人凝血因子V的缺乏,并可能引起严重出血倾向(李征,1999,华西药学杂志,14(1):34~36)。有人使用猪凝血酶,但一样存在携带人畜共患病毒等可能。
3.Tisseel、BeriplastP等几家公司使用人凝血酶制剂,用人凝血酶替代牛凝血酶,但人类携带的各种病毒,例如肝炎、艾滋病等病毒将存在潜在的传播危险。
发明内容
本发明根据上述领域的缺陷及需求,提供一种不需要凝血酶就能形成纤维蛋白交联结构的脱端基纤维蛋白原。
一种脱端基纤维蛋白原(CNFg),包括α、β、γ3对肽链,其特征在于所述α链脱去了N末端1~16位中包括2D、5E、7D, 11E和/或16R在内的氨基酸残基;和/或β链脱去了N末端1~14位中包括5D、7E、8E和/或14R在内的氨基酸残基。
所述α链的N末端脱去的若干氨基酸残基包括自N末端开始的11~16个氨基酸;所述所β链的N末端脱去的若干氨基酸残基包括自N末端开始的8~14个氨基酸。上述脱端基纤维蛋白原的制备方法,指酶解纤维蛋白原;所述酶解纤维蛋白原采用的酶为氨基肽酶、胰蛋白酶法、V8蛋白酶法、凝血酶或蛇毒类凝血酶。
所述纤维蛋白原为人或哺乳动物的血液中分离获得,或基因工程方法制备而得。
所述酶解之后收集丝状纤维蛋白交联物。
所述收集之后对收集物进行纯化和干燥,所述纯化指水洗所述丝状纤维蛋白交联物。
所述酶解在25~45℃,pH7.0~8.0环境下进行,酶解时间为10分钟~4小时。
上述脱端基纤维蛋白原在制备止血制剂、组织填充物、缓释制剂中的应用。
所述制备止血制剂中的应用是指:以所述脱端基纤维蛋白原为主要成分配制成10~100mg/ml的液体制剂,pH为2.0~5.0。
所述制备缓释制剂中的应用指:将所述脱端基纤维蛋白原作为缓控释制剂的包埋剂。
本发明提供一种脱端基纤维蛋白原,不需要凝血酶参与,该脱端基纤维蛋白原分子之间 即可形成交联状分子。其原理如下:纤维蛋白原包括α、β、γ3对肽链,α链的C末端的氨基酸序列(601~610)为:KRGHA KSRPV其中有四个碱性氨基酸残基:601(K)、(602)R、(606)K、(608)R;α链的N末端的氨基酸序列(1~16)为:ADSGE GDFLA EGGGV R,其中含有四个酸性氨基酸残基2(D)、5(E)、7(D)、11(E);一个碱性氨基酸16(R)。β链的N末端的氨基酸序列(1~15)为:QGVND NEEGF FSARG,其中含有三个酸性氨基酸残基5(D)、7(E)、8(E);一个碱性氨基酸14(R)。可见,α链C末端氨基酸序列(601~610)中含有四个碱性氨基酸,不含酸性氨基酸,其在酸碱度中性条件下带正电荷。而α链N末端氨基酸序列(1~16)中含有四个酸性氨基酸和一个碱性氨基酸,其在酸碱度中性条件下带负电荷。β链N末端的氨基酸序列(1~15)中含有三个酸性氨基酸和一个碱性氨基酸,其在酸碱度中性条件下带负电荷。因此通常的纤维蛋白原α链的C末端与E区通过静电力结合在一起,进而将纤维蛋白原结合位点A、B屏蔽,使分子间不能聚合。
本发明中由于α、β链脱去了N端酸、碱性氨基酸残基,因此,α、β链的N端在PH中性条件下不再带电荷,使得α链的C端处于游离状态,而不是与纤维蛋白原的E区特异性识别及结合;α链游离状态的C端形成两个相邻纤维蛋白分子间的连接,见图2和图3,从而实现无凝血酶条件下纤维蛋白原分子的交联,节约资源,降低成本,同时避免了由凝血酶带来的不利影响。经止血试验检测见实施例7,本发明脱端基纤维蛋白原制备的止血剂,喷在手术创面上,PH中性条件下立即形成纤维蛋白交联物,见图6,本发明采用与PH8.0的TRis-HCl同时碰到创口的方法,创造pH中性环境;稳定性试验结果表明,本发明脱端基纤维蛋白原在溶液状态下,2℃~6℃,24个月内未见明显变化,说明具有良好的稳定性,见表7。
本发明还提供了上述脱端基纤维蛋白原的制备方法,主要采用限制性蛋白水解酶进行专一位点酶解或采用氨基肽酶从肽链的N末端逐个酶解,酶解的纤维蛋白原形成交联物,收集纯化交联物,冷冻干燥得到脱端基纤维蛋白原;本发明采用的酶优选氨基肽酶、胰蛋白酶法、V8蛋白酶法、凝血酶或蛇毒类凝血酶。该制备方法获得的脱端基纤维蛋白原经测定其α链和β链的N末端的1~16位氨基酸中,均不含氨基酸残基D,E或R,见实施例1~5。本发明还采用凝胶排阻高效液相色谱法比较了纤维蛋白原和制备得到的脱端基纤维蛋白原,实验数据证明制备得到的脱端基纤维蛋白原的分子量明显低于纤维蛋白原,且为单一组分,不含其他蛋白质成份如凝血酶、类凝血酶、抑肽酶、白蛋白等,见图4和图5。
本发明中用于制备脱端基纤维蛋白原的纤维蛋白原为常规产品,可为人或哺乳动物的血液分离而得,也可以是基因工程制备而得。本发明的实施例中还提供了对制备产物的收集及纯化工艺。本发明中采用酶解制备得到丝状交联的脱端基纤维蛋白原之后,收集丝状交联物, 可以是常规方法收集,本发明采用离心收集,离心过程可以将降解太严重的小分子物质或未降解的单分子纤维蛋白原留在液相中,仅仅交联状的脱端基纤维蛋白原成为离心沉淀,提高产率。
本发明的制备方法,优选对制备得到的产物中进行纯化和干燥。由于初产物中可能还含有部分单分子纤维蛋白原及酶蛋白,为了得到纯度较高的产物,本发明优选采用水洗的方法去掉这些杂质,然后进行冷冻干燥,干燥后有利于保存。
本发明的制备方法采用的酶的反应温度及所需的pH值为每种酶自身的特性决定的,本发明优选采用的这些酶的最适反应温度在25~40摄氏度之间,PH在7.0~8.0之间。而酶解所需的时间在10分钟~4小时,时间太短或太长都会导致产率太低。在这个时间段内,可以间隔一定时间收集一次得到的丝状交联物,如实施例1~5。收集后余下的原料继续进行降解反应。
本发明的脱端基纤维蛋白原,根据其自动交联的性能,可应用于制备止血制剂、组织填充物、缓释制剂中。本发明的实施例中,提供在制备止血剂和缓释剂中应用的优选方案,止血剂的优选方案中,制成的液体制剂的pH须为2.0~5.0,因为本发明的脱端基纤维蛋白原可以溶解在pH 2.0~5.0的溶液中,而在pH5.5~9.0的溶液中可自发的形成交联物。本领域技术人员可以根据制备的止血制剂的剂型要求,组织填充物所应用的组织,以及缓释剂中药物成分的不同,选择不同比例或浓度的脱端基纤维蛋白原。
附图说明
图1.纤维蛋白原的构象
图2.α链C末端与E区相互作用示意图
图3.α链C末端与E区相互作用示意图二
图4.纤维蛋白原高效液相色谱图
色谱条件见实施例6,
纤维蛋白原高效液相色谱图显示结果参数:
|
min |
mAU |
mAU*min |
% |
|
|
1 |
6.896 |
129.030 |
87.888 |
75.14 |
|
|
2 |
9.912 |
15.487 |
17.363 |
14.84 |
|
|
3 |
11.025 |
13.265 |
11.619 |
9.93 |
|
|
4 |
16.893 |
0.481 |
0.093 |
0.08 |
|
|
Total |
|
158.263 |
116.963 |
100.00 |
|
|
图5.脱端基纤维蛋白原高效液相色谱图
色谱条件见实施例6
脱端基纤维蛋白原高效液相色谱图显示结果参数:
图6.CNFg在创面上形成的纤维蛋白交联物
图7.CNFg亚基分离高效液相色谱图
色谱条件见实施例1步骤2
图8.CNFgα链反相高效液相色谱图
色谱条件见实施例1步骤2
图9.CNFgβ链反相高效液相色谱图
色谱条件见实施例1步骤2
具体实施方式
实施例1.氨基肽酶法制备脱端基纤维蛋白原
步骤1制备:纤维蛋白原溶液(50mg/ml),加入氨基肽酶500单位/ml,在pH 8.0、45℃条件下搅拌水解4小时,每30分钟离心收集一次形成的丝状纤维蛋白交联物。合并得到的纤维蛋白交联物,用水洗3次,除去氨基肽酶和未反应的纤维蛋白原,低温冷冻干燥,得到脱端基纤维蛋白原CNFg。
步骤2,检测
取步骤1制备的CNFg,加含有50mmol/L二硫苏糖醇的8mol/L脲溶液,制成10mg/ml的CNFg溶液,上TSK G-3000SWxl层析柱,采用含有0.1mol/L Na2SO4的磷酸盐缓冲液(pH6.5)进行洗脱,分别收集α链和β链组分(图7中的色谱峰1和2),对水透析后冷冻干燥,分别得到CNFg的α链和β链干粉。
取CNFg的α链干粉加水制成5mg/ml的溶液,采用高效液相色谱法进行分离,色谱条件为:
色谱柱YMC-PACK Protein-RP(150×4.6mm,5μm)。
流速为1ml/min,检测波长为214nm,进样量为20μl。
流动相A液为含0.1%三氟乙酸的水溶液,B液为含0.1%三氟乙酸的乙腈溶液,梯度见表2:
表2、梯度流脱程序
时间 |
0 |
2min |
12min |
22min |
23min |
28min |
29min |
37min |
A% |
100 |
100 |
92 |
50 |
0 |
0 |
100 |
100 |
分别收集色谱图中的组分1、2、3(见图8)进行N末端序列分析,结果见表3:
表3、CNFg的α链N末端序列分析结果
|
N末端氨基酸序列 |
α链组分1 |
GGGVR GPRVV |
α链组分2 |
GPRVVERHQS |
α链组分3 |
GVRGPVVERH |
取CNFg的β链干粉加水制成5mg/ml的溶液,采用高效液相色谱法进行分离,色谱条件同上。
分别收集色谱图中的组分1、2、3(见附图9)进行N末端序列分析,结果见表4:
表4、CNFg的β链N末端序列分析结果
|
N末端氨基酸序列 |
β链组分1 |
GHRPL DKKRE |
β链组分2 |
GFFSA RGHRP |
β链组分3 |
FSARG HRPLD |
实施例2.胰蛋白酶法制备脱端基纤维蛋白原
步骤1纤维蛋白原溶液(80mg/ml),加入胰蛋白酶0.8mg/ml,在pH 7.6、37℃条件下搅拌水解60min,每10分钟离心收集一次形成的丝状纤维蛋白交联物。合并得到的纤维蛋白交联物,用水洗3次,除去胰蛋白酶、未反应的纤维蛋白原和其他杂蛋白,低温冷冻干燥,得到脱端基纤维蛋白原.
步骤2,同实施例1,经测定其α链和β链的N末端氨基酸,均为甘氨酸(G)。
实施例3.V8蛋白酶法制备脱端基纤维蛋白原
步骤1.制备
纤维蛋白原溶液(60mg/ml),加入V8蛋白酶0.1mg/ml,在pH 8.0、25℃条件下搅拌水解80min,每16分钟离心收集一次形成的丝状纤维蛋白交联物。合并得到的纤维蛋白交联物,用水洗3次,除去V8蛋白酶、未反应的纤维蛋白原和其他杂蛋白,低温冷冻干燥,得到脱端基纤维蛋白原。
步骤2,同实施例1,测定其α链和β链的N末端氨基酸,均为甘氨酸(G)。
实施例4.凝血酶法制备脱端基纤维蛋白原
步骤1,制备
纤维蛋白原溶液(70mg/ml),加入凝血酶20单位/ml,在pH 7.5、37℃条件下搅拌反应30min,离心收集纤维蛋白交联物,用水洗3次,除去凝血酶、未反应的纤维蛋白原和其他杂蛋白,低温冷冻干燥,得到脱端基纤维蛋白原。
步骤2.同实施例1,经测定其α链和β链的N末端氨基酸,均为甘氨酸(G)。
实施例5.蛇毒类凝血酶法制备脱端基纤维蛋白原
步骤1.制备
纤维蛋白原溶液(100mg/ml),加入降纤酶10单位/ml,在pH 7.0、37℃条件下搅拌水解40min,离心收集纤维蛋白交联物,用水洗3次,除去降纤酶、未反应的纤维蛋白原和其他杂蛋白,低温冷冻干燥,得到脱端基纤维蛋白原。
步骤2.同实施例1,测定其α链和β链的N末端氨基酸,α链的N末端为甘氨酸(G),β链的N末端为谷氨酰胺(Q)。
实施例6.采用凝胶排阻高效液相色谱法比较了纤维蛋白原和实施例5制备得到的脱端基纤维蛋白原。
色谱条件如下:
流动相:0.1mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.5)含0.2mol/L氯化钠;色谱柱:TSK-Gel G3000Sw30cm*7.5mm;检测波长280nm,进样量10μl,流速0.7ml/min。
实验结果显示制备得到的脱端基纤维蛋白原的分子量明显低于纤维蛋白原,且为单一组分,不含其他蛋白质成份(如凝血酶、类凝血酶、抑肽酶、白蛋白等)见图4和图5。
实施例7、止血应用
分别取实施1~5制备得到的脱端基纤维蛋白原CNFg1克,加0.05mol/L醋酸溶液20ml(pH约为4.5),制成50mg/ml的CNFg溶液,将该溶液与0.1mol/L Tris-HCl缓冲液(pH 8.0,含40mM CaCl2)分别装入双联注射器中,喷在手术创面上,立即形成纤维蛋白交联物,其中实施例1获得的CNFg制备的止血剂效果见附图6。
实施例8、CNFg溶液稳定性
取脱端基纤维蛋白原CNFg 12克,加入0.1mol/L醋酸盐缓冲液200ml,搅拌溶解后,采用0.22μm过滤膜除菌过滤,滤液无菌分装入安瓿,每支装1ml,熔封后在2℃~6℃条件下保存,每3个月取样进行检查,结果见表5。可见溶液状态的CNFg在2℃~6℃条件下24个月内未见明显变化。
表5、CNFg溶液稳定性
实施例9脱端基纤维蛋白原在缓释制剂中的应用。
取CNFg 10克,加入0.05mol/L醋酸盐缓冲液100ml,搅拌溶解后,得到CNFg溶液(每1ml含有CNFg 100mg);取甲氨蝶呤3g,加入0.1mol/L磷酸氢二钠溶液100ml,搅拌溶解后,得到甲氨蝶呤溶液(每1ml含有甲氨蝶呤30mg);将上述CNFg溶液和甲氨蝶呤溶液等量混合,形成含有甲氨蝶呤的纤维蛋白凝胶,冷冻干燥后得到甲氨蝶呤缓释凝胶。