CN102260747B - 生物芯片上基于微乳液等温扩增的dna测序方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种生物芯片上基于微乳液等温扩增的DNA测序方法。本发明方法首先对玻片表面进行修饰，对待检测的核酸片段进行对应的醛基、氨基或链亲和素修饰；其次将修饰后的待检测的核酸片段和T7gp4引发酶混合物在微乳液中进行扩增；然后把扩增产物固定到修饰后的玻片上，为测序提供模板；最后对固定在生物芯片上的模板进行在片延伸测序。本发明把微乳液等温扩增和生物芯片技术相结合,可高通量﹑快速﹑高灵敏地对核酸进行大规模测序。
Description
技术领域
本发明是一种基于生物芯片的DNA测序方法，属于生物医学领域中的生物检测方法。
背景技术
人类全部基因序列的获得有助于认识许多遗传疾病以及癌症等疾病的致病机理，对个体进行疾病诊断、基因治疗等新方法提供理论依据。并且根据基因组的序列，可以了解每个人DNA序列的差异以及不同个体对疾病的抵抗力，针对每个人的基因序列和特点进行相应的治疗。根据基因组序列还可以预防个体可能发生的疾病，对疾病的预防诊断有较大的帮助。人类全基因组序列的获得依赖于DNA测序技术的发展，目前完成一个哺乳动物全基因组的测序大约需要上千万美元和半年时间的工作。DNA测序成本正在以每二年降低一半的速度递减，但是目前通用的DNA测序方法仍然成本较高，而且耗时较长，满足不了生命科学和医学发展的要求，同时也极大地制约了DNA测序市场的发展。人们急需发展出快速、廉价的个体化基因信息检测技术。现有的DNA各种检测主要以PCR扩增产物作为模板，耗时比较长、步骤繁琐、不能满足生命科学和医学发展的要求，同时也制约了市场的发展。人们急需发展出快速、廉价的个体化基因信息检测技术。
Li等在2008年报道了T7 gp4引发酶为基础的全基因组扩增的方式（primase-based Whole Genome
Amplification)，T7 gp4引发酶为基础的全基因组扩增的方式简单、不需要引物和变性、在37度下恒温60分钟下即可以进行（Li,Y. et al.Nucleic Acids
Research, 2008, 36, (13): e79)。这种扩增方式特别对微量的DNA扩增有较大的帮助，能短期内对全基因组进行扩增。生物芯片是一种高通量的工具，能在较小的面积上固定大量的基因序列，把T7 gp4引发酶为基础的全基因组扩增的方式和生物芯片相结合将有助于推动基因组测序的发展。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于生物芯片的测序方法，能为高通量、高灵敏性、快速地进行DNA测序。
本发明方法包括以下步骤：
1.对玻片表面进行修饰，所述的修饰包括氨基修饰、醛基修饰或生物素修饰；
2. 对待检测的核酸片段进行对应的醛基、氨基或链亲和素修饰；
3. 将修饰后的待检测的核酸片段和T7 gp4引发酶混合物在微乳液中进行扩增；
4. 把扩增产物固定到修饰后的玻片上，为测序提供模板；
5. 对固定在生物芯片上的模板进行在片延伸测序。
所述的核酸片段是脱氧核糖核酸、核糖核酸或它们的核酸序列扩增产物、克隆产物中的一种。
所述的T7 gp4引发酶混合物包括T7 gp4引发酶、缓冲液、谷氨酸、二硫苏糖醇、氯化镁、谷氨酸钾、dNTP、牛血清蛋白、T7 gp2.5、T7 DNA 聚合酶、T7测序酶。
所述的微乳液制备方法为：
油相为4.5% Span 80, 0.40% Tween
80 和 0.05% Triton X-100 其他为矿物油，液相溶液为T7 gp4引发酶混合物。液相溶液滴加到油相中，然后将油液混合物在超声波仪中超声5分钟，形成稳定的乳液。
本发明的有益效果：1.本发明把微乳液等温扩增和生物芯片技术相结合,高通量﹑快速﹑高灵敏地对核酸进行大规模测序。2.本发明这种模板制备方法,实施简单而且有效。
附图说明
图1为本发明方法示意图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明作进一步的说明。
如图1所示, 本实施例步骤如下：
1.对玻片表面进行修饰:对玻片表面进行醛基修饰，用肥皂水洗净玻片，1:1的甲醇与盐酸浸泡30分钟，双蒸水清洗后用硫酸浸泡30分钟，再用双蒸水洗净，95%乙醇清洗。对清洗后的玻片，用49:1的硅烷与95%乙醇浸泡30分钟，乙醇与双蒸水清洗吹干后，110度烘箱内烘30分钟，95%乙醇与双蒸水清洗吹干后，用戊二醛与0.01PB 4:1的比例浸泡2小时，用0.01PB清洗，用95%乙醇清洗2次，最后用双蒸水清洗4次。
2.用做测序的扩增产物的制备：通过对滚环成环序列5’-P-TAGCTAGAATCAAAAATGTTGAGTACGACGAATCTGTATGCTAATGCGGCGTGATGTATTATGCGTATAGAAATAATACAGA-3’,
5’-ACCTTTATGTCAACATTTTTGATTCTAGCTATCTGTATTATTTCACCTAGCTT-3',浓度均为10µm各4µl混合后通过变性，自然复性后成环,通过用T4 连接酶进行连接。加入0.3µl的浓度为100µm的探针5’-Acry-T（ 10 ）ATTAGCATACAGATTCGTCGTACT-3’，通过变性，自然复性后杂交上。然后分别加入100×BSA，dNTP，Bst酶，40度30小时滚环。对产物浓度进行测定，取10ng的DNA产物，加入20 µl pWGA Master Mix:
(20mM Tris–Glutamate pH 7.5, 6mM DTT,
9mM MgCl2, 100mM potassium glutamate, 550 mM of each of the four
dNTPs, 330 mM rATP, 440 mM rCTP, 0.05 mg/ml BSA, 3.6 mg T7 gp2.5, 0.047 mg
native T7 DNA polymerase, 0.47 mg T7 Sequenase, 0.45 mg T7 gp4, 25 ng
nucleotide diphosphokinase, 15 ng pyrophosphatase, 750 ng creatine kinase, and
10mM creatine phosphate in a final reaction volume of 25 ml.)(Li,Y. et
al.Nucleic Acids Research, 2008, 36, (13): e79), 在油相为4.5% Span 80, 0.40% Tween 80和 0.05% Triton X-100 其他为矿物油，液相溶液滴加到油相中，然后将油水混合物在超声波仪中超声5分钟，形成稳定的乳液(Dressman,D. et al.
Proc. Natl Acad. Sci. USA, 2003, 100, 8817-8822)，进行反应60分钟。
3.把扩增产物固定到修饰后的玻片上并进行检测：上述扩增产物用异丙醇沉淀并吹干后，固定在丙烯酰胺修饰的芯片上。用1µM Cy5-probe（5’-Cy5-GCGGCGTGATGTA）与固定的产物杂交，经扫描后，能获得清晰以及荧光强度较高的图像。对杂交后的滚环产物用淬灭剂(CuSO4）5分钟后，荧光完全淬灭（Gao, L. et al. Talanta.
2010, 81(1-2): 418-23.)。
4.在片延伸测序：对淬灭后的滚环产物进行延伸，用1×reaction buffer,0.1U/µl
Therminator DNA 聚合酶以及0.1µMCy5-dNTP混合液在65度10分钟下进行延伸。延伸碱基分别为T，T，A，T，G，C，G，T，延伸后能获得清晰的荧光图像，在这个基础上继续延伸G，C，G，T后能获得比较强的荧光图像。
Claims (1)
1.生物芯片上基于微乳液等温扩增的DNA测序方法，其特征在于该方法包括以下步骤：
步骤1.对玻片表面进行修饰，所述的修饰包括氨基修饰、醛基修饰或生物素修饰；
步骤2.对待检测的核酸片段进行对应的醛基、氨基或链亲和素修饰；
步骤3.将修饰后的待检测的核酸片段和T7 gp4引发酶混合物在微乳液中进行扩增；
步骤4.把扩增产物固定到修饰后的玻片上，为测序提供模板；
步骤5.对固定在生物芯片上的模板进行在片延伸测序；
步骤2中所述的核酸片段是脱氧核糖核酸、核糖核酸或它们的核酸序列扩增产物、克隆产物中的一种；
步骤3中所述的T7 gp4引发酶混合物包括T7 gp4引发酶、缓冲液、谷氨酸、二硫苏糖醇、氯化镁、谷氨酸钾、dNTP、牛血清蛋白、T7 gp2.5、T7 DNA 聚合酶、T7测序酶；
步骤3中所述的微乳液其制备方法为：
油相为4.5% Span 80, 0.40% Tween
80 和 0.05% Triton X-100 其他为矿物油，液相溶液为T7 gp4引发酶混合物，液相溶液滴加到油相中，然后将油液混合物在超声波仪中超声5分钟，形成稳定的乳液；
步骤5中所述的在片延伸测序，其具体是：1×reaction buffer,0.1U/µl
Therminator DNA 聚合酶以及0.1µM Cy5-dNTP混合液在65度10分钟下进行延伸。
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| Yang Li et al.Primase-based whole genome amplification.《Nucleic Acids Research》.2008,第36卷(第13期),题目、摘要、正文第2页右栏倒数第2段至第3页左栏第1段. |
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