CN102257137B - 生产β-葡聚糖酶和木聚糖酶的方法及液体培养基 - Google Patents

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Abstract

本发明解决的问题是以低成本生产具有极好的分解含有木聚糖的纤维素资源能力的纤维素酶。用于生产β-葡聚糖酶和木聚糖酶的方法包括用含有a)来源于未经历热处理也未经历碱处理的纸的纸浆作为碳源和b)氨型氮或氨基氮作为氮源的液体培养基来培养归类于木霉属的微生物的步骤。

Description

生产β-葡聚糖酶和木聚糖酶的方法及液体培养基
发明领域
本发明涉及一种生产β-葡聚糖酶和木聚糖酶的方法，及液体培养基。
背景技术
为了有效利用纤维素资源，近年来已经在探索用于有效分解纤维素的方法。纤维素在自然界中主要被微生物分解，已知各种各样的微生物如细菌和真菌产生纤维素分解酶。
这些微生物在体外分泌纤维素分解酶，纤维素通过其作用主要经纤维寡糖和纤维二糖被分解成葡萄糖。纤维素分解酶通常被称为纤维素酶。
当要想人工生产纤维素酶时，木霉属(Trichoderma)作为分泌纤维素酶的微生物已知并被广泛利用。而且，也已知使用含有营养物如碳源和氮源的培养基通过培养归类于木霉属的微生物来分泌纤维素的方法。
然而，用于生产纤维素酶的常规方法中，可作为碳源使用的物质是有限的。举例来说，结晶纤维素是昂贵的。即使有不昂贵的纤维素资源，通常它们需要预处理如热处理或碱处理，导致相对高的成本。
举例来说，专利文献1公开了一种用于产生纤维素酶的物质，其能够通过在硫酸亚铁溶液中煮沸使用过的纸来接种产生纤维素酶的微生物。另外，专利文献2公开了一种生产用于产生纤维素酶的物质的方法，所述物质能够通过用苛性碱煮沸细磨的蔗渣和用次氯酸盐溶液处理来接种里氏木霉(Trichoderma reesei)，即产生纤维素酶的微生物。
此外，通过这些常规方法获得的纤维素酶主要包含β-葡聚糖酶，具有低木聚糖酶活性并具有很差的分解含有木聚糖的纤维素资源如蔗渣和稻杆的能力。因而，它对于有效利用天然存在的各种纤维素资源目的不太有效。
专利文献3公开了一种通过使用受过初步处理如去除固体成分，浓缩不挥发组分，或高压灭菌处理浓缩物的黑麦的稀释酒精蒸馏废液培养归类在木霉属下的微生物来生产木聚糖酶的方法。
然而，在这种技术中作为碳源利用的黑麦难以获得，并且它需要复杂的预处理和导致高成本。另外，用这种方法，β-葡聚糖酶的产量甚至减少地更多。
非专利文献1显示纤维素酶的生产力在使用没有受到过预处理如热处理或碱处理的纸(报纸和文件纸)，由里氏木霉生产的酶试验中是低的。
还未知有利用未受到过热处理及碱处理的纸作为纤维素资源可以同时大量生产β-葡聚糖酶和木聚糖酶的成功例子。
[专利文献1]日本公开专利公开号2003-137901
[专利文献2]日本专利公开号H5(1993)-33984
[专利文献3]日本公开专利公开号H11(1999)-113568
[非专利文献1]应用生物化学与生物技术(Applied Biochemistry andBiotechnology)第237-245页，卷84-86，2000
发明内容
本发明要解决的问题
本发明解决上述常规问题，其目的是以低成本生产具有极好的分解含有木聚糖的纤维素资源能力的纤维素酶。
解决问题的途径
本发明提供一种生产β-葡聚糖酶和木聚糖酶的方法，所述方法包括使用包含(a)来源于没有受过热处理也没有碱处理的纸的纸浆作为碳源和(b)氨型氮或氨基氮作为氮源的液体培养基来培养归类于木霉属的微生物的步骤。
在一个实施方案中，在液体培养基中纸浆起始浓度为不低于2％W/V。
在一个实施方案中，在液体培养基中纸浆起始浓度为2-7％W/V。
在一个实施方案中，在液体培养基中氨型氮或氨基氮起始浓度为不低于50mM。
在一个实施方案中，在液体培养基中氨型氮或氨基氮起始浓度为50至660mM。
在一个实施方案中，所述纸是选自由高质量纸，木浆制纸，复印纸，报纸和纸板组成的组中的至少一种。
在一个实施方案中，归类于木霉属的微生物是里氏木霉.
在一个实施方案中，在培养过程中把纸浆加入液体培养基。
另外，本发明提供了一种包含(a)来源于没有受过热处理也没有碱处理的纸的纸浆作为碳源和(b)氨型氮或氨基氮作为氮源的液体培养基，其中所述的液体培养基用于培养归类于木霉属的微生物。
在一个实施方案中，包含不低于2％W/V的纸浆。
在一个实施方案中，包含50至660mM的氨型氮或氨基氮。
另外，本发明提供了根据上述方法中的任何一种方法生产的β-葡聚糖酶和木聚糖酶。
此外，本发明提供了一种分解或糖基化纤维素资源的方法，其特征为使用所述β-葡聚糖酶和木聚糖酶。
发明功效
在本发明中，由于未处理的纸可以作为液体培养基的碳源使用，它具有低成本和低能量及对环境具有低影响。此外，由于β-葡聚糖酶和木聚糖酶可以作为纤维素酶同时大量生产，它对含木聚糖的天然纤维素资源比如蔗渣和稻杆的糖基化极其有用。特别是，它有效用于由纤维素资源生产乙醇的生物量乙醇生产。
实现本发明的最佳实施方案
液体培养基
本发明的液体培养基是包含营养物的物质，其生长归类于木霉属的微生物。所述液体培养基在通过将以下培养基组分溶解和悬浮于100ml水而获得的液体培养基(通常称为Mandel培养基)的基础上制备，并包含作为碳源的纸浆和作为氮源的氨型氮或氨基氮。以下所示是优选培养基组分的一个例子。
含有结晶纤维素(由Fluka BioChemika生产，商品名：Avicel PH101)：1g，(NH4)2SO4：0.14g，KH2PO4：1.5g，CaCl2·2H2O：0.03g，MgSO4·7H2O：0.03g，玉米浆：2mL，吐温80：0.1mL，痕量元素溶液(H3BO46mg，(NH4)6Mo7O24·4H2O 26mg，FeCl3·6H2O 100mg，CuSO4·5H2O 40mg，MnCl2·4H2O 8mg，ZnSO4·7H2O 200mg溶液)：0.1mL，和水：100mL(用磷酸或氢氧化钠调节至pH4.8)
纸浆指用于作为原材料生产纸的纤维。纸浆的类型优选是具有高纤维素纯度的纸浆比如化学纸浆和使用过的纸浆。优选的纸浆是来源于纸的纸浆，其可以通过分裂和切割纸而获得。
优选纸的具体例子包括高质量纸，木浆制纸，复印纸，报纸，纸板等。纸可以是含有优选的纸浆的那些，也可以是已打印或已书写的纸或通常称为使用过的纸的纸。例如，也可以使用一页来自旧书，杂志和充分用旧了的笔记本，传单，信封，书写纸，明信片，面巾纸等的纸。
液体培养基中纸浆的浓度优选不低于2％W/V。当纸浆的浓度低于2％W/V时，纤维素酶，尤其是β-葡聚糖酶的生产量，可能增加不多。
液体培养基中纸浆的浓度越高，则越好。换言之，上限是可以进行搅拌和混合液体培养基的极限量。为了促进搅拌和混合液体培养基，用碎纸机切割并使用纸是优选的。例如，液体培养基中纸浆的起始浓度的上限可以是20，15或10％W/V，其取决于搅拌机的性能。通常纸浆起始浓度优选的范围是2至7％W/V并优选3至5％W/V。
氨型氮指包含在氨或由氨衍生的铵盐中的氮。此外，氨基氮指包含在胺或由胺衍生的氨基化合物中的氮。含有氨型氮或氨基氮的化合物的例子是硫酸铵，硝酸铵，磷酸氢二铵，氯化铵，氨水，尿素，氨基酸和其盐类(例如，谷氨酸钠)。
这些当中，特别优选用作本发明的液体培养基中的氮源的化合物是硫酸铵。原因是它成本低和容易获取。
液体培养基中氨型氮或氨基氮的浓度是35至660mM，以铵的摩尔数计。优选地，所述浓度是50至580mM。当浓度低于35mM时，纤维素酶，尤其是β-葡聚糖酶的生产量，可能增加不多。另外，当起始浓度超过660mM时，酶的生产力减小。此外，优选根据液体培养基中的纸浆浓度来增加或减小液体培养基中氨型氮或氨基氮的浓度，例如，当纸浆浓度是3％W/V，考虑到成本等因素时，优选的是50mM。
用于生产β-葡聚糖酶和木聚糖酶的方法
木霉属的真菌是被认为是产生纤维素糖基化所需的纤维素酶的微生物。在本发明中使用的归类于木霉属的微生物无特别限定，只要它能产生纤维素酶。归类于木霉属的优选微生物是里氏木霉或绿色木霉(Trichoderma viride)。特别优选地，所述微生物是里氏木霉。
真菌里氏木霉和绿色木霉的真菌学特性被描述在，例如，E.G.Simmons，第二届国际真菌学大会摘要(Abst.2nd International MycologicalCongress)，Tampa，Florida，U.S.，1977年8月，第618页。
常规的通气搅拌培养装置被用于液体培养，并使用以上所述的液体培养基，在培养温度为20℃至33℃，优选28℃至30℃，培养pH为4至6，培养4至10天。在培养过程中可以在液体培养基中加入纸浆。这是因为可能存在这样的情形，即由于在培养基中的纸浆随着培养进行被分解，所以纤维素酶的生产效率通过补加碳源提高。当加入纸浆时，加入的方式可以是连续的或分批的，且加入的时间与量可以调节以致即使加入纸浆后仍可能搅拌和混合。
当加入纸浆时，必要时，可以适当加入氨型氮或氨基氮。
随后，如果有必要，真菌体通过已知方法如离心和过滤从这种培养液中移出，以获得木霉属真菌的培养上清液。木霉属真菌的培养液或培养上清液含有处于高浓度的所需纤维素酶，换言之，β-葡聚糖酶和木聚糖酶。
获得的培养液或培养上清液的β-葡聚糖酶活性为不低于30U/ml，优选不低于50U/ml，更优选不低于60U/ml，和进一步优选不低于70U/ml。而且，获得的培养液或培养上清液的木聚糖酶活性为不低于25U/ml，优选不低于30U/ml，更优选不低于40U/ml，和进一步优选不低于50U/ml。当所述培养液或培养上清液的β-葡聚糖酶活性或木聚糖酶活性降低到小于上述下限时，对有效利用自然存在的各种纤维素资源的目的的影响减小。
上述的半纤维素酶活性可以，通过用燕麦斯卑尔脱小麦(oat spelt)来源的木聚糖作为底物经酶水解产生的还原糖与DNS起反应，根据在540nm吸光度的增加来定量。
更具体地，0.1ml的培养液或培养上清液加入至1.9ml的1％木聚糖底物溶液(由Sigma生产的来自燕麦斯卑尔脱小麦的木聚糖，溶解在200nM乙酸缓冲溶液(pH4.5)中)，并且酶反应在40℃准确进行10分钟。之后，4ml的DNS试剂(含有0.75％二硝基水杨酸，1.2％氢氧化钠，22.5％酒石酸钾钠四水合物，和0.3％乳糖一水合物)被加入其中并充分混合以终止反应。为了定量反应终止溶液中含有的还原糖的量，把反应终止溶液在沸水浴中精确加热15分钟。接着，反应终止溶液冷却至室温，然后确定在540nm的吸光度，以作为对应于木糖的还原糖的量来定量。1单位的半纤维素酶活性表示为这样的酶水平，其在40℃、10分钟的反应条件下1分钟产生与1μmol木糖相对应的还原糖。
用于分解或糖基化纤维素资源的方法
使用本发明的方法获得的β-葡聚糖酶和木聚糖酶有效用于分解或糖基化纤维素资源。在此所指的纤维素资源可以是合成的纤维素或天然的纤维素资源。合成的纤维素代表作为纤维素粉分布的纤维素。天然的纤维素资源包括蔗渣，稻杆，麦秆，啤酒渣滓，木材等。本发明可以同时大量生产β-葡聚糖酶和木聚糖酶，因而是极好的，特别是，对天然的纤维素资源比如蔗渣，稻杆，麦秆，和啤酒渣滓的糖基化作用。
可以使用已知的方法作为用于分解或糖基化纤维素资源的方法，并且没有特别限定。一个例子包括这样的方法，其在水性培养液中悬浮作为底物的纤维素资源，在其中加入以上所描述的培养液或培养上清液，并在搅拌或摇晃的同时加热，以进行糖基化反应。替代以上所描述的显示溶纤活性的培养液或培养上清液，可以使用其干物质或通过在水中分散或溶解所述干物质而获得的溶液。
优选的是，纤维素原材料被初步脱木质化。反应条件比如悬浮方法，搅拌方法，加入上述混合溶液的方法，加入的顺序及其浓度适当调整以致以较高产率获得葡萄糖。
反应溶液当时的pH和温度应该在酶不被灭活的范围内，通常在常压下进行反应时，温度应该在30至70℃范围内且pH应该在3至7范围内。此外，尽管压力，温度和pH也适当调节以致如上所述以较高产率获得葡萄糖，优选的是在常压下，温度在50℃至60℃范围内和pH在4至6范围内，在乙酸-或磷酸盐-缓冲溶液中进行。反应时间通常是6至147小时，优选的是24至72小时。
含有葡萄糖的水溶液通过纤维素的糖基化获得。获得的水溶液必要时可以进行纯化处理如脱色，脱盐及酶去除。纯化方法没有特别限定，只要它是已知的方法，举例来说，可以使用活性炭处理，离子-交换树脂处理，层析处理，过滤处理如微量过滤，超滤和逆向渗透过滤，结晶化处理等，这些方法可以单独使用或以2种或更多种组合使用。
经以上方法纯化的主要由葡萄糖组成的水溶液可以照现有的样子使用，并且在必要时，可以通过干燥被固化。干燥方法没有特别限定，只要它是已知的方法，举例来说，可以使用喷雾干燥，冷冻干燥，转鼓式干燥，薄膜干燥法，盘式干燥，气流干燥，真空干燥等，这些方法可以单独使用或以2种或更多种组合使用。
实施例
在下文中，将参考实施例对本发明作更具体描述，但是本发明不仅限于这些实施例。
实施例1
里氏木霉QM9414(NBRC 31329)在马铃薯葡萄糖琼脂培养基上在28℃培养7天，以充分形成孢子。用3％的复印纸(3g/100ml)替代作为Mandel培养基碳源的结晶纤维素，并加入作为氮源的硫酸铵，以致氨型氮的摩尔浓度分别变为15mM，35mM，50mM，65mM，80mM，100mM或115mM，并用磷酸和氢氧化钠调节至pH 4.8，以在带挡板的500-ml容积锥形瓶(Erlenmeyer flask)内制备100ml的液体培养基。一菌环量的培养的里氏木霉接种在此液体培养基中并在28℃，180rpm摇晃培养7天。第7天把培养液离心，并确定上清液中的β-葡聚糖酶活性和木聚糖酶活性。复印纸未接受预处理比如碱处理或热处理，只用碎纸机(CARL的desk purser DS-4100)切割至2mmx7mm并使用。
(酶活性的测定)
测定上述获得的培养液的酶活性
对于β-葡聚糖酶活性，使用Megazyme生产的β-葡聚糖酶测定试剂盒来测定通过使用染料标记的β-葡聚糖作为底物的酶分解产生的染色片段的吸光度。具体来说，把0.1ml的培养液加入至0.1ml的偶氮-大麦葡聚糖底物溶液，酶反应在40℃准确进行10分钟。此后，把0.6ml的终止溶液[含有4％乙酸钠，0.4％乙酸锌和80％甲基溶纤剂(pH5)]加入其中并搁置5分钟以终止反应。接着，把溶液离心，随后测定上清液在590nm的吸光度。1单位的β-葡聚糖酶活性表示为这样的酶水平，其在40℃、10分钟的反应条件下1分钟产生与1μmol的葡萄糖相对应的还原糖。
接下来，木聚糖酶活性通过用燕麦斯卑尔脱小麦来源的木聚糖作为底物经酶水解产生的还原糖与DNS起反应引起的540nm处吸光度的增加来定量。更具体地，把0.1ml的培养液加入至1.9ml的1％木聚糖底物溶液[由Sigma生产的来自燕麦斯卑尔脱小麦的木聚糖，溶解在200mM乙酸缓冲溶液(pH4.5)中]，并且酶反应在40℃准确进行10分钟。此后，4ml的DNS试剂(含有0.75％二硝基水杨酸，1.2％氢氧化钠，22.5％酒石酸钾钠四水合物，和0.3％乳糖一水合物)被加入其中并充分混合，以终止反应。为了定量在反应终止溶液中含有的还原糖的量，把反应终止溶液在沸水浴中精确加热15分钟。接着，反应终止溶液冷却至室温，然后确定在540nm的吸光度，以作为对应于木糖的还原糖的量来定量。1单位的木聚糖酶活性表示为这样的酶水平，其在40℃、10分钟的反应条件下1分钟生产与1μmol的木糖相对应的还原糖。结果在图1中显示。
实施例2
根据与实施例1中相同的方法，使用3％的纸板(3g/100ml)代替作为Mandel培养基碳源的结晶纤维素，来制备液体培养基。里氏木霉QM9414(NBRC 31329)在马铃薯葡萄糖琼脂培养基上在28℃培养7天，以充分形成孢子，并将其一菌环量接种在液体培养基内并在28℃，180rpm摇晃培养7天。第7天把培养液离心，用与实施例1中相同的方法测定β-葡聚糖酶活性和木聚糖酶活性。结果在图2中显示。
实施例3
根据与实施例1中相同的方法，使用3％的报纸(3g/100ml)代替作为Mandel培养基碳源的结晶纤维素，来制备液体培养基。里氏木霉QM9414(NBRC 31329)在马铃薯葡萄糖琼脂培养基上在28℃培养7天，以充分形成孢子，并将其一菌环量接种在液体培养基内并在28℃，180rpm摇晃培养7天。第7天把培养液离心，用与实施例1中相同的方法测定β-葡聚糖酶活性和木聚糖酶活性。结果在图3中显示。
实施例4
根据与实施例1中相同的方法，使用3％的复印纸(3g/100ml)代替作为Mandel培养基碳源的结晶纤维素，并加入氯化铵代替作为氮源的硫酸铵，以致氨型氮的摩尔浓度分别变为20mM，40mM，50mM，60mM，80mM，100mM或120mM，以制备液体培养基。里氏木霉QM9414(NBRC31329)在马铃薯葡萄糖琼脂培养基上在28℃培养7天，以充分形成孢子，并将其一菌环量接种在液体培养基内并在28℃，180rpm摇晃培养7天。第7天把培养液离心，用与实施例1中相同的方法测定β-葡聚糖酶活性和木聚糖酶活性。结果在图4中显示。
实施例5
根据与实施例1中相同的方法，使用3％的复印纸(3g/100ml)代替作为Mandel培养基碳源的结晶纤维素，和加入磷酸氢二铵代替作为氮源的硫酸铵，以致氨型氮的摩尔浓度分别变为15mM，35mM，50mM，65mM，80mM，100mM或115mM，以制备液体培养基。里氏木霉QM9414(NBRC31329)在马铃薯葡萄糖琼脂培养基上在28℃培养7天，以充分形成孢子，并将其一菌环量接种在液体培养基内并在28℃，180rpm摇晃培养7天。第7天把培养液离心，用与实施例1中相同的方法测定β-葡聚糖酶活性和木聚糖酶活性。结果在图5中显示。
实施例6
根据与实施例1中相同的方法，使用3％的复印纸(3g/100ml)代替作为Mandel培养基碳源的结晶纤维素，和加入硝酸铵代替作为氮源的硫酸铵，以致氨型氮的摩尔浓度分别变为12mM，24mM，36mM，48mM，60mM，72mM或84mM，以制备液体培养基。里氏木霉QM9414(NBRC31329)在马铃薯葡萄糖琼脂培养基上在28℃培养7天，以充分形成孢子，并将其一菌环量接种在液体培养基内并在28℃，180rpm摇晃培养7天。第7天把培养液离心，用与实施例1中相同的方法测定β-葡聚糖酶活性和木聚糖酶活性。结果在图6中显示。
实施例7
根据与实施例1中相同的方法，使用3％的复印纸(3g/100ml)代替作为Mandel培养基碳源的结晶纤维素，和加入氨水代替作为氮源的硫酸铵，以致其摩尔浓度分别变为15mM，30mM，45mM，65mM，75mM，90mM或105mM，以制备液体培养基。里氏木霉QM9414(NBRC 31329)在马铃薯葡萄糖琼脂培养基上在28℃培养7天，以充分形成孢子，并将其一菌环量接种在液体培养基内并在28℃，180rpm摇晃培养7天。第7天把培养液离心，用与实施例1中相同的方法测定β-葡聚糖酶活性和木聚糖酶活性。结果在图7中显示。
实施例8
根据与实施例1中相同的方法，使用3％的复印纸(3g/100ml)代替作为Mandel培养基碳源的结晶纤维素，和加入尿素代替作为氮源的硫酸铵，以致氨型氮的摩尔浓度分别变为17mM，33mM，50mM，67mM，83mM或100mM，以制备液体培养基。里氏木霉QM9414(NBRC 31329)在马铃薯葡萄糖琼脂培养基上在28℃培养7天，以充分形成孢子，并将其一菌环量接种在液体培养基内并在28℃，180rpm摇晃培养7天。第7天把培养液离心，用与实施例1中相同的方法测定β-葡聚糖酶活性和木聚糖酶活性。结果在图8中显示。
实施例9
根据与实施例1中相同的方法，加入复印纸代替作为Mandel培养基碳源的结晶纤维素，以致其浓度变为1％，2％，3％，4％，5％，6％，或7％，并加入作为氮源的硫酸铵，以致氨型氮的摩尔浓度变为80mM，以制备液体培养基。里氏木霉QM9414(NBRC 31329)在马铃薯葡萄糖琼脂培养基上在28℃培养7天，以充分形成孢子，并将其一菌环量接种在液体培养基内并在28℃，180rpm摇晃培养7天。第7天把培养液离心，用与实施例1中相同的方法测定β-葡聚糖酶活性和木聚糖酶活性。结果在图9中显示。
实施例10
根据与实施例1中相同的方法，加入复印纸代替作为Mandel培养基碳源的结晶纤维素，以致其浓度变为1％，2％，3％，4％，5％，6％，或7％，并加入作为氮源的硫酸铵，以致氨型氮的摩尔浓度变为160mM，以制备液体培养基。里氏木霉QM9414(NBRC 31329)在马铃薯葡萄糖琼脂培养基上在28℃培养7天，以充分形成孢子，并将其一菌环量接种在液体培养基内并在28℃，180rpm摇晃培养7天。第7天把培养液离心，用与实施例1中相同的方法测定β-葡聚糖酶活性和木聚糖酶活性。结果在图10中显示。
实施例11
根据与实施例1中相同的方法，加入复印纸代替作为Mandel培养基碳源的结晶纤维素，以致其浓度变为1％，2％，3％，4％，5％，6％，或7％，并加入作为氮源的硫酸铵，以致氨型氮的摩尔浓度变为320mM，以制备液体培养基。里氏木霉QM9414(NBRC 31329)在马铃薯葡萄糖琼脂培养基上在28℃培养7天，以充分形成孢子，并将其一菌环量接种在液体培养基内并在28℃，180rpm摇晃培养7天。第7天把培养液离心，用与实施例1中相同的方法测定β-葡聚糖酶活性和木聚糖酶活性。结果在图11中显示。
实施例12
根据与实施例1中相同的方法，加入复印纸代替作为Mandel培养基碳源的结晶纤维素，以致其浓度变为1％，2％，3％，4％，5％，6％，或7％，并加入作为氮源的硫酸铵，以致氨型氮的摩尔浓度变为480mM，以制备液体培养基。里氏木霉QM9414(NBRC 31329)在马铃薯葡萄糖琼脂培养基上在28℃培养7天，以充分形成孢子，并将其一菌环量接种在液体培养基内并在28℃，180rpm摇晃培养7天。第7天把培养液离心，用与实施例1中相同的方法测定β-葡聚糖酶活性和木聚糖酶活性。结果在图12中显示。
参考实施例1
根据与实施例1中相同的方法，把作为Mandel培养基碳源的结晶纤维素的浓度调节到1％，并加入作为氮源的硫酸铵，以致氨型氮的摩尔浓度分别变为15mM，35mM，50mM，65mM，80mM，100mM或115mM，以制备液体培养基。里氏木霉QM9414(NBRC 31329)在马铃薯葡萄糖琼脂培养基上在28℃培养7天，以充分形成孢子，并将其一菌环量接种在液体培养基内并在28℃，180rpm摇晃培养7天。第7天把培养液离心，用与实施例1中相同的方法测定β-葡聚糖酶活性和木聚糖酶活性。结果在图13中显示。
参考实施例2
根据与实施例1中相同的方法，加入作为Mandel培养基碳源的结晶纤维素，以致其浓度变为1％，1.5％，2％，2.5％，3％，3.5％，或4％，，并加入作为氮源的硫酸铵，以致氨型氮的摩尔浓度变为160mM，以制备液体培养基。里氏木霉QM9414(NBRC 31329)在马铃薯葡萄糖琼脂培养基上在28℃培养7天，以充分形成孢子，并将其一菌环量接种在液体培养基内并在28℃，180rpm摇晃培养7天。第7天把培养液离心，用与实施例1中相同的方法测定β-葡聚糖酶活性和木聚糖酶活性。结果在图14中显示。
参考实施例3
根据与实施例1中相同的方法，加入1％的复印纸(3g/100ml)代替作为Mandel培养基碳源的结晶纤维素，并加入作为氮源的硫酸铵，以致氨型氮的摩尔浓度分别变为15mM，35mM，50mM，65mM，80mM，100mM或115mM，以制备液体培养基。里氏木霉QM9414(NBRC 31329)在马铃薯葡萄糖琼脂培养基上在28℃培养7天，以充分形成孢子，并将其一菌环量接种在液体培养基内并在28℃，180rpm摇晃培养7天。第7天把培养液离心，用与实施例1中相同的方法测定β-葡聚糖酶活性和木聚糖酶活性。结果在图15中显示。
参考实施例4
根据与实施例1中相同的方法，加入3％的复印纸(3g/100ml)代替作为Mandel培养基碳源的结晶纤维素，并加入硝酸钾代替作为氮源的硫酸铵，以致氨型氮的摩尔浓度分别变为10mM，20mM，30mM，40mM，50mM，60mM或70mM，以制备液体培养基。里氏木霉QM9414(NBRC31329)在马铃薯葡萄糖琼脂培养基上在28℃培养7天，以充分形成孢子，并将其一菌环量接种在液体培养基内并在28℃，180rpm摇晃培养7天。第7天把培养液离心，用与实施例1中相同的方法测定β-葡聚糖酶活性和木聚糖酶活性。结果在图16中显示。
实施例13
里氏木霉QM9414(NBRC 31329)在马铃薯葡萄糖琼脂培养基上在28℃培养7天，以充分形成孢子。将其一菌环量接种在含有100ml的Mandel培养基的带挡板的500-ml容积锥形瓶内，并在28℃，180rpm摇晃培养4天。将其接种在含有150ml的Mandel培养基的带挡板的500-ml容积锥形瓶内，并在28℃，180rpm摇晃培养2天，以获得的培养液。将3L的培养基(其通过加入3％(30g/l)，6％(60g/l)的复印纸或3％的结晶纤维素(AvicelPH101)替代作为Mandel培养基碳源的结晶纤维素，加入作为氮源的硫酸铵，以致氨型氮的摩尔浓度变为200mM，并使用6g/l的Adekanol LG 126(由ADEKA公司生产)替代吐温80而获得)和所述培养液加入至5-L发酵罐(由B.E MARUBISHI有限公司生产)，并将混合物在28℃培养。其在1VVM通气和在450rpm搅拌条件下进行，并用2N氢氧化钠和5-倍稀释的磷酸调节pH使在培养期间持续保持pH4.8。第7天把培养液离心，测定上清液的β-葡聚糖酶活性和木聚糖酶活性。结果在图17中显示。
使用用碎纸机(由Meikoshokai公司生产的Primo 1400)切割成4mmx30mm的复印纸。另外，6％的复印纸(60g/l)一次性全部加入，搅拌变得不充分，因此在培养的第1天和第3天把复印纸和硫酸铵按对半加入。
实施例14
根据与实施例13中相同的方法，把6％的复印纸(60g/l)加入5-L发酵罐中，加入硫酸铵以致氨型氮的摩尔浓度变为44mM，100mM，134mM，或224mM，及测定酶生产量。结果在图18中显示.
实施例15
根据与实施例13中相同的方法，将6％的复印纸(60g/l)和硫酸铵加入5-L发酵罐中以致氨型氮的摩尔浓度变为45mM，并在培养期间使用2N氢氧化钠作为调节pH的化学物的情形和使用18％氨水的情形之间比较酶生产量。在当时培养期间氨水输入量为123mM。结果在图19中显示。
实施例16
根据与实施例1中相同的方法，使用3％的复印纸(3g/100ml)代替作为Mandel培养基碳源的结晶纤维素，并加入作为氮源的硫酸铵，以致氨型氮的摩尔浓度分别变为330mM，420mM，500mM，580mM，660mM，720mM或800mM，以制备液体培养基。里氏木霉QM9414(NBRC 31329)在马铃薯葡萄糖琼脂培养基上在28℃培养7天，以充分形成孢子，并将其一菌环量接种在液体培养基内并在28℃，180rpm摇晃培养7天。第7天把培养液离心，用与实施例1中相同的方法测定β-葡聚糖酶活性和木聚糖酶活性。结果在图20中显示。
实施例17
根据与实施例1中相同的方法，使用3％的复印纸(3g/100ml)代替作为Mandel培养基碳源的结晶纤维素，并加入谷氨酸钠代替作为氮源的硫酸铵，以致氨基氮的摩尔浓度分别变为17mM，33mM，50mM，67mM，83mM或100mM，来制备液体培养基。里氏木霉QM9414(NBRC 31329)在马铃薯葡萄糖琼脂培养基上在28℃培养7天，以充分形成孢子，并将其一菌环量接种在液体培养基内并在28℃，180rpm摇晃培养7天。第7天把培养液离心，用与实施例1中相同的方法测定β-葡聚糖酶活性和木聚糖酶活性。结果在图21中显示。
实施例18
使用在实施例13中获得的含有6％复印纸的培养基和含有3％结晶纤维素的培养基的每一种上清液进行纤维素资源的糖基化测验。作为经历了糖基化的纤维素资源，使用纤维素粉(由NIPPON PAPER CHEMICALSCO.，LTD.生产，商品名KC FLOCK W-50)，蔗渣，稻杆和啤酒渣滓。蔗渣，稻杆和啤酒渣滓各自被细磨，悬浮于0.3N NaOH，在120℃处理15分钟，用水充分洗涤，接着被干燥，进行脱木质化处理并进行糖基化处理。纤维素粉直接进行糖基化。一种包含纤维素资源：0.8g，培养上清液：9ml，和1M乙酸缓冲液(pH4.8)：0.2ml的溶液(8％纤维素资源溶液)在50℃，pH 4.8被摇晃48小时以进行糖基化，产生的葡萄糖由葡萄糖CII-测试Wako(Glucose CII-Test Wako)(Wako Pure Chemicals)确定。结果在图22至图25中显示。
实施例和参考实施例的结果显示通过使用含有未被处理的纸作为碳源和含有氨/铵盐作为氮源的培养基培养里氏木霉，以高产率同时生产β-葡聚糖酶和木聚糖酶。还显示培养基中纸的浓度增加到高于通常使用的碳源浓度的水平，或培养基中氨/铵盐的浓度调节到特定范围以显著增加纤维素酶的产量。还显示通过使用产生的培养上清液可以分解和糖基化不同的纤维素资源。
工业实用性
极度有效用于，特别是，糖基化天然的纤维素资源比如蔗渣和稻杆的β-葡聚糖酶和木聚糖酶可以同时被大量生产，并可以用于从纤维资源生产乙醇的生物量乙醇生产。
附图说明
[图1]显示培养上清液酶活性针对含有3％复印纸的培养基中硫酸铵浓度的变化的图。
[图2]显示培养上清液酶活性针对含有3％纸板的培养基中硫酸铵浓度的变化的图。
[图3]显示培养上清液酶活性针对含有3％报纸的培养基中硫酸铵浓度的变化的图。
[图4]显示培养上清液酶活性针对含有3％复印纸的培养基中氯化铵浓度的变化的图。
[图5]显示培养上清液酶活性针对含有3％复印纸的培养基中磷酸氢二铵浓度的变化的图。
[图6]显示培养上清液酶活性针对含有3％复印纸的培养基中硝酸铵浓度的变化的图。
[图7]显示培养上清液酶活性针对含有3％复印纸的培养基中氨浓度的变化的图。
[图8]显示培养上清液酶活性针对含有3％复印纸的培养基中尿素浓度的变化的图。
[图9]显示培养上清液酶活性针对含有80mM硫酸铵的培养基中复印纸浓度的变化的图。
[图10]显示培养上清液酶活性针对含有160mM硫酸铵的培养基中复印纸浓度的变化的图。
[图11]显示培养上清液酶活性针对含有320mM硫酸铵的培养基中复印纸浓度的变化的图。
[图12]显示培养上清液酶活性针对含有480mM硫酸铵的培养基中复印纸浓度的变化的图。
[图13]显示培养上清液酶活性针对含有1％ Avicel的培养基中硫酸铵浓度的变化的图。
[图14]显示培养上清液酶活性针对含有160mM硫酸铵的培养基中Avicel浓度的变化的图。
[图15]显示培养上清液酶活性针对含有1％复印纸的培养基中硫酸铵浓度的变化的图。
[图16]显示培养上清液酶活性针对含有3％复印纸的培养基中硝酸钾浓度的变化的图。
[图17]显示培养上清液酶活性针对含有200mM硫酸铵的培养基中碳源类型的变化的图。
[图18]显示培养上清液酶活性针对含6％使用过的复印纸的培养基中硫酸铵浓度的变化的图。
[图19]显示培养上清液酶活性针对用于调节含有6％使用过的复印纸和45mM硫酸铵的培养基中pH的化学物类型的变化的图。
[图20]显示培养上清液酶活性针对含有3％复印纸的培养基中硫酸铵浓度的变化的图。
[图21]显示培养上清液酶活性针对含有3％复印纸的培养基中谷氨酸钠浓度的变化的图。
[图22]比较当使用在实施例13中获得的含有6％复印纸的培养基和含有3％结晶纤维素的培养基的每一种上清液糖基化蔗渣时产生的葡萄糖浓度的图。
[图23]比较当使用在实施例13中获得的含有6％复印纸的培养基和含有3％结晶纤维素的培养基的每一种上清液糖基化稻杆时产生的葡萄糖浓度的图。
[图24]比较当使用在实施例13中获得的含有6％复印纸的培养基和含有3％结晶纤维素的培养基的每一种上清液糖基化啤酒渣滓时产生的葡萄糖浓度的图。
[图25]比较当使用在实施例13中获得的含有6％复印纸的培养基和含有3％结晶纤维素的培养基的每一种上清液糖基化纤维素粉时产生的葡萄糖浓度的图。

Claims (8)

1.一种用于生产β-葡聚糖酶和木聚糖酶的方法，所述方法包括用含有a)来源于未经历热处理也未经历碱处理的纸的纸浆作为碳源和b)氨型氮或氨基氮作为氮源的液体培养基来培养里氏木霉(Trichoderma reesei)的步骤，其中所述的液体培养基中纸浆的浓度为3-20％W/V，其中所述液体培养基中氨型氮或氨基氮的浓度是50mM-660mM，其中获得的培养液或培养上清液的β-葡聚糖酶活性为不低于30U/ml，并且获得的培养液或培养上清液的木聚糖酶活性为不低于25U/ml，其中氨型氮指包含在氨或由氨衍生的铵盐中的氮，氨基氮指包含在胺或由胺衍生的氨基化合物中的氮。
2.根据权利要求1所述的生产β-葡聚糖酶和木聚糖酶的方法，其中所述的液体培养基中纸浆的起始浓度为3-7％W/V。
3.根据权利要求1至2中任何一项所述的生产β-葡聚糖酶和木聚糖酶的方法，其中所述的纸是木浆制纸。
4.根据权利要求1至2中任何一项所述的生产β-葡聚糖酶和木聚糖酶的方法，其中所述的纸是复印纸。
5.根据权利要求1至2中任何一项所述的生产β-葡聚糖酶和木聚糖酶的方法，其中所述的纸是报纸。
6.根据权利要求1至2中任何一项所述的生产β-葡聚糖酶和木聚糖酶的方法，其中所述的纸是纸板。
7.根据权利要求1或2所述的生产β-葡聚糖酶和木聚糖酶的方法，其中在培养过程中向所述的液体培养基加入所述纸浆。
8.一种液体培养基，其包含a)来源于未经历热处理也未经历碱处理的纸的纸浆作为碳源和b)氨型氮或氨基氮作为氮源，其中所述的液体培养基用于培养里氏木霉，其中所述的液体培养基中纸浆的浓度为3-20％W/V，其中所述液体培养基中氨型氮或氨基氮的浓度是50mM-660mM，其中氨型氮指包含在氨或由氨衍生的铵盐中的氮，氨基氮指包含在胺或由胺衍生的氨基化合物中的氮。
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