BRPI0823296B1

BRPI0823296B1 - Método para produzir beta-glucanase e xilanase, e, meio de cultura líquido

Info

Publication number: BRPI0823296B1
Application number: BRPI0823296-2A
Authority: BR
Inventors: Fukuda Kazuro
Original assignee: Asahi Group Holdings, Ltd.
Priority date: 2008-12-17
Filing date: 2008-12-17
Publication date: 2018-04-17
Also published as: CN102257137B; BRPI0823296A2; ES2568269T3; US20110244527A1; JPWO2010070748A1; CA2747201A1; EP2360245A1; DK2360245T3; CA2747201C; AU2008365468A1; AU2008365468B2; CN102257137A; EP2360245B1; US8999693B2; JP4343266B1; EP2360245A4; WO2010070748A1

Description

(54) Título: MÉTODO PARA PRODUZIR BETA-GLUCANASE E XILANASE, E, MEIO DE CULTURA LÍQUIDO (51) Int.CI.: C12N 9/24; C12N 1/00; C12P 19/00 (73) Titular(es): ASAHI GROUP HOLDINGS, LTD.

(72) Inventor(es): KAZURO FUKUDA “MÉTODO PARA PRODUZIR BETA-GLUCANASE E XILANASE, E, MEIO DE CULTURA LÍQUIDO”

CAMPO TÉCNICO

A presente invenção diz respeito a um método para produzir β5 glucanase e xilanase, e um meio de cultura líquido.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

A fim de utilizar eficientemente os recursos celulósicos, um método para decompor de maneira eficiente a celulose foi explorado nos últimos anos. A celulose é decomposta principalmente por microrganismo na natureza e sabe-se que vários microrganismos, tais como bactérias e fungos, produzem enzimas celulósicas.

Estes microrganismos secretam as enzimas celulósicas fora do corpo, e a celulose é decomposta por sua ação na glicose principalmente por meio de celo-oligossacarídeo e celobiose. As enzimas celulósicas são denominadas em geral como celulase.

Quando a celulase é pretendida para ser produzida artificialmente, o gênero Trichoderma é conhecido como um microrganismo que secreta celulase e é amplamente utilizado. Além disso, também é conhecido um método para secretar a celulase cultivando os microrganismos classificados no gênero Trichoderma usando um meio de cultura contendo nutrientes, tais como fontes de carbono e fontes de nitrogênio.

Entretanto, no método convencional para produzir celulase, os materiais usados como uma fonte de carbono são limitados. Por exemplo, as celuloses cristalinas são caras. Mesmo se existirem recursos celulósicos que não são caros, eles exigem em geral pré-tratamentos, tal como tratamento térmico ou tratamento alcalino, e resultam em custos relativamente altos.

Por exemplo, a literatura da patente 1 descreve um substrato

Petição 870180012606, de 16/02/2018, pág. 14/24 para produzir celulase, capaz de inocular microrganismos produtores de celulase, fervendo papel usado em uma solução de sulfato ferroso. Além do mais, a literatura da patente 2 descreve um método para produzir um substrato para produzir celulase capaz de inocular Trichoderma reesei, que são microrganismos produtores de celulase, fervendo bagaço finamente moído com álcali cáustico e tratando com uma solução de hipoclorito.

Além do mais, a celulase obtida por estes métodos convencionais contém principalmente B-glucanase, que apresenta pouca atividade de xilanase e apresenta pouca capacidade de decompor um recurso celulósico contendo xilano, tais como bagaço e palha de arroz. Portanto, é menos eficiente com o propósito de utilizar de maneira eficiente vários recursos celulósicos de ocorrência natural.

A literatura da patente 3 descreve um método para produzir xilanase cultivando um microrganismo classificado no gênero Trichoderma usando um fluido residual alcoólico diluído de destilação de centeio, submetido ao tratamento preliminar, tal como a remoção de constituintes sólidos, a concentração de componentes não voláteis ou tratamento por autoclave do concentrado.

Entretanto, o centeio usado como uma fonte de carbono nesta tecnologia é difícil de se obter, e exige pré-tratamento complicado e gera alto custo. Além do mais, a quantidade de produção de B-glucanase diminui ainda mais neste método.

A literatura não associada à patente 1 mostra que a produtividade de celulase é baixa no teste de produção de enzima por Trichoderma reesei usando papel (jornal e papel de escritório) que não foi submetido a pré-tratamento, tal como tratamento térmico ou tratamento alcalino.

Não se conhece um exemplo satisfatório que possa produzir muita B-glucanase e xilanase ao mesmo tempo usando papel que não foi submetido a tratamento térmico nem tratamento alcalino como um recurso celulósico.

[Literatura da patente 1] Publicação de patente Japonesa submetida à inspeção pública 2003-137901.

[Literatura da patente 2] Publicação de patente Japonesa

H5(1993)-33984.

[Literatura da patente 3] Publicação de patente Japonesa submetida à inspeção pública H11(1999)-113568 [Literatura não associada à patente 1] Applied Biochemistry 10 and Biotechnology pp. 237-245, Vol. 84-86, 2000

DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO

PROBLEMAS A SEREM RESOLVIDOS PELA INVENÇÃO

A presente invenção resolve os problemas convencionais anteriores, e o objetivo desta é produzir celulase que apresenta excelente 15 capacidade para decompor um recurso celulósico contendo xilano com baixo custo.

MEIOS PARA RESOLVER O PROBLEMA

A presente invenção fornece um método para produzir βglucanase e xilanase, compreendendo a etapa de cultivar um microrganismo 20 classificado no gênero Trichoderma usando um meio de cultura líquido que contém (a) uma polpa derivada de papel que não foi submetido a tratamento térmico nem tratamento alcalino como uma fonte de carbono, e (b) um nitrogênio de amônia ou um nitrogênio amino como uma fonte de nitrogênio.

Em uma modalidade, a concentração inicial da polpa no meio de cultura líquido é não menos que 2 % P/V.

Em uma modalidade, a concentração inicial da polpa no meio de cultura líquido é de 2 a 7 % P/V.

Em uma modalidade, a concentração inicial do nitrogênio de

Petição 870180012606, de 16/02/2018, pág. 15/24 amônia ou nitrogênio do amido no meio de cultura líquido é não menos que 50 mM.

Em uma modalidade, a concentração inicial do nitrogênio de amônia ou nitrogênio amino no meio de cultura líquido é de 50 a 660 mM.

Em uma modalidade, o papel é pelo menos um selecionado do grupo que consiste em papel de alta qualidade, papel de madeira moída, papel para cópia, jornal e papelão.

Em uma modalidade, o microrganismo classificado no gênero Trichoderma é Trichoderma reesei.

Em uma modalidade, a polpa é adicionada ao meio de cultura líquido durante o cultivo.

Além do mais, a presente invenção fornece um meio de cultura líquido compreendendo (a) uma polpa derivada de papel que não foi submetido a tratamento térmico nem tratamento alcalino como uma fonte de carbono, e (b) um nitrogênio de amônia ou um nitrogênio amino como uma fonte de nitrogênio, em que o meio de cultura líquido é usado para cultivar um microrganismo classificado no gênero Trichoderma.

Em uma modalidade, a polpa está contida em não menos que 2 % P/V.

Em uma modalidade, o nitrogênio de amônia ou nitrogênio amino está contido em 50 a 660 mM.

Além do mais, a presente invenção fornece uma β-glucanase e xilanase produzidas de acordo com qualquer um dos métodos descritos anteriormente.

Além do mais, a presente invenção fornece um método para decompor ou glicosilar um recurso celulósico, caracterizado pelo uso da βglucanase e xilanase.

EFEITOS DA INVENÇÃO

Na presente invenção, uma vez que os papéis não tratados

Petição 870180012606, de 16/02/2018, pág. 16/24 podem ser usados como uma fonte de carbono de um meio de cultura líquido, isto é mais barato e gasta menos energia e apresenta um impacto baixo no ambiente. Além do mais, uma vez que a β-glucanase e xilanase podem ser altamente produzidas como celulase ao mesmo tempo, isto é muito usado para glicosilação de recursos celulósicos naturais contendo xilano, tais como bagaço e palha de arroz. Especificamente, é usado para a produção de etanol na biomassa que produz etanol a partir de um recurso celulósico.

MELHOR MODALIDADE PARA REALIZAR A INVENÇÃO

Meio de cultura líquido

O meio de cultura líquido da presente invenção é um material contendo nutrientes que cresce um microrganismo classificado no gênero Trichoderma. O meio de cultura líquido é preparado com base em um meio de cultura líquido obtido dissolvendo e suspendendo a composição de meio de cultura a seguir em 100 mL de água (em geral denominado meio Mandel), e contém uma polpa como uma fonte de carbono e um nitrogênio de amônia ou um nitrogênio amino como uma fonte de nitrogênio. Um exemplo de uma composição de meio preferido é mostrada a seguir.

Contendo celulose cristalina (fabricada por Fluka BioChemika, Nome comercial: Avicel PH101): 1 g, (NH4)2SO4: 0,14 g, KH2PO4: 1,5 g,

CaCb’2H2O: 0.03 g, MgSOr7H<): 0,03 g, água de maceração de milho: 2 mL, Tween 80: 0,1 mL, solução com elemento traço (solução com H3BO4 6 mg, (NH4)ôMo7O24’4H2O 26 mg, FeCh’6H2O 100 mg, CuSC)r5H<) 40 mg, MnCl2*4H2O 8 mg, ZnSO4’7^O 200 mg): 0,1 mL, e água: 100 mL (ajustada para pH 4,8 com ácido fosfórico ou hidróxido de sódio)

A polpa refere-se a fibras usadas como um material bruto para fabricar o papel. O tipo da polpa é preferivelmente uma polpa com alta pureza de celulose, tais como polpa química e polpa de papel usado. A polpa preferida é uma polpa derivada de papéis, que pode ser obtida fragmentando e cortando papéis.

Petição 870180012606, de 16/02/2018, pág. 17/24

Exemplos específicos do papel preferido incluem papel de alta qualidade, papel de madeira moída, papel para cópia, jornal, papelão e similares. Os papéis pode ser aqueles que contêm polpa preferida, e também podem ser um papel pintado ou escrito ou um papel em geral referido como um papel usado. Por exemplo, uma página de papel de um livro velho, revista e caderno de anotação bem gasto, boletim de propaganda, envelope, papel para escrever, cartão postal, papel de seda e similares podem ser usados.

A concentração da polpa no meio de cultura líquido é preferivelmente não menos que 2 % P/V. Quando a concentração da polpa é menos que 2 % P/V, a quantidade de produção de celulase, especialmente βglucanase, pode não aumentar muito.

Quanto maior a concentração da polpa no meio de cultura líquido melhor. Em outras palavras, o limite superior é a quantidade de limite que pode realizar agitação e mistura do meio de cultura líquido. A fim de facilitar a agitação e mistura do meio de cultura líquido, é preferível que os papéis sejam cortados com uma máquina fragmentadora e usados. Por exemplo, o limite superior da concentração inicial da polpa no meio de cultura líquido pode ser 20, 15 ou 10 % P/V, dependendo do desempenho do agitador. Em geral, a faixa preferida da concentração inicial da polpa é de 2 a

7 % P/V e preferivelmente de 3 a 5 % P/V.

O nitrogênio de amônia refere-se a um nitrogênio contido em amônia ou um sal de amônio derivado de amônia. Além do mais, o nitrogênio amino refere-se a um nitrogênio contido em amina ou um composto de amino derivado de amina. Exemplos do composto que contém um nitrogênio de amônia ou um nitrogênio amino são sulfato de amônio, nitrato de amônio, fosfato de diamônio, cloreto de amônio, amônia aquosa, uréia, aminoácido e os sais destes (por exemplo, glutamato de sódio).

Entre estes, o composto particularmente preferível para uso como uma fonte de nitrogênio no meio de cultura líquido da presente

Petição 870180012606, de 16/02/2018, pág. 18/24 invenção é sulfato de amônio. A razão é que ele é barato e facilmente disponível.

A concentração do nitrogênio de amônia ou nitrogênio amino no meio de cultura líquido é de 35 a 660 mM com o número de mols de amônio. Preferivelmente, a concentração é de 50 a 580 mM. Quando a concentração é menos que 35 mM, a quantidade de produção de celulase, especialmente β-glucanase, pode não aumentar muito. Além do mais, quando a concentração inicial excede 660 mM, a produtividade das enzimas diminui. Além do mais, é preferível aumentar ou diminuir a concentração do nitrogênio de amônia ou nitrogênio amino no meio de cultura líquido dependendo da concentração da polpa no meio de cultura líquido e, por exemplo, quando a concentração da polpa é 3 % P/V, 50 mM é preferível quando o custo e similares são considerados.

Método para produzir β-glucanase e xilanase

Os fungos do gênero Trichoderma são conhecidos como os microrganismos que produzem celulase exigida para a glicosilação da celulose. O microrganismo classificado no gênero Trichoderma usado na presente invenção não é particularmente limitado, contanto que possa produzir celulase. O microrganismo preferido classificado no gênero

Trichoderma é Trichoderma reesei ou Trichoderma viride. Particularmente preferível, o microrganismo é Trichoderma reesei.

As propriedades micológicas dos fungos Trichoderma reesei e Trichoderma viride são descritas em, por exemplo, E.G. Simmons, Abst. 2nd International Mycological Congress, Tampa, Flórida, EUA, Agosto de 1977, página 618.

Um dispositivo de cultura de aeração-agitação convencional é usado para cultura líquida, e é cultivado em uma temperatura de cultura de

20°C a 33°C e, preferivelmente, 28°C a 30°C, em um pH de cultura de 4 a 6 por 4 a 10 dias, usando o meio de cultura líquido descrito anteriormente. A

Petição 870180012606, de 16/02/2018, pág. 19/24 polpa pode ser adicionada ao meio de cultura líquido durante o cultivo. Isto é em decorrência de poder ser o caso de que a eficiência de produção de celulase melhora suplementando uma fonte de carbono, uma vez que a polpa no meio de cultura é decomposta com a progressão de cultura. Quando a polpa é adicionada, a forma da adição pode ser contínua ou em lotes, e a cronometragem e quantidade de adição podem ser ajustadas, de maneira tal que a agitação e mistura sejam possíveis após a adição da polpa.

Quando a polpa é adicionada, o nitrogênio de amônia ou nitrogênio amino pode ser adicionado de maneira adequada, se necessário.

Subsequentemente, se necessário, um corpo de fungo é removido deste fluido de cultura por um método conhecido, tais como centrifugação e filtração, para obter o fluido do sobrenadante de cultura dos fungos do gênero Trichoderma. O fluido de cultura ou fluido do sobrenadante de cultura dos fungos do gênero Trichoderma contém a celulase pretendida, em outras palavras, β-glucanase e xilanase, em alta concentração.

A atividade de β-glucanase do fluido de cultura obtido ou fluido do sobrenadante de cultura é não menos que 30 U/mL, preferivelmente não menos que 50 U/mL, mais preferivelmente não menos que 60 U/mL, e ainda mais preferivelmente não menos que 70 U/mL. Igualmente, a atividade de xilanase do fluido de cultura obtido ou fluido do sobrenadante de cultura é não menos que 25 U/mL, preferivelmente não menos que 30 U/mL, mais preferivelmente não menos que 40 U/mL, e ainda mais preferivelmente não menos que 50 U/mL. Quando tanto a atividade de β-glucanase quanto à atividade de xilanase do fluido de cultura ou fluido do sobrenadante de cultura diminui para menos que o limite inferior anterior, o efeito no propósito de utilizar de maneira eficiente vários recursos celulósicos de ocorrência natural diminui.

A atividade de hemicelulase anterior pode ser quantificada com base no aumento da absorbância em 540 nm reagindo um açúcar redutor

Petição 870180012606, de 16/02/2018, pág. 20/24 produzido por hidrólise enzimática usando xilano derivado de espeltas de aveia como um substrato com DNS.

Mais especificamente, 0,1 mL do fluido de cultura ou fluido do sobrenadante de cultura é adicionado a 1,9 mL de uma solução de substrato xilano 1 % (Xilano, de espeltas de aveia, fabricada pela Sigma é dissolvido em solução tampão de ácido acético 200 nM (pH 4,5)), e a reação enzimática é realizada exatamente por 10 minutos a 40°C. Assim, 4 mL de um reagente DNS (contendo 0,75 % de ácido dinitrossalicílico, 1,2 % de hidróxido de sódio, 22,5 % de tetra-hidrato de tartarato de potássio e sódio e 0,3 % de mono-hidrato de lactose) é adicionado a esta e bem misturado para parar a reação. A fim de quantificar a quantidade de açúcar redutor contido na solução de parada de reação, a solução de parada de reação é aquecida em um banho de água fervente exatamente por 15 minutos. Subsequentemente, a solução de parada de reação é resfriada em temperatura ambiente, e a absorbância em 540 nm é então determinada para quantificar a quantidade de açúcar redutor correspondente à xilose. 1 unidade da atividade de hemicelulase é representada como o nível de enzima que produz um açúcar redutor correspondente a 1 gmol de xilose em 1 minuto nas condições de reação a 40°C por 10 minutos.

Método para decompor ou glicosilar recursos celulósicos

A β-glucanase e xilanase obtidas pelo método da presente invenção são usadas para decompor ou glicosilar recursos celulósicos. Os recursos celulósicos aqui referidos podem ser tanto celulose sintético quanto recursos celulósicos naturais. A celulose sintético representa uma celulose distribuída como pó de celulose. Os recursos celulósicos naturais incluem bagaço, palha de arroz, palha de trigo, cerveja de barril, madeira e similares. A presente invenção pode produzir muita β-glucanase e xilanase ao mesmo tempo e é, portanto, excelente, em particular, glicosilação de recursos celulósicos naturais tais como bagaço, palha de arroz, palha de trigo e cerveja de barril.

Um método conhecido pode ser usado como o método para decompor ou glicosilar um recurso celulósico, e não é particularmente limitado. Um exemplo inclui um método de suspender um recurso celulósico como um substrato em um meio aquoso, adicionar o fluido de cultura descrito anteriormente ou fluido do sobrenadante de cultura deste, e aquecer agitando ou vibrando ao mesmo tempo para realizar uma reação de glicosilação. No lugar do fluido de cultura descrito anteriormente ou fluido do sobrenadante de cultura, que mostra atividade celulolítica, o material seco deste ou uma solução obtida dispersando ou dissolvendo o material seco em água pode ser usado.

É preferível que o material bruto celulósico seja preliminarmente deslignificado. As condições de reação, tais como método de suspensão, método de agitação, método de adição da solução misturada anteriormente, ordem de adição e concentrações desta são ajustadas adequadamente, de maneira tal que a glicose seja obtida em maior rendimento.

O pH e temperatura da solução de reação neste período pode estar na faixa que a enzima não é inativada e, em geral, quando a reação é realizada em pressão comum, a temperatura pode estar na faixa de 30 a 70°C e o pH pode estar na faixa de 3 a 7. Além do mais, embora a pressão, temperatura e pH também sejam ajustados adequadamente de maneira tal que a glicose seja obtida em maior rendimento da maneira descrita anteriormente, é preferível realizar em uma solução tampão com ácido acético ou fosfato, em pressão comum em uma temperatura na faixa de 50°C a 60°C e um pH na faixa de 4 a 6. O tempo de reação é em geral de 6 a 147 horas e, preferivelmente, de 24 a 72 horas.

Uma solução aquosa contendo glicose é obtida por glicosilação de celulose. A solução aquosa obtida pode ser submetida ao tratamento de purificação, tais como descoloração, dessalinação e remoção de enzimas, se necessário. O método de purificação não é particularmente limitado, contanto que seja um método conhecido e, por exemplo, o tratamento com carbono ativado, tratamento com resina de troca iônica, tratamento por cromatografia, tratamentos por filtração tais como microfiltração, ultrafiltração e filtração por osmose reversa, tratamento por cristalização e similares podem ser usados, e estes métodos podem ser usados sozinhos ou em combinação de 2 ou mais tipos.

A solução aquosa, composta princípalmente de uma glicose purificada pelo método anterior, pode ser usada como ela é, e pode ser solidificada secando se necessário. O método de secagem não é particularmente limitado, contanto que seja um método conhecido e, por exemplo, secagem por aspersão, secagem por congelamento, secagem em cilindro, secagem em filme fino, secagem em bandeja, secagem rápida, secagem a vácuo e similares podem ser usados, e estes métodos podem ser usados sozinhos ou em combinação de 2 ou mais tipos.

EXEMPLOS

Assim, a presente invenção será descrita mais especificamente com referência aos exemplos, mas a presente invenção não é limitada a estes exemplos.

Exemplo 1

Trichoderma reesei QM9414 (NBRC 31329) foi cultivado em um meio de ágar batata dextrose a 28°C por 7 dias, para formar esporos de maneira suficiente. A celulose cristalina, uma fonte de carbono do meio Mandei, foi substituída por 3 % de papel para cópia (3 g/100 mL) e sulfato de amônio, uma fonte de nitrogênio, de maneira tal que a concentração molar de nitrogênio de amônia se torne cada qual 15 mM, 35 mM, 50 mM, 65 mM, 80 mM, 100 mM ou 115 mM, e ajustada para pH 4,8 com ácido fosfórico e hidróxido de sódio, para preparar 100 mL de um meio de cultura líquido em um frasco Erlenmeyer com volume de 500 mL com defletores. Uma alça do Trichoderma reesei cultivado foi inoculada neste meio de cultura líquido e cultivado com agitação a 28°C, 180 rpm por 7 dias. O fluido de cultura foi centrifugado no dia 7, e a atividade de β-glucanase e atividade de xilanase do fluido sobrenadante foram determinadas. O papel para cópia não foi submetido à pré-tratamento, tal como tratamento alcalino ou tratamento térmico, e foi cortado apenas em 2 mm x 7 mm com uma máquina fragmentadora (cortador de mesa DS-4100 por CARL) e usado.

(Determinação da atividade enzimática)

A atividade enzimática foi determinada com relação ao fluido de cultura obtido anteriormente.

Para a atividade de β-glucanase, a absorbância de um fragmento corado gerado por decomposição enzimática usando β-glucano marcado com corante como um substrato foi determinada usando um estojo de ensaio de β-glucanase fabricado por Megazyme. Especificamente, 0,1 mL do fluido de cultura foi adicionado a 0,1 mL de solução de substrato de glucano de azo-cevada, e a reação enzimática foi realizada exatamente por 10 minutos a 40°C. Assim, 0,6 mL de uma solução de parada [contendo 4 % de acetato de sódio, 0,4 % de acetato de zinco e 80 % de metil celulose (pH 5)] foi adicionado a esta e deixado por 5 minutos para parar a reação. Subsequentemente, a solução foi centrifugada e, assim, a absorbância em 590 nm do fluido sobrenadante foi determinada. 1 unidade da atividade de βglucanase foi representada como o nível de enzima que produz um açúcar redutor correspondente a 1 pmol de glicose em 1 minuto nas condições de reação a 40°C por 10 minutos.

A seguir, a atividade de xilanase foi quantificada pelo aumento na absorbância a 540 nm, reagindo um açúcar redutor produzido por hidrólise enzimática usando xilano derivado de espeltas de aveia como um substrato com DNS. Mais especificamente, 0,1 mL do fluido de cultura foi adicionado a

1,9 mL de uma solução de substrato xilano 1 % [Xilano, de espeltas de aveia, fabricada por Sigma foi dissolvido em solução tampão de ácido acético 200 mM (pH 4,5)], e a reação enzimática foi realizada exatamente por 10 minutos a 40°C. Assim, 4 mL de um reagente DNS (contendo 0,75 % de ácido dinitrossalicílico, 1,2 % de hidróxido de sódio, 22,5 % tetra-hidrato de tartarato de potássio e sódio e 0,3 % de mono-hidrato de lactose) foi adicionado aqui e bem misturado para parar a reação. A fim de quantificar a quantidade de açúcar redutor contido na solução de parada de reação, a solução de parada de reação foi aquecida em um banho de água fervente exatamente por 15 minutos. Subsequentemente, a solução de parada de reação foi resfriada em temperatura ambiente, e a absorbância em 540 nm foi então determinada para quantificar a quantidade de açúcar redutor correspondente a xilose. 1 unidade da atividade de xilanase foi representada como o nível de enzima que produz um açúcar redutor correspondente a 1 pmol de xilose em 1 minuto nas condições de reação a 40°C por 10 minutos. Os resultados são mostrados na figura 1.

Exemplo 2

De acordo com a mesma maneira do exemplo 1, 3 % de papelão (3 g/100 mL) foram empregados em vez da celulose cristalina, uma fonte de carbono do meio Mandei, para preparar um meio de cultura líquido. Trichoderma reesei QM9414 (NBRC 31329) foi cultivado em um meio de ágar batata dextrose a 28°C por 7 dias, para formar esporos de maneira suficiente, e uma alça deste foi inoculada no meio de cultura líquido e cultivada com agitação a 28°C, 180 rpm por 7 dias. O fluido de cultura foi centrifugado no dia 7, e a atividade de β-glucanase e atividade de xilanase foram determinadas da mesma maneira do exemplo 1. Os resultados são mostrados na figura 2.

Exemplo 3

De acordo com a mesma maneira do exemplo 1,3 % de jornal (3 g/100 mL) foram empregados em vez da celulose cristalina, uma fonte de carbono do meio Mandei, para preparar um meio de cultura líquido. Trichoderma rees ei QM9414 (NBRC 31329) foi cultivado em um meio de ágar batata dextrose a 28°C por 7 dias, para formar esporos de maneira suficiente, e uma alça deste foi inoculada no meio de cultura líquido e cultivada com agitação a 28°C, 180 rpm por 7 dias. O fluido de cultura foi centrifugado no dia 7, e atividade de β-glucanase e atividade de xilanase foram determinadas da mesma maneira do exemplo 1. Os resultados são mostrados na figura 3.

Exemplo 4

De acordo com a mesma maneira do exemplo 1, 3 % de papel para cópia (3 g/100 mL) foram empregados em vez da celulose cristalina, uma fonte de carbono do meio Mandei, e cloreto de amônio em vez do sulfato de amônio, uma fonte de nitrogênio, de maneira tal que a concentração molar de nitrogênio de amônia se tome cada qual 20 mM, 40 mM, 50 mM, 60 mM, 80 mM, 100 mM ou 120 mM para preparar um meio de cultura líquido. Trichoderma reesei QM9414 (NBRC 31329) foi cultivado em um meio de ágar batata dextrose a 28°C por 7 dias, para formar esporos de maneira suficiente, e uma alça deste foi inoculada no meio de cultura líquido e cultivada com agitação a 28°C, 180 rpm por 7 dias. O fluido de cultura foi centrifugado no dia 7, e atividade de β-glucanase e atividade de xilanase foram determinadas da mesma maneira do exemplo 1. Os resultados são mostrados na figura 4.

Exemplo 5

De acordo com a mesma maneira do exemplo 1, 3 % de papel para cópia (3 g/100 mL) foram empregados em vez da celulose cristalina, uma fonte de carbono do meio Mandei, e fosfato de diamônio em vez do sulfato de amônio, uma fonte de nitrogênio, de maneira tal que a concentração molar de nitrogênio de amônia se tome cada qual 15 mM, 35 mM, 50 mM, 65 mM, 80 mM, 100 mM ou 115 mM para preparar um meio de cultura líquido. Trichoderma reesei QM9414 (NBRC 31329) foi cultivado em um meio de ágar batata dextrose a 28°C por 7 dias, para formar esporos de maneira suficiente, e uma alça deste foi inoculada no meio de cultura líquido e cultivada com agitação a 28°C, 180 rpm por 7 dias. O fluido de cultura foi centrifugado no dia 7, e atividade de β-glucanase e atividade de xilanase foram determinadas da mesma maneira do exemplo 1. Os resultados são mostrados na figura 5.

Exemplo 6

De acordo com a mesma maneira do exemplo 1, 3 % de papel para cópia (3 g/100 mL) foram empregados em vez da celulose cristalina, uma fonte de carbono do meio Mandei, nitrato de amônio em vez do sulfato de amônio, uma fonte de nitrogênio, de maneira tal que a concentração molar de nitrogênio de amônia se tome cada qual 12 mM, 24 mM, 36 mM, 48 mM,

60 mM, 72 mM ou 84 mM para preparar um meio de cultura líquido.

Trichoderma reesei QM9414 (NBRC 31329) foi cultivado em um meio de ágar batata dextrose a 28°C por 7 dias, para formar esporos de maneira suficiente, e uma alça deste foi inoculada no meio de cultura líquido e cultivada com agitação a 28°C, 180 rpm por 7 dias. O fluido de cultura foi centrifugado no dia 7, e atividade de β-glucanase e atividade de xilanase foram determinadas da mesma maneira do exemplo 1. Os resultados são mostrados na figura 6.

Exemplo 7

De acordo com a mesma maneira do exemplo 1, 3 % de papel para cópia (3 g/100 mL) foram empregados em vez da celulose cristalina, uma fonte de carbono do meio Mandei, e amônia aquosa em vez do sulfato de amônio, uma fonte de nitrogênio, de maneira tal que a concentração molar deste se tome cada qual 15 mM, 30 mM, 45 mM, 65 mM, 75 mM, 90 mM ou 105 mM para preparar um meio de cultura líquido. Trichoderma reesei

QM9414 (NBRC 31329) foi cultivado em um meio de ágar batata dextrose a 28°C por 7 dias, para formar esporos de maneira suficiente, e uma alça deste foi inoculada no meio de cultura líquido e cultivada com agitação a 28°C, 180 rpm por 7 dias. O fluido de cultura foi centrifugado no dia 7, e atividade de Bglucanase e atividade de xilanase foram determinadas da mesma maneira do exemplo 1. Os resultados são mostrados na figura 7.

Exemplo 8

De acordo com a mesma maneira do exemplo 1, 3 % de papel para cópia (3 g/100 mL) foram empregados em vez da celulose cristalina, uma fonte de carbono do meio Mandei, e uréia em vez do sulfato de amônio, uma fonte de nitrogênio, de maneira tal que a concentração molar de nitrogênio de amônia se tome cada qual 17 mM, 33 mM, 50 mM, 67 mM, 83 mM ou 100 mM para preparar um meio de cultura líquido. Trichoderma reesei QM9414 (NBRC 31329) foi cultivado em um meio de ágar batata dextrose a 28°C por 7 dias, para formar esporos de maneira suficiente, e uma alça deste foi inoculada no meio de cultura líquido e cultivada com agitação a 28°C, 180 rpm por 7 dias. O fluido de cultura foi centrifugado no dia 7, e atividade de B-glucanase e atividade de xilanase foram determinadas da mesma maneira do exemplo 1. Os resultados são mostrados na figura 8. Exemplo 9

De acordo com a mesma maneira do exemplo 1, papel para cópia em vez da celulose cristalina, uma fonte de carbono do meio Mandei, foi adicionado de maneira tal que a concentração deste se tome 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, ou 7 %, e o sulfato de amônio, uma fonte de nitrogênio, de maneira tal que a concentração molar de nitrogênio de amônia se tome 80 mM para preparar um meio de cultura líquido. Trichoderma reesei QM9414 (NBRC 31329) foi cultivado em um meio de ágar batata dextrose a 28°C por 7 dias, para formar esporos de maneira suficiente, e uma alça deste foi inoculada no meio de cultura líquido e cultivada com agitação a 28°C, 180 rpm por 7 dias. O fluido de cultura foi centrifugado no dia 7, e atividade de βglucanase e atividade de xilanase foram determinadas da mesma maneira do exemplo 1. Os resultados são mostrados na figura 9.

Exemplo 10

De acordo com a mesma maneira do exemplo 1, papel para cópia em vez da celulose cristalina, uma fonte de carbono do meio Mandei, foi adicionado de maneira tal que a concentração deste se tome 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, ou 7 %, e o sulfato de amônio, uma fonte de nitrogênio, de maneira tal que a concentração molar de nitrogênio de amônia se tome 160 mM para preparar um meio de cultura líquido. Trichoderma reeseí QM9414 (NBRC 31329) foi cultivado em um meio de ágar batata dextrose a 28°C por 7 dias, para formar esporos de maneira suficiente, e uma alça deste foi inoculada no meio de cultura líquido e cultivada com agitação a 28°C, 180 rpm por 7 dias. O fluido de cultura foi centrifugado no dia 7, e atividade de βglucanase e atividade de xilanase foram determinadas da mesma maneira do exemplo 1. Os resultados são mostrados na figura 10.

Exemplo 11

De acordo com a mesma maneira do exemplo 1, papel para cópia em vez da celulose cristalina, uma fonte de carbono do meio Mandei, foi adicionado de maneira tal que a concentração deste se tome 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, ou 7 %, e o sulfato de amônio, uma fonte de nitrogênio, de maneira tal que a concentração molar de nitrogênio de amônia se tome 320 mM para preparar um meio de cultura líquido. Trichoderma reesei QM9414 (NBRC 31329) foi cultivado em um meio de ágar batata dextrose a 28°C por 7 dias, para formar esporos de maneira suficiente, e uma alça deste foi inoculada no meio de cultura líquido e cultivada com agitação a 28°C, 180 rpm por 7 dias. O fluido de cultura foi centrifugado no dia 7, e atividade de βglucanase e atividade de xilanase foram determinadas da mesma maneira do exemplo 1. Os resultados são mostrados na figura 11.

Exemplo 12

De acordo com a mesma maneira do exemplo 1, papel para cópia em vez da celulose cristalina, uma fonte de carbono do meio Mandei, foi adicionado de maneira tal que a concentração deste se tome 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, ou 7 %, e o sulfato de amônio, uma fonte de nitrogênio, de maneira tal que a concentração molar de nitrogênio de amônia se tome 480 mM para preparar um meio de cultura líquido. Trichoderma reesei QM9414 (NBRC 31329) foi cultivado em um meio de ágar batata dextrose a 28°C por 7 dias, para formar esporos de maneira suficiente, e uma alça deste foi inoculada no meio de cultura líquido e cultivada com agitação a 28°C, 180 rpm por 7 dias. O fluido de cultura foi centrifugado no dia 7, e atividade de βglucanase e atividade de xilanase foram determinadas da mesma maneira do exemplo 1. Os resultados são mostrados na figura 12.

Exemplo de referência 1

De acordo com a mesma maneira do exemplo 1, a concentração da celulose cristalina, uma fonte de carbono do meio Mandei, foi ajustada para 1 %, e o sulfato de amônio, uma fonte de nitrogênio, de maneira tal que a concentração molar de nitrogênio de amônia se tome cada qual 15 mM, 35 mM, 50 mM, 65 mM, 80 mM, 100 mM ou 115 mM para preparar um meio de cultura líquido. Trichoderma reesei QM9414 (NBRC 31329) foi cultivado em um meio de ágar batata dextrose a 28°C por 7 dias, para formar esporos de maneira suficiente, e uma alça deste foi inoculada no meio de cultura líquido e cultivada com agitação a 28°C, 180 rpm por 7 dias. O fluido de cultura foi centrifugado no dia 7, e atividade de β-glucanase e atividade de xilanase foram determinadas da mesma maneira do exemplo 1. Os resultados são mostrados na figura 13.

Exemplo de referência 2

De acordo com a mesma maneira do exemplo 1, a celulose cristalina, uma fonte de carbono do meio Mandei, foi adicionada de maneira tal que a concentração desta se tome 1 %, 1.5 %, 2 %, 2.5 %, 3 %, 3.5 %, ou 4 %, e o sulfato de amônio, uma fonte de nitrogênio, de maneira tal que a concentração molar de nitrogênio de amônia se tome 160 mM para preparar um meio de cultura líquido. Trichoderma reesei QM9414 (NBRC 31329) foi cultivado em um meio de ágar batata dextrose a 28°C por 7 dias, para formar esporos de maneira suficiente, e uma alça deste foi inoculada no meio de cultura líquido e cultivada com agitação a 28°C, 180 rpm por 7 dias. O fluido de cultura foi centrifugado no dia 7, e atividade de β-glucanase e atividade de xilanase foram determinadas da mesma maneira do exemplo 1. Os resultados são mostrados na figura 14.

Exemplo de referência 3

De acordo com a mesma maneira do exemplo 1,1 % de papel para cópia (3 g/100 mL) foi adicionado em vez da celulose cristalina, uma fonte de carbono do meio Mandei, e o sulfato de amônio, uma fonte de nitrogênio, de maneira tal que a concentração molar de nitrogênio de amônia se tome cada qual 15 mM, 35 mM, 50 mM, 65 mM, 80 mM, 100 mM ou 115 mM para preparar um meio de cultura líquido. Trichoderma reesei QM9414 (NBRC 31329) foi cultivado em um meio de ágar batata dextrose a 28°C por 7 dias, para formar esporos de maneira suficiente, e uma alça deste foi inoculada no meio de cultura líquido e cultivada com agitação a 28°C, 180 rpm por 7 dias. O fluido de cultura foi centrifugado no dia 7, e atividade de βglucanase e atividade de xilanase foram determinadas da mesma maneira do exemplo 1. Os resultados são mostrados na figura 15.

Exemplo de referência 4

De acordo com a mesma maneira do exemplo 1,3% de papel para cópia (3 g/100 mL) foram adicionados em vez da celulose cristalina, uma fonte de carbono do meio Mandei, e nitrato de potássio em vez do sulfato de amônio, uma fonte de nitrogênio, de maneira tal que a concentração molar de nitrogênio de amônia se tome cada qual 10 mM, 20 mM, 30 mM, 40 mM, 50 mM, 60 mM ou 70 mM para preparar um meio de cultura líquido. Trichoderma reesei QM9414 (NBRC 31329) foi cultivado em um meio de ágar batata dextrose a 28°C por 7 dias, para formar esporos de maneira suficiente, e uma alça deste foi inoculada no meio de cultura líquido e cultivada com agitação a 28°C, 180 rpm por 7 dias. O fluido de cultura foi centrifugado no dia 7, e atividade de β-glucanase e atividade de xilanase foram determinadas da mesma maneira do exemplo 1. Os resultados são mostrados na figura 16.

Exemplo 13

Trichoderma reesei QM9414 (NBRC 31329) foi cultivado em um meio de ágar batata dextrose a 28°C por 7 dias, para formar esporos de maneira suficiente. Uma alça deste foi inoculada em um frasco Erlenmeyer com volume de 500 mL com defletores que contém 100 mL do meio Mandei e cultivada com agitação a 28°C, 180 rpm por 4 dias. Foi inoculada em um frasco Erlenmeyer com volume de 500 mL com defletores que contém 150 mL do meio Mandei e cultivada com agitação a 28°C, 180 rpm for 2 dias para obter um fluido de cultura. 3 L de um meio de cultura obtidos adicionando 3 % (30 g/L), 6 % (60g/L) de papel para cópia ou 3 % de celulose cristalina (Avicel PH101) em vez da celulose cristalina, uma fonte de carbono do meio Mandei, adicionando o sulfato de amônio, uma fonte de nitrogênio, de maneira tal que a concentração molar de nitrogênio de amônia se tome 200 mM, e empregando 6 g/L de Adekanol LG-126 (fabricado por ADEKA CORPORATION) em vez de Tween 80 e o fluido de cultura foram adicionados a um fermentador de 5 L (fabricado por B.E. MARUBISHI CO., LTD.), e a mistura foi cultivada a 28°C. Isto foi conduzido com uma aeração de 1VVM e agitação a 450 rpm, e o pH foi ajustado com hidróxido de sódio 2 N e ácido fosfórico diluído cinco vezes, de maneira a permanecer constante em pH 4,8 durante o período de cultura. O fluido de cultura foi centrifugado no dia 7, e atividade de B-glucanase e atividade de xilanase do fluido sobrenadante foram determinadas. Os resultados são mostrados na figura 17.

O papel para cópia foi cortado em 4 mm x 30 mm com uma máquina fragmentadora (Primo 1400 fabricada por Meikoshokai Co., Ltd.) e usado. Além do mais, 6 % de papel para cópia (60 g/L) foram adicionados em uma quantidade total em uma vez, a agitação se toma insuficiente e, portanto, papel para cópia e sulfato de amônio foram adicionados em divisões no dia 1 e dia 3 do cultivo.

Exemplo 14

De acordo com a mesma maneira do exemplo 13, 6 % de papel para cópia (60 g/l) foram adicionados a um fermentador de 5 L, sulfato de amônio, de maneira tal que a concentração molar de nitrogênio de amônia se tome 44 mM, 100 mM, 134 mM, ou 224 mM, e produção das enzimas foi examinada. Os resultados são mostrados na figura 18.

Exemplo 15

De acordo com a mesma maneira do exemplo 13, 6 % de papel para cópia (60 g/l) e sulfato de amônio foram adicionados, de maneira tal que a concentração molar de nitrogênio de amônia se tome 45 mM em um fermentador de 5 L, e produção das enzimas foi comparada com o caso de que hidróxido de sódio 2N foi empregado como um produto químico para ajustar o pH durante o período de cultura e o caso de que 18 % de amônia aquosa foram empregados. A quantidade de entrada da amônia aquosa durante o período de cultura foi 123 mM. Os resultados são mostrados na figura 19. Exemplo 16

De acordo com a mesma maneira do exemplo 1, 3 % de papel para cópia (3 g/l00 mL) foram empregados em vez da celulose cristalina, uma fonte de carbono do meio Mandei, e o sulfato de amônio, uma fonte de nitrogênio, de maneira tal que a concentração molar de nitrogênio de amônia se tome cada qual 330 mM, 420 mM, 500 mM, 580 mM, 660 mM, 720 mM ou 800 mM para preparar um meio de cultura líquido. Trichoderma reesei

QM9414 (NBRC 31329) foi cultivado em um meio de ágar batata dextrose a 28°C por 7 dias, para formar esporos de maneira suficiente, e uma alça deste foi inoculada no meio de cultura líquido e cultivada com agitação a 28°C, 180 rpm por 7 dias. O fluido de cultura foi centrifugado no dia 7, e atividade de β5 glucanase e atividade de xilanase foram determinadas da mesma maneira do exemplo 1. Os resultados são mostrados na figura 20.

Exemplo 17

De acordo com a mesma maneira do exemplo 1, 3 % de papel para cópia (3 g/100 mL) foram empregados em vez da celulose cristalina, uma fonte de carbono do meio Mandel, e glutamato de sódio em vez do sulfato de amônio, uma fonte de nitrogênio, de maneira tal que a concentração molar de nitrogênio amino se torne cada qual 17 mM, 33 mM, 50 mM, 67 mM, 83 mM ou 100 mM para preparar um meio de cultura líquido. Trichoderma reesei QM9414 (NBRC 31329) foi cultivado em um meio de ágar batata dextrose a 28°C por 7 dias, para formar esporos de maneira suficiente, e uma alça deste foi inoculada no meio de cultura líquido e cultivada com agitação a 28°C, 180 rpm por 7 dias. O fluido de cultura foi centrifugado no dia 7, e atividade de β-glucanase e atividade de xilanase foram determinadas da mesma maneira do exemplo 1. Os resultados são mostrados na figura 21.

Exemplo 18

O teste de glicosilação de recursos celulósicos foi realizado usando cada fluido sobrenadante do meio de cultura com 6 % de papel para cópia e o meio de cultura com 3 % de celulose cristalina obtidos no exemplo

13. À medida que os recursos celulósicos são submetidos à glicosilação, o pó de celulose (fabricado por NIPPON PAPER CHEMICALS CO.,LTD., nome comercial: KC FLOCK W-50), bagaço, palha de arroz e cerveja de barril foram usados. O bagaço, palha de arroz e cerveja de barril foram cada um finamente moídos, suspensos em NaOH 0,3N, tratados a 120°C por 15

Petição 870180012606, de 16/02/2018, pág. 21/24 minutos, lavados satisfatoriamente com água, e então secos, submetidos ao tratamento de deslignificação, e submetidos à glicosilação. O pó de celulose foi submetido diretamente à glicosilação. Uma solução (8 % de solução de recurso celulósico) que foi composta do recurso celulósico: 0,8 g, o fluido do sobrenadante de cultura: 9 mL, e tampão de ácido acético 1M (pH 4,8): 0,2 mL foram agitados a 50°C, pH 4,8 por 48 horas para glicolisar, e a glicose produzida foi determinada por Glucose CII-Test Wako (Wako Pure Chemicals). Os resultados são mostrados na figura 22 a Fig. 25.

Observa-se a partir dos resultados dos exemplos e exemplos de referência que o Trichoderma reesei foi cultivado usando um meio de cultura líquido que contém papel não tratado como uma fonte de carbono, e contém amônia/sal de amônio como uma fonte de nitrogênio para produzir Bglucanase e xilanase ao mesmo tempo em alta produtividade. Observa-se também que o papel no meio de cultura aumentou em concentração para o nível maior que aquele de uma fonte de carbono normalmente usada, ou amônia/sal de amônio no meio de cultura foi ajustado em concentração para uma faixa específica para aumentar a quantidade de produção da celulase consideravelmente. Observa-se também que vários recursos celulósicos podem ser decompostos e glicosilados usando o fluido do sobrenadante de cultura resultante.

APLICABILIDADE INDUSTRIAL

B-glucanase e xilanase que são muito usadas, em particular, para glicosilação de recursos celulósicos naturais, tais como bagaço e palha de arroz, podem ser produzidas em grande escala ao mesmo tempo, e podem ser utilizadas para a produção do etanol em biomassa, que produz etanol a partir de recursos celulósicos.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS [Figura 1] Um gráfico mostrando a mudança da atividade enzimática de um fluido do sobrenadante de cultura contra a concentração de sulfato de amônio em um meio de cultura com 3 % de papel para cópia.

[Figura 2] Um gráfico mostrando a mudança da atividade enzimática de um fluido do sobrenadante de cultura contra a concentração de sulfato de amônio em um meio de cultura com 3 % de papelão.

[Figura 3] Um gráfico mostrando a mudança da atividade enzimática de um fluido do sobrenadante de cultura contra a concentração de sulfato de amônio em um meio de cultura com 3 % de jornal.

[Figura 4] Um gráfico mostrando a mudança da atividade enzimática de um fluido do sobrenadante de cultura contra a concentração de cloreto de amônio em um meio de cultura com 3 % de papel para cópia.

[Figura 5] Um gráfico mostrando a mudança da atividade enzimática de um fluido do sobrenadante de cultura contra a concentração de fosfato de diamônio em um meio de cultura com 3 % de papel para cópia.

[Figura 6] Um gráfico mostrando a mudança da atividade enzimática de um fluido do sobrenadante de cultura contra a concentração de nitrato de amônio em um meio de cultura com 3 % de papel para cópia.

[Figura 7] Um gráfico mostrando a mudança da atividade enzimática de um fluido do sobrenadante de cultura contra a concentração de amônia em um meio de cultura com 3 % de papel para cópia.

[Figura 8] Um gráfico mostrando a mudança da atividade enzimática de um fluido do sobrenadante de cultura contra a concentração de uréia em um meio de cultura com 3 % de papel para cópia.

[Figura 9] Um gráfico mostrando a mudança da atividade enzimática de um fluido do sobrenadante de cultura contra a concentração de papel para cópia em um meio de cultura com sulfato de amônio 80 mM.

[Figura 10] Um gráfico mostrando a mudança da atividade enzimática de um fluido do sobrenadante de cultura contra a concentração de papel para cópia em um meio de cultura com sulfato de amônio 160 mM.

[Figura 11] Um gráfico mostrando a mudança da atividade enzimática de um fluido do sobrenadante de cultura contra a concentração de papel para cópia em um meio de cultura com sulfato de amônio 320 mM.

[Figura 12] Um gráfico mostrando a mudança da atividade enzimática de um fluido do sobrenadante de cultura contra a concentração de papel para cópia em um meio de cultura com sulfato de amônio 480 mM.

[Figura 13] Um gráfico mostrando a mudança da atividade enzimática de um fluido do sobrenadante de cultura contra a concentração de sulfato de amônio em um meio de cultura com 1 % de Avicel.

[Figura 14] Um gráfico mostrando a mudança da atividade enzimática de um fluido do sobrenadante de cultura contra a concentração de Avicel em um meio de cultura com sulfato de amônio 160 mM.

[Figura 15] Um gráfico mostrando a mudança da atividade enzimática de um fluido do sobrenadante de cultura contra a concentração de sulfato de amônio em um meio de cultura com 1 % de papel para cópia.

[Figura 16] Um gráfico mostrando a mudança da atividade enzimática de um fluido do sobrenadante de cultura contra a concentração de nitrato de potássio em um meio de cultura com 3 % de papel para cópia.

[Figura 17] Um gráfico mostrando a mudança da atividade enzimática de um fluido do sobrenadante de cultura contra o tipo de fonte de carbono em um meio de cultura com sulfato de amônio 200 mM.

[Figura 18] Um gráfico mostrando a mudança da atividade enzimática de um fluido do sobrenadante de cultura contra a concentração de sulfato de amônio em um meio de cultura com 6 % de papel usado para cópia.

[Figura 19] Um gráfico mostrando a mudança da atividade enzimática de um fluido do sobrenadante de cultura contra o tipo de produto químico para ajustar o pH em um meio de cultura com 6 % de papel usado para cópia e sulfato de amônio 45 mM.

[Figura 20] Um gráfico mostrando a mudança da atividade enzimática de um fluido do sobrenadante de cultura contra a concentração de sulfato de amônio em um meio de cultura com 3 % de papel para cópia.

[Figura 21] Um gráfico mostrando a mudança da atividade enzimática de um fluido do sobrenadante de cultura contra a concentração de glutamato de sódio em um meio de cultura com 3 % de papel para cópia.

[Figura 22] Um gráfico comparando a concentração da glicose produzida quando o bagaço é glicosilado usando cada qual o fluido do sobrenadante do meio de cultura com 6 % de papel para cópia, e o meio de cultura com 3 % de celulose cristalina obtido no exemplo 13.

[Figura 23] Um gráfico comparando a concentração da glicose 10 produzida quando a palha de arroz é glicosilada usando cada qual o fluido do sobrenadante do meio de cultura com 6 % de papel para cópia, e o meio de cultura com 3 % de celulose cristalina obtido no exemplo 13.

[Figura 24] Um gráfico comparando a concentração da glicose produzida quando a cerveja de barril é glicosilada usando cada qual o fluido do sobrenadante do meio de cultura com 6 % de papel para cópia, e o meio de cultura com 3 % de celulose cristalina obtido no exemplo 13.

[Figura 25] Um gráfico comparando a concentração da glicose produzida quando o pó de celulose é glicosilado usando cada qual o fluido do sobrenadante do meio de cultura com 6 % de papel para cópia, e o meio de cultura com 3 % de celulose cristalina obtido no exemplo 13.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Método para produzir β-glucanase e xilanase, caracterizado pelo fato de que compreende a etapa de cultivar um microrganismo classificado no gênero Trichoderma usando um meio de cultura líquido que

5 contém (a) uma polpa derivada de papel que não foi submetido a tratamento térmico nem tratamento alcalino como uma fonte de carbono, e (b) um nitrogênio de amônia ou um nitrogênio amino como uma fonte de nitrogênio, em que a concentração do nitrogênio de amônia ou nitrogênio amino no meio de cultura líquido é de 35 mM a 660 mM; e

10 em que o microrganismo classificado no gênero Trichoderma é Trichoderma reesei.
2. Método para produzir β-glucanase e xilanase de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a concentração da polpa no meio de cultura líquido é não menos que 2 % P/V.

15 3. Método para produzir β-glucanase e xilanase de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a concentração inicial da polpa no meio de cultura líquido é de 2 a 7 % P/V.

4. Método para produzir β-glucanase e xilanase de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a

20 concentração inicial do nitrogênio de amônia ou nitrogênio amino no meio de cultura líquido é de 50 a 580 mM.

5. Método para produzir β-glucanase e xilanase de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o papel é pelo menos um selecionado do grupo que consiste em papel de alta

25 qualidade, papel de madeira moída, papel para cópia, jornal e papelão.

6. Método para produzir β-glucanase e xilanase de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que a polpa é adicionada ao meio de cultura líquido durante o cultivo.

7. Meio de cultura líquido, caracterizado pelo fato de que

Petição 870180012606, de 16/02/2018, pág. 22/24 compreende (a) uma polpa derivada de papel que não foi submetido a tratamento térmico nem tratamento alcalino como uma fonte de carbono, e (b) um nitrogênio de amônia ou um nitrogênio amino como uma fonte de nitrogênio, em que o meio de cultura líquido é usado para cultivar um microrganismo classificado no gênero Trichoderma, em que a concentração do nitrogênio de amônia ou nitrogênio amino no meio de cultura líquido é de 35 mM a 660 mM; e em que o microrganismo classificado no gênero Trichoderma é Trichoderma reesei.

8. Meio de cultura líquido de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que a polpa está contida em não menos que 2 % P/V.

9. Meio de cultura líquido de acordo com a reivindicação 7 ou 8, caracterizado pelo fato de que o nitrogênio de amônia ou nitrogênio amino está contido em 50 a 580 mM.

Petição 870180012606, de 16/02/2018, pág. 23/24

1/25

DESENHOS

FIGURA 1

Xilanase

15 35 50 65 80 1 00 115

Sulfato de Amônio (mM)

2/25

FIGURA 2 β - Glucanase (U/ml)

35 50 65 80 100

Sulfato de Amônio (mM)

115
3/25

FIGURA 3

Xilanase (U/ml)
4/25

FIGURA 4 β -Glucanase

Xilanase
5/25

FIGURA 5 β-Glucanase (U/ml)

Xilanase (U/ml)
6/25

FIGURA 6 β-Glucanase (U/ml)

Xilanase (U/ml)
7/25

FIGURA 7 β-Glucanase (U/ml)

90 80 70 60 50 40 30 20 10 ο

15 30 45 60 75 90 105

Amônia aquosa (mMj

Xilanase (U/ml)
8/25

FIGURA 8 (3 -G1 ucanase (U/ml)

Xilanase (U/ml)
9/25

FIGURA 9 β-Glucanase

Papel para Cópia (%)

Xilanase

Papel para Cópia (%)
10/25

FIGURA 10

3-Glucanase (U/ml)

Xilanase (U/ml)
11/25

FIGURA 11 (8 -Glucanase (U/ml)

Xilanase (U/ml)
12/25

FIGURA 12 β-Glucanase (U/ml)

Xilanase (U/ml)

Papel para Cópia (%)
13/25

FIGURA 13

3 -Glucanase (U/rol)

15 35 50 65 80 100 115

Sulfato de Amônio (nM)

Xilanase (U/ml)
14/25

FIGURA 14 /5 -Glucanase

Celulose cristalina %

Xilanase

Celulose cristalina%
15/25

FIGURA 15 β-Glucanase

Xilanase
16/25

FIGURA 16

0 -Glucanase (U/ml)

Xilanase (U/ml)
17/25

FIGURA 17 β -Glucanase (U/ml)

Xilanase (U/ml)
18/25

FIGURA 18 β-Glucanase (U/ml)

Sulfato de Amônio (nM)

Xilanase (U/ml)

Sulfato de Amônio (nM)
19/25

FIGURA 19 β-Glucanase (U/ml)

Xilanase (U/ml)
20/25

FIGURA 20 β-Glucanase (U/ml)

Xilanase (U/ml)
21/25

FIGURA 21 β-Glucanase (U/ml)
22/25

FIGURA 22

Glicosilação de bagaço —Φ— papel para cópia 6 %

Celulose Cristalina 3%
23/25

FIGURA 23

Glicosilação de palha de arroz

Tempo

.... papel para cópia 6 %

Celulose Cristalina 3%
24/25

FIGURA 24
25/25

FIGURA 25

Glicosilação de pó de celulose papel para cópia 6 %

Celulose Cristalina 3%