CN102586122A - 高产纤维素酶真菌的初筛方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了高产纤维素酶真菌的初筛方法，包括以下步骤：依金属离子液的质量计，将其质量0.1-5%的预处理木质纤维素、0.5-3%琼脂、0.1-1%硫酸铵、0.05-0.5%磷酸二氢钾、0.05-0.5%(w/v)TritonX-100置于容器中，在121-128℃消毒灭菌20-30分钟后取出摇匀，待温度冷却到60-90摄氏度时，加入金属离子液，得培养基液；将培养基液倒入消过毒的平板中，凝固后备用；将被筛选的菌株涂布在平板上，置于培养箱中3-20天，通过对平板上各个菌落的生长情况进行选择，挑选具有优良产酶活性的菌株；本发明是一种廉价、高效的对高产纤维素酶菌株进行初筛的方法，比传统筛选方法具有更强的工业化针对性，能有效的筛选出适应于工业化培养基的高产菌株。
Description
技术领域
本发明涉及菌株的筛选方法，具体涉及一种高产纤维素酶真菌的初筛方法。
背景技术
广泛意义的纤维素酶是指包含微生物分泌出来的可水解复杂的木质纤维素的纤维素酶的总体，同时也包含半纤维素酶等辅助酶，Endoglucanases，EG，又称葡聚糖内切酶、内切型纤维素酶，主要作用于纤维素内部的非结晶区，随机水解β-1，4糖苷键，将长链纤维素分子截短，产生大量带非还原性末端的小分子纤维素）；Cellobiohydrolases，或者CBH酶，又称葡聚糖外切酶、外切型纤维素酶、纤维二糖水解酶，（这类酶作用于纤维素线状分子还原末端，水解1，4-β-D糖苷键，每次切下一个纤维二糖分子，故又称为纤维二糖水解酶）；β-葡萄糖苷酶（BG），这类酶一般将纤维二糖水解成葡萄糖分子。含有几种与纤维素酶作用类似的半纤维素酶，主要是水解木质纤维素外壁的半纤维素。一般微生物所产生的每一种功能的酶并不是唯一的，比如T. reesei所分泌的外切酶有CBHI（占总共酶含量的60%），CBHII（20%），CBHIII，内切酶有EGI（6-10%），EGII--EGIV（5%）；β-葡萄糖苷酶有BGI和BGII（合起来占0.5%）；半纤维素酶有木聚糖酶I，II，III，IV和β-木糖苷酶。纤维素酶几种酶根据各自的作用和功能协同作用对纤维素进行水解。
一些细菌、真菌、植物和原生动物，而且无脊椎动物，包括昆虫、疥虫、环节动物、贝类和线虫类等均可产生纤维素酶。在反刍动物的瘤胃中含有共生的纤维分解菌和原生动物；在高等植物中也含有纤维素酶；在微生物方面，真菌、放线菌及细菌等在一定条件下也可产生纤维素酶。目前用于生产纤维素酶的微生物大多属于真菌，其中研究较多的有木霉属、曲霉属、根霉属和漆斑霉属，其中以1956 年发现的木霉属真菌最为突出。实验室层面上对各种产纤维素酶的微生物都有不同程度的研究， 工业化层面上一些真菌使用得比较多。
虽然我们对促使一些真菌分泌纤维素酶的天然诱导剂及其作用机理还知之甚少，但到目前为止很多的研究已经表明：一些可溶性的碳源，比如山梨糖（Sorbose），乳糖（Lactose）和槐糖（Sophorose）可以作为较好的诱导剂。一些不溶性碳源，纯的微晶纤维素、木聚糖、预处理的木质纤维素、牛粪、玉米纤维也能起到促使这些真菌产酶的作用。实验室中这些作为碳源以及纤维素酶诱导因子或者诱导因子的前体都有过使用，但是出于经济成本考虑，工业化产纤维素酶一般更适合于采用比较廉价的像秸秆等木质纤维素这样的碳源培养基。
纤维素酶具备的水解木质纤维素成糖的能力使得其具有广泛的应用前景，通过对秸秆等木质纤维素水解，将其发酵成糖，在通过发酵等方法制备燃料乙醇或者其他的化工产品， 这也是利用木质纤维素制备能源化工产品当中一个关键要素之一，纤维素酶的制备成本和效率也是能否实现生物质基能源化工产品逐渐取代石油能源和化工产品的决定因素之一。
当前有很多的科研工作投入到从天然的微生物中寻找具备很强的纤维素酶生产能力的菌株，以及在一些原有较好的菌株基础上通过变异等方式不断提高其产酶的能力，在这些工作当中有一个重要的环节就是对高产菌株的判断方式，或者怎么才能筛选出具备高产能力的菌株。微生物领域中一般采用含有特殊成分的培养基，通过微生物分泌的酶作用于培养基上产生的一些反馈信息的差异来实现这种筛选。
目前筛选培养基一般使用纯的纤维素作为碳源和诱导因子的前体，通过微生物分泌的纤维素酶作用于纯的纤维素上，将不溶的纤维素转变成可溶的葡萄糖，通过辨别透明圈的大小来实现在不同菌株产酶能力的一个初步筛选。由于微生物分泌纤维素酶组成比例等受本身诱导因子或诱导因子前体影响较大，简单的说用纯纤维素作为培养基筛选出好的菌株，对纯纤维素水解能力相对较强。但一般不一定对木质纤维素水解能也相对高。与此同时，由于筛选出来的菌株最终的工业化产酶环境不是用纯纤维素作为碳源，更多的利用一些诸如预处理的木质纤维素廉价的碳源。因此传统实验室含纯纤维素筛选配方，对于筛选酶活性差异相对较小，以及选择性较强地筛选出使用木质纤维素作为培养基碳源的发酵环境的优良菌株缺乏针对性，有一定的局限性。
发明内容
本发明的目的在于；提供一种高产纤维素酶真菌的初筛方法，针对传统纤维素酶菌株筛选培养基在对工业化筛选中针对性不足等弊端，采用粉碎后预处理的木质纤维素作为主要的碳源和诱导因子前体进行筛选，同时在结合真菌纤维素酶分泌和水解的特点的基础上，通过对高产纤维素酶的生长形态进行评判，筛选出高产的纤维素酶菌株。
本发明的技术解决方案是该初筛方法包括以下步骤：
（1）制备培养基：首先，依金属离子液的质量计，将含有其质量的0.1-5%的粉碎后的干的50目以上的预处理木质纤维素、0.5-3%琼脂、0.1-1%硫酸铵(NH4)2SO4、0.05-0.5%磷酸二氢钾KH2PO4、0.05-0.5%(w/v) TritonX-100置于容器中， 在121-128℃消毒灭菌20-30分钟后取出摇匀，待温度冷却到60-90摄氏度时，加入金属离子液，得培养基液；然后，将培养基液倒入消过毒的平板中，凝固后备用；
（2）接种筛选：将被筛选的菌株涂布在平板上，置于培养箱中3-20天，通过对平板上各个菌落的生长情况进行选择，挑选具有优良产酶活性的菌株；根据菌落生长选择性挑选是指：在整体菌落平均直径在10毫米以上后，挑选那些菌落直径相对较大，在菌落边缘不产孢子，边缘与固体培养基接触紧密，相对湿润，有肉眼可见或不可见菌丝形成，优先挑选这一菌丝地带相对较宽的菌落，以外菌丝直径与整个菌落直径的比值作为挑选菌株的初筛标准，优先挑选比值相对较大的菌落。
其中，所述的金属离子液的制备方法如下：首先，制备金属离子浓液，它含有硫酸镁、硫酸亚铁、硫酸锌、硫酸锰、氯化钴和氯化钙，其浓度为金属离子液的10-200倍；其次，稀释金属离子浓液成金属离子液，并用质量浓度36%的 HCl将金属离子液的pH调至1-3，金属离子液添加的量要确保金属离子在培养基中浓度为：硫酸镁MgSO4·7H2O 0.05-1g/L、硫酸亚铁FeSO4·7H2O 0.1-20mg/L、硫酸锌ZnSO4·7H2O 0.1-5mg/L、硫酸锰MnSO4·7H2O 0.1-10mg/L、氯化钴CoCl2·6H2O 0.1-20mg/L、CaCl 0.005-0.1g/L。
其中，所述的预处理的木质纤维素的处理方法是如下一种或者几种方法的组合：一是利用蒸汽或者超临界过热水在含有质量百分比0-2%的稀酸环境下进行蒸煮1-30分钟，酸是指盐酸、硫酸、亚硫酸、硝酸、磷酸、碳酸中的一种或其组合；二是使用质量浓度0.2- 20%的碱液在温度为60-160摄氏度蒸煮1-600 分钟；碱性物质是指氢氧化钾、氢氧化钠、碳酸钠、氨水、生石灰、氢氧化钙中的一种或其组合。
其中，所述的木质纤维素为农作物秸秆、草类、林木生物质中的一项或几项的组合；所述的农作物秸秆为稻草、麦草、棉花秆、油菜秆、玉米秆、玉米芯、大豆秆茎、花生秆茎、葵花秆、甘蔗渣中的一种或几种的组合；所述的草类为芒草、柳枝稷、芦苇中的一种或几种的组合；所述的林木生物质为软木、硬木、锯木屑中的一种或几种的组合。
本发明的初筛方法是基于真菌产酶的特点：真菌是在形成菌丝后在整体生长后期分泌出来的，分泌出来的纤维素酶能够作用于预处理后的木质纤维素，将其转变成葡萄糖，真菌利用葡萄糖，菌丝不断向外扩展，形成较大的湿润的菌丝外圈；对于酶分泌能力差的菌株，由于无法分泌纤维素酶或者分泌纤维素酶较少，在形成一定的孢子后，无法形成或者形成的菌丝圈较小，通过外圈菌丝直径与整个菌落直径的比值能反映出该菌株产酶的能力；当然通过以预处理的木质纤维素作为唯一的碳源培养基本身也筛选掉了很多无法在该培养基上生存的菌落。
本发明提供了一种廉价、高效的对高产纤维素酶菌株进行初筛和筛选评判的方法，这种初筛方法比传统的筛选方法具有更强的工业化针对性，能更有效的筛选出适应于工业化培养基的高产菌株。
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步说明本发明的技术解决方案，这些实施例不能理解为是对技术解决方案的限制。
实施例中的木质纤维素是采用稻草，湿度为20%左右，平均长度为2厘米左右；预处理条件是直接将2公斤稻草置于在50升的预处理压力容器中，在200摄氏度的湿热蒸汽下预处理10分钟；预处理的秸秆烘干后进行粉碎，再通过200目的筛子获得粉碎的预处理的木质纤维素。
实施例中的菌种是采用李氏木霉的一种变体及五种已知不同酶活的黑曲霉，其中李氏木霉通过紫外（UV）光照射和亚硝基胍(NTG)进行变异。
实施例中的酶活测定是通过测定菌株经以预处理后的稻草为碳源、以Mandels盐培养基为营养的液体培养基发酵后的酶活，通过测定发酵液单位时间单位体积水解滤纸所得的还原糖的量反应酶活大小，单位采用国际酶活定义（IU）。
实施例1：依以下步骤初筛纤维素酶真菌
（1）培养基：首先，依金属离子液的质量计，将含有其质量的0.1-5%的粉碎后的干的50目以上的预处理木质纤维素、0.5-3%琼脂、0.1-1%硫酸铵(NH4)2SO4、0.05-0.5%磷酸二氢钾KH2PO4、0.05-0.5%(w/v) TritonX-100置于容器中， 在121-128℃消毒灭菌20-30分钟后取出摇匀，待温度冷却到60-90摄氏度时，加入金属离子液，得培养基液；然后，将培养基液倒入消过毒的平板中，凝固后备用；其中，所述的金属离子液的制备方法如下：首先，制备金属离子浓液，它含有硫酸镁、硫酸亚铁、硫酸锌、硫酸锰、氯化钴和氯化钙，其浓度为金属离子液的10-200倍；其次，稀释金属离子浓液成金属离子液，并用质量浓度36%的 HCl将金属离子液的pH调至1-3，金属离子液添加的量要确保金属离子在培养基中浓度为：硫酸镁MgSO4·7H2O 0.05-1g/L、硫酸亚铁FeSO4·7H2O 0.1-20mg/L、硫酸锌ZnSO4·7H2O 0.1-5mg/L、硫酸锰MnSO4·7H2O 0.1-10mg/L、氯化钴CoCl2·6H2O 0.1-20mg/L、CaCl 0.005-0.1g/L；
（2）接种筛选：将200微升浓度为10^7的木霉孢子悬浮液在距离有效波长范围200~300 nm的30瓦UV灯15厘米处照射15分钟，稀释成合适的浓度均匀的涂布于步骤（1）中所述的培养基上，并涂布未经照射的孢子作为空白对照；30摄氏度避光培养7天后以母体为对照随机筛选出符合条件的菌落5株；以筛选到的菌落及空白菌落为种子接种木质纤维素液体培养基，摇瓶发酵后测得的酶活均高于空白酶活，其酶活与菌丝圈与菌落外径（包含菌丝圈）比值呈正相关；其中空白菌丝圈与菌落外径比值为0.389，酶活为1.1u/ml选出的菌比值分别为0.402、0.435、0.396、0.523、0.421，对应的酶活分别为1.3 2u/ml、1.53u/ml、1.2 2u/ml、1.82 u/ml及1.46 u/ml。
实施例2：依以下步骤初筛纤维素酶真菌
（1）培养基：首先，依金属离子液的质量计，将含有其质量的0.1-5%的粉碎后的干的50目以上的预处理木质纤维素、0.5-3%琼脂、0.1-1%硫酸铵(NH4)2SO4、0.05-0.5%磷酸二氢钾KH2PO4、0.05-0.5%(w/v) TritonX-100置于容器中， 在121-128℃消毒灭菌20-30分钟后取出摇匀，待温度冷却到60-90摄氏度时，加入金属离子液，得培养基液；然后，将培养基液倒入消过毒的平板中，凝固后备用；其中，所述的金属离子液的制备方法如下：首先，制备金属离子浓液，它含有硫酸镁、硫酸亚铁、硫酸锌、硫酸锰、氯化钴和氯化钙，其浓度为金属离子液的10-200倍；其次，稀释金属离子浓液成金属离子液，并用质量浓度36%的 HCl将金属离子液的pH调至1-3，金属离子液添加的量要确保金属离子在培养基中浓度为：硫酸镁MgSO4·7H2O 0.05-1g/L、硫酸亚铁FeSO4·7H2O 0.1-20mg/L、硫酸锌ZnSO4·7H2O 0.1-5mg/L、硫酸锰MnSO4·7H2O 0.1-10mg/L、氯化钴CoCl2·6H2O 0.1-20mg/L、CaCl 0.005-0.1g/L；
（2）接种筛选：取1毫升浓度为10^7的木霉孢子悬浮液，加入50微升NTG母液使得最终NTG浓度为5mg/ml，处理45分钟，离心弃上清，用大量的无菌生理盐水洗涤，稀释成合适的浓度涂布步骤（1）所述平板，并涂布未经NTG处理的孢子作为空白对照；30摄氏度培养7天后以母体为对照，随机筛选出符合条件的菌落5个；以筛选到的菌落及空白菌落为种子接种木质纤维素液体培养基摇瓶发酵后的酶活较空白均有提高，最高提高0.22 u/ml；其中空白菌丝圈与菌落外径比值为0.433对应酶活为1.53u/ml，筛选出的菌比值分别为0.52、0.62、0.55、0.48、0.6，对应的酶活分别为1.76u/ml、1.93u/ml、1.83 u/ml、1.62 u/ml及1.88u/ml。
实施例3：依以下步骤初筛纤维素酶真菌
（1）培养基：首先，依金属离子液的质量计，将含有其质量的0.1-5%的粉碎后的干的50目以上的预处理木质纤维素、0.5-3%琼脂、0.1-1%硫酸铵(NH4)2SO4、0.05-0.5%磷酸二氢钾KH2PO4、0.05-0.5%(w/v) TritonX-100置于容器中， 在121-128℃消毒灭菌20-30分钟后取出摇匀，待温度冷却到60-90摄氏度时，加入金属离子液，得培养基液；然后，将培养基液倒入消过毒的平板中，凝固后备用；其中，所述的金属离子液的制备方法如下：首先，制备金属离子浓液，它含有硫酸镁、硫酸亚铁、硫酸锌、硫酸锰、氯化钴和氯化钙，其浓度为金属离子液的10-200倍；其次，稀释金属离子浓液成金属离子液，并用质量浓度36%的 HCl将金属离子液的pH调至1-3，金属离子液添加的量要确保金属离子在培养基中浓度为：硫酸镁MgSO4·7H2O 0.05-1g/L、硫酸亚铁FeSO4·7H2O 0.1-20mg/L、硫酸锌ZnSO4·7H2O 0.1-5mg/L、硫酸锰MnSO4·7H2O 0.1-10mg/L、氯化钴CoCl2·6H2O 0.1-20mg/L、CaCl 0.005-0.1g/L；
（2）接种筛选：以相同接种量接种已知滤纸酶活大小不同的5株黑曲霉与步骤（1）所述培养基上，其酶活分别为0.5 u/ml、0.62u/ml、0.93 u/ml、1.02 u/ml、1.21 u/ml；28摄氏度培养5天量取其菌丝圈与菌落外径，其比率分别为0.11、0.15、0.18、0.24、0.32。
Claims (4)
1. 高产纤维素酶真菌的初筛方法，其特征在于该初筛方法包括以下步骤：
（1）制备培养基：首先，依金属离子液的质量计，将含有其质量的0.1-5%的粉碎后的干的50目以上的预处理木质纤维素、0.5-3%琼脂、0.1-1%硫酸铵(NH4)2SO4、0.05-0.5%磷酸二氢钾KH2PO4、0.05-0.5%(w/v) TritonX-100置于容器中， 在121-128℃消毒灭菌20-30分钟后取出摇匀，待温度冷却到60-90摄氏度时，加入金属离子液，得培养基液；然后，将培养基液倒入消过毒的平板中，凝固后备用；
（2）接种筛选：将被筛选的菌株涂布在平板上，置于培养箱中3-20天，通过对平板上各个菌落的生长情况进行选择，挑选具有优良产酶活性的菌株；根据菌落生长选择性挑选是指：在整体菌落平均直径在10毫米以上后，挑选那些菌落直径相对较大，在菌落边缘不产孢子，边缘与固体培养基接触紧密，相对湿润，有肉眼可见或不可见菌丝形成，优先挑选这一菌丝地带相对较宽的菌落，以外菌丝直径与整个菌落直径的比值作为挑选菌株的初筛标准，优先挑选比值相对较大的菌落。
2. 根据权利要求1所述的高产纤维素酶真菌的初筛方法，其特征在于所述的金属离子液的制备方法如下：首先，制备金属离子浓液，它含有硫酸镁、硫酸亚铁、硫酸锌、硫酸锰、氯化钴和氯化钙，其浓度为金属离子液的10-200倍；其次，稀释金属离子浓液成金属离子液，并用质量浓度36%的 HCl将金属离子液的pH调至1-3，金属离子液添加的量要确保金属离子在培养基中浓度为：硫酸镁MgSO4·7H2O 0.05-1g/L、硫酸亚铁FeSO4·7H2O 0.1-20mg/L、硫酸锌ZnSO4·7H2O 0.1-5mg/L、硫酸锰MnSO4·7H2O 0.1-10mg/L、氯化钴CoCl2·6H2O 0.1-20mg/L、CaCl 0.005-0.1g/L。
3. 根据权利要求1所述的高产纤维素酶真菌的初筛方法，其特征在于所述的预处理的木质纤维素的处理方法是如下一种或者几种方法的组合：一是利用蒸汽或者超临界过热水在含有质量百分比0-2%的稀酸环境下进行蒸煮1-30分钟，酸是指盐酸、硫酸、亚硫酸、硝酸、磷酸、碳酸中的一种或其组合；二是使用质量浓度0.2- 20%的碱液在温度为60-160摄氏度蒸煮1-600 分钟；碱性物质是指氢氧化钾、氢氧化钠、碳酸钠、氨水、生石灰、氢氧化钙中的一种或其组合。
4. 根据权利要求1所述的高产纤维素酶真菌的初筛方法，其特征在于：所述的木质纤维素为农作物秸秆、草类、林木生物质中的一项或几项的组合；所述的农作物秸秆为稻草、麦草、棉花秆、油菜秆、玉米秆、玉米芯、大豆秆茎、花生秆茎、葵花秆、甘蔗渣中的一种或几种的组合；所述的草类为芒草、柳枝稷、芦苇中的一种或几种的组合；所述的林木生物质为软木、硬木、锯木屑中的一种或几种的组合。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
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| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| EE01 | Entry into force of recordation of patent licensing contract |
Application publication date: 20120718 Assignee: Huaian hundred green green energy Co., Ltd. Assignor: Xiong Peng Contract record no.: 2012320000863 Denomination of invention: Method for primarily screening high-yield cellulase funguses License type: Exclusive License Record date: 20120705 |
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| LICC | Enforcement, change and cancellation of record of contracts on the licence for exploitation of a patent or utility model | ||
| C12 | Rejection of a patent application after its publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20120718 |
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| EC01 | Cancellation of recordation of patent licensing contract |
Assignee: Huaian hundred green green energy Co., Ltd. Assignor: Xiong Peng Contract record no.: 2012320000863 Date of cancellation: 20161229 |
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| LICC | Enforcement, change and cancellation of record of contracts on the licence for exploitation of a patent or utility model |