CN102251028A - 半巢式pcr酶切分型快速检测军团菌试剂液及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种军团菌快速检测试剂液，由细菌基因组DNA提取液、第一和第二PCR反应体系混合液、酶切反应液，以上各种液体分别置于容器中。还公开了试剂液的检测步骤，应用DNA提取液提取检测样品中的细菌基因组DNA，以细菌基因组DNA为模板，应用第一PCR反应体系混合液扩增15～35个循环后，以第一PCR反应产物为模板，用第二PCR反应体系混合液扩增35个循环，将所得的最终PCR产物作琼脂糖凝胶电泳；将PCR产物加入到酶切反应液中，于65℃消化5min后，将酶切产物做琼脂糖凝胶电泳检测。试剂液被广泛运用于临床标本如痰液、支气管灌洗液和环境水标本中军团菌的检测，具有快速，简便，易于使用的优点。
Description
技术领域
本发明涉及军团菌分型检测技术领域，具体为一种不仅能检测临床和环境水标本中军团菌，而且可以将军团菌进一步分型为嗜肺军团菌与非嗜肺军团菌的快速检测试剂液。
背景技术
目前，军团菌检测试剂液主要分为两大类：一是利用抗原抗体反应检测军团菌特异性抗体或抗原，此类试剂液包括军团菌ELISA法试剂液以及嗜肺军团菌尿抗原检测试剂液。因为军团菌相关抗原或抗体在军团菌感染病人体内出现较晚，一般需要一周及以上的时间才能检测到，只能检测嗜肺军团菌，而且具有一定的交叉反应，所以该类型的试剂液具有一定的局限性；第二类是利用分子生物学方法检测军团菌，如荧光定量PCR检测嗜肺军团菌试剂液，该试剂液仅可用以检测嗜肺军团菌，对非嗜肺军团菌不能检测。虽然临床上80％以上的军团菌感染是由嗜肺军团菌引起的，水环境也广泛存在嗜肺军团菌，但是非嗜肺军团菌也具有较为广泛的存在性和一定的感染力，目前已知至少有24种军团菌与人类疾病相关。因此，一种既能检测军团菌又能鉴别嗜肺军团菌与非嗜肺军团菌的检测试剂液是很必要的。
发明内容
本发明针对以上所述军团菌检测试剂液存在的不足，提供一种不仅能检测临床和环境水标本中军团菌，而且可以将军团菌进一步分型为嗜肺军团菌与非嗜肺军团菌的快速检测试剂液。
本发明是这样实现的：一种半巢式PCR酶切分型快速检测军团菌的试剂液，包括细菌基因组DNA提取液、第一PCR反应体系混合液、第二PCR反应体系混合液、酶切反应液，以上液体分别置于容器中，进行半巢式PCR和核酸内切酶酶切分析，用以鉴别嗜肺军团菌和非嗜肺军团菌。
DNA提取液组成成分：
| DNA提取液组成 | 浓度 |
| Chelex-10离子交换树脂(Chelex-100resin) | 5％ |
| 三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl pH8.3) | 10mmol/L |
| 乙二胺四乙酸二钠(EDTA-Na2) | 0.1mmol/L |
| 叠氮钠(NaN3) | 0.1％ |
| 蛋白酶K(Protease-K) | 200μg/ml |
| 总量 | 100mL |
第一PCR反应体系混合液组成成分(总量20μl)：
| 反应体系组成 | 体积(微升) |
| 2x PCR反应混合液(2×PCR Master Mix) | 12.5μl |
| 军团菌386上游引物(Leg 386F 10μmol/L) | 0.9μl |
| 军团菌386下游引物(Leg 386R 10μmol/L) | 0.9μl |
| 双蒸水(dd H2O) | 5.7μl |
第二PCR反应体系混合液组成成分(总量20μl)：
| 反应体系组成 | 体积(微升) |
| 2x PCR反应混合液(2×PCR Master Mix) | 12.5μl |
| 军团菌226上游引物(Leg 226F 10μmol/L) | 0.9μl |
| 军团菌226下游引物(Leg 226R 10μmol/L) | 0.9μl |
| 双蒸水(dd H2O) | 5.7μl |
酶切反应体系组成成分(总量20μl)：
| 反应体系组成 | 体积(微升) |
| 10x酶切缓冲液4(10×FastDidest Buffuer4) | 2μl |
| Taa I核酸内切(FastDigest Taa I) | 1μl |
| 双蒸水(dd H2O) | 17μl |
本发明用于检测军团菌的步骤如下：应用DNA提取液提取检测样品中的细菌基因组DNA；以细菌基因组DNA为模板，应用第一PCR反应体系混合液扩增15～35个循环后，以第一PCR反应产物为模板，用第二PCR反应体系混合液扩增35个循环，将所得的最终PCR产物作琼脂糖凝胶电泳；将PCR产物加入到酶切反应液中，于65℃消化5min后，将酶切产物做琼脂糖凝胶电泳检测。
本发明不仅可运用于临床标本如痰液、支气管灌洗液中军团菌的检测，也可以运用于环境水标本中军团菌检测，具有快速，简便，易于使用的优点。同时本试剂液还可以鉴别军团菌种，即通过本试剂液的检测，可以获知临床标本与水环境标本中军团菌的类型。总的来说，半巢氏PCR反应检测军团菌具有良好的敏感性和特异性，最低检测限度达1～10个军团菌DNA，特异性在95％以上；酶切反应液可对检测出的军团菌进行分型，准确率达99％。
附图说明
图1：半巢氏PCR扩增军团菌的226bp基因片段电泳图；PCR反应后琼脂糖凝胶电泳检测中出现226bp条带说明，样品中检测出军团菌。
图2：不同类型军团菌的酶切分型电泳图；a：嗜肺军团菌酶切分型电泳图，酶切后出现180bp及46bp条带；b：非嗜肺军团菌中的菲氏军团菌、昆氏军团菌等酶切分型电泳图，酶切后出现153bp及73bp条带；c：其他类型非嗜肺军团菌酶切分型电泳图，酶切后若仍为226bp条带。
下面，结合最佳实施例对本发明进一步详细描述。
具体实施方式
本发明军团菌快速检测试剂液，包括细菌基因组DNA提取液，第一PCR反应体系混合液、第二PCR反应体系混合液、酶切反应液组成，以上液体分别置于容器中。具体操作步骤如下：
(1)应用DNA提取液(表1)提取待检样品中细菌基因组DNA：
表1 DNA提取液组成成分：
| DNA提取液组成 | 浓度 |
| Chelex-10离子交换树脂(Chelex-100resin) | 5％ |
| 三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl pH 8.3) | 10mmol/L |
| 乙二胺四乙酸二钠(EDTA-Na2) | 0.1mmol/L |
| 叠氮钠(NaN3) | 0.1％ |
| 蛋白酶K(Protease-K) | 200μg/ml |
| 总量 | 100mL |
(2)以细菌基因组DNA为模板，应用第一PCR反应体系混合液(表2)，加入5μl提取的细菌基因组DNA，置PCR扩增仪，按下表(表3)所述反应条件扩增386bp片段，15～35个循环。
表2 第一PCR反应体系混合液组成成分(总量20μl)：
| 反应体系组成 | 体积(微升) |
| 2x PCR反应混合液(2×PCR Master Mix) | 12.5μl |
| 军团菌386上游引物(Leg 386F 10μmol/L) | 0.9μl |
| 军团菌386下游引物(Leg 386R 10μmol/L) | 0.9μl |
| 双蒸水(dd H2O) | 5.7μl |
表3 反应条件
(3)以5μl第一PCR反应产物为模板，加入第二PCR反应体系混合液(表4)，扩增226bp片段，按上述反应条件(表3)进行扩增，35个循环。
表4 第PCR反应体系混合液组成成分(总量20μl)：
| 反应体系组成 | 体积(微升) |
| 2x PCR反应混合液(2×PCR Master Mix) | 12.5μl |
| 军团菌226上游引物(Leg 226F 10μmol/L) | 0.9μl |
| 军团菌226下游引物(Leg 226R 10μmol/L) | 0.9μl |
| 双蒸水(dd H2O) | 5.7μl |
(4)取5μl PCR产物作琼脂糖凝胶电泳，可见226bp片段者为军团菌阳性。
(5)酶切反应：将10μl阳性PCR产物加入到酶切反应液中，于65℃水浴，消化5min，酶切产物做琼脂糖凝胶电泳检测。
(6)酶切结果分析：嗜肺军团菌可见180bp和46bp两条带，如图2a；非嗜肺军团菌中：菲氏(L.feeilei)、昆氏(L.quinlivanii)、伯明翰(L.birminghamensis)、布吕嫩(L.brunensis)、兰斯格(L.lansingensis)和圣灵湖军团菌(L.spiritensis)等6种，可见153bp和73bp两条带，如图2b；其非嗜肺军团菌不被酶切，仍为226bp条带，如图2c。
本发明可制造成试剂盒，其组成如下表(表5)：
| 编号 | 试剂盒组成 | 包装(20次) |
| 1 | DNA提取液 | 1ml |
| 2 | PCR反应液1 | 500μl |
| 3 | PCR反应液2 | 1ml |
| 4 | 酶切反应液 | 400μl |
| 5 | 阳性对照 | 1ml |
| 6 | 阴性对照 | 1ml |
| 7 | DNA Marker | 300μl |
| 12 | 说明书 | 1份 |
使用本试剂盒分型检测军团菌种，最低可检测出标本中1～10个军团菌DNA，特异性达95％以上。
试剂盒的操作步骤
1.标本预处理(以痰液处理和环境水标本处理为例，其他标本可参照处理)
A.痰标本处理
1)1.5ml离心管中加入0.5ml可供军团菌使用的痰消化液。
2)用枪头或灭菌牙签从痰标本中吸取或挑取约0.5ml痰标本，置于上述痰消化液中。
3)充分混匀后，37℃水浴10～30min。
4)13000rpm离心5分钟后，弃上清，用0.5ml无菌水洗涤2次后离心留沉淀，支气管灌洗液等流程标本直接离心沉淀浓缩。
B.水样处理
1)水样置于50ml离心管中，10000rpm离心10min，弃上清，留底部1ml悬液，转移至1.5m离心管。
2)13000rpm离心5min。弃上清，留沉淀物。
2.标本中细菌基因组DNA的提取
1)上述留取沉淀的离心管中加入50μlDNA提取液，充分混匀。
2)55℃水浴30min，后100℃水浴10min。
3)冷却后，10000rpm离心5min，将上清吸至另一离心管中，所得上清即为标本中的细菌基因组DNA溶液。
3.PCR反应
1)每个标本准备3个PCR管，做3个反应体系，除了标本为一个体系外，阳性对照及阴性对照亦各为一个体系。
2)取PCR反应液24μl于PCR管中，加入基因组DNA1μl。
3)各管PCR反应条件：[94℃ 3min，94℃ 30s，57℃ 30s，72℃ 30s，72℃5min，4℃贮存，步骤2～4的15～35个循环]。
4)反应完成后，每个管中加入45μl PCR反应液2，继续行PCR，各管PCR反应条件：[94℃3min，94℃ 30s，57℃ 30s，72℃ 30s，72℃ 5min，4℃贮存，步骤2～4的35循环]
5)琼脂糖凝胶电泳，5μlPCR产物，1.5％琼脂糖凝胶中，电压100v，电泳40分钟，加入DNA Marker 5μl，其条带从小到大分别为100bp，200bp，300bp，400bp，500bp，600bp。
6)凝胶成像，若出现226bp条带，则说明标本中检出军团菌。若无226bp条带出现，则标本中未检出军团菌。具体见说明书附图。
注意：若凝胶成像后，阴性对照出现该条带，或(和)阳性对照未出现226bp条带则实验结果不可信，可能存在污染及误操作。
4.酶切反应
1)上一步获得的PCR产物，取10μl加入到小离心管中。
2)加入20μl酶切反应液，混匀后放置于65℃温箱，反应5min，取出。
3)取8μl做琼脂糖凝胶电泳。加入DNA Marker 5μl用以了解条带大小。
结果与解释
1.PCR结果的解释
1)阳性结果：PCR反应后琼脂糖凝胶电泳检测中出现226bp条带，说明样品中检测出军团菌(图1)。
2)阴性结果：PCR反应后琼脂糖凝胶电泳检测未出现226bp条带，说明样品中未检测出军团菌。报告为：未检测出军团菌。
注意：
①阳性结果若出现226bp条带暗淡，可取PCR产物5μl加入45μlPCR反应液2，按上述条件再行PCR一次。
②阳性结果若出现386bp条带，应减少第二次PCR时386bp模板的用量或者对其稀释后再使用。
2.酶切反应结果解释
1)结果1：酶切后出现180bp及46bp(可能不出现)条带，说明检测出嗜肺军团菌。(图2a)
2)结果2：酶切后出现153bp及73bp条带，说明检测出非嗜肺军团菌中的菲氏军团菌(L.feeleii)、昆氏军团菌(L.quinlivanii)、水手军团菌(L.nautarum)和伯明翰军团菌(L.birminghamiensis)等。(图2b)
3)结果3：酶切后若仍为226bp条带，则说明样品中仅有非嗜肺军团菌[菲氏(L.feeleii)及昆氏(L. quinlivanii)等除外。(图2c)。
4)结果4：酶切后若出现上述条带的合集(同时存在多个条带)，说明样品中含有同时存在嗜肺军团菌和非嗜肺军团菌。
Claims (2)
1.一种半巢式PCR酶切分型快速检测军团菌试剂液，其特征在于，它由细菌基因组DNA提取液、第一PCR反应体系混合液、第二PCR反应体系混合液和酶切反应液组成，以上各种液体单独盛于容器中；
其中，第一PCR反应体系混合液的组分为：2×PCR反应混合液12.5μl，军团菌386上游引物0.9μl，军团菌386下游引物0.9μl，双蒸水5.7μl；
第二PCR反应体系混合液组分为：2×PCR反应混合液12.5μl，军团菌226上游引物0.9μl，军团菌226下游引物0.9μl，双蒸水5.7μl。
2.如权利要求1所述的试剂液的应用，其特征在于检测军团菌的步骤如下：
应用DNA提取液提取检测样品中的细菌基因组DNA；
以细菌基因组DNA为模板，应用第一PCR反应体系混合液扩增15～35个循环后，以第一PCR反应产物为模板，用第二PCR反应体系混合液扩增35个循环，将所得的最终PCR产物作琼脂糖凝胶电泳；
将PCR产物加入到酶切反应液中，于65℃消化5min后，将酶切产物做琼脂糖凝胶电泳检测。
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