CN102250921B

CN102250921B - 一种多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白基因CaPGIP1及其抗病性技术

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Publication number: CN102250921B
Application number: CN201110158939A
Authority: CN
Inventors: 张修国
Original assignee: Shandong Agricultural University
Current assignee: Shandong Agricultural University
Priority date: 2011-06-14
Filing date: 2011-06-14
Publication date: 2012-09-12
Anticipated expiration: 2031-06-14
Also published as: CN102250921A

Abstract

本发明属于植物生物技术领域，特别提供了克隆自辣椒的1个多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白基因CaPGIP1，该基因能特异的抑制病原菌分泌的多聚半乳糖醛酸酶（PGs）活性，本发明提供该基因编码的蛋白制作、酶活测定、基因沉默、转基因过量表达等功能验证技术及其应用。立足于基因和蛋白质操作技术，证明了CaPGIP1基因有效的参与了胁迫因子诱导辣椒的防卫反应，并对多种病原菌分泌的多聚半乳糖醛酸酶（PGs）活性具抑制效果。利用基因沉默和转基因技术进一步证明了该基因在辣椒中沉默或少量表达降低了寄主的抗病性，而在转基因烟草中过量表达使其抗性增强，因此该基因编码一种重要的抗病相关蛋白。本发明为转化多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白（PGIP）基因和培育抗病新品种提供了重要的技术储备。

Description

一种多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白基因CaPGIP1及其抗病性技术

技术领域

本发明属分子生物学领域，具体地说，本发明涉及一种多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白基因CaPGIP1的基因克隆、功能验证及其应用技术。

背景技术

植物病原菌与寄主互作过程中，可分泌多种细胞壁降解酶，主要包括多聚半乳糖醛酸酶(PG)、果胶酸盐裂解酶(Pel)、果胶甲基酯酶(Pme)和β-半乳糖苷酶(LacZ)，其中PG是重要的细胞壁降解酶，这些酶类主要通过降解细胞壁的重要组分果胶而破坏细胞壁，促进病菌的侵染致病，导致寄主产生病变症状或加速病程发展，同时为病原菌的生长和繁殖提供糖源营养，多项研究证明了PG在植物病原菌侵染寄主及其病程中的重要作用。

研究发现多种植物含多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白PGIP基因，PGIP基因是一种富含亮氨酸重复(LRRs)的特异性细胞壁结合蛋白，能专一地抑制病原菌内切型PGs活性，该类蛋白与PG特异性结合能有效的促进植物体内与抗性有关的寡聚半乳糖醛酸(OGs)的积累，而有效地激活植物的防御系统和抗病信号转导，增强植物的抗病性，从而阻断病菌侵染寄主和抑制病程的发生与发展。PGIP与病原真菌分泌的内切型PG结合，减少了内切型PG对植物细胞壁的降解，有助于维护植物细胞壁的完整性，使其不易被病原真菌分泌的其它水解酶所渗透，减缓了细胞壁的降解，减少了可供病原真菌利用的养分，进而抑制了病菌的定殖与繁殖，增强了植物的抗病性。在对PGIP特性充分认识的基础上，借助基因和蛋白操作技术，人类首次从菜豆下胚轴、番茄茎和桐叶槭悬浮培养细胞的蛋白提取物中发现了PGIP，并证明了该类蛋白能抑制植物病原真菌分泌的PG活性，随后从菜豆中克隆了2个PGIP基因，两者均编码342个氨基酸残基，含29个氨基酸残基的信号肽和313个氨基酸残基的成熟肽，随后研究发现将外源PGIP基因整合到植物基因组中，使其进行组成型表达，可提高植物的抗病性，从而为进一步克隆PGIP基因及利用该类基因改良作物抗病性提供了技术储备。

在世界范围内，鉴于PGIP基因可增强植物的抗病性，该类基因的研究已显现出强劲的发展势头，国外许多公司已把多个PGIP基因转入目的植物，改良或增强植物抗病性，获得抗病植物，抑制了病害的发生，减少了农药使用量，产生了巨大经济效益。但是现有技术中还未公开过辣椒多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白PGIP基因对植物病原菌分泌的多聚半乳糖醛酸酶PG活性抑制作用及其转基因植物抗病性提高的研究资料信息。

发明内容

基于上述的原因，本发明提供了1个克隆自辣椒的多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白基因CaPGIP1及其蛋白质制作、酶活测定、功能验证及其应用操作技术。依据基因和蛋白操作技术，证明了该基因能有效的抑制病原真菌分泌的多聚半乳糖醛酸酶(PGs)活性，抑制病菌的侵染，提高植物的抗病性。在此基础上，借助基因沉默技术证明了CaPGIP1基因的功能缺失，使辣椒的抗病性降低，而转基因技术表明CaPGIP1基因在烟草中的过量表达可提高其抗病性。因此，该基因在植物的抗病性中扮演了重要的角色，本发明为进一步挖掘PGIP基因资源及系统开展转PGIP基因植物技术研发和培育抗病新品种提供重要的技术储备。

本发明提供的多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白基因CaPGIP1，其特征在于：其基因序列如SeqID No：1所示；其氨基酸序列为SEQ ID NO：2所示，该基因编码的蛋白质能有效的抑制病原真菌分泌的多聚半乳糖醛酸酶活性。

该基因开放阅读框有1038个碱基，编码一种含有345个氨基酸的蛋白质，分子量为38.8kDa，有36个氨基酸的信号肽，4个N-糖基化位点(分别为SEQ ID NO：2序列中的121，145，159，306氨基酸)，无内含子。

该基因的具体克隆制备方法为：

1、CaPGIP1基因克隆：

A：辣椒基因组DNA提取，采用CTAB法，辣椒品种为克星3号；

B：PCR获得目的基因：根据NCBI数据库上所有植物PGIP基因保守序列，设计兼并引物PGIP1-1(其序列如Seq ID No：3所示)和PGIP1-2(其序列如Seq ID No：4所示)，PCR扩增得到423bp基因片段；

C：Tail-PCR方法获得基因5’和3’段，获得目的基因开放阅读框。

2、CaPGIP1基因表达差异分析：

A：样品准备，取辣椒不同组织器官(根、茎、叶、花、果实)，-80℃保存；胁迫因子(水杨酸、茉莉酸甲酯、脱落酸、创伤、冷冻)处理4-6叶期辣椒叶片，0、1、2、6、12、18、24、36、48h后取样；

B：总RNA抽提，根据RNA提取试剂盒(购自天根生化科技有限公司)；

C：反转录合成cDNA第一链；

D：根据CaPGIP1基因序列，设计特异引物PGIP1F-qPCR(其序列如Seq ID No：15所示)和PGIP1R-qPCR(其序列如Seq ID No：16所示)，荧光定量PCR检测不同处理在不同处理阶段的基因表达差异。

3、基因原核表达与蛋白纯化：

A：CaPGIP1基因蛋白表达

根据CaPGIP1基因序列设计特异引物PGIP1-YHSP(其序列如Seq ID No：17所示)和PGIP1-YHASP(其序列如Seq ID No：18所示)，构建基因原核表达载体pET28a-CaPGIP1；转化大肠杆菌Trans-rosetta感受态细胞，筛选抗卡那霉素的转化子；异丙基硫代-β-D半乳糖苷(IPTG)诱导获得原核表达蛋白；

B：CaPGIP1基因蛋白纯化，将表达蛋白过Ni-NTA凝胶树脂，洗脱获得纯化蛋白。

4、PGs-CaPGIP1活性测定：

A：植物病原菌的准备，收集并培养玉米纹枯、玉米大斑、玉米弯孢霉叶斑、小麦赤霉、小麦全蚀、小麦根腐、小麦纹枯、辣椒疫霉、大豆疫霉、黄瓜疫霉、烟草疫霉和荔枝霜疫霉病菌；

B：PGs诱导，分别用果胶诱导获得粗PGs溶液；

C：D-半乳糖醛酸标准曲线的制作，绘制1mg/ml的D-半乳糖醛酸溶液OD540nm标准曲线；

D：CaPGIP1对不同PGs活性抑制效果测定，紫外分光光度法检测CaPGIP1对不同参试病菌PGs活性抑制效果差异。

5、辣椒体内CaPGIP1基因沉默：

A：转化载体的构建，设计特异引物GS12SP(其序列如Seq ID No：19所示)和GS12ASP(其序列如Seq ID No：20所示)，构建沉默表达载体pTRV2-CaPGIP1；

B：菌体收集及侵染，提取上述重组表达载体质粒，转化农杆菌GV3101感受态细胞，筛选抗利福平及卡那霉素的转化子，阳性农杆菌转化子利用LB液体培养基(含卡那霉素和利福平各50mg/ml)震荡培养，收集菌体后，用无菌注射器将农杆菌悬浮液注入辣椒叶片中，使辣椒体内CaPGIP1基因进行瞬时沉默；

C：荧光定量PCR检测沉默植株CaPGIP1基因的表达情况，3-4周后荧光定量PCR检测基因表达量变化；

D：接种检测沉默植株抗病性情况，接种辣椒疫霉菌株，检测辣椒寄主的抗性变化。

6、烟草体内CaPGIP1基因过量表达及其抗性检测：

A：遗传转化载体的构建，设计特异引物OE1SP(其序列如Seq ID No：21所示)和OE1ASP(其序列如Seq ID No：22所示)，构建沉默表达载体pROK II-CaPGIP1；

B：农杆菌介导的遗传转化，提取上述重组表达载体质粒，转化农杆菌LBA4404感受态细胞，筛选抗利福平及卡那霉素的转化子，阳性农杆菌转化子利用LB液体培养基(含卡那霉素和利福平各50mg/ml)震荡培养，收集菌体后，侵染烟草外植体，组织培养获得转基因烟草植株；

C：转基因烟草的PCR检测，以烟草植株DNA为模板，以OE1SP(其序列如Seq ID No：21所示)和OE1ASP(其序列如Seq ID No：22所示)为引物，PCR扩增；

D：接种检测转基因阳性植株抗病性情况，接种烟草炭疽病菌和烟草赤星病菌，检测烟草寄主的抗病性变化。

本发明的实例部分阐述了CaPGIP1基因克隆、蛋白表达纯化、酶活测定、基因沉默、转基因功能验证及其应用技术。本发明所用的载体和宿主菌均为常见，Peasy-T3为CaPGIP1基因宿主载体，DH5α为宿主细胞；pET-28a为CaPIP1基因原核表达载体，Trans-rosetta为该基因的表达宿主菌；pROK II为CaPIP1基因过量表达载体，农杆菌LBA4404为该基因的表达宿主菌；pTRV2为沉默表达载体，pTRV1为沉默表达的辅助质粒，农杆菌GV3101为该基因的表达宿主菌。

综上所述，本发明依据基因和蛋白操作技术，证明了多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白基因CaPGIP1能有效的抑制病原真菌分泌的多聚半乳糖醛酸酶(PGs)活性，抑制病菌的侵染，提高植物的抗病性。在此基础上，借助基因沉默技术证明了CaPGIP1基因的功能缺失，使辣椒的抗病性降低，而转基因技术表明CaPGIP1基因在烟草中的过量表达可提高其抗病性。因此，该基因在植物的抗病性中扮演了重要的角色，本发明为进一步挖掘PGIP基因资源及系统开展转PGIP基因植物技术研发和培育抗病新品种提供重要的技术储备。

附图说明

图1.CaPGIP1基因重组原核表达载体示意图；

图中Kan为卡那抗性，MCS为多克隆位点，BamH I和EcoR I为双酶切位点，CaPGIP1为目的基因；

图2.CaPGIP1基因原核表达蛋白结果电泳图；

图中M为标准蛋白Marker(由上至下电泳带分别为：100、62、40、30、20、14kDa)，1为pET28a(+)-CaPGIP1重组菌IPTG诱导前；2-7为重组菌IPTG诱导后表达蛋白，诱导获得38KDa目的蛋白，8为纯化蛋白；

图3.CaPGIP1基因在辣椒不同组织器官(根、茎、叶、花、果实)中的荧光定量PCR检测结果示意图；

图4为辣椒受5mM水杨酸(SA)刺激后CaPGIP1基因荧光定量PCR检测结果示意图；

图5为辣椒受100uM茉莉酸甲酯(MJA)刺激后CaPGIP1基因荧光定量PCR检测结果示意图；

图6为辣椒受100uM脱落酸(ABA)刺激后CaPGIP1基因荧光定量PCR检测结果示意图；

图7为辣椒创伤(Wounding)刺激后CaPGIP1基因荧光定量PCR检测结果示意图；

图8为辣椒受冷冻(Cold)刺激后CaPGIP1基因荧光定量PCR检测结果示意图；

图9为D-半乳糖醛酸标准曲线图；

图10为CaPGIP1对PGs活性抑制效果统计图；

图中1-12分别代表诱导玉米纹枯、玉米大斑、玉米弯孢霉叶斑、小麦赤霉、小麦全蚀、小麦根腐、小麦纹枯、辣椒疫霉、大豆疫霉、黄瓜疫霉、烟草疫霉和荔枝霜疫霉病菌产生的PGs粗溶液及分别加入CaPGIP1和灭活CaPGIP1后的活性；

图11为CaPGIP1基因沉默表达载体示意图；

图中2×35S为启动子，BamH I和Smal I为双酶切位点，CaPGIP1为目的基因；

图12为辣椒CaPGIP1基因沉默后，荧光定量PCR检测其表达结果示意图；

1为野生型对照；2为接种pTRV1-TRV2载体对照；3为接种pTRV1-CaPGIP1沉默植株。

图13为CaPGIP1基因沉默后辣椒和对照辣椒接种辣椒疫霉菌后发病情况灰度图；

图14为CaPGIP1基因沉默后辣椒和对照辣椒接种辣椒疫霉菌后病斑面积统计结果示意图；

图15为CaPGIP1转基因表达载体示意图；

图中Kan(r)为卡那抗性；CaMV35SPro为启动子；BamH I和Kpn I为双酶切位点；CaPGIP1为目的基因；

图16为PCR检测转基因植株F₀代CaPGIP1基因表达情况电泳示意图；

1为野生型对照；2为转空载体对照；3为基因阳性质粒；4-12为不同转基因阳性植株；M为分子标记(自上至下依次为：2000、1000、750、500、250、100bp)；

图17为转基因阳性植株和对照组(野生型和转空载pROK II植株)接种烟草炭疽病菌TBC-01后抗病情况检测灰度图；图中A、B、C分别为野生型对照、转空载pROK II对照、转基因烟草。

图18为转基因阳性植株和对照组(野生型和转空载pROK II植株)接种烟草赤星病菌TBA-003后抗病情况检测灰度图；图中A、B、C分别为野生型对照、转空载pROK II对照、转基因烟草。

具体实施方式

本发明所提供的实施例，均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(NewYork：Gold Spring Harbor Laboratory Press，1989)，或Draper，J等(Blackwell科学出版社，1988)所述的操作技术规程或按制造商的建议实验条件。

实施例1：基因克隆

根据已报道的PGIP基因序列设计引物，PGIP1-1(其序列如Seq ID No：3所示)和PGIP1-2(其序列如Seq ID No：4所示)，以辣椒基因组DNA为模板，PCR扩增获得CaPGIP1基因片段，按照Tail-PCR原理，根据目的基因设计特异引物J5-1(其序列如Seq ID No：5所示)、J5-2(其序列如Seq ID No：6所示)、J5-3(其序列如Seq ID No：7所示)及通用引物AD4(其序列如Seq IDNo：8所示)获得基因的5’段侧翼序列，设计引物J3-1(其序列如Seq ID No：9所示)、J 3-2(其序列如Seq ID No：10所示)、J 3-3(其序列如Seq ID No：11所示)和通用引物AD2(其序列如SeqID No：12所示)获得基因的3’段侧翼序列，然后设计全长引物PGIP1SP(其序列如Seq ID No：13所示)、PGIP1ASP(其序列如Seq ID No：14所示)从而得到完整基因的开放阅读框。

1、辣椒寄主基因组DNA提取(CTAB法)

A：试材及用具

试材：辣椒幼嫩叶片或果实

仪器用具：离心机、离心管、紫外分光光度计、微量移液器、吸头、吸水纸、水浴锅、冰箱、研钵、液氮罐、电子天平、pH计、高压灭菌锅、一次性手套和口罩、电泳仪、电泳槽等。

配置药品和缓冲液：

提取DNA缓冲液(CTAB法)：2％CTAB(W/V)，100mmol/L Tris-HCI pH 8.0，20mmol/L EDTApH 8.0，1.4mol·L^-1NaCl，2％PVP(灭菌后加入2％PVP，使之充分溶解)。在研磨叶片前加入1％(V/V)β-巯基乙醇。

氯仿/异戊醇(24∶1，v/v)：将氯仿和异戊醇按24∶1混匀，置棕色瓶中，4℃保存。

酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)：按饱和酚、氯仿、异戊醇体积比为25∶24∶1比例混匀，置棕色瓶中，4℃保存。

B：方法步骤

(1)在65℃水浴预热CTAB提取液。

(2)在液氮中研磨2-3g新鲜样品或-20℃冷冻样品材料。

(3)迅速加入CTAB提取液，混匀，倒入离心管中，65℃水浴30min，其间不断轻轻摇动离心管。

(4)加入5mol/L的乙酸钾充分混匀，在冰浴中放置30min中，4℃12000rpm离心5min，吸上清。

注意：对于幼嫩叶片此步可以省略，对成熟的老叶片需采用。

(5)加入等体积氯仿/异戊醇，混匀，放置10min，12000rpm常温离心10min。

(6)吸上清至新离心管中，用氯仿/异戊醇重复抽提一次。

(7)吸上清至新离心管中，加入2.5倍体积的无水乙醇，混匀，-20℃放置10-30min沉淀DNA。

(8)10000rpm常温离心10min。

(9)去掉乙醇，用400μL70％乙醇洗沉淀，然后用400μL100％乙醇洗沉淀，吹干后用200-500μL TE溶解DNA。

(10)溶解后的DNA再用氯仿/异戊醇抽提一遍.

(11)吸上清至新离心管中，加入2.5倍体积的无水乙醇，混匀，-20℃放置10-30min，沉淀DNA。

(12)离心，弃上清，70％乙醇洗沉淀，再用100％乙醇洗沉淀，吹干后，用200μLTE溶解DNA。用紫外分光光度计测定浓度后，按要求的浓度(如200μg·μL^-1)再向DNA溶液中加入适量TE，在-20℃冰箱中可长期保存。

2、PCR扩增获得目的基因

A：PCR反应程序

95℃4min；94℃1min，55℃45s，72℃45s，共35个循环；最后72℃延伸10min。

B：反应体系

ddH₂O(32.5μL)，10×buffer(5μL)，MgCL₂(4μL)，dNTP(4μL)，PGIP1-1(1μL)，PGIP1-2(1μL)，DNA(2μL)，TaqE(0.5μL)。

取反应产物电泳，确定含目的基因大小单克隆，送上海博亚生物有限公司测序。然后借助NCBI中的BLAST程序对获得基因进行同源序列比较，确定获得目的基因片段为423bp。

3、Tail-PCR获得基因全长

A：PCR反应程序

第一轮：94℃1min，98℃1min；94℃30s，68℃1min，72℃2min，5个循环；94℃30s，30℃3min，72℃2min；94℃30s，68℃1min，72℃2min，94℃30s，64℃1min，72℃2min，94℃30s，44℃1min，72℃2min，15个循环；72℃10min总延伸；第二、三轮：94℃5min；94℃30s，60℃1min，72℃2min，94℃30s，60℃1min，72℃2min，94℃30s，44℃1min，72℃2min，15个循环；72℃10min总延伸。

B：反应体系

ddH₂O(28.5μL)，10×buffer(5μL)，MgCL₂(4μL)，dNTP(8μL)，AD(1μL)，特异引物(对应每一轮)(1μL)，DNA(2μL)，TaqE(0.5μL)。

取最后一轮反应产物电泳，确定含有单一目的条带单克隆，送上海博亚生物有限公司测序。然后借助NCBI中的BLAST程序对获得基因进行同源序列比较，确定获得片段为目的基因的5’和3’端侧翼序列，并从中设计扩增目的基因全长的特异引物，以辣椒DNA为模板，克隆获得开放阅读框为1038bp的全长基因，根据基因全长序列推测其氨基酸序列及其编码的蛋白质分子量(约为38.6kDa)。

实施例2：CaPGIP1基因表达差异分析

1、样品准备

取辣椒不同组织器官(根、茎、叶、花、果实)，-80℃保存备用；用胁迫因子(水杨酸、茉莉酸甲酯、脱落酸、创伤、冷冻)处理4-6叶期辣椒叶片，0、1、2、6、12、18、24、36、48h后取样，-80℃保存备用。

2、辣椒RNA提取

总RNA抽提根据RNA提取试剂盒(购自天根生化科技有限公司)

(1)匀浆处理：

50-100mg辣椒植物叶片液氮研磨成粉末，加入450μl RL(使用前检查是否已加入β-巯基乙醇)，涡旋剧烈震荡混匀。

注意1：在56℃水浴1-3min有助于植物组织裂解。

注意2：由于植物多样性非常丰富，而且同种植物的不同生长发育阶段和不同组织的RNA含量不同，根据具体实验情况选择合适的植物材料用量。

(2)将所有溶液转移至过滤柱CS(过滤柱CS放于收集管)，12,000rpm(13,400×g)离心2-5分钟，小心吸取收集管中的上清至RNase-free离心管中，吸头尽量避免接触收集管中的细胞碎片沉淀。

注意：由于裂解液较粘稠，将溶液转移至过滤柱时，可剪去部分吸头末端。

(3)缓慢加入0.5倍上清体积的无水乙醇(通常为225μl)，混匀(此时可能会出现沉淀)，将混合溶液和沉淀一起转入吸附柱CR3中，12,000rpm(13,400×g)离心30-60s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR3放回收集管中。

注意：如上清液体积有损失，可调整乙醇加量。

(4)向吸附柱CR3中加入350μl去蛋白液RW1，12,000rpm(13,400×g)离心30-60秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR3放回收集管中。

(5)DNaseI工作液配制：取10μl DNaseI储存液放入新的RNase-free离心管中，加入70μl ROD溶液，轻柔混匀。

(6)向吸附柱CR3中央部位加入80μlDNaseI工作液，室温放置15分钟。

(7)向吸附柱CR3中加入350μl去蛋白液RW1，12,000rpm(13,400×g)离心30-60s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR3放回收集管中。

(8)向吸附柱CR3中加入500μl漂洗液RW(使用前请先检查是否已加入乙醇)，室温静置2min，12,000rpm(13,400×g)离心30-60s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR3放回收集管中。

(9)重复步骤(8)。

(10)12,000rpm(13,400×g)离心2min，倒掉废液，将吸附柱CR3置于室温放置数分钟，彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。

注意：此步骤目的是将吸附柱CR3中残余漂洗液去除，漂洗液的残留，可能会影响后续的RT等实验。

(11)将吸附柱CR3放入一个新的RNase-free离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加30-100μl RNase-free ddH₂O，室温放置2min，12,000rpm(13,400×g)离心2min，获得RNA溶液。

注意：洗脱缓冲液体积不少于30μl，体积过小影响回收效率，RNA样品于-80℃下保存。

RNA纯度及浓度检测

完整性：RNA可用普通琼脂糖凝胶电泳(电泳条件：胶浓度1.2％；0.5×TBE电泳缓冲液；150v，15分钟)检测完整性。由于细胞中70％-80％的RNA为rRNA，电泳后UV下应能看到非常明显的rRNA条带。出现弥散片状或条带消失表明样品严重降解。纯度：OD260/OD280比值是衡量蛋白质污染程度的指标。高质量的RNA，OD260/OD280读数在1.8-2.1之间，比值为2.0是高质量RNA的标志。

浓度：取一定量的RNA提取物，用RNase-free ddH₂O稀释n倍，用RNase-free ddH₂O将分光光度计调零，取稀释液进行OD260，OD280测定，按照以下公式进行RNA浓度的计算：终浓度(ng/μl)＝(OD260)×(稀释倍数n)×40

3、反转录合成cDNA第一链

(1)将模板RNA在冰上解冻，引物、10×RT mix、dNTP混合液、RNase-free ddH₂O在室温解冻，解冻后迅速置于冰上。使用前将每种溶液漩涡振荡混匀，简短离心以收集残留在管壁上的液体。

(2)反转录体系配制混合液包括2ul引物、2ul 10×RT mix、2ul dNTP混合液、1ul QuantReverse Transcriptase，彻底混匀，漩涡振荡时间不超过5秒，简短离心并置于冰层。

(3)将模板RNA(50ng-2ug)加入至混合液中，彻底混匀，加入RNase-free ddH₂O补足20ul反应体系，漩涡振荡时间不超过5秒，简短离心以收集残留于管壁中的液体。

(4)37℃水浴60min。

(5)将反转录产物进行后续荧光定量PCR检测。

4、荧光定量PCR分析

SYBR检测方法：

(1)将20×SYBR solution在室温下平衡并彻底混匀。

(2)将125ul 20×SYBR solution加入至1.0ml 2.5×RealMasterMix中，混匀。

反应体系：11.25ul 2.5×RealMasterMix，0.5ul Primerl(PGIP1F-qPCR)，0.5ulPrimer2(PGIP1R-qPCR)，1ul eDNA模板，11.75ul超纯水，共25ul。

反应程序：95℃ 1-2min；95℃20s，58℃30s，35-45个循环；68℃60s延伸。反应结束后，查看PCR仪上收集的数据：扩增曲线、溶解曲线及CT值，初步推测本次PCR是否精确，数据是否可用，合格后即可以通过2^-ΔΔCt法进行基因表达差异的分析，计算方法如下：

第一步：应用参照基因对校准样本和待测样本进行校正：

ΔCt_{(标准样本)}＝基因的(平均CT值)-18sRNA的(平均CT值)

＝a-b

ΔCt_{(待测样本)}＝基因的(平均CT值)-18sRNA的(平均CT值)

＝c-d

第二步：校准样本和待测样本的ΔCt进行归一化：

ΔΔCt＝ΔCt_{(待测样本)}-ΔCt_{(校准样本)}

＝(c-d)-(a-b)

第三步：表达差异的计算：

2^-ΔΔCt＝2^{-【(c-d)-(a-b)】}

以此类推，最后通过柱状图形象的表示出基因表达量的差异。

如图3-8所示，图3为CaPGIP1基因在辣椒不同组织器官(根、茎、叶、花、果实)中的表达情况，果实中的表达量最高，叶片次之；图4为辣椒受5mM水杨酸(SA)刺激后，CaPGIP1基因在处理6h内表达量持续升高，然后缓慢下降；图5为辣椒受100uM茉莉酸甲酯(MJA)刺激后18h内目的基因呈上调表达趋势，随之下降；图6为辣椒受100uM脱落酸(ABA)刺激后，CaPGIP基因在第6h时基因表达量达到高峰，其它时段表达量变化不大；图7为辣椒受创伤(Wounding)刺激后，基因表达呈现上调表达至18h达到最大，随后缓慢下降至正常水平；图8为辣椒受冷冻(Cold)刺激后即开始诱导基因表达，12h表达量最大随后下降，在受到不同刺激后，基因均出现上调表达趋势，这与此类基因的作用机理是一致的，外界的刺激，激活了植物体内的防御系统，PGIP的表达量升高说明PGIP也参与了植物的防卫反应，从而有效地提高了植物的抗性。

实施例3：基因原核表达与蛋白纯化

1、CaPGIP1基因原核表达

提取表达载体pET28a(+)质粒备用，经PCR扩增后的CaPGIP1基因通过琼脂糖凝胶电泳进行纯化回收后待用。

将基因和载体质粒进行双酶切，酶切体系为：CaPGIP1基因/pET28a质粒10-20g，10×Buffer 10μL，BamHI 4μL，EcoRI 4μL，加入ddH2O至40ul

混合后于37℃水浴酶切4h以上，然后通过琼脂糖凝胶电泳进行纯化回收，待用。

基因和载体进行连接转化：酶切后pET-28a(+)1-3μL，酶切后CaPGIP1基因5-7μL，Solution I 1ul，共10ul。

混合后于16℃水浴反应4h后进行连接。

连接步骤：

取连接产物10μL加入到50μLDH5α感受态细胞中，小心的放入42℃水浴中热激90s，快速放入冰水中2min；加入800μL不含抗性的LB培养基，37℃水浴1h以上；12,000转/分离心2min，吸弃大部分上清培养基，剩余约100μL吹打悬浮沉淀；涂布含有卡那抗生素的LB琼脂平板，倒置平板37℃培养过夜。

重组质粒的鉴定：

从每一个培养板上各挑出五个菌落，接入5ml的LB培养基中，培养过夜，提取质粒备用。

PCR鉴定：取1μL质粒按前面基因扩增的体系和步骤进行PCR，产物通过琼脂糖凝胶进行电泳检测，将阳性菌送测序公司测序检测。

双酶切鉴定：按前面载体双酶切的体系和步骤进行双酶切，产物通过琼脂糖凝胶进行电泳检测。

目的蛋白的试表达：

将阳性重组质粒转化表达宿主Trans-rosetta(DE3)，涂于卡那抗性平板。

(1)从LB平板上分别挑取4个单克隆菌落，接入5ml LB(50mg/L Kan)的15ml离心管中，于37℃震荡培养OD值至0.6-0.8之间。

(2)每一个试管各取500μL菌液和15％的甘油1∶1(V/V)混合后装至灭菌冻存管中，-80℃保存。

(3)再从每一个试管中取500μL的菌液，做为诱导表达前的对照。

(4)向每一个试管中加入5μL的IPTG(终浓度为1mM/L)，37℃200rpm诱导表达4h。

(5)诱导结束后再各取500μL的菌液，与诱导前的菌液一起离心，12000rpm，2min。

(6)弃掉上清，各加入10μL的5×样品缓冲液，于100℃加热5min使之变性。上样前离心，12000rpm，5min。

(7)15％SDS-PAGE电泳分析表达结果

表达蛋白的大量表达：

挑取阳性克隆，接种到含有50mg/L卡那霉素的10ml LB培养基中，37℃震荡培养过夜至OD600＝0.6-0.8，然后按1∶100接种到含有50mg/L卡那霉素的1L LB培养基中，37℃震荡培养至OD600＝0.6-0.8。冷却到16℃后，添加IPTG至1mM/L，培养16h。然后5000rpm，离心6min收集菌体。待用。

2、CaPGIP1基因蛋白纯化

取收集CaPGIP菌体用50ml重悬液重悬，加入5ml甘油，20μL β-巯基乙醇，250μL吐温-20，用超声波破碎仪冰水浴下在300W条件下超声30min(超声3s间歇3s)。超声后的破菌液15000rpm离心20min吸取上清待用。上清液及沉淀分别SDS-PAGE分析，确定目的蛋白以可溶的形式存在于上清液中。

取3ml Ni-NTA凝胶树脂加入至纯化柱中，用重悬液(20mM Tris，150mM NaCl，pH8.5)冲洗2-5个柱体积，将超声破菌离心后的上清液过纯化柱3遍以上，再进行洗杂。先用基本洗杂液WBI(20mM Tris，150mM NaCl，20mM Imidazole，pH8.5)洗杂200ml左右，接下来依次用WBII(20mM Tris，150mM NaCl，20mM Imidazole，1％Tween-20，pH8.5)、WBIII(20mM Tris，150mM NaCl，20mM Imidazole，1M Urea，pH8.5)、WBIV(20mM Tris，150mMNaCl，40mM Imidazole，pH8.5)分别洗杂100ml左右，最后用洗脱液(20mM Tris，150mMNaCl，200mM Imidazole，pH8.5)洗脱10ml左右，并进行SDS-PAGE分析，结果显示蛋白纯度较高，与预测的大小相似，约为38kDa。蛋白浓度用考马斯亮蓝法测定，蛋白浓度为0.491mg/ml。待用。

实施例4：PGs-CaPGIP1活性测定

多聚半乳糖醛酸酶(PGs)在一定的反应体系中、一定的条件下，能够降解其特异性底物多聚半乳糖醛酸，产生D-半乳糖醛酸，其在540nm的吸光度达到最大，根据吸光度值的大小，得知PGs降解产生的D-半乳糖醛酸的量的多少，产物D-半乳糖醛酸的量代表PGs的活性，产物量越多，PGs活性越强；CaPGIP1的抑制性也是通过PGs的活性反映出来，产生的D-半乳糖醛酸越多，PGs活性越强，CaPGIP1抑制性越弱，反之，产生的D-半乳糖醛酸越少，PGs活性越弱，CaPGIP1抑制性越强。

1、植物病原菌的准备

采集多种植物病原菌，并进行分化纯化，最后得到十二种植物病原菌菌株，分别是：玉米纹枯、玉米大斑、玉米弯孢霉叶斑、小麦赤霉、小麦全蚀、小麦根腐、小麦纹枯、辣椒疫霉、大豆疫霉、黄瓜疫霉、烟草疫霉和荔枝霜疫霉病原菌，28℃条件下PDA或燕麦培养基上培养4d左右至菌丝活性最旺盛。

2、PGs诱导

察氏培养基的配制：

KNO3 2.0g，KCl 0.5g，FeSO4 0.01g，K2HPO4 1.0g，MgSO4·7H2O 0.5g，橘皮果胶10g，蒸馏水1000ml，分装后121℃灭菌20min。

将培养至活性最大期的病原菌，从菌落边缘打10mm的菌丝块，放入250ml的三角瓶中，平均每10ml察氏培养基一个菌丝块，培养3-5d后，收集培养物，12000rpm离心30min后，用WhtmanGF/A过滤，4℃，PH4.0，0.1M的乙酸钠透析过夜，即得粗PGs溶液，4℃保存待用。

3、D-半乳糖醛酸标准曲线的制作

预先配制溶液：lmg/ml的D-半乳糖醛酸溶液，0.05M、PH5.0的醋酸缓冲液反应体系

30℃下反应30min后，各加入1mlDNS，100℃水浴加热10min，冷却至室温，测OD_540.

4、CaPGIP1对不同PGs活性抑制性测定

反应体系：

将以上体系反应液，30℃孵育30min后，加入1mlDNS，100℃水浴10min终止反应，冷却至室温，测OD₅₄₀，每个反应均有三个重复。根据OD值从标准曲线上得到体系中相应的D-半乳糖醛酸的量，从而求得CaPGIP1对不同PGs抑制效果。如图10，CaPGIP1除了对玉米弯孢霉叶斑病菌PGs活性没有明显的抑制性外，对其他病原菌产生的PGs表现出不同程度的抑制效果，而加入灭活的CaPGIP1后PGs活性不变，可见CaPGIP1对PGs活性具有广谱抑制性。

实施例5：辣椒体内CaPGIP1基因沉默

1、转化载体构建

本实验所需载体为TRV1(PYL192)和TRV2(PYL156)，为国际通用载体。

PCR扩增CaPGIP1基因保守的244bp片段，加酶切位点BamH I和Sma I后，将TRV2和扩增片段同时双酶切，乙醇沉淀回收，T4连接酶连接载体和基因，并转入DH5α感受态细胞，挑取单克隆，提取质粒，PCR鉴定测序并酶切鉴定确定阳性克隆，并将其转入侵染菌株农杆菌GV3101中。

2、菌体收集及侵染

(1)试剂及溶液：

侵染介质：20mM柠檬酸，2％蔗糖，PH5.2

诱导剂：0.1M乙酰丁香酮(AS)

抗生素：50mg/ml卡那(KaNa)，50mg/ml利福平(rif)

(2)侵染菌液制备：

将农杆菌单菌落挑至5mlLB中(50mg/LKaNa，50mg/Lrif)，28℃过夜培养，将过夜培养物接种到50mlLB中，大量培养至OD值1.0左右；3000rpm，15min离心收集菌体；用侵染介质重悬至OD值0.5-0.8，并加入200uM AS，22-25℃摇3-5h；用注射器将1ml培养物注入3-4叶期辣椒叶片；将接种过的辣椒植株转入16℃培养1天，然后转入20-22℃，16h光照，8h黑暗循环培养。

3、荧光定量PCR检测沉默植株CaPGIP1基因表达情况

沉默3-4周后荧光定量PCR检测(具体方法同实施例2)，沉默植株CaPGIP1表达量降低，而接种RNA病毒载体的植株CaPGIP1表达量升高(如图12)；

4、接种检测沉默植株抗病性情况

离体叶片半叶法接种辣椒疫霉强致病菌游动孢子悬浮液(10⁶个/ml)，3-4d后用70％乙醇脱色约6h即可见明显病斑，统计结果显示沉默植株抗病性降低，而接种病毒空载体的植株却表现抗性增强的现象，但是各组抗性差别不是很大(如图13)。

携带有基因保守片段的重组沉默载体质粒在体内复制增殖，通过病毒诱导的转录后基因沉默机制，使辣椒体内PGIP基因转录形成的mRNA得到了部分降解，从而使辣椒寄主体内CaPGIP基因有效表达量降低；而VIGS现象本身也是植物抗病毒侵染的一种自然机制，植物体内存在抑制病毒的系统传播的抗病毒的机制，而未重组的病毒载体质粒在寄主体内的积累激活了植物体的防卫反应，PGIP参与了这个防御过程，从而使CaPGIP的表达量高于正常水平，因此在抗病能力上也表现出较野生型较强的抗性。

实施例6：CaPGIP1基因转化烟草植株过量表达

1、遗传转化载体的构建

将CaPGIP1基因加上酶切位点BamH I和Kpn I，将基因片段和载体同时双酶切，乙醇沉淀回收，T4连接酶连接载体和基因，并转入DH5α感受态细胞，挑取单克隆，提取质粒PCR鉴定测序并酶切鉴定确定阳性克隆，并将其转入农杆菌菌株GV3101中，用农杆菌介导的叶盘转化法，将其导入烟草NC89。

2、农杆菌介导的遗传转化

(1)试剂和溶液缩写

6-BA(6-Benzylaminopur ine，6-苄基嘌呤)；CN(Carbenicillin，羧苄青霉素)；NAA(Naphthaleneacetic acid，萘乙酸)；AgNO₃(硝酸银)；MSmax(MS大量成分溶液)；MSmix(MS小量成分溶液)

(2)主要溶液配方

①MSmax母液(20×)

室温下溶解并定容至1000ml。

②MSmix母液(100×)

室温下溶解并定容至500ml。

③维生素储存液(100×)

室温下溶解并定容至500ml。

④Fe₂EDTA储存液(100×)

FeSO₄·7H₂O 1.39g

乙二胺四乙酸二钠(Na₂EDTA·2H₂O) 1.87g

加热溶解并定容至500ml。

⑤6-BA储存液(1mg/ml)

6-BA 100mg，用1ml1M的NaOH溶解后，加水定容至100ml，室温保存备用。

⑥NAA储存液(0.5mg/ml)

NAA 50mg，用1ml 1M的NaOH溶解后，加水定容至100ml，4℃保存备用。

⑦AgNO₃储存液(4mg/ml)

AgNO₃ 400mg，加水定容至100ml，4℃避光保存备用。

(3)培养及配方

预分化培养基：MS大量元素，MS微量元素，MS维生素，铁盐，蔗糖30g/L，6-BA 3mg/L，NAA 0.2mg/L，pH5.8，琼脂9g/L。

MS₀培养液及共培养基：MS大量元素，MS微量元素，MS维生素，铁盐，蔗糖30g/L，pH5.8(注：共培养基添加琼脂9g/L)。

选择培养基：MS大量元素，MS微量元素，MS维生素，铁盐，蔗糖30g/L，6-BA 2mg/L，NAA 0.5mg/L，AgNO3 4mg/L，pH5.8，琼脂9g/L，卡那霉素100mg/L，羧卞青霉素500mg/L(注：卡那霉素和羧苄青霉素在冷却到60℃时加入倒制平板)。

生根培养基：MS大量元素，MS微量元素，MS维生素，铁盐，蔗糖20g/L，pH5.8，琼脂9g/L，羧卞青霉素250mg/L(注：羧苄青霉素在倒制平板前加)。

(4)农杆菌介导的遗传转化步骤

①烟草Nc89种子催芽后，播种于塑料盘中，常规管理，至2-3片真叶期，备用。

②将农杆菌(内含带卡那霉素抗性基因的表达载体)，在固体LB(含卡那霉素50mg/L，利福平20mg/L)培养基上划线接种；在28℃、黑暗条件下培养3天。

③挑取农杆菌(携带重组质粒的农杆菌单菌落)接种于含有50mg/L卡那霉素的YEP液体培养基中，28℃，250rpm，振荡培养约48h，至对数生长后期。

④将处于对数生长后期的农杆菌液，在无菌离心管中，3000rpm，离心15min；用液体MS₀重悬浮，稀释5-10倍(OD600＝0.4-0.6)，用于转化。

⑤取烟草叶片，用水洗去表面的污物，吸干多余水分，用70％乙醇消毒30s，再用0.1％HgCl₂消毒10min，用无菌水冲洗5次，灭菌滤纸吸去表面水，用刀片切成小块(0.5×0.5em2)左右。

⑥将切好的烟草叶片，平放于预分化培养基中，25℃，光照时间16h/d，光照强度2000LX，预培养2d。

⑦将预培养后的烟草叶片浸入同时准备好的菌液中10min，中间摇动几次；然后用灭菌的滤纸吸干多余菌液，接入共培养基；弱光下，28℃，共培养2-3天(外植体基部可见微菌落)。

⑧共培养后的外植体先用含羧卞青霉素500mg/L的无菌水洗涤3次，再用含羧苄青霉素500mg/L的MS₀培养液洗1次，然后用灭菌滤纸吸干，转入选择培养基上，恒温培养(条件同预培养)；每15d更换一次培养基。

⑨待芽长至1cm左右时，切下，移入MS生根培养基中，若20-30d后，转基因苗将会生根。

⑩待根系发育好后，移入盛有无菌土(基质)的花盆中(注意洗净根部培养基)，用塑料薄膜保湿2d后，温室常规管理。对抗性苗进行抗性鉴定。

3、转基因烟草植株的PCR检测

以烟草植株DNA为模板，以OE1SP(其序列如Seq ID No：21所示)和OE1ASP(其序列如Seq ID No：22所示)为引物，PCR扩增，如图16，从转基因植株中均能检测出目的基因，说明CaPGIP1已经整合到烟草基因组中。

4、接种检测转基因阳性植株抗病性情况

离体叶片半叶接种法，接种强致病菌株烟草炭疽病菌(TBC-01)和烟草赤星病菌(TBA-003)，观察发病症状，每次处理取生长时间一致、生长部位相同的叶片，将叶片消毒，用挑针或打孔器在一侧制造微小创伤，用20mm的打孔器从菌落边缘打下菌丝块并置于伤口上，5d后取出叶片观察发病情况，如图17和18，转基因阳性植株表现出比野生型和转空载体对照较强的抗性，说明CaPGIP1在烟草体内的过量表达确实起到了增强其抗病性的目的。

<110>山东农业大学

<120>一种多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白基因CaPGIP1及其抗病性技术

<160>22

<210>1

<211>1038

<212>DNA

<213>辣椒(Capsicum annuum)

<220>

<221>sig_peptide

<222>(1)...(108)

<221>CDS

<222>(1)...(1038)

<400>1

atg aac gtg aag tgc tac cgg gtc ttg tcg aga gag atg aag ccc tct 48

MET Asn Val Lys Cys Tyr Arg Val Leu Ser Arg Glu MET Lys Pro Ser

1 5 10 15

gta gtt tcc att ctt tct ttt tct ctc ttc ttt ctc tcc caa ttc ttg 96

Val Val Ser Ile Leu Ser Phe Ser Leu Phe Phe Leu Ser Gln Phe Leu

20 25 30

cta tct ctc tcc gaa agg tgc aat cca gat gac aaa aaa gcc ctc tta 144

Leu Ser Leu Ser Glu Arg Cys Asn Pro Asp Asp Lys Lys Ala Leu Leu

35 40 45

gaa ata aaa aga ggc cta ggc aat ccc tat gac ttg atc acg tgg gat 192

Glu Ile Lys Arg Gly Leu Gly Asn Pro Tyr Asp Leu Ile Thr Trp Asp

50 55 60

ccc aaa act gat tgt tgt act gat tgg gtt aaa gct act ctc tca tgt 240

Pro Lys Thr Asp Cys Cys Thr Asp Trp Val Lys Ala Thr Leu Ser Cys

65 70 75 80

gat gaa aaa act aat cgt gtt act gtc cta aac ctc ttc caa att aat 288

Asp Glu Lys Thr Asn Arg Val Thr Val Leu Asn Leu Phe Gln Ile Asn

85 90 95

age ccc ggt cac ctc tct cct gcc gtt gga gac ctt tcg tac ctc caa 336

Ser Pro Gly His Leu Ser Pro Ala Val Gly Asp Leu Ser Tyr Leu Gln

100 105 110

acg tta gac atc aac aat gtc cga aat ctc tcc ggt cct att cca ccc 384

Thr Leu Asp Ile Asn Asn Val Arg Asn Leu Ser Gly Pro Ile Pro Pro

115 120 125

aca att gct aag ctc ttg aag ctc aca ttc ttg aga att agt caa aca 432

Thr Ile Ala Lys Leu Leu Lys Leu Thr Phe Leu Arg Ile Ser Gln Thr

130 135 140

aac att tca gga cct gtc cct gag ttt ctt agt aag ttg aaa aac ata 480

Asn Ile Ser Gly Pro Val Pro Glu Phe Leu Ser Lys Leu Lys Asn Ile

145 150 155 160

acg tac atc aac tta tcg tac ggt age ctc gtt ggt aca atc cct ccc 528

Thr Tyr Ile Asn Leu Ser Tyr Gly Ser Leu Val Gly Thr Ile Pro Pro

165 170 175

tca ctt tct caa ctg aca aac ttg gag ttc cta cgc tta gat agg aac 576

Ser Leu Ser Gln Leu Thr Asn Leu Glu Phe Leu Arg Leu Asp Arg Asn

180 185 190

aaa ctt act gga aca att cca caa tct ctt agc aaa tta gct cca aaa 624

Lys Leu Thr Gly Thr Ile Pro Gln Ser Leu Ser Lys Leu Ala Pro Lys

195 200 205

ctc acg tat ctt tac ctc gga cac aac caa cta aca ggg att gtg cca 672

Leu Thr Tyr Leu Tyr Leu Gly His Asn Gln Leu Thr Gly Ile Val Pro

210 215 220

act tct ttt act ggt tgg agc ttt gac aca att gac tta tca agg aac 720

Thr Ser Phe Thr Gly Trp Ser Phe Asp Thr Ile Asp Leu Ser Arg Asn

225 230 235 240

atg ctt gaa ggg gat atc tca ttc ttg ttt ggc aaa gat aag aca aca 768

MET Leu Glu Gly Asp Ile Ser Phe Leu Phe Gly Lys Asp Lys Thr Thr

245 250 255

tat gaa atg ttg ttg gat cac aat aag ttt gcg ttc gac ttc tca aag 816

Tyr Glu MET Leu Leu Asp His Asn Lys Phe Ala Phe Asp Phe Ser Lys

260 265 270

cta aca ttt ggg aag gga tta tgg agg ttg gat ttg aac cat aac aag 864

Leu Thr Phe Gly Lys Gly Leu Trp Arg Leu Asp Leu Asn His Asn Lys

275 280 285

att tac ggt agc ctt cct cca tcc ttg acg aag caa cca tgg cag ctc 912

Ile Tyr Gly Ser Leu Pro Pro Ser Leu Thr Lys Gln Pro Trp Gln Leu

290 295 300 305

ttc aat gtg agt tat aac aga ctt tgt gga aag att cca cag ggt gga 960

Phe Asn Val Ser Tyr Asn Arg Leu Cys Gly Lys Ile Pro Gln Gly Gly

310 315 320

tct atg cag aga tgt gat caa cat tgc tat ttt cac aac aaa tgc ttg 1008

Ser MET Gln Arg Cys Asp Gln His Cys Tyr Phe His Asn Lys Cys Leu

325 330 335

tgt gat ggt cca ttg cca cca tgt aaa tga 1038

Cys Asp Gly Pro Leu Pro Pro Cys Lys ***

340 345

<210>2

<211>346

<212>PRT

<213>辣椒(Capsicum annuum)

<220>

<221>SIGNAL

<222>(1)...(36)

<400>2

MET Asn Val Lys Cys Tyr Arg Val Leu Ser Arg Glu MET Lys Pro Ser

1 5 10 15

Val Val Ser Ile Leu Ser Phe Ser Leu Phe Phe Leu Ser Gln Phe Leu

20 25 30

Leu Ser Leu Ser Glu Arg Cys Asn Pro Asp Asp Lys Lys Ala Leu Leu

35 40 45

Glu Ile Lys Arg Gly Leu Gly Asn Pro Tyr Asp Leu Ile Thr Trp Asp

50 55 60

Pro Lys Thr Asp Cys Cys Thr Asp Trp Val Lys Ala Thr Leu Ser Cys

65 70 75 80

Asp Glu Lys Thr Asn Arg Val Thr Val Leu Asn Leu Phe Gln Ile Asn

85 90 95

Ser Pro Gly His Leu Ser Pro Ala Val Gly Asp Leu Ser Tyr Leu Gln

100 105 110

Thr Leu Asp Ile Asn Asn Val Arg Asn Leu Ser Gly Pro Ile Pro Pro

115 120 125

Thr Ile Ala Lys Leu Leu Lys Leu Thr Phe Leu Arg Ile Ser Gln Thr

130 135 140

Asn Ile Ser Gly Pro Val Pro Glu Phe Leu Ser Lys Leu Lys Asn Ile

145 150 155 160

Thr Tyr Ile Asn Leu Ser Tyr Gly Ser Leu Val Gly Thr Ile Pro Pro

165 170 175

Ser Leu Ser Gln Leu Thr Asn Leu Glu Phe Leu Arg Leu Asp Arg Asn

180 185 190

Lys Leu Thr Gly Thr Ile Pro Gln Ser Leu Ser Lys Leu Ala Pro Lys

195 200 205

Leu Thr Tyr Leu Tyr Leu Gly Hi s Asn Gln Leu Thr Gly Ile Val Pro

210 215 220

Thr Ser Phe Thr Gly Trp Ser Phe Asp Thr Ile Asp Leu Ser Arg Asn

225 230 235 240

MET Leu Glu Gly Asp Ile Ser Phe Leu Phe Gly Lys Asp Lys Thr Thr

245 250 255

Tyr Glu MET Leu Leu Asp His Asn Lys Phe Ala Phe Asp Phe Ser Lys

260 265 270

Leu Thr Phe Gly Lys Gly Leu Trp Arg Leu Asp Leu Asn His Asn Lys

275 280 285

Ile Tyr Gly Ser Leu Pro Pro Ser Leu Thr Lys Gln Pro Trp Gln Leu

290 295 300 305

Phe Asn Val Ser Tyr Asn Arg Leu Cys Gly Lys Ile Pro Gln Gly Gly

310 315 320

Ser MET Gln Arg Cys Asp Gln His Cys Tyr Phe Hi s Asn Lys Cys Leu

325 330 335

Cys Asp Gly Pro Leu Pro Pro Cys Lys ***

340 345

<210>3

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>n＝c或t

<222>(4，14)

<220>

<221>misc_feature

<223>n＝a或g

<222>(17)

<220>

<221>misc_feature

<223>n＝t或c

<222>(20)

<400>3

cgtnggagacc ttnccntan ctc 23

<210>4

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>n＝c或t

<222>(3)

<220>

<221>misc_feature

<223>n＝t或a

<222>(13)

<220>

<221>misc_feature

<223>n＝a或g

<222>(15)

<220>

<221>misc_feature

<223>n＝g或t

<222>(21)

<400>4

tcnccttcaa gcntnttcct ng 22

<210>5

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<400>5

agtcaattgt gtcaaagctc caacc 25

<210>6

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<400>6

gctaagagat tgtggaattg ttccagt 27

<210>7

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<400>7

actaagaaac tcagggacag gtcct 25

<210>8

<211>16

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>n＝a或t

<222>(3，8，13)

<220>

<221>misc_feature

<223>n＝g或t

<222>(5，10)

<400>8

agngnagnan canagg 16

<210>9

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<400>9

attccaccca caattgctaa gctct 25

<210>10

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<400>10

caatccctcc ctcactttct caact 25

<210>11

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<400>11

accaactaac agggattgtg ccaact 26

<210>12

<211>16

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>n＝c或g

<222>(7)

<220>

<221>misc_feature

<223>n＝t或a

<222>(8，13)

<220>

<221>misc_feature

<223>n＝g或t

<222>(1，11)

<400>12

ngtcgannga nangaa 16

<210>13

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<400>13

atggtgttgt cgagtgtcga g 21

<210>14

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<400>14

tcatttacat ggtggcaat 19

<210>15

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<400>15

acggtagcct tcctccatcc ttg 23

<210>16

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<400>16

ggcaatggac catcacacaa gca 23

<210>17

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<400>17

cggaattcga aaggtgcaat cc 22

<210>18

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<400>18

cccaagcttt catttacatg gtgg 24

<210>19

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<400>19

cgggatccac taatcgtgtt actgtcc 27

<210>20

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<400>20

tcccccggga gttgatgtac gttat 25

<210>21

<211>45

<212>DNA

<213>人工序列

<400>21

tcccccggga tgcaccacca ccaccaccac atgaacgtga agtgc 45

<210>22

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<400>22

ggggtacctc atttacatgg tggcaatgga c 31

Claims

1.一种多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白基因CaPGIP1，其特征在于：其编码的蛋白质的氨基酸序列如序列表中的序列2所示。

2.如权利要求1所述基因在增强转基因烟草对烟草炭疽病菌(Colletotrichum micotianae)和烟草赤星病菌（Alternaria alternata）的抗性的应用。