CN102250231A - 华支睾吸虫特异性ppmp型抗原及其应用 - Google Patents

华支睾吸虫特异性ppmp型抗原及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN102250231A
CN102250231A CN2010101786846A CN201010178684A CN102250231A CN 102250231 A CN102250231 A CN 102250231A CN 2010101786846 A CN2010101786846 A CN 2010101786846A CN 201010178684 A CN201010178684 A CN 201010178684A CN 102250231 A CN102250231 A CN 102250231A
Authority
CN
China
Prior art keywords
pro
ppmp
sinensis
clonorchis sinensis
specificity
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN2010101786846A
Other languages
English (en)
Other versions
CN102250231B (zh
Inventor
许学年
周岩
董玉婷
包意芳
徐斌
冯正
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
National Institute of Parasitic Diseases of Chinese Center for Disease Control and Prevention
Original Assignee
National Institute of Parasitic Diseases of Chinese Center for Disease Control and Prevention
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by National Institute of Parasitic Diseases of Chinese Center for Disease Control and Prevention filed Critical National Institute of Parasitic Diseases of Chinese Center for Disease Control and Prevention
Priority to CN201010178684.6A priority Critical patent/CN102250231B/zh
Priority to CN201410068195.3A priority patent/CN103897051B/zh
Publication of CN102250231A publication Critical patent/CN102250231A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN102250231B publication Critical patent/CN102250231B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/43504—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates
    • C07K14/43536—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates from worms
    • C07K14/43559—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates from worms from trematodes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/43504—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans from invertebrates
    • G01N2333/43526—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans from invertebrates from worms
    • G01N2333/43547—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans from invertebrates from worms from trematodes

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明提供了三种华支睾吸虫的特异性PPMP型抗原，还提供了三种特异性的结合华支睾吸虫的特异性抗原的抗体。本发明还提供了三种分离的华支睾吸虫的特异性PPMP型抗原蛋白，由华支睾吸虫的特异性抗原基因的核苷酸序列所编码。本发明还提供了三种含有华支睾吸虫的特异性抗原基因的载体。本发明还提供了三种试剂盒。本发明还提供了上述的三种华支睾吸虫的特异性抗原蛋白、抗体、载体和试剂盒在制备诊断华支睾吸虫病的应用。本发明的华支睾吸虫PPMP型抗原具有较高的免疫原性，易制备多/单克隆抗体，进而进一步应用于抗原检测等方面，实验证明实验动物(小鼠)对该抗原免疫应答较强。

Description

华支睾吸虫特异性PPMP型抗原及其应用
技术领域：
本发明属于生物工程领域，尤其涉及一种华支睾吸虫，具体来说是三种华支睾吸虫的特异性抗原PPMP型抗原及其应用。 
背景技术：
华支睾吸虫病(Clonorchiasis sinensis)是由华支睾吸虫[Clonorchis sinensis，Cs]感染所引起的人兽共患病。该病主要分布于亚洲，如中国、日本、韩国(为韩国主要人体寄生虫)、朝鲜、越南、东南亚等国家。估计全球有3500万人感染。在我国，除新疆、内蒙古、甘肃、青海、西藏、宁夏等省、自治区未见报道外，其余25个省、市、自治区以及台湾省和香港特别行政区都已有该病的流行报道或病例报告。由于移民的流动，以及日益频繁的全球范围的旅游和经济活动，在一些非流行区和发达国家(包括北美和西欧)该病的病例报告也越来越多。 
根据卫生部于2001年6月～2004年底在全国(除台湾、香港、澳门外)进行的人体重要寄生虫病现状调查结果显示，华支睾吸虫感染率比1990年全国寄生虫病分布调查的结果上升了75％，其中广东、广西、吉林3省(区)分别上升了182％、164％和630％。估计目前全国华支睾吸虫感染者达1200多万人。华支睾吸虫病是我国少数个别几个呈现上升趋势的寄生虫病之一，该病的防治工作已迫在眉睫。 
在我国南方(如广东、广西)及部分北方地区(如东北3省的朝 鲜族居住区)，当地人群有吃生的或未煮熟的淡水鱼肉的习惯，鱼肉中活的囊蚴被摄入人体，引起人的感染。这些地区居民虽知吃“鱼生”会感染本病，但饮食习惯一时难以改变。而且随着生活水平的提高，以往不吃或很少吃“鱼生”的人群也开始吃“鱼生”，现在生鱼片的风味吃法在非流行区，特别是大中城市也很盛行。同时由于市场开放，流行区含华支睾吸虫囊蚴的鱼运往各地，因此城镇居民感染华支睾吸虫的人数有增加的趋势。 
华支睾吸虫成虫寄生于人或其它终宿主的肝胆管内，虫体的分泌/代谢产物及虫体本身的机械刺激，可引起胆管，特别是引起次级胆管的炎症反应，中度感染胆管可出现局限性扩张，胆管上皮增生、管壁增厚、管腔狭窄，如合并细菌感染，可引起胆管炎和胆管肝炎，周围纤维组织增生，晚期可发生肝硬化。有证据表明，华支睾吸虫感染可增加患者患胆管癌(CLG)的风险，华支睾吸虫感染相关性肝胆管肿瘤是华支睾吸虫病流行区一个重要的公共卫生问题。 
为了快速诊断、及时治疗和有效控制华支睾吸虫病，需要特异、灵敏、简便的方法检测人群中华支睾吸虫的感染。 
对于华支睾吸虫病人的诊断，传统的粪便检查仍是目前确诊华支睾吸虫病的主要方法。但由于患者依从性较差，且华支睾吸虫虫卵较小易于漏检，该方法有一定的缺陷。 
目前在现场防治工作中较广泛地应用了免疫诊断方法(主要是ELISA法)。但是仍存在一些问题：对健康人有不同程度的假阳性，对华支睾吸虫病人有一定的假阴性，对其它寄生虫(血吸虫、并殖吸 虫)感染也有一定的交叉反应。Yong TS应用ELISA方法检测48例华支睾吸虫病人血清抗体，只有75％的阳性反应，但在28例正常对照和16例并殖吸虫病例中，分别出现了7.1％和37.5％的假阳性。 
已有研究资料表明一些寄生虫的排泄分泌抗原(ESA)或重组的ESA可应用于寄生虫病的血清学诊断。Kim SI用ESA来检测活动性华支睾吸虫病病人血清相应抗体动态反应，发现30kDa和7kDa区带与患者血清呈强阳性反应，而与吡喹酮治疗6个月后的病人血清反应较弱，其中7kDa区带未见与卫氏并殖吸虫病、横川后殖吸虫病、华支睾吸虫病患者痊愈后的血清起交叉反应，特异性比30kDa区带更强，据此认为7kDa抗原可作为活动性华支睾吸虫病的标志性诊断抗原。Min-Ho CHOI对华支睾吸虫的排泄分泌抗原(ESA)检测抗体的ELISA法和成虫粗抗原(CA)检测抗体的ELISA法的诊断价值进行了比较和评估。ESA检测抗体的ELISA法的特异性显著高于用CA检测抗体的ELISA法(前者特异性为93.1％，后者为87.8％)，表明ESA用于检测华支睾吸虫患者血清抗体优于粗抗原。因此，与华支睾吸虫的CA相比，ESA作为华支睾吸虫病的诊断抗原具有更高的特异性和敏感性。然而传统的虫源性抗原制备复杂，质量可控性较低，制备量有限，难以适应大规模查病的需求。 
此外，由于该虫寄生于肝胆管这一特定的部位，决定了宿主血清中的抗原和抗体水平较低，难以检测(也是目前该病缺乏良好诊断试剂的原因)，但在粪样中却有ESA的存在。Yong TS等鉴定了与IgE抗体反应的华支睾吸虫抗原，发现28kDa的抗原与IgE反应最强，该 蛋白也存在于粪便排泄物中。Sirisinha S等人用单克隆抗体ELISA(Monoclonal antibody ELISA，McAb-ELISA)检测麝猫后睾吸虫患者粪样中的抗原，能检测的抗原最低量为0.05ng-0.1ng。研究表明，检测患者粪样中的特异抗原，可提供早期诊断、现症患者确诊及疗效考核的依据。 
而诊断抗体或抗原的特性决定着粪样和血清中抗原或血清抗体检测等免疫学方法的诊断效果。同时由于难以取得高纯度的特异抗原或大量的天然抗原，故使用分子生物学技术，构建特异性重组抗原的技术路线是寻找合适抗原的必由之路。 
发明内容：
本发明的目的在于提供三种华支睾吸虫的特异性抗原及应用，所述的这三种华支睾吸虫的特异性抗原及应用要解决现有技术诊断华支睾吸虫病的方法特异性和敏感性不高的技术问题。 
本发明提供了一种华支睾吸虫特异性PPMP型抗原(Cs34)，所述的抗原基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示、或者所述的抗原基因的核苷酸序列与SEQ ID NO：1所示核苷酸序列同源性达90％以上、或者其部分经过取代、缺失或者添加后如SEQ ID NO：1所示核苷酸序列所衍生的具有抗原性的核苷酸序列。 
本发明还提供了一种分离的华支睾吸虫特异性PPMP型抗原(Cs34)蛋白质，由上述的一种华支睾吸虫的特异性抗原基因(Cs34)的核苷酸序列所编码、或者与上述的一种华支睾吸虫的特异性抗原基因(Cs34)的核苷酸序列同源性达90％以上的核苷酸序列所编码、或 者由部分经过取代、缺失或者添加后的上述的一种华支睾吸虫的特异性抗原基因(Cs34)的核苷酸序列所编码。 
进一步的，上述分离的华支睾吸虫特异性PPMP型抗原(Cs34)蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示、或者对SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列经过取代、缺失或者添加一个或者几个氨基酸后的由SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列所衍生的氨基酸序列。 
进一步的，上述分离的华支睾吸虫特异性PPMP型抗原(Cs34)蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示、或者对SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列经过取代、缺失或者添加一个或者几个氨基酸后的由SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列所衍生的氨基酸序列。 
进一步的，上述分离的华支睾吸虫特异性PPMP型抗原(Cs34)蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示、或者对SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列经过取代、缺失或者添加一个或者几个氨基酸后的由SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列所衍生的氨基酸序列。 
本发明还提供了一种抗体，特异性的结合上述的一种华支睾吸虫的特异性PPMP型抗原(Cs34)蛋白。 
进一步的，所述的抗体为单克隆抗体。 
本发明还提供了一种载体，含有上述的一种华支睾吸虫的特异性抗原基因(Cs34)。 
本发明还提供了一种宿主细胞，含有上述的载体，或者用上述的所述的一种华支睾吸虫的特异性PPMP型抗原基因(Cs34)转化或转染。 
本发明还提供了一种疫苗，含有上述的一种华支睾吸虫的特异性PPMP型抗原(Cs34)蛋白、或者上述的抗体、或者上述的载体。 
本发明还提供了上述的一种华支睾吸虫的特异性PPMP型抗原(Cs34)蛋白在制备治疗、诊断或者预防华支睾吸虫病的药物中的应用。 
本发明还提供了上述的抗体在制备治疗、诊断或者预防华支睾吸虫病的药物中的应用。 
本发明还提供了上述的疫苗在制备治疗、诊断或者预防华支睾吸虫病的药物中的应用。 
本发明还提供了上述的载体在制备治疗、诊断或者预防华支睾吸虫病的药物中的应用。 
本发明还提供了一种试剂盒，含有上述的华支睾吸虫的特异性PPMP型抗原(Cs34)蛋白、或者上述的抗体。 
本发明还提供了第二种华支睾吸虫特异性PPMP型抗原(Cs2)，所述的抗原基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示、或者或者所述的抗原基因的核苷酸序列与SEQ ID NO：2所示核苷酸序列同源性达90％以上的核苷酸序列、或者其部分经过取代、缺失或者添加后如SEQID NO：2所示核苷酸序列所衍生的具有抗原性的核苷酸序列。 
本发明还提供了第二种分离的华支睾吸虫特异性PPMP型抗原(Cs2)蛋白，由上述的第二种华支睾吸虫的特异性抗原基因(Cs2)的核苷酸序列所编码、或者与上述的第二种华支睾吸虫的特异性抗原基因(Cs2)的核苷酸序列同源性达90％以上的核苷酸序列所编码、 或者由部分经过取代、缺失或者添加后的上述的第二种华支睾吸虫的特异性抗原基因(Cs2)的核苷酸序列所编码。 
进一步的，上述的分离的分离的华支睾吸虫特异性PPMP型抗原(Cs2)蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示、或者对SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列经过取代、缺失或者添加一个或者几个氨基酸后的由SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列所衍生的氨基酸序列。 
本发明还提供了第二种抗体，特异性的结合上述的第二种华支睾吸虫的特异性PPMP型抗原(Cs2)蛋白。 
进一步的，所述的抗体为单克隆抗体。 
本发明还提供了第二种载体，含有上述的第二种华支睾吸虫的特异性抗原基因(Cs2)。 
进一步的，上述的载体的氨基酸序列如SEQ ID NO：9所示。 
本发明还提供了第二种宿主细胞，含有上述的第二种载体，或者用上述的所述的第二种华支睾吸虫的特异性PPMP型抗原基因(Cs2)转化或转染。 
本发明还提供了第二种疫苗，含有上述的第二种分离的华支睾吸虫的特异性PPMP型抗原(Cs2)蛋白、或者第二种所述的抗体、或者上述的第二种载体。 
本发明还提供了上述的第二种华支睾吸虫的特异性PPMP型抗原(Cs2)蛋白在制备治疗、诊断或者预防华支睾吸虫病的药物中的应用。 
本发明还提供了上述的第二种抗体在制备治疗、诊断或者预防华 支睾吸虫病的药物中的应用。 
本发明还提供了上述的第二种疫苗在制备治疗、诊断或者预防华支睾吸虫病的药物中的应用。 
本发明还提供了上述的第二种载体在制备治疗、诊断或者预防华支睾吸虫病的药物中的应用。 
本发明还提供了第二种试剂盒，含有上述的第二种华支睾吸虫的特异性PPMP型抗原(Cs2)蛋白、或者上述的第二种抗体。
本发明还提供了第三种华支睾吸虫特异性PPMP型抗原(Cs3)，所述的抗原基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示、或者或者所述的抗原基因的核苷酸序列与SEQ ID NO：3所示核苷酸序列同源性达90％以上的核苷酸序列、或者其部分经过取代、缺失或者添加后如SEQID NO：3所示核苷酸序列所衍生的具有抗原性的核苷酸序列。 
本发明还提供了第三种分离的华支睾吸虫特异性PPMP型抗原(Cs3)蛋白，由上述的一种华支睾吸虫的特异性抗原基因(Cs3)的核苷酸序列所编码、或者与上述的一种华支睾吸虫的特异性抗原基因(Cs3)的核苷酸序列同源性达90％以上的核苷酸序列所编码、或者由部分经过取代、缺失或者添加后的上述的一种华支睾吸虫的特异性抗原基因(Cs3)的核苷酸序列所编码。 
进一步的，上述第三种分离的华支睾吸虫特异性PPMP型抗原(Cs3)蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示、或者对SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列经过取代、缺失或者添加一个或者几个氨基酸后的由SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列所衍生的氨基酸序列。 
本发明还提供了第三种抗体，特异性的结合上述的第三种华支睾吸虫的特异性PPMP型抗原(Cs3)蛋白。 
进一步的，所述的抗体为单克隆抗体。 
本发明还提供了第三种载体，含有上述的第三种华支睾吸虫的特异性抗原基因(Cs3)。 
进一步的，上述的第三种载体的氨基酸序列如SEQ ID NO：10所示。 
本发明还提供了第三种宿主细胞，含有上述的第三种载体，或者用上述的第三种华支睾吸虫的特异性PPMP型抗原基因(Cs3)转化或转染。 
本发明还提供了第三种疫苗，含有上述的第三种华支睾吸虫的特异性PPMP型抗原(Cs3)蛋白、或者上述的第三种抗体、或者第三种载体。 
本发明还提供了第三种华支睾吸虫的特异性PPMP型抗原(Cs3)蛋白在制备治疗、诊断或者预防华支睾吸虫病的药物中的应用。 
本发明还提供了第三种上述的抗体在制备治疗、诊断或者预防华支睾吸虫病的药物中的应用。 
本发明还提供了第三种上述疫苗在制备治疗、诊断或者预防华支睾吸虫病的药物中的应用。 
本发明还提供了第三种上述的载体在制备治疗、诊断或者预防华支睾吸虫病的药物中的应用。 
本发明还提供了第三种一种试剂盒，含有上述的第三种华支睾吸 虫的特异性PPMP型抗原(Cs3)蛋白、或者上述的第三种抗体。
本文中的术语“表达载体”，是指本领域中常用的细菌质粒、酵母质粒及其它各种病毒载体。本发明中适用的载体包括但不限于：在细菌中表达用的载体(原核表达载体)、在酵母中表达用的载体(如毕赤酵母载体)、在哺乳动物细胞中表达用的载体(逆转录病毒载体、腺病毒载体等)。在一优选实施方式中，所述表达载体为大肠杆菌表达载体。本领域技术人员可利用DNA重组技术等一系列技术，构建含本发明所述编码融合蛋白的DNA序列、合适的转录和翻译调控序列、启动子及选择性标记基因等特定元件的表达载体。上述载体可用来转化、转染合适的宿主细胞，以便获得所需要的融合蛋白。 
本发明的宿主细胞可以是原核细胞，也可以是真核细胞，如，细菌细胞、哺乳动物细胞等。宿主细胞在转化或转染含本发明所述编码融合蛋白的基因序列后，即构成工程化细胞或细胞株，可用于生产所需融合蛋白。本领域技术人员能够恰当地选择适当的载体、宿主细胞，并熟知如何将载体高效地转化或转染入宿主细胞中，所用方法包括但不限于：氯化钙法、电穿孔法用于细菌细胞，脂质体包裹、电融合法用于哺乳动物细胞等真核细胞。 
本发明的宿主细胞可以通过常规方法培养、诱导来表达所需要的融合蛋白，包括发酵过程和纯化工艺。上述表达的蛋白可在细胞内、细胞膜上或分泌到细胞周质、细胞外。根据需要，可利用融合蛋白的物理的、化学的以及其它生物学特性，进行分离纯化。方法包括但不限于：裂菌，离心，盐析，分子筛色谱，离子交换色谱，吸附色谱， 反向色谱，以及常规的变性、复性处理等，这些方法均是本领域技术人员所熟知的。 
通过对本发明人构建的华支睾吸虫成虫cDNA表达文库，用采自广西壮族自治区的华支睾吸虫病人混合血清，使用免疫筛选法筛选华支睾吸虫成虫cDNA表达文库。共获得51个阳性克隆，有44个克隆完成测序。发现其中3例蛋白氨基酸序列中含有特异性KPPMPGDRDA或QPPMPGGRDA重复串列序列，因均含有PPMP序列特征，故命名为华支睾吸虫PPMP型抗原。并将含有KPPMPGDRDA重复串列序列的该类抗原称为PPMP I型抗原，含有QPPMPGGRDA重复串列序列的则称为PPMP II型抗原。经同源性比较，本发明的华支睾吸虫PPMP型抗原是迄今为止还没有公开的华支睾吸虫新颖的特异性抗原。但与华支睾吸虫的GRA(富甘氨酸蛋白)、Glycine rich antigen 2(富甘氨酸蛋白2)、PRA(富脯氨酸蛋白)和PRA2(富脯氨酸蛋白2)等有较高的同源性。通过华支睾吸虫抗原PPMP I型抗原Cs2抗原和PPMP II型抗原Cs3抗原的表达纯化，已进一步建立了高特异性和敏感性的华支睾吸虫病诊断初步方法；并易制备多/单克隆抗体，可应用华支睾吸虫病的科研和防治等不同方面。本发明的试剂盒还可以用来检测华支睾吸虫病。 
附图说明：
图1、图2是华支睾吸虫PPMP型抗原基因Alignment分析结果。图中1-3号序列为本发明人获得的华支睾吸虫PPMP型抗原基因Cs34、Cs2和Cs3的氨基酸序列，GRA为Glycine rich antigen序列， GRA2为Glycine rich antigen 2序列，PRA为Proline rich antigen序列(注：本发明人对原序列中不正确的编码进行了修正)，PRA2为Proline rich antigen 2序列。 
图3是将Cs34抗原全长氨基酸序列传送至SignalP 3.0 Server(网址：http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)，使用神经网络法(NN)进行在线信号肽剪切位点分析图。 
图4将Cs34抗原全长氨基酸序列传送至SignalP 3.0 Server(网址：http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)，使用隐马可夫模型(HMM)进行在线信号肽剪切位点分析图。 
图5是pBluescript SK_Cs2噬菌粒EcoRI/XhoI双酶切1％的琼脂糖凝胶电泳图，M：DNA Marker；1：pBluescript SK_Cs2质粒EcoRI/XhoI双酶切结果(755bp)。 
图6是pET28b质粒EcoRI/XhoI双酶切的1％的琼脂糖凝胶电泳图，M：DNA Marker；1：pET28b质粒NcoI/XhoI双酶切结果。 
图7是pBluescript SK_Cs3噬菌粒和pET28b质粒EcoRI/XhoI双酶切的1％的琼脂糖凝胶电泳图，M：DNA Marker；1：pET28b质粒NcoI/XhoI双酶切结果。2：pBluescript SK_Cs3质粒EcoRI/XhoI双酶切结果(1157bp)。 
图8是pET28b-Cs2[BLR(DE3)宿主菌]重组蛋白表达鉴定12％的聚丙烯胺凝胶电泳图，M：Protein Marker(FERMENTAS MBI)；NI：pET28b-Cs2未诱导；I：pET28b-Cs2诱导；S：诱导上清；P：诱导沉淀。 
图9是pET28b-Cs3[BLR(DE3)pLysS宿主菌]重组蛋白表达鉴定12％的聚丙烯胺凝胶电泳图，M：Protein Marker(FERMENTAS MBI)；NI：pET28b-Cs3未诱导；I：pET28b-Cs3诱导；S：诱导上清；P：诱导沉淀。 
图10是pET28b-Cs2[BLR(DE3)宿主菌]可溶性蛋白纯化12％聚丙烯酰胺凝胶电泳图，M：Protein marker；1：Ni-NTA纯化流出液(含10mM咪唑)；2-3：含20mM咪唑洗涤液管4、6；4-9：含50mM咪唑洗脱液1-6管；9-11：含100mM咪唑洗脱液1-3管；12-14：含250mM咪唑洗脱液1-3管，其中，pET28b-Cs2可溶性蛋白集中在含50mM-100mM咪唑的洗脱液中。 
图11是pET28b-Cs3[BLR(DE3)pLysS宿主菌]可溶性蛋白纯化12％聚丙烯酰胺凝胶电泳图，M：Protein marker；1：Ni-NTA纯化流出液(含10mM咪唑)；2-3：含20mM咪唑洗涤液管4、6；4-9：含50mM咪唑洗脱液1-6管；10-12：含100mM咪唑洗脱液1-3管；13-14：含250mM咪唑洗脱液1-2管，其中，pET28b-Cs3可溶性蛋白集中在含50mM-100mM咪唑的洗脱液中。 
图12是pET28b-CS2可溶性纯化蛋白ELISA法检测各类血清抗体散点图。 
图13是pET28b-CS3可溶性纯化蛋白ELISA法检测各类血清抗体散点图。 
为了便于理解，以下将通过具体的实施例对本发明进行详细地描 述。需要特别指出的是，这些描述仅仅是示例性的描述，并不构成对本发明范围的限制。依据本说明书的论述，本发明的许多变化、改变对所属领域技术人员来说都是显而易见了，而这些等价修改，均应属于本发明所限定的范围。 
具体实施方式：
以下所述实验方法，没有具体说明的，均按照《分子克隆实验指南》，2002年，科学出版社)所述方法进行。 
实施例1  华支睾吸虫成虫cDNA文库的构建 
用采自广西壮族自治区的华支睾吸虫囊蚴，通过灌胃法感染猫5只。40天后，检查粪便虫卵，然后剖杀，收集华支睾吸虫成虫，用灭菌的生理盐水冲洗干净，液氮保存。 
利用TRIzol(GIBCO/BRL公司)试剂盒抽提华支睾吸虫成虫(1克华支睾吸虫成虫压积，液氮保存)的总RNA。 
采用mRNA纯化试剂盒(mRNA Purification Kit，Amersham公司)，从提取的总RNA中纯化mRNA。具体步骤见产品说明书。 
华支睾吸虫成虫cDNA文库采用定向克隆法，利用ZAP-cDNASynthesis Kit(Stratagene公司)构建。参照试剂盒说明书操作，主要过程包括： 
1.cDNA第一链的合成，应用含有Xho I内切酶位点的多聚T引物，为了使cDNA第一链在合成过程中不受限制性内切酶的破坏，用5-甲 基dCTP替代dNTP中的dCTP，使合成的DNA半甲基化，从而在Xho I消化cDNA时，只有位于多聚T引物内的非甲基化位点可被裂解； 
2.cDNA第二链的合成，由RNase H消化第一链合成产物mRNA-DNA杂合体中的RNA，产生的cDNA片段作为引物在DNA聚合酶I作用下合成第二链； 
3.用Pfu DNA聚合酶将合成的双链cDNA的末端补平，之后在补平的双链DNA的5’端加上含有EcoR I酶切位点的接头(adaptor)，并使接头磷酸化； 
4.用限制性内切酶Xho I消化，消化后的双链DNA通过SepharoseCL-2B凝胶柱层析，进行分级分离，去除游离接头； 
5.将分离后的DNA片段合并浓缩，连接到Uni-ZAP xR载体上； 
6.最后用包装抽提液(Gigapack III Gold Packing Extract，Stratagene)包装噬菌体蛋白外壳。 
华支睾吸虫成虫cDNA文库构建完成后，进一步对文库容量及插入片段平均长度等进行检测。 
检测计算结果，华支睾吸虫成虫cDNA文库的容量为1.43×106pfu/ml。 
从文库中随机挑取16个重组克隆进行PCR扩增，1％琼脂糖凝胶电泳对PCR产物鉴定。重组克隆扩增片段长度范围在0.6kb～2kb。平均插入片段长度为1.1kb。 
重组插入率为99.6％。 
实施例2  cDNA文库的免疫筛选 
噬菌体感染： 
取XL1-blue MRF′菌液200μl与适量cDNA文库噬菌体液混合(根据文库滴度预先确定，约3000噬菌斑/每板)，37℃温育15分钟后，加入3ml 48℃的上层琼脂(top agar)混匀，立即铺于NZY培养基平板上。室温下凝固10分钟，于42℃孵育。 
融合蛋白的诱导表达： 
观察到噬菌斑出现后(约3.5小时)，用经IPTG(15mM/L)浸泡30分钟的硝酸纤维素膜(Hybond-C extra，Amersham，NC)覆盖平板，于37℃再培育3.5小时；取出平板4℃冷却15分钟，然后用针在膜以及板上做上标记。将膜取下置于TBST中洗3次，每次10分钟，然后浸于NC膜浸在封闭液中，室温，轻微振荡，封闭过夜。 
将NC膜从封闭液中取出，用TBST洗膜2次，每次5分钟。加入华支睾吸虫病人混合血清(采自广西壮族自治区)5ml/膜，室温下轻微振荡3小时。再用TBST洗膜3次，每次10分钟。加入二抗(5ml/膜)即羊抗人碱性磷酸酶结合物(AP-GAH，BIO-RAD，1∶3 000稀释)室温下反应1小时，用TBST洗膜3次，每次10分钟，用TBS洗膜2次，每次5分钟，洗去残留的Tween20。 
将NC膜从TBS中取出，用Whatman 3MM的滤纸吸干多余的溶液，放入AP buffer浸泡NC膜3分钟。 
用Color Development Solution稀释NBT至终浓度0.3mg/ml，BCIP终浓度为0.15mg/ml(BCIP应逐滴加入已稀释的NBT中，防止 沉淀形成。)，配制成NBT-BCIP显色液。将NC膜浸入NBT-BCIP显色液中，在暗处进行显色反应直到阳性斑点清晰可见。终止显色反应。 
根据NC膜上阳性斑点在原培养板上的相应位置，挑取阳性噬菌斑，再经过复筛、三筛使得阳性噬菌体单克隆化。 
实施例3  噬菌体删除环化为pBluescript SK_噬菌粒及提取噬菌粒 
E.coli XL1-blue MRF′于LB培养基(含有10mM MgSO4，0.2％麦芽糖，15μg/ml Tet)中培养过夜。次日，取培养液100μl转接到新的LB培养基中，37℃，200rpm振荡培养约2小时。培养液经2 000g，离心10分钟，沉淀细菌，用10mM MgSO4重悬至OD600＝1.0。在细菌培养管中加入200μl E.coli XL1-blue MRF′重悬液、50μl含有阳性噬菌体的SM buffer和1μl辅助噬菌体。将细菌培养管放置于37℃水浴中15分钟。然后加入3ml LB，于37℃振荡培养5小时。取出细菌培养管，在65℃加热20分钟，然后3000g，离心15分钟，将上清转入一个新离心管中，置于4℃保存。 
SOLR菌于LB培养基(含有10mM MgSO4，50μg/ml Kan)中振荡培养，然后2 000g，离心10分钟，用10mM MgSO4重悬至OD600＝1.0，在1.5ml Ep离心管中加入200μl SOLR和上述制备的上清保存液1μl，在37℃温育15分钟，然后取出25μl均匀涂布于LB(含100μg/ml Amp)琼脂平板上，37℃倒置培养过夜。 
培养基上生长的菌落，即为含华支睾吸虫cDNA插入片段的pBluescript SK_噬菌粒的SOLR菌落。 
使用AxyPrep质粒DNA小量试剂盒[爱思进生物技术(杭州)有限公司]提取pBluescript SK_噬菌粒。 
实施例4  华支睾吸虫PPMP型抗原基因的分离 
筛选获得的阳性克隆，经删除环化为pBluescript SK_质粒。由上海Invitrogen公司测序，共得到3个华支睾吸虫PPMP型抗原基因的部分mRNA(cDNA)序列。分别是华支睾吸虫Cs34、Cs2和Cs3基因，插入片段长度分别为1044、734和1136个碱基。 
华支睾吸虫Cs34基因的mRNA(cDNA)序列如SEQ ID NO：1所示。 
华支睾吸虫Cs2基因的mRNA(cDNA)序列如SEQ ID NO：2所示。 
华支睾吸虫Cs3基因的mRNA(cDNA)序列如SEQ ID NO：3所示。 
Cs34、Cs2和Cs3克隆中插入的cDNA片段推导的蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO：4-6所示，Cs34、Cs2和Cs3蛋白分别含265、157和284个氨基酸。 
华支睾吸虫Cs34基因的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。 
华支睾吸虫Cs2基因的氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示。 
华支睾吸虫Cs3基因的氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示。 
实施例5  华支睾吸虫Cs34抗原同源性比较 
使用Blastp对GenBank中nr库进行同源性比较，结果如下： 
Search database NOn-redundant protein sequences(nr)using Blastp(protein-protein BLAST) 
                                                                     Score   E 
Sequences producing significant alignments：                         (Bits)  Value 
gb|AAD33058.1|AF136608_1 antigen Cs44[Clonorchis sinensis]           249     2e-64 
gb|EAW95432.1|hCG1645603，isoform CRA_b[Homo sapiens]                187     7e-46 
gb|AAC61699.1|antigen[Clonorchis sinensis]                           186     2e-45 
sp|Q25060.1|LWA_HYDEC RecName：Full＝LWamide neuropeptides；Co...    132     2e-29 
gb|AAM18465.1|AF461711_1 proline rich antigen 2[Clonorchis s...      127     1e-27 
gb|AAM18463.1|AF461709_1 glycine rich antigen 2[Clonorchis s...      125     2e-27 
ref|XP_844266.1|hypothetical protein[Trypanosoma brucei TRE...       111     7e-23 
ref|ZP_03206353.1|multiple banded antigen[Ureaplasma urealy...       106     2e-21 
gb|AAT79412.1|multiple banded antigen[Ureaplasma urealyticum]        105     3e-21 
sp|Q27409.1|FP1_MYTGA RecName：Full＝Adhesive plaque matrix pr...    102     2e-20 
ref|XP_001625536.1|predicted protein[Nematostella vectensis...       97.1    1e-18 
gb|ABD75543.1|orf1ab polyprotein[Human coronavirus HKU1]             95.5    4e-18 
sp|Q25460.1|FP1_MYTED RecName：Full＝Adhesive plaque matrix pr...    94.4    9e-18 
gb|AAT79415.1|multiple banded antigen[Ureaplasma urealyticum]        92.4    3e-17 
ref|XP_002243306.1|hypothetical protein BRAFLDRAFT_139244[B...       90.5    1e-16 
ref|ZP_02558216.1|multiple banded antigen[Ureaplasma urealy...       90.1    1e-16 
gb|AAX23968.1|foot protein 1[Mytilus edulis]                         88.6    5e-16 
ref|XP_001601102.1|PREDICTED：similar to Sec24B protein，put...      84.7    6e-15 
gb|AAK35165.1|proline-rich antigen[Clonorchis sinensis]              84.7    7e-15 
ref|ZP_02696229.1|conserved hypothetical protein[Ureaplasma...       82.0    5e-14 
ref|XP_001818288.1|hypothetical protein[Aspergillus oryzae...        80.1    2e-13 
ref|XP_001714252.1|PREDICTED：similar to RE32881p[Homo sapi...       80.1    2e-13 
gb|EED57898.1|cell surface protein，putative[Aspergillus fl...       79.0    4e-13 
ref|XP_001377293.1|PREDICTED：hypothetical protein[Monodelp...       78.2    7e-13 
ref|XP_001114423.1|PREDICTED：MAGE-like protein 2[Macaca mu...       75.9    3e-12 
ref|XP_220903.4|PREDICTED：similar to calcium binding and co...      74.3    9e-12 
gb|ABK24691.1|unknown[Picea sitchensis]                              71.6    5e-11 
ref|NP_001024021.1|hypothetical protein H39E23.3[Caenorhabd...       67.0    1e-09 
ref|XP_001493076.2|PREDICTED：similar to MAGEL2 protein[Equ...       60.1    2e-07 
ref|XP_001137791.1|PREDICTED：hypothetical protein[Pan trog...       56.6    2e-06 
ref|XP_001671474.1|Hypothetical protein CBG17606[Caenorhabd...       54.3    9e-06 
ref|XP_001697432.1|predicted protein[Chlamydomonas reinhard...       54.3    1e-05 
ref|YP_001107629.1|PE-PGRS family protein[Saccharopolyspora...       52.4    3e-05 
gb|AAH96211.1|PRB3 protein[Homo sapiens]                             47.0    0.002 
gb|AAH96210.1|PRB3 protein[Homo sapiens]>gb|AAH96209.1|PR...         45.8    0.004 
ref|NP_006240.4|proline-rich protein BstNI subfamily 3precu...       45.4    0.005 
gb|EAW96230.1|proline-rich protein BstNI subfamily 3[Homo s...       45.1    0.006 
ref|XP_002249737.1|hypothetical protein BRAFLDRAFT_111807[B...       41.6    0.061 
gb|AAF71700.1|AF206618_1 carboxyl-ester lipase[Gorilla gorilla]      41.2    0.094 
ref|XP_808957.1|trans-sialidase[Trypanosoma cruzi strain CL...       37.7    1.0 
ref|XP_581873.3|PREDICTED：similar to MAGEL2 protein[Bos ta...       37.7    1.1 
sp|Q04118.1|PRB3_HUMAN RecName：Full＝Basic salivary proline-r...    37.4    1.1 
ref|NP_001078199.1|structural constituent of cell wall [Arab...      36.2    2.7 
ref|XP_820135.1|trans-sialidase[Trypanosoma cruzi strain CL...       35.0    6.2 
ref|XP_001303156.1|agglutinin[Trichomonas vaginalis G3]>gb...        34.7    7.2 
与第一例：antigen Cs44[Clonorchis sinensis]的氨基酸一致性为55％，同源性为63％。如下所示： 
gb|AAD33058.1|AF136608_1 antigen Cs44[Clonorchis sinensis] 
Length＝274 
Score＝249bits(636)，Expect＝2e-64，Method：Compositional matrix adjust. 
Identities＝150/271(55％)，Positives＝172/271(63％)，Gaps＝6/271(2％) 
Query 1    LKLTISAALFLNVLC---SAEP---GDRDAKPPMPGDRDAKPPMPGDRDAKPPMPGDRDA  54 
           LKL I  ALFLNVLC    A+P   GD  A+PP  GD  A+PP  GD  A+PP  GD  A 
Sbjct 4    LKLVIIGALFLNVLCLDGGAQPPKSGDGGAQPPKSGDGGAQPPKSGDGGAQPPKSGDGGA  63 
Query 55   KPPMPGDRDAKPPMPGDRDAKPPMPGDRDAKPPMPGDRDAKPPMPGDRDAKPPMPGDRDA  114 
           +PP  GD  A+PP  GD  A+PP  GD  A+PP  GD  A+PP  GD  A+PP  GD  A 
Sbjct 64   QPPKSGDGGAQPPKSGDGGAQPPKSGDGGAQPPKSGDGGAQPPKSGDGGAQPPKSGDGGA  123 
Query 115  KPPMPGDRDAKPPMPGDRDAKPPMPGDRDAKPPMPGDRDAKPPMPGDRDAKPPMPGDRDA  174 
           +PP  GD  A+PP  GD  A+PP  GD  A+PP  GD  A+PP  GD  A+PP  GD  A 
Sbjct 124  QPPKSGDGGAQPPKSGDGGAQPPKSGDGGAQPPKSGDGGAQPPKSGDGGAQPPKSGDGGA  183 
Query 175  KPPMPGDRDAKPPMPGDRDAKPPMPGDRDAKPPMPGDRDAKPPMPGDRDAKPPMPGDRDA  234 
           +PP  GD  A+PP  GD  A+PP  GD  A+PP  GD  A+PP  GD  A+PP  GD  A 
Sbjct 184  QPPKSGDGGAQPPKSGDGGAQPPKSGDGGAQPPKSGDGGAQPPKSGDGGAQPPKSGDGGA  243 
Query 235  QPPMSGAQRPFSHWIAGWFLVLLAVKASDHF  265 
           QPP SGAQRPFSHWIAGWFLV L VKASDHF 
Sbjct 244  QPPKSGAQRPFSHWIAGWFLVPLEVKASDHF  274 
实施例6  华支睾吸虫PPMP型抗原基因的Alignment分析 
本发明人发现的3例PPMP型抗原氨基酸序列，使用Omiga2.0 
软件与Glycine rich antigen等序列一同进行多序列alignment分析，经 手工调整后，alignment分析如图1及图2所示。Alignment分析表明：华支睾吸虫PPMP抗原基因是一类多同源基因家族。PPMP I型抗原的Cs34和Cs2序列基本相同，具有相同“KPPMPGDRDA”十氨基酸重复串列序列，但Cs2基因的C端缺失，Cs34基因含有部分C端结构。而PPMP II型的Cs3基因的十氨基酸重复串列序列为“QPPMPGGRDA”，重复串列结构中有二个氨基酸发生了改变，该基因的C端同样缺失。该类抗原与华支睾吸虫的GRA、GRA2、PRA和PRA2蛋白的N和C端结构序列高度一致，并含有高度疏水区，由大量的疏水性氨基酸组成。由此可推：Cs34抗原的全长氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示，含268个氨基酸。 
实施例7  华支睾吸虫Cs34抗原基因的SignalP分析 
将Cs34抗原全长氨基酸序列传送至SignalP 3.0Server(网址：http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)，使用神经网络法(NN)进行在线信号肽剪切位点分析，结果如图3和下面计算结果： 
#data 
>Sequence             length＝268 
#Measure  Position  Value  Cutoff signal peptide？ 
max.C     21        0.513  0.32        YES 
max.Y     21        0.622  0.33        YES 
max.S     6         0.969  0.87        YES 
mean S    1-20      0.828  0.48        YES 
D         1-20      0.725  0.43        YES 
#Most likely cleavage site between pos.20 and 21：CSA-EP 
使用隐马可夫模型(HMM)进行在线信号肽剪切位点分析，结 果如图4和下面的计算结果： 
#data 
>Sequence 
Prediction：Signal peptide 
Signal peptide probability：0.991 
Signal anchor probability：0.000 
Max cleavage site probability：0.741 between pos.20 and 21 
根据SignalP分析结果，表明华支睾吸虫Cs34抗原确实含有信号肽结构。信号肽剪切位点位于第20和第21个氨基酸之间。经信号肽剪切后的成熟Cs34抗原的氨基酸序列(含248个氨基酸)如SEQ IDNO：8所示。含248个氨基酸，预测分子量为26.61kDa。 
由此可见Cs2和Cs3基因虽然缺失N端序列，但已含有成熟抗原蛋白的全部编码区域。 
实施例8  pET28b-Cs2表达载体的构建 
将pBluescript SK_Cs2噬菌粒，用EcoRI/XhoI(NEB公司)限制性内切酶，37℃双酶切过夜。酶切产物在1％的琼脂糖凝胶电泳(见图5)，在紫外灯下切割分离的目的片段，用E.Z.N.A.Ultra-Sep 
Figure GSA00000131328100221
GelExtraction Kit(Omiga公司)纯化回收目的片段(755bp)。 
pET28b表达载体同样用EcoRI/XhoI(NEB公司)限制性内切酶作双酶切，37℃反应过夜。酶切产物在1％的琼脂糖凝胶电泳(见图6)，在紫外灯下切割分离的目的片段，用E.Z.N.A.Ultra-Sep 
Figure GSA00000131328100222
GelExtraction Kit(Omiga公司)纯化回收。 
将目的片段和载体片段按8∶1摩尔比进行连接，连接体系中含 T4 DNA连接酶(NEB公司)1ul，10×T4 ligase buffer 2ul，去离子水，目的片段和载体片段共计体积为20ul于1.5ml Eppendorf管中16℃连接过夜，构建成pET28b-Cs2的原核表达的重组质粒。该重组蛋白的氨基酸序列(含196个氨基酸)如SEQ ID NO：9所示。预测分子量为20.98kDa。 
连接好的表达载体转化至DH5a，提取质粒后，验证插入序列无误。并进一步转化E.coli BLR(DE3)感受态细胞。 
实施例9  pET28b-Cs3表达载体的构建 
将pBluescript SK_Cs3噬菌粒，用EcoRI/XhoI(NEB公司)限制性内切酶，37℃双酶切过夜。酶切产物在1％的琼脂糖凝胶电泳(见图7)，在紫外灯下切割分离的目的片段，用E.Z.N.A.Ultra-Sep 
Figure GSA00000131328100231
GelExtraction Kit(Omiga公司)纯化回收目的片段(755bp)。 
pET28b表达载体同样用EcoRI/XhoI(NEB公司)限制性内切酶作双酶切，37℃反应过夜。酶切产物在1％的琼脂糖凝胶电泳(见图7)，在紫外灯下切割分离的目的片段，用E.Z.N.A.Ultra-Sep 
Figure GSA00000131328100232
GelExtraction Kit(Omiga公司)纯化回收。 
将目的片段和载体片段按8∶1摩尔比进行连接，连接体系中含T4 DNA连接酶(NEB公司)1ul，10×T4 ligase buffer 2ul，去离子水，目的片段和载体片段共计体积为20ul于1.5ml Eppendorf管中16℃连接过夜，构建成pET28b-Cs3的原核表达的重组质粒。该重组蛋白的氨基酸序列(含323个氨基酸)如SEQ ID NO：10所示。预测分子 量为33.05kDa。 
连接好的表达载体转化至DH5a，提取质粒后，验证插入序列无误。并进一步转化E.coli BLR(DE3)pLysS感受态细胞。 
实施例10  重组蛋白的表达鉴定及纯化 
转化好的表达宿主菌接种于4ml的LB培养基(含50μg/ml的Kan)中，于37℃，200rpm，振荡培养至OD600＝0.6时，取出2ml菌液加入2μl 1M的IPTG进行诱导，剩余的2ml菌液不加IPTG作为对照，37℃，200rpm，振荡培养4小时。将培养好的菌液于4℃，经5 000rpm离心10分钟收集菌体，弃去上清。向诱导管和对照管中分别加入200μl 0.15M的PBS重悬菌体。分别从诱导管和对照管中取出5μl的重悬液，加入2×SDS-PAGE加样缓冲液5μl，混匀后于100℃煮沸5分钟变性。以8μl/孔样品进行SDS-PAGE分析(浓缩胶为5％，分离胶为12％或16％)。电泳条件为浓缩胶80V，分离胶100V。电泳结束后，用染色液染色4小时，再用脱色液脱色，直到蛋白条带清晰可见。 
结果： 
pET28b-Cs2、pET28b-Cs3在1mM的IPTG条件下37℃诱导，分别在22、39Ku处可见重组蛋白表达条带。重组蛋白仅在上清中有表达。如图8、9所示。 
重组蛋白的纯化 
诱导后的菌液(500ml)经4000rpm，4℃，离心10分钟，弃尽上清。按每克细菌糊加入5ml的比例，向菌体中加入BugBuster 
Figure GSA00000131328100251
蛋白抽提剂(NOvagen公司)，并加入5Ku rLysozyme(每克细菌糊，NOvagen公司)以及125u Benzonase核酸酶(每克细菌糊，NOvagen公司)，充分悬浮沉淀后，室温振荡30min。然后于4℃，9 000rpm离心10分钟。 
可溶性蛋白的纯化 
取1ml的Ni-NTA Agarose(Qiagen公司)装柱，加入大量0.15M的PBS冲洗，除去残留的乙醇。 
将离心后的诱导细菌上清液加入到已经处理好的Ni-NTAAgarose中，置于摇床上，室温振荡60-90分钟，使蛋白与Ni-NTAAgarose充分结合。 
停止振荡后，待Ni-NTA Agarose沉降，打开柱子下面的塞子，收集流出的液体。 
用4倍床体的Washing Buffer洗柱两次，收集流出的液体。 
然后用2-4倍床体的含不同浓度咪唑的Elution Buffer洗涤柱子，分别收集洗脱液。 
将收集的液体进行SDS-PAGE电泳检测分析，检测蛋白纯化的效果。pET28b-Cs2在E.coli BLR(DE3)宿主菌、pET28b-Cs3在E.coliBLR(DE3)pLysS宿主菌中的可溶性重组蛋白纯化结果如图10、11所示。 
实施例11  酶联免疫吸附试验检测抗体 
1.间接ELISA方法检测血清中的抗体方法 
用重组蛋白包被酶标板(Nunc公司，96孔板)，4℃过夜；1％BSA37℃封闭1小时；分别加入1∶100稀释的华支睾吸虫病人、正常人血清100ul，37℃反应1.5小时；加入100μl的HRP标记羊抗人IgG(Sigma公司，1∶10 000稀释)，37℃反应1小时；加入底物TMB(天根公司)显色，酶标仪450nm读取数值。 
2.pET28b-Cs2可溶性纯化蛋白检测抗体效果评价 
对采自广西横县的35份华支睾吸虫病人血清，采自华支睾吸虫病非流行区的广西靖西市的36份正常人血清，15例日本血吸虫病人血清、15例并殖吸虫病人血清和13例猪囊尾蚴病人血清，以上述间接ELISA方法检测血清中的抗体。重组抗原pET28b-Cs2的可溶性纯化蛋白的包被浓度为0.5ug/ml，每孔100ul。 
ELISA结果如下： 
pET28b-Cs2可溶性纯化蛋白检测血清中特异性抗体间接ELISA结果 
36份正常人血清平均OD值＝0.047，SD＝0.0247。以正常人血清均值加上2倍SD为判断标准，OD值大于0.096为阳性。 
36份粪检阴性的正常人血清中，有2例大于0.096。以pET28b-CS2不可溶性纯化蛋白检测抗体的ELISA方法的特异性＝34/36×100％＝94.4％。 
35份粪检阳性血清平均OD值＝0.218，SD＝0.175，其中26例血清OD值大于0.096。建立的ELISA方法的敏感性＝26/35×100％＝74.3％。 
本ELISA方法的总符合率＝(34+26)/(36+35)×100％＝84.5％。 
15例日本血吸虫病人血清、15例并殖吸虫病人血清和13例猪囊尾蚴病人血清中，各有一例的OD值大于0.096，假阳性率分别为6.67％、6.67％和7.69％。该ELISA方法特异性较高，与血吸虫、并殖吸虫、猪囊尾蚴抗体无明显交叉反应，假阳性率同正常人血清。 
pET28b-Cs2可溶性纯化重组蛋白ELISA法检测各类血清中的特异性抗体的散点图见图12。 
3.pET28b-Cs3可溶性纯化蛋白检测抗体效果评价 
对采自广西横县的35份华支睾吸虫病人血清，采自华支睾吸虫病非流行区的广西靖西市的36份正常人血清，15例日本血吸虫病人血清、15例并殖吸虫病人血清和13例猪囊尾蚴病人血清，以上述间接ELISA方法检测血清中的抗体。重组pET28b-Cs3的可溶性纯化蛋白的包被浓度为0.5ug/ml，每孔100ul。 ELISA结果如下： 
pET28b-Cs3可溶性纯化蛋白检测血清中特异性抗体间接ELISA结果 
Figure GSA00000131328100281
36份正常人血清平均OD值＝0.037，SD＝0.0146。以正常人血清均值加上2倍SD为判断标准，OD值大于0.066为阳性。 
36份粪检阴性的正常人血清中，有2例大于0.066。以pET28b-Cs3可溶性纯化蛋白检测抗体的ELISA方法的特异性＝34/36×100％＝94.4％。 
35份粪检阳性血清平均OD值＝0.235，SD＝0.170，其中30例血清OD值大于0.066。建立的ELISA方法的敏感性＝30/35×100％＝85.7％。 
本ELISA方法的总符合率＝(34+30)/(36+35)×100％＝90.1％。 
15例日本血吸虫病人血清、15例并殖吸虫病人血清和13例猪囊尾蚴病人血清中，各有1例的OD值大于阳性界值，假阳性率分别为6.67％、6.67％和7.69％。该ELISA方法特异性较高，与血吸虫、并殖吸虫、猪囊尾蚴抗体无明显交叉反应，假阳性率同正常人血清。 
pET28b-Cs3可溶性纯化重组蛋白ELISA法检测各类血清中的特 异性抗体的散点图见图13。 
实施例12  华支睾吸虫Cs2抗原免疫原性检测 
用pET28b-Cs2可溶性纯化重组蛋白，免疫5只Balb/c小鼠。每鼠接种抗原30ug，首次接种使用福氏完全佐剂(Sigma公司)，皮下注射；每隔3周，使用福氏不完全佐剂(Sigma公司)加强，腹腔注射，共强化免疫4次。取小鼠尾血，间接ELISA方法检测小鼠免疫效果。以pET28b-Cs2、pET28b-Cs3可溶性纯化蛋白(浓度为0.5ug/ml，100ul)分别包被酶标板，二抗为Sigma公司的HRP标记羊抗鼠IgG，1∶5000稀释。 
结果：以pET28b-Cs2、pET28b-Cs3可溶性纯化蛋白分别包被酶标板，间接ELISA方法检测。免疫小鼠血清的平均OD值分别为0.500、0.517，SD分别为0.019、0.019；正常小鼠血清的OD值分别为0.075、0.072；PBST空白对照的OD值分别为0.058、0.061。 
具体结果如下表所示： 
华支睾吸虫Cs2重组蛋白免疫效果简接ELISA检测结果 
实验结果表明，pET28b-Cs2重组蛋白，具很强的免疫原性，实验小鼠对重组抗原可产生强烈的免疫应答，易制备多/单克隆抗体。Cs2 重组蛋白的氨基酸序列已含有Cs34抗原的所有的氨基酸序列特征，Cs2的抗原决定簇已涵盖Cs34的所有抗原决定簇。故可知：Cs34抗原也具有较好的免疫原性。重组蛋白的小鼠多抗对Cs3重组蛋白也存在强烈的交叉反应。 
实施例13  华支睾吸虫Cs3抗原免疫原性检测 
用pET28b-Cs3可溶性纯化重组蛋白，免疫5只Balb/c小鼠。每鼠接种抗原30ug，首次接种使用福氏完全佐剂(Sigma公司)，皮下注射；每隔3周，使用福氏不完全佐剂(Sigma公司)加强，腹腔注射，共强化免疫4次。取小鼠尾血，间接ELISA方法检测小鼠免疫效果。以pET28b-Cs3可溶性纯化蛋白(浓度为0.5ug/ml，100ul)包被酶标板，二抗为Sigma公司的HRP标记羊抗鼠IgG，1∶5000稀释。 
结果：以pET28b-Cs3可溶性纯化蛋白包被酶标板，间接ELISA方法检测。免疫小鼠血清的平均OD值为0.500，SD分别为0.023；正常小鼠血清的OD值为0.076；PBST空白对照的OD值为0.059。 
具体结果如下表所示： 
华支睾吸虫Cs3重组蛋白免疫效果简接ELISA检测结果 
  #1鼠   0.474
  #2鼠   0.495
  #3鼠   0.543
  #4鼠   0.489
  #5鼠   0.501
  正常鼠   0.076
  PBST   0.059
实验结果表明，pET28b-Cs3重组蛋白，具很强的免疫原性，实验小鼠对重组抗原可产生强烈的免疫应答，易制备多/单克隆抗体。
序列表 
<110>中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所 
<120>华支睾吸虫特异性PPMP型抗原及其应用 
<160>10 
<170>PatentIn version 3.3 
<210>1 
<211>1044 
<212>cDNA 
<213>华支睾吸虫Cs34 
<400>1 
cctgaaactt actatcagtg cagccctctt cctcaatgtt ctgtgttcag cagaacctgg    60 
agaccgcgat gcaaaacctc ctatgccagg tgaccgcgat gcaaaacctc ctatgccagg    120 
tgaccgcgat gcaaaacctc ctatgccagg tgaccgcgat gcaaaacctc ctatgccagg    180 
tgaccgcgat gcaaaacctc ctatgccagg tgaccgcgat gcaaaacctc ctatgccagg    240 
tgaccgcgat gcaaaacctc ctatgccagg tgaccgcgat gcaaaacctc ctatgccagg    300 
tgaccgcgat gcaaaacctc ctatgccagg tgaccgcgat gcaaaacctc ctatgccagg    360 
tgaccgcgat gcaaaacctc ctatgccagg tgaccgcgat gcaaaacctc ctatgccagg    420 
tgaccgcgat gcaaaacctc ctatgccagg tgaccgcgat gcaaaacctc ctatgccagg    480 
tgaccgcgat gcaaaacctc ctatgccagg tgaccgcgat gcaaaacctc ctatgccagg    540 
tgaccgcgat gcaaaacctc ctatgccagg tgaccgcgat gcaaaacctc ctatgccagg    600 
tgaccgcgat gcaaaacctc ctatgccagg tgaccgcgat gcaaaacctc ctatgccagg    660 
tgaccgcgat gcaaaacctc ctatgccagg tgaccgcgat gcacaacctc ctatgtcagg    720 
tgctcaacga ccgtttagtc actggatcgc tggttggttc ttggttctcc tggcagtcaa    780 
ggcctccgat cacttctgat ttccatgtgc aaacggacgc gcatcgcccc aaaatactat    840 
gtgtgttgag ctttgacatc atgcatctaa cgtacgcttc tcgccatttt gtggatttta    900 
tttaattcgg catacgacta ttcatttgtg ctactccgaa caatatctgc ataatccatg    960 
acttttcgcg tttctggatg atgaagtaca ttatataacc catgtttatt acactttttc    1020 
cctctaaaaa aaaaaaaaaa aaaa                                           1044 
<210>2 
<211>734 
<212>cDNA 
<213>华支睾吸虫Cs2 
<400>2 
gccaggtgac cgcgatgcaa aacctcctat gccaggtgac cgcgatgcaa aacctcctat    60 
gccaggtgac cgcgatgcaa aacctcctat gccaggtgac cgcgatgcaa aacctcctat    120 
gccaggtgac cgcgatgcaa aacctcctat gccaggtgac cgcgatgcaa aacctcctat    180 
gccaggtgac cgcgatgcaa aacctcctat gccaggtgac cgcgatgcaa aacctcctat    240 
gccaggtgac cgcgatgcaa aacctcctat gccaggtgac cgcgatgcaa aacctcctat    300 
gccaggtgac cgcgatgcaa aacctcctat gccaggtgac cgcgatgcac aacctcctat    360 
gtcaggtgac cgcgatgcac aacctcctat gtcaggtgct caacgaccgt ttagtcactg    420 
gatcgctggt tggttcttgg ttctcctggc agtcaaggcc tccgatcact tctgatttcc    480 
atgtgcaaac ggacgcgcat cgccccaaaa tactatgtgt gttgagcttt gacatcatgc    540 
atctaacgta cgcttctcgc cattttgtgg attttattta attcggcata cgactattca    600 
tttgtgctac tccgaacaat atctgcataa tccatgactt ttcgcgtttc cggatgatga    660 
agtacattat ataacccatg tttattacac tttttccctc taaaaaaaaa aaaaaaaaaa    720 
aaaaaaaaaa aaaa                                                      734 
<210>3 
<211>1136 
<212>cDNA 
<213>华支睾吸虫Cs3 
<400>3 
ccgcgatgca caacctccta tgccaggtgg ccgcgatgca caacctccta tgccaggtgg    60 
ccgcgatgca caacctccta tgccaggtgg ccgcgatgca caacctccta tgccaggtgg    120 
ccgcgatgca caacctccta tgccaggtgg ccgcgatgca caacctccta tgccaggtgg    180 
ccgcgatgca caacctccta tgccaggtgg ccgcgatgca caacctccta tgccaggtgg    240 
ccgcgatgca caacctccta tgccaggtgg ccgcgatgca caacctccta tgccaggtgg    300 
ccgcgatgca caacctccta tgccaggtgg ccgcgatgca caacctccta tgccaggtgg    360 
ccgcgatgca caacctccta tgccaggtgg ccgcgatgca caacctccta tgccaggtgg    420 
ccgcgatgca caacctccta tgccaggtgg ccgcgatgca caacctccta tgccaggtgg    480 
ccgcgatgca caacctccta tgccaggtgg ccgcgatgca caacctccta tgccaggtgg    540 
ccgcgatgca caacctccta tgccaggtgg ccgcgatgca caacctccta tgccaggtgg    600 
ccgcgatgca caacctccta tgccaggtgg cggcgatgca caacctccta agtcagatgg    660 
ccgcgatgca caacctccta agtcagatgg cggcgatgca caacctccta agtcagatgg    720 
ccgcgatgca caacctccta agtcagatgg cggcgatgca caacctccta agtcagatgc    780 
tcaacgaccg tttagtcact ggatcgctgg ttggttcttg gttctcctgg cagtcaaggc    840 
ctccgatcac ttttgattcc catgtgcaaa cggacgcgca tcgccccaaa atactatgtg    900 
tgttgagctt tgacatcatg catctaacgt acgcttctcg ccattttgtg gattttattt    960 
aattcggcat acgactattc atttgtgtta ctccgaacaa tatttgcata atccatgact    1020 
tttcgcgttt ccggatgatg aagtacatta tataacccat gtttattacc ctttttccct    1080 
ttaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaa        1136 
<210>4 
<211>265 
<212>PRT 
<213>华支睾吸虫Cs34 
<400>4 
Leu Lys Leu Thr Ile Ser Ala Ala Leu Phe Leu Asn Val Leu Cys Ser 
1               5                   10                  15 
Ala Glu Pro Gly Asp Arg Asp Ala Lys Pro Pro Met Pro Gly Asp Arg 
            20                  25                  30 
Asp Ala Lys Pro Pro Met Pro Gly Asp Arg Asp Ala Lys Pro Pro Met 
        35                  40                  45 
Pro Gly Asp Arg Asp Ala Lys Pro Pro Met Pro Gly Asp Arg Asp Ala 
    50                  55                  60 
Lys Pro Pro Met Pro Gly Asp Arg Asp Ala Lys Pro Pro Met Pro Gly 
65                  70                  75                  80 
Asp Arg Asp Ala Lys Pro Pro Met Pro Gly Asp Arg Asp Ala Lys Pro 
                85                  90                  95 
Pro Met Pro Gly Asp Arg Asp Ala Lys Pro Pro Met Pro Gly Asp Arg 
            100                 105                 110 
Asp Ala Lys Pro Pro Met Pro Gly Asp Arg Asp Ala Lys Pro Pro Met 
        115                 120                 125 
Pro Gly Asp Arg Asp Ala Lys Pro Pro Met Pro Gly Asp Arg Asp Ala 
    130                 135                 140 
Lys Pro Pro Met Pro Gly Asp Arg Asp Ala Lys Pro Pro Met Pro Gly 
145                 150                 155                 160 
Asp Arg Asp Ala Lys Pro Pro Met Pro Gly Asp Arg Asp Ala Lys Pro 
                165                 170                 175 
Pro Met Pro Gly Asp Arg Asp Ala Lys Pro Pro Met Pro Gly Asp Arg 
            180                 185                 190 
Asp Ala Lys Pro Pro Met Pro Gly Asp Arg Asp Ala Lys Pro Pro Met 
        195                 200                 205 
Pro Gly Asp Arg Asp Ala Lys Pro Pro Met Pro Gly Asp Arg Asp Ala 
    210                 215                 220 
Lys Pro Pro Met Pro Gly Asp Arg Asp Ala Gln Pro Pro Met Ser Gly 
225                 230                 235                 240 
Ala Gln Arg Pro Phe Ser His Trp Ile Ala Gly Trp Phe Leu Val Leu 
                245                 250                 255 
Leu Ala Val Lys Ala Ser Asp His Phe 
            260                 265 
<2l0>5 
<211>157 
<212>PRT 
<213>华支睾吸虫Cs2 
<400>5 
Pro Gly Asp Arg Asp Ala Lys Pro Pro Met Pro Gly Asp Arg Asp Ala 
1               5                   10                  15 
Lys Pro Pro Met Pro Gly Asp Arg Asp Ala Lys Pro Pro Met Pro Gly 
            20                  25                  30 
Asp Arg Asp Ala Lys Pro Pro Met Pro Gly Asp Arg Asp Ala Lys Pro 
        35                  40                  45 
Pro Met Pro Gly Asp Arg Asp Ala Lys Pro Pro Met Pro Gly Asp Arg 
    50                  55                  60 
Asp Ala Lys Pro Pro Met Pro Gly Asp Arg Asp Ala Lys Pro Pro Met 
65                  70                  75                  80 
Pro Gly Asp Arg Asp Ala Lys Pro Pro Met Pro Gly Asp Arg Asp Ala 
                85                  90                  95 
Lys Pro Pro Met Pro Gly Asp Arg Asp Ala Lys Pro Pro Met Pro Gly 
            100                 105                 110 
Asp Arg Asp Ala Gln Pro Pro Met Ser Gly Asp Arg Asp Ala Gln Pro 
        115                 120                 125 
Pro Met Ser Gly Ala Gln Arg Pro Phe Ser His Trp Ile Ala Gly Trp 
    130                 135                 140 
Phe Leu Val Leu Leu Ala Val Lys Ala Ser Asp His Phe 
145                 150                 155 
<210>6 
<211>284 
<212>PRT 
<213>华支睾吸虫Cs3 
<400>6 
Arg Asp Ala Gln Pro Pro Met Pro Gly Gly Arg Asp Ala Gln Pro Pro 
1               5                   10                  15 
Met Pro Gly Gly Arg Asp Ala Gln Pro Pro Met Pro Gly Gly Arg Asp 
            20                  25                  30 
Ala Gln Pro Pro Met Pro Gly Gly Arg Asp Ala Gln Pro Pro Met Pro 
        35                  40                  45 
Gly Gly Arg Asp Ala Gln Pro Pro Met Pro Gly Gly Arg Asp Ala Gln 
    50                  55                  60 
Pro Pro Met Pro Gly Gly Arg Asp Ala Gln Pro Pro Met Pro Gly Gly 
65                  70                  75                  80 
Arg Asp Ala Gln Pro Pro Met Pro Gly Gly Arg Asp Ala Gln Pro Pro 
                85                  90                  95 
Met Pro Gly Gly Arg Asp Ala Gln Pro Pro Met Pro Gly Gly Arg Asp 
            100                 105                 110 
Ala Gln Pro Pro Met Pro Gly Gly Arg Asp Ala Gln Pro Pro Met Pro 
        115                 120                 125 
Gly Gly Arg Asp Ala Gln Pro Pro Met Pro Gly Gly Arg Asp Ala Gln 
    130                 135                 140 
Pro Pro Met Pro Gly Gly Arg Asp Ala Gln Pro Pro Met Pro Gly Gly 
145                 150                 155                 160 
Arg Asp Ala Gln Pro Pro Met Pro Gly Gly Arg Asp Ala Gln Pro Pro 
                165                 170                 175 
Met Pro Gly Gly Arg Asp Ala Gln Pro Pro Met Pro Gly Gly Arg Asp 
            180                 185                 190 
Ala Gln Pro Pro Met Pro Gly Gly Arg Asp Ala Gln Pro Pro Met Pro 
        195                 200                 205 
Gly Gly Gly Asp Ala Gln Pro Pro Lys Ser Asp Gly Arg Asp Ala Gln 
    210                 215                 220 
Pro Pro Lys Ser Asp Gly Gly Asp Ala Gln Pro Pro Lys Ser Asp Gly 
225                 230                 235                 240 
Arg Asp Ala Gln Pro Pro Lys Ser Asp Gly Gly Asp Ala Gln Pro Pro 
                245                 250                 255 
Lys Ser Asp Ala Gln Arg Pro Phe Ser His Trp Ile Ala Gly Trp Phe 
            260                 265                 270 
Leu Val Leu Leu Ala Val Lys Ala Ser Asp His Phe 
        275                 280 
<210>7 
<211>268 
<212>PRT 
<213>华支睾吸虫Cs34抗原 
<400>7 
Met Lys Phe Leu Lys Leu Thr Ile Ser Ala Ala Leu Phe Leu Asn Val 
1               5                   10                  15 
Leu Cys Ser Ala Glu Pro Gly Asp Arg Asp Ala Lys Pro Pro Met Pro 
            20                  25                  30 
Gly Asp Arg Asp Ala Lys Pro Pro Met Pro Gly Asp Arg Asp Ala Lys 
        35                  40                  45 
Pro Pro Met Pro Gly Asp Arg Asp Ala Lys Pro Pro Met Pro Gly Asp 
    50                  55                  60 
Arg Asp Ala Lys Pro Pro Met Pro Gly Asp Arg Asp Ala Lys Pro Pro 
65                  70                  75                  80 
Met Pro Gly Asp Arg Asp Ala Lys Pro Pro Met Pro Gly Asp Arg Asp 
                85                  90                  95 
Ala Lys Pro Pro Met Pro Gly Asp Arg Asp Ala Lys Pro Pro Met Pro 
            100                 105                 110 
Gly Asp Arg Asp Ala Lys Pro Pro Met Pro Gly Asp Arg Asp Ala Lys 
        115                 120                 125 
Pro Pro Met Pro Gly Asp Arg Asp Ala Lys Pro Pro Met Pro Gly Asp 
    130                 135                 140 
Arg Asp Ala Lys Pro Pro Met Pro Gly Asp Arg Asp Ala Lys Pro Pro 
145                 150                 155                 160 
Met Pro Gly Asp Arg Asp Ala Lys Pro Pro Met Pro Gly Asp Arg Asp 
                165                 170                 175 
Ala Lys Pro Pro Met Pro Gly Asp Arg Asp Ala Lys Pro Pro Met Pro 
            180                 185                 190 
Gly Asp Arg Asp Ala Lys Pro Pro Met Pro Gly Asp Arg Asp Ala Lys 
        195                 200                 205 
Pro Pro Met Pro Gly Asp Arg Asp Ala Lys Pro Pro Met Pro Gly Asp 
    210                 215                 220 
Arg Asp Ala Lys Pro Pro Met Pro Gly Asp Arg Asp Ala Gln Pro Pro 
225                 230                 235                 240 
Met Ser Gly Ala Gln Arg Pro Phe Ser His Trp Ile Ala Gly Trp Phe 
                245                 250                 255 
Leu Val Leu Leu Ala Val Lys Ala Ser Asp His Phe 
            260                 265 
<210>8 
<211>248 
<212>PRT 
<213>华支睾吸虫Cs34抗原 
<400>8 
Glu Pro Gly Asp Arg Asp Ala Lys Pro Pro Met Pro Gly Asp Arg Asp 
1               5                   10                  15 
Ala Lys Pro Pro Met Pro Gly Asp Arg Asp Ala Lys Pro Pro Met Pro 
            20                  25                  30 
Gly Asp Arg Asp Ala Lys Pro Pro Met Pro Gly Asp Arg Asp Ala Lys 
        35                  40                  45 
Pro Pro Met Pro Gly Asp Arg Asp Ala Lys Pro Pro Met Pro Gly Asp 
    50                  55                  60 
Arg Asp Ala Lys Pro Pro Met Pro Gly Asp Arg Asp Ala Lys Pro Pro 
65                  70                  75                  80 
Met Pro Gly Asp Arg Asp Ala Lys Pro Pro Met Pro Gly Asp Arg Asp 
                85                  90                  95 
Ala Lys Pro Pro Met Pro Gly Asp Arg Asp Ala Lys Pro Pro Met Pro 
            100                 105                 110 
Gly Asp Arg Asp Ala Lys Pro Pro Met Pro Gly Asp Arg Asp Ala Lys 
        115                 120                 125 
Pro Pro Met Pro Gly Asp Arg Asp Ala Lys Pro Pro Met Pro Gly Asp 
    130                 135                 140 
Arg Asp Ala Lys Pro Pro Met Pro Gly Asp Arg Asp Ala Lys Pro Pro 
145                 150                 155                 160 
Met Pro Gly Asp Arg Asp Ala Lys Pro Pro Met Pro Gly Asp Arg Asp 
                165                 170                 175 
Ala Lys Pro Pro Met Pro Gly Asp Arg Asp Ala Lys Pro Pro Met Pro 
            180                 185                 190 
Gly Asp Arg Asp Ala Lys Pro Pro Met Pro Gly Asp Arg Asp Ala Lys 
        195                 200                 205 
Pro Pro Met Pro Gly Asp Arg Asp Ala Gln Pro Pro Met Ser Gly Ala 
    210                 215                 220 
Gln Arg Pro Phe Ser His Trp Ile Ala Gly Trp Phe Leu Val Leu Leu 
225                 230                 235                 240 
Ala Val Lys Ala Ser Asp His Phe 
                245 
<210>9 
<211>196 
<212>PRT 
<213>原核表达的重组质粒pPET28b-Cs2 
<400>9 
Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro 
1               5                   10                  15 
Arg Gly Ser His Met Ala Ser Met Thr Gly Gly Gln Gln Met Gly Arg 
            20                  25                  30 
Asp Pro Asn Ser Ala Arg Gly Pro Gly Asp Arg Asp Ala Lys Pro Pro 
        35                  40                  45 
Met Pro Gly Asp Arg Asp Ala Lys Pro Pro Met Pro Gly Asp Arg Asp 
    50                  55                  60 
Ala Lys Pro Pro Met Pro Gly Asp Arg Asp Ala Lys Pro Pro Met Pro 
65                  70                  75                  80 
Gly Asp Arg Asp Ala Lys Pro Pro Met Pro Gly Asp Arg Asp Ala Lys 
                85                  90                  95 
Pro Pro Met Pro Gly Asp Arg Asp Ala Lys Pro Pro Met Pro Gly Asp 
            100                 105                 110 
Arg Asp Ala Lys Pro Pro Met Pro Gly Asp Arg Asp Ala Lys Pro Pro 
        115                 120                 125 
Met Pro Gly Asp Arg Asp Ala Lys Pro Pro Met Pro Gly Asp Arg Asp 
    130                 135                 140 
Ala Lys Pro Pro Met Pro Gly Asp Arg Asp Ala Gln Pro Pro Met Ser 
145                 150                 155                 160 
Gly Asp Arg Asp Ala Gln Pro Pro Met Ser Gly Ala Gln Arg Pro Phe 
                165                 170                 175 
Ser His Trp Ile Ala Gly Trp Phe Leu Val Leu Leu Ala Val Lys Ala 
            180                 185                 190 
Ser Asp His Phe 
        195 
<210>10 
<211>323 
<212>PRT 
<213>原核表达的重组质粒pPET28b-Cs3 
<400>10 
Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro 
1               5                   10                  15 
Arg Gly Ser His Met Ala Ser Met Thr Gly Gly Gln Gln Met Gly Arg 
            20                  25                  30 
Asp Pro Asn Ser Ala Arg Gly Arg Asp Ala Gln Pro Pro Met Pro Gly 
        35                  40                  45 
Gly Arg Asp Ala Gln Pro Pro Met Pro Gly Gly Arg Asp Ala Gln Pro 
    50                  55                  60 
Pro Met Pro Gly Gly Arg Asp Ala Gln Pro Pro Met Pro Gly Gly Arg 
65                  70                  75                  80 
Asp Ala Gln Pro Pro Met Pro Gly Gly Arg Asp Ala Gln Pro Pro Met 
                85                  90                  95 
Pro Gly Gly Arg Asp Ala Gln Pro Pro Met Pro Gly Gly Arg Asp Ala 
            100                 105                 110 
Gln Pro Pro Met Pro Gly Gly Arg Asp Ala Gln Pro Pro Met Pro Gly 
        115                 120                 125 
Gly Arg Asp Ala Gln Pro Pro Met Pro Gly Gly Arg Asp Ala Gln Pro 
    130                 135                 140 
Pro Met Pro Gly Gly Arg Asp Ala Gln Pro Pro Met Pro Gly Gly Arg 
145                 150                 155                 160 
Asp Ala Gln Pro Pro Met Pro Gly Gly Arg Asp Ala Gln Pro Pro Met 
                165                 170                 175 
Pro Gly Gly Arg Asp Ala Gln Pro Pro Met Pro Gly Gly Arg Asp Ala 
            180                 185                 190 
Gln Pro Pro Met Pro Gly Gly Arg Asp Ala Gln Pro Pro Met Pro Gly 
        195                 200                 205 
Gly Arg Asp Ala Gln Pro Pro Met Pro Gly Gly Arg Asp Ala Gln Pro 
    210                 215                 220 
Pro Met Pro Gly Gly Arg Asp Ala Gln Pro Pro Met Pro Gly Gly Arg 
225                 230                 235                 240 
Asp Ala Gln Pro Pro Met Pro Gly Gly Gly Asp Ala Gln Pro Pro Lys 
                245                 250                 255 
Ser Asp Gly Arg Asp Ala Gln Pro Pro Lys Ser Asp Gly Gly Asp Ala 
            260                 265                 270 
Gln Pro Pro Lys Ser Asp Gly Arg Asp Ala Gln Pro Pro Lys Ser Asp 
        275                 280                 285 
Gly Gly Asp Ala Gln Pro Pro Lys Ser Asp Ala Gln Arg Pro Phe Ser 
    290                 295                 300 
His Trp Ile Ala Gly Trp Phe Leu Val Leu Leu Ala Val Lys Ala Ser 
305                 310                 315                 320 
Asp His Phe 

Claims (43)

1.一种华支睾吸虫特异性PPMP型抗原，其特征在于：所述的抗原基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示、或者所述的抗原基因的核苷酸序列与SEQ ID NO：1所示核苷酸序列同源性达90％以上、或者其部分经过取代、缺失或者添加后如SEQ ID NO：1所示核苷酸序列所衍生的具有抗原性的核苷酸序列。
2.一种分离的华支睾吸虫特异性PPMP型抗原蛋白，其特征在于：由权利要求1所述的一种华支睾吸虫的特异性抗原基因的核苷酸序列所编码、或者与权利要求1所述的一种华支睾吸虫的特异性抗原基因的核苷酸序列同源性达90％以上的核苷酸序列所编码、或者由部分经过取代、缺失或者添加后的权利要求1所述的一种华支睾吸虫的特异性抗原基因的核苷酸序列所编码。
3.如权利要求2所述的分离的华支睾吸虫特异性PPMP型抗原蛋白，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示、或者对SEQ IDNO：4所示的氨基酸序列经过取代、缺失或者添加一个或者几个氨基酸后的由SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列所衍生的氨基酸序列。
4.如权利要求2所述的分离的华支睾吸虫特异性PPMP型抗原蛋白，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示、或者对SEQ IDNO：7所示的氨基酸序列经过取代、缺失或者添加一个或者几个氨基酸后的由SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列所衍生的氨基酸序列。
5.如权利要求2所述的分离的华支睾吸虫特异性PPMP型抗原蛋白，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示、或者对SEQ IDNO：8所示的氨基酸序列经过取代、缺失或者添加一个或者几个氨基酸后的由SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列所衍生的氨基酸序列。
6.一种抗体，其特征在于：特异性的结合权利要求2、或者权利要求3、或者权利要求4、或者权利要求5所述的一种分离的华支睾吸虫的特异性PPMP型抗原蛋白。
7.如权利要求6所述的一种抗体，其特征在于：所述的抗体为单克隆抗体。
8.一种载体，其特征在于：含有权利要求1所述的一种华支睾吸虫的特异性抗原基因。
9.一种宿主细胞，其特征在于：含有权利要求8所述的载体，或者用权利要求1所述的所述的一种华支睾吸虫的特异性PPMP型抗原基因转化或转染。
10.一种疫苗，其特征在于：含有权利要求6所述的抗体、或者权利要求2所述的分离的华支睾吸虫特异性PPMP型抗原蛋白、或者权利要求3所述的分离的华支睾吸虫特异性PPMP型抗原蛋白、或者权利要求4所述的分离的华支睾吸虫特异性PPMP型抗原蛋白、或者权利要求5所述的分离的华支睾吸虫特异性PPMP型抗原蛋白、或者权利要求8所述的载体。
11.权利要求2、或者权利要求3、或者权利要求4、或者权利要求5所述的一种分离的华支睾吸虫的特异性PPMP型抗原蛋白在制备治疗、诊断或者预防华支睾吸虫病的药物中的应用。
12.权利要求6所述的抗体在制备治疗、诊断或者预防华支睾吸虫病的药物中的应用。
13.权利要求8所述的载体在制备治疗、诊断或者预防华支睾吸虫病的药物中的应用。
14.权利要求10所述的疫苗在制备治疗、诊断或者预防华支睾吸虫病的药物中的应用。
15.一种试剂盒，其特征在于：含有权利要求2一种分离的华支睾吸虫的特异性PPMP型抗原蛋白、或者权利要求3一种分离的华支睾吸虫的特异性PPMP型抗原蛋白、或者权利要求4一种分离的华支睾吸虫的特异性PPMP型抗原蛋白、或者权利要求5所述的一种分离的华支睾吸虫的特异性PPMP型抗原蛋白、或者权利要求6所述的抗体。
16.一种华支睾吸虫特异性PPMP型抗原，其特征在于：所述的抗原基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示、或者所述的抗原基因的核苷酸序列与SEQ ID NO：2所示核苷酸序列同源性达90％以上、或者其部分经过取代、缺失或者添加后如SEQ ID NO：2所示核苷酸序列所衍生的具有抗原性的核苷酸序列。
17.一种分离的华支睾吸虫的特异性PPMP型抗原蛋白，其特征在于：由权利要求16所述的一种华支睾吸虫的特异性抗原基因的核苷酸序列所编码、或者与权利要求16所述的一种华支睾吸虫的特异性抗原基因的核苷酸序列同源性达90％以上的核苷酸序列所编码、或者由部分经过取代、缺失或者添加后的权利要求16所述的一种华支睾吸虫的特异性抗原基因的核苷酸序列所编码。
18.如权利要求17所述的分离的华支睾吸虫的特异性PPMP型抗原蛋白，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示、或者对SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列经过取代、缺失或者添加一个或者几个氨基酸后的由SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列所衍生的氨基酸序列。
19.一种抗体，其特征在于：特异性的结合权利要求17、或者权利要求18所述的一种分离的华支睾吸虫的特异性PPMP型抗原蛋白。
20.如权利要求19所述的一种抗体，其特征在于：所述的抗体为单克隆抗体。
21.一种载体，其特征在于：含有权利要求16所述的一种华支睾吸虫的特异性抗原基因。
22.如权利要求21所述的载体，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ IDNO：9所示。
23.一种宿主细胞，其特征在于：含有权利要求21所述的载体，或者所述的细胞用权利要求16所述的所述的一种华支睾吸虫的特异性PPMP型抗原基因转化或转染。
24.一种疫苗，其特征在于：含有权利要求19所述的抗体、或者权利要求17所述的分离的华支睾吸虫的特异性PPMP型抗原蛋白、或者权利要求18所述的分离的华支睾吸虫的特异性PPMP型抗原蛋白、或者权利要求21所述的载体。
25.权利要求17、或者权利要求18所述的一种华支睾吸虫的特异性PPMP型抗原蛋白在制备治疗、诊断或者预防华支睾吸虫病的药物中的应用。
26.权利要求19所述的抗体在制备治疗、诊断或者预防华支睾吸虫病的药物中的应用。
27.权利要求21所述的载体在制备治疗、诊断或者预防华支睾吸虫病的药物中的应用。
28.权利要求24所述的疫苗在制备治疗、诊断或者预防华支睾吸虫病的药物中的应用。
29.一种试剂盒，其特征在于：含有权利要求17或者权利要求18所述的一种分离的华支睾吸虫的特异性PPMP型抗原蛋白、或者权利要求19所述的抗体。
30.一种华支睾吸虫特异性PPMP型抗原，其特征在于：所述的抗原基因核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示、或者所述的抗原基因核苷酸序列与SEQ ID NO：3所示核苷酸序列同源性达90％以上、或者其部分经过取代、缺失或者添加后如SEQ ID NO：3所示核苷酸序列所衍生的具有抗原性的核苷酸序列。
31.一种分离的华支睾吸虫特异性PPMP型抗原蛋白，其特征在于：由权利要求30所述的一种华支睾吸虫的特异性抗原基因的核苷酸序列所编码、或者与权利要求30所述的一种华支睾吸虫的特异性抗原基因的核苷酸序列同源性达90％以上的核苷酸序列所编码、或者由部分经过取代、缺失或者添加后的权利要求30所述的一种华支睾吸虫的特异性抗原基因的核苷酸序列所编码。
32.如权利要求31所述的分离的华支睾吸虫特异性PPMP型抗原蛋白，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示、或者对SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列经过取代、缺失或者添加一个或者几个氨基酸后的由SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列所衍生的氨基酸序列。
33.一种抗体，其特征在于：特异性的结合权利要求31所述的一种华支睾吸虫的特异性PPMP型抗原蛋白、或者权利要求32所述的一种华支睾吸虫的特异性PPMP型抗原蛋白。
34.如权利要求33所述的一种抗体，其特征在于：所述的抗体为单克隆抗体。
35.一种载体，其特征在于：含有权利要求30所述的一种华支睾吸虫的特异性抗原基因。
36.如权利要求35所述的载体，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ IDNO：10所示。
37.一种宿主细胞，其特征在于：含有权利要求35所述的载体，或者所述的细胞用权利要求30所述的所述的一种华支睾吸虫的特异性PPMP型抗原基因转化或转染。
38.一种疫苗，其特征在于：含有权利要求31所述的一种分离的华支睾吸虫的特异性PPMP型抗原蛋白、或者权利要求32所述的一种分离的华支睾吸虫的特异性PPMP型抗原蛋白、或者权利要求33所述的抗体、或者权利要求35所述的载体。
39.权利要求31或者权利要求32所述的一种华支睾吸虫的特异性PPMP型抗原蛋白在制备治疗、诊断或者预防华支睾吸虫病的药物中的应用。
40.权利要求33所述的抗体在制备治疗、诊断或者预防华支睾吸虫病的药物中的应用。
41.权利要求35所述的载体在制备治疗、诊断或者预防华支睾吸虫病的药物中的应用。
42.权利要求38所述的疫苗在制备治疗、诊断或者预防华支睾吸虫病的药物中的应用。
43.一种试剂盒，其特征在于：含有权利要求31所述的一种分离的华支睾吸虫的特异性PPMP型抗原蛋白、或者权利要求32所述的分离的一种华支睾吸虫的特异性PPMP型抗原蛋白、或者权利要求33所述的抗体。
CN201010178684.6A 2010-05-19 2010-05-19 华支睾吸虫特异性ppmp型抗原及其应用 Active CN102250231B (zh)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201010178684.6A CN102250231B (zh) 2010-05-19 2010-05-19 华支睾吸虫特异性ppmp型抗原及其应用
CN201410068195.3A CN103897051B (zh) 2010-05-19 2010-05-19 一种华支睾吸虫特异性ppmp型抗原

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201010178684.6A CN102250231B (zh) 2010-05-19 2010-05-19 华支睾吸虫特异性ppmp型抗原及其应用

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201410068195.3A Division CN103897051B (zh) 2010-05-19 2010-05-19 一种华支睾吸虫特异性ppmp型抗原

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN102250231A true CN102250231A (zh) 2011-11-23
CN102250231B CN102250231B (zh) 2014-09-10

Family

ID=44977830

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201010178684.6A Active CN102250231B (zh) 2010-05-19 2010-05-19 华支睾吸虫特异性ppmp型抗原及其应用
CN201410068195.3A Active CN103897051B (zh) 2010-05-19 2010-05-19 一种华支睾吸虫特异性ppmp型抗原

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201410068195.3A Active CN103897051B (zh) 2010-05-19 2010-05-19 一种华支睾吸虫特异性ppmp型抗原

Country Status (1)

Country Link
CN (2) CN102250231B (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106243212A (zh) * 2016-07-29 2016-12-21 华中科技大学 一种重组蛋白及其应用
CN114717240A (zh) * 2022-04-21 2022-07-08 上海交通大学医学院 一种华支睾吸虫蛋白Cs144的制备和应用

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105254733B (zh) * 2015-10-08 2019-01-29 深圳华康生物医学工程有限公司 一种检测肝吸虫的特异性抗原CsSP46、其制备方法及应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN2604688Y (zh) * 2003-03-24 2004-02-25 中山大学 华支睾吸虫囊蚴免疫胶体金检测盒
MXPA02004417A (es) * 2001-05-02 2004-07-16 Shin Poong Pharmaceutical Co Equipo para prueba de elisa para el diagnostico de clonorquiasis, paragonimiasis, cisticercosis y esparganosis.
CN101586161A (zh) * 2009-06-19 2009-11-25 华南农业大学 动物华支睾吸虫病特异性检测引物、检测方法和检测试剂盒

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1683404A (zh) * 2005-03-11 2005-10-19 中山大学 华支睾吸虫泛素同源蛋白，其编码核酸及其应用

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
MXPA02004417A (es) * 2001-05-02 2004-07-16 Shin Poong Pharmaceutical Co Equipo para prueba de elisa para el diagnostico de clonorquiasis, paragonimiasis, cisticercosis y esparganosis.
CN2604688Y (zh) * 2003-03-24 2004-02-25 中山大学 华支睾吸虫囊蚴免疫胶体金检测盒
CN101586161A (zh) * 2009-06-19 2009-11-25 华南农业大学 动物华支睾吸虫病特异性检测引物、检测方法和检测试剂盒

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106243212A (zh) * 2016-07-29 2016-12-21 华中科技大学 一种重组蛋白及其应用
CN114717240A (zh) * 2022-04-21 2022-07-08 上海交通大学医学院 一种华支睾吸虫蛋白Cs144的制备和应用
CN114717240B (zh) * 2022-04-21 2023-11-28 上海交通大学医学院 一种华支睾吸虫蛋白Cs144的制备和应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN102250231B (zh) 2014-09-10
CN103897051B (zh) 2016-04-06
CN103897051A (zh) 2014-07-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN102559601B (zh) 用于鉴定肿瘤细胞或肿瘤组织的crept抗体
CN105384803A (zh) 一种日本血吸虫重组蛋白SjSAPLP4及其编码基因与应用
CN106632619A (zh) 一种甲型流感病毒重组蛋白及其单克隆抗体的制备
CN101365714A (zh) 结核抗原的检测分析及疫苗
CN103539856A (zh) 淮山药温和花叶病毒的多克隆抗体制备、检测及其应用
CN102250231B (zh) 华支睾吸虫特异性ppmp型抗原及其应用
CN102702323B (zh) 降钙素原b细胞表位肽段及其单克隆抗体的应用
CN106018831B (zh) 脑多头蚴病的标志物gp50以及用于诊断脑多头蚴病的试剂盒
CN102702324B (zh) 人降钙素原b细胞表位肽段及其单克隆抗体的应用
CN106811470A (zh) 一种犬松弛素原重组蛋白及犬松弛素原多克隆抗体的制备方法
CN101735317A (zh) Cathepsin D抗原多肽、应用及含有该多肽的检测试剂盒
CN102071205B (zh) 华支睾吸虫的特异性抗原及用途
CN102070710B (zh) 华支睾吸虫特异性GRA2a类抗原蛋白及其应用
CN105254732A (zh) 一种日本血吸虫重组蛋白SjSAPLP5及其编码基因与应用
CN102643332B (zh) 人pct的b细胞表位肽段及其单克隆抗体的应用
CN115028713A (zh) 一种抗冠状病毒n蛋白的抗体及其应用
CN104558145B (zh) 一种胎球蛋白a重组蛋白及多克隆抗体的制备方法
CN107098980A (zh) 一种检测风疹病毒抗体的融合蛋白及其制备方法
CN103966237B (zh) 日本血吸虫Wnt5基因、蛋白及应用
CN101570573A (zh) 一种诊断日本血吸虫病的方法及试剂盒
CN103459414B (zh) 对肝吸虫类具有抗原活性的蛋白质
CN104897834A (zh) 一种检测弓形虫急性感染的方法及其靶标蛋白
CN100497377C (zh) Sars冠状病毒结构蛋白orf3及其应用
CN109265545A (zh) 鼠抗人C1orf109单克隆抗体及其制备方法与应用
CN108840925A (zh) 一种来源于凡纳滨对虾血蓝蛋白的抗WSSV肽LvHcL48及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant