CN102249917A - 菊苣酸及其提取分离方法和用途 - Google Patents
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Abstract
一种菊苣酸及其提取分离方法和用途。菊苣酸，其特征在于其结构式为：
分子量：474.37分子式：C22H18O12本发明能用于治疗心脑血管疾病、改善微循环疾病，能测定抱茎苦荬菜制剂质量。
Description
技术领域
本发明提供了由抱茎苦荬菜中提取分离的新化合物菊苣酸，公开了该化合物的提取、分离和鉴定方法，公开了其在治疗心脑血管疾病方面的应用，公开了以该化合物为测定指标的抱茎苦荬菜药材和制剂的含量测定方法，属于天然产物提取分离方法和用途技术领域。
背景技术
抱茎苦荬菜，又名苦碟子，为菊科植物抱茎苦荬菜[Ixeris sonchifolia (Bge.) Hance]的干燥地上部分。分布于东北、华北和华东，卫生部药品标准蒙药分册记载其具有开胃，解毒，接骨和祛痞作用。现代药理研究表明，抱茎苦荬菜在心血管方面的活性受到人们的广泛重视，冯玉书等通过药理实验证明，抱茎苦荬菜提取物具有增加冠脉流量，降低心肌耗氧，改善心肌循环等作用；能清除血液氧自由基，扩张血管，改善微循环，显著抑制血小板聚集。在此基础上，研究成功了苦碟子注射液，具有活血止痛，清热祛瘀作用，用于冠心病、心绞痛和脑梗塞的治疗，取得了良好的治疗效果。在抱茎苦荬菜治疗心脑血管疾病的活性化合物研究过程中，已有腺苷、木犀草素- 7 - O -β- D - 葡萄糖苷和木犀草素- 7- O -β- D - 葡萄糖醛酸苷的报道，在不同程度上完善了抱茎苦荬菜药材的质量控制方法。
发明内容
本发明所涉及的菊苣酸 是从菊科植物抱茎苦荬菜中提取分离的新化合物，目前尚未见有关其从苦荬菜属药用植物中提取分离的报道，未见该化合物在治疗心脑血管疾病中的应用，未见该化合物在控制抱茎苦荬菜质量和含有抱茎苦荬菜药物的质量控制中的应用。
本发明的目的之一是提供一种菊苣酸化合物。
本发明的另外目的是提供该化合物的制备方法及提供该化合物在测定抱茎苦荬菜有效成分含量方法中的用途。
本发明的又一个目的是提供该化合物在治疗心脑血管疾病，尤其是急性心肌缺血和脑梗塞的药物的用途。
本发明还公开了该化合物在测定苦碟子注射液及粉针剂含量测定中的用途。
本发明所述的菊苣酸，结构式为：
分子量：474.37
分子式：C22H18O12
从抱茎苦荬菜中提取的新化合物菊苣酸，它具有抗血栓和抗血小板凝集作用，具有促进自由基的清除及抗氧化作用，可用于治疗心脑血管疾病的治疗。本发明还涉及该化合物的制备方法和在制备治疗心脑血管疾病、改善微循环和降脂药物的用途，在测定抱茎苦荬菜和含有抱茎苦荬菜制剂的药物的含量方法中的用途。
本发明所述的菊苣酸化合物的提取分离方法为：将抱茎苦荬菜药材加入6—8倍量水，煎煮两次，合并煎煮液，浓缩，加盐酸调节pH值至3～4，加乙醇至含醇量60%～70%，静置12小时，离心，分取上清液，减压回收乙醇至浓缩液无醇味，过滤，滤液通过预先处理好的大孔吸附树脂柱，先用水洗脱至洗液无色，再用60%乙醇洗脱，醇液减压浓缩，浓缩液通过聚酰胺柱，用水洗脱后，再用30%乙醇洗脱，醇液减压浓缩，浓缩液用NaOH溶液调节pH至6.0-7.0，再用正丁醇萃取3次，水溶液用盐酸溶液调节pH值至2-3，再用正丁醇萃取3-5次，合并正丁醇液，减压浓缩至干，干燥物用甲醇溶解和洗涤处理1次，不溶物（白色结晶状物）用热甲醇重结晶2次，得到无色针状结晶菊苣酸。
该化合物可溶于水、甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、乙醚等有机试剂中。
薄层色谱检查：取上述样品适量，加甲醇制成每1ml含0.5mg的溶液，作为供试品溶液。取上述供试品溶液2～5μl，点于硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-甲醇-甲酸-水（20：2：1：1）为展开剂，展开，晾干，置紫外光灯（365nm）下检视，供食品色谱中，应呈单一的蓝色荧光斑点，喷以三氯化铁试液，日光下检视，应呈单一的墨绿色斑点。
菊苣酸能制备成注射液、冻干粉针剂、片剂、胶囊和颗粒剂以及缓控释制剂。
菊苣酸的用途：
（1）、菊苣酸能用于治疗心脑血管疾病、改善微循环疾病。
（2）、菊苣酸用于测定抱茎苦荬菜药材的方法为：
色谱条件与系统适用性试验 用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；乙腈－0.4％磷酸溶液单位为ml/ml，以16：84配比为流动相；检测波长为327nm，理论板数按菊苣酸计算应不低于5000。
对照品溶液的制备 取菊苣酸对照品适量，加甲醇制成毎1ml含菊苣酸0.05mg的溶液，即得；
供试品溶液的制备 取本品粗粉，60%甲醇提取，用0.45μm滤膜滤过，即得；
测定法 分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各5μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
（3）、菊苣酸测定抱茎苦荬菜制剂质量控制方法为：
色谱条件与系统适用性试验 用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；乙腈－0.4％磷酸溶液单位为ml/ml以16：84配比为流动相；检测波长为327nm。理论板数按菊苣酸峰计算应不低于5000；
对照品溶液的制备 取菊苣酸对照品适量，加甲醇制成毎1ml含菊苣酸0.05mg的溶液，即得；
供试品溶液的制备 取本品适量，用0.45μm滤膜滤过，即得；
测定法 分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各5μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
（4）、菊苣酸测定抱茎苦荬菜制剂质量控制方法为：
色谱条件 色谱柱Phenomenex Luna C18 4.6mm×250mm 5μ;流动相A为乙腈，B为0.4％磷酸溶液单位为ml/ml,按下表程序进行梯度洗脱，流速0.9ml/min;检测波长为327nm;柱温40℃。
参照物溶液的制备 取菊苣酸对照品适量，加50%甲醇制成每1ml含0.05mg的溶液，即得；
供试品溶液的制备 取本品适量，用0.45μm滤膜滤过，即得。
测定法 精密吸取上述叁种溶液，注入高效液相色谱仪，记录90分钟内的色谱图；供试品液相色谱图应与对照指纹图谱基本一致，有相对应的10个特征峰；按中药色谱指纹图谱相似度评价系统，供试品指纹图谱与对照指纹图谱经相似度计算，相似度不得低于0.8。
附图说明
图1为C13-NMR谱。
图2为H1-NMR谱。
图3为HMBC谱。
图4 为质谱。
图5为质谱。
图6是对照指纹图谱。
图7是苦碟子注射液指纹图谱数据。
结构鉴定方法
紫外吸收光谱检测
UV：最大吸收值219.50，244.50，329.50。
红外吸收光谱检测
IR(KBr)λcm-1：3600～3050（OH），1750，1720（C=O），1611，1510为苯环吸收。
核磁共振测定
结果见表1和图1、2、3。
表1 菊苣酸的NMR测定数据(DMSO)
| 位置 | H1-NMR | C13-NMR |
| 1 | 125.3 | |
| 2 | 7.10 | 112.4 |
| 3 | 145.7 | |
| 4 | 148.9 | |
| 5 | 6.79 | 115.9 |
| 6 | 7.08 | 121.8 |
| 7 | 6.38 | 147.1 |
| 8 | 7.57 | 115.3 |
| 9 | 5.68 | 165.5 |
| 10 | 70.7 | |
| -COOH | 13.7 | 167.5 |
质谱测定测定
由图6中[M+1]峰475.4可知该化合物分子量为474.4。结果见图4。
药效学实验如下
试验动物及药品 实验用体重180～250g雌雄兼有的Wistar大鼠和小鼠，购自沈阳医学院院动物研究所。本发明药物菊苣酸制成注射液，由发明人提供。
1、 对大鼠静脉血栓形成的影响
1.1方法
大鼠用戊巴比妥钠(40mg/kg,ip)麻醉后仰卧位固定，于腹正中切开腹壁，分离下腔静脉。在下腔静脉与左肾静脉交叉处下方，预置丝线准备结扎用；舌下静脉给药(或PBS)，5min后立即拉紧丝线结扎下腔静脉，缝合腹壁。结扎后2h重新开腹，在下腔静脉分枝为髂静脉处用止血钳夹紧，此处距丝线结扎处约为2cm，同时用止血钳夹住这2cm段内的主要静脉侧枝。纵向剪开下腔静脉管腔，用滤纸条仔细吸去血管内血液井观察有无血栓形成。若有则轻镊出，置滤纸上吸去水分。将湿血栓置60℃，20min烘干、称重，即为血栓干重。将给药组与对照组作比较。
1.2 结果 菊苣酸抑制大鼠静脉血栓形成的作用见表2。当剂量为0.5mg/kg时，抑制率为45.7% ；而当剂量增为2.0mg/kg时，抑制率为68.6% ，给药组血栓干重明显低于对照组(P<0.01)。
表2 对大鼠静脉血栓形成的影响（
±s，n=10）
_对大鼠血小板聚集的影响
2.1 方法
于大鼠麻醉后iv给药后5～10min内，自腹主动脉取血，血液以3.8%枸橼酸钠溶液抗凝（1/9）。按常规方法制备富含血小板血浆(PRP)和贫血小板血浆(PPP) 分别以ADP和胶原为诱导剂，测定血小板的聚集率并计算药物的抑制率。
2.2 结果
菊苣酸抗血小板聚集作用见表3，给大鼠iv菊苣酸(0.5、1.0及2.0mg/Kg)后，以ADP诱导的对照组血小板聚集无明显改变；由胶原诱导的血小扳聚集受到抑制，抑制率分别为25.9%(P＜0.05)及42.6%和57.4%(P＜0.01)
表3 对大鼠血小板聚集的影响（
±s）
3、 菊苣酸对小鼠断头后张口喘气时间的影响
结果如表4所示，0.5, 1.0, 2.0 mg/kg 菊苣酸可明显延长小鼠断头后张口喘气时间，并呈一定的量效关系。
表4 菊苣酸对小鼠断头后张口喘气时间的影响(
±S)
| 组别 | 剂量(mg/kg) | n | 张口喘气时间(sec) | 延长百分率(%) |
| 对照 | - | 10 | 18.5±2.0 | |
| 丹参素 | 5.0 | 10 | 21.4±1.8 | 8.3 |
| 菊苣酸 | 0.5 | 10 | 21.3±1.6 | 8.6 |
| 1.0 | 10 | 25.2±1.8 | 17.0 | |
| 2.0 | 10 | 30.0±1.6 | 27.8 |
4、对脑梗塞组织重量的影响
结果如表5所示，大鼠MCAO后有明显的脑梗塞发生，菊苣酸可显著降低脑梗塞组织重量百分比，并呈一定的量效关系。
表5 菊苣酸对MCAO致大鼠脑梗塞组织重量的影响(
±S)
| 组别 | 剂量(mg/kg) | n | 梗塞脑组织重量百分比(%) | 抑制率(%) |
| 空白 | - | 10 | 1.7±0.36** | |
| 对照 | 10 | 19.6±1.8 | ||
| 丹参素 | 5.0 | 10 | 15.4±1.9* | 21.4 |
| 菊苣酸 | 0.5 | 10 | 16.5±2.1* | 15.8 |
| 1.0 | 10 | 13.0±2.2** | 33.7 | |
| 2.0 | 10 | 12.3±2.0** | 37.2 |
注:与对照组比较, * P<0.05， ** P<0.01。
5、对心肌缺血缺氧损伤的影响
5.1 菊苣酸对挟闭气管小白鼠心脏缺氧损伤的影响
结果如表6所示，与对照组NS比较，菊苣酸可显著延长小白鼠挟闭气管后心电时间，并呈一定的量效关系。
表6 菊苣酸对挟闭气管小白鼠心脏缺氧损伤的影响
| 组别 | 剂量(mg/kg ) | n | 心电时间(min) |
| 对照（NS） | 10 | 7.4±1.10 | |
| 菊苣酸 | 0.5 | 10 | 8.6±1.20** |
| 1.0 | 10 | 9.8±1.40** | |
| 2.0 | 10 | 10.8±1.50** |
注：与对照组NS比较， ** P<0.01。
5.2 菊苣酸对冠状动脉结扎引起的大鼠急性心肌梗塞的影响
结果如表7所示，与对照组比较，菊苣酸1.0和2.0 mg/kg/d可显著减小冠状动脉结扎引起的大鼠急性心肌梗塞心肌重量百分比，并呈一定的量效关系。
表7 菊苣酸对冠状动脉结扎引起的大鼠急性心肌梗塞的影响
| 组别 | 剂量(mg/kg/d ) | n | 梗塞心肌重量百分比(%) |
| 对照 | 6 | 33.75±13.45 | |
| 丹参素 | 5.0 | 6 | 19.85±6.20** |
| 菊苣酸 | 0.5 | 6 | 23.22±10.35 |
| 1.0 | 6 | 18.10±4.35** | |
| 2.0 | 6 | 14.55±6.68** |
注:与对照组比较，*P<0.05，** P<0.01。
药效学实验结论：
1、菊苣酸具有抑制大鼠静脉血栓形成的作用，当剂量为0.5mg/kg时，抑制率为45.7% ；而当剂量增为2.0mg/kg时，抑制率为68.6% ，给药组血栓干重明显低于对照组(P<0.01)。
2、菊苣酸具有抗血小板聚集作用，给大鼠iv菊苣酸0.5、1.0及2.0mg/Kg后，以ADP诱导的对照组血小板聚集无明显改变；由胶原诱导的血小扳聚集受到抑制，抑制率分别为25.9%(P＜0.05)及42.6%和57.4%(P＜0.01)。
3、菊苣酸对小鼠断头后张口喘气时间有明显延长作用，0.5, 1.0, 2.0 mg/kg 菊苣酸可明显延长小鼠断头后张口喘气时间，并呈一定的量效关系。
4、菊苣酸可明显减少脑梗塞组织重量的重量，并呈一定的量效关系。
5、菊苣酸可显著延长小白鼠挟闭气管后心电时间，并呈一定的量效关系。
6、菊苣酸1.0和2.0 mg/kg/d可显著减小冠状动脉结扎引起的大鼠急性心肌梗塞心肌重量百分比，并呈一定的量效关系。
含量测定研究
1、仪器与所用试剂
仪器：SHIMADZU-2010 液相色谱仪及工作站。
试剂：乙腈为色谱纯，其它试剂为分析纯。
2、测定波长的确立
经绘制菊苣酸紫外吸收图谱，菊苣酸在329.5nm处有最大吸收，故330nm为样品中菊苣酸含量测定的波长。
3、流动相筛选
参照中国药典2005年版一部224页蒲公英【含量测定】项下的流动相，同时对比乙腈－0.4%mol磷酸溶液（16：84）对本品中菊苣酸分离的影响，两种方法均可以使本品中各成分达到基线分离，而流动相乙腈－0.4%mol磷酸溶液（16：84）更简单易用，因此确定乙腈－0.4%mol磷酸溶液（16：84）为本试验中菊苣酸含量测定的流动相。
4、方法系统适用性试验考察
选用不同品牌的色谱柱加以试验，试验条件为：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；乙腈－0.4%mol磷酸溶液（16：84）为流动相；流速：1.0ml/min，检测波长：327nm，结果见表8。
表8保留时间及理论板数
结论：根据测定结果，暂定本试验中理论塔板数以菊苣酸色谱峰计不得低于3000。
5、菊苣酸对照品线性范围考察
精密称取菊苣酸对照品9.98mg，置10ml棕色量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，精密吸取1ml，置10ml棕色量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，制成每1ml含0.0998mg的溶液。
分别精密吸取2、6、10、14、18 μl溶液，注入液相色谱仪中，测定色谱峰面积，测定结果见表9 。
表9 菊苣酸对照品线性范围考察结果
| 对照品进样体积（μl） | 2.0 | 6.0 | 10.0 | 14.0 | 18.0 |
| 对照品进样量（μg） | 0.1996 | 0.5988 | 0.998 | 1.3972 | 1.7964 |
| 色谱峰面积 | 254239 | 748146 | 1262361 | 1788030 | 2268274 |
以菊苣酸对照品进样量为横坐标，色谱峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，回归方程为：y = 126952.76 x －6127.20 r=0.9999
结论：菊苣酸对照品进样量在0.1996～1.7964μg范围内线性关系良好。
6、精密度试验
精密吸取线性范围考察项下对照品溶液10μl，连续进样6次，测定色谱峰面积，测定结果见表10。
表10精密度试验结果
| 序号 | 菊苣酸色谱峰面积 | 均值 | RSD（%） |
| 1 | 1273484 | ||
| 2 | 1255479 | ||
| 3 | 1281015 | ||
| 4 | 1247842 | 1262768 | 0.98 |
| 5 | 1261814 | ||
| 6 | 1256973 |
结论：菊苣酸对照品溶液精密度试验符合规定。
7、稳定性试验
取样品溶液，精密吸取10μl，每间隔2小时进样1次，测定色谱峰面积，测定结果见表11。
表11 稳定性试验结果
| 时间（小时） | 菊苣酸色谱峰面积 | 均值 | RSD（%） |
| 0 | 1273484 | ||
| 2 | 1275546 | ||
| 4 | 1290361 | ||
| 6 | 1281025 | 1272287 | 1.10 |
| 8 | 1263021 | ||
| 12 | 1250284 |
结论：菊苣酸色谱峰峰面积积分值基本一致,RSD为1.10%。说明供试品溶液中的菊苣酸在12小时内具有良好的稳定性。
8、重复性试验
取样品溶液，精密吸取10μl，测定色谱峰面积，测定结果见表12。
表12重复性试验结果
| 菊苣酸含量（mg/ml） | 均值（mg/ml） | RSD（%） |
| 0.698 | ||
| 0.689 | ||
| 0.695 | ||
| 0.694 | 0.689 | 1.26 |
| 0.681 | ||
| 0.676 |
结论：菊苣酸重复性试验符合规定。
9、回收率试验考察
取样品溶液5ml，置10ml棕色量瓶中，精密加入菊苣酸对照品溶液（0.4856 mg/ml）1ml，其他操作按【含量测定】项下方法进行，测定色谱峰面积，计算，测定结果见表13。
表13回收率试验结果
| 序号 | 样品含量(mg) | 对照品加入量(mg) | 实测总量(mg) | 回收率（%） |
| 1 | 0.3445 | 0.356 | 0.698 | 99.22 |
| 2 | 0.3445 | 0.356 | 0.694 | 98.13 |
| 3 | 0.3445 | 0.356 | 0.696 | 98.82 |
| 4 | 0.3445 | 0.356 | 0.690 | 97.02 |
| 5 | 0.3445 | 0.356 | 0.687 | 96.07 |
| 6 | 0.3445 | 0.356 | 0.686 | 95.88 |
 | 97.52 | |||
| RSD（%） | 1.45 |
结论：菊苣酸回收率在95.88～99.22%之间，RSD为1.45%，符合规定。
指纹图谱研究色谱条件 色谱柱Phenomenex Luna C18 4.6mm×250mm 5μ;流动相A为乙腈，B为0.4％磷酸溶液（ml/ml）,按下表程序进行梯度洗脱，流速0.9ml/min;检测波长为327nm;柱温40℃。
| 分钟 | A（％） | B（％） |
| 0分钟 | 8 | 92 |
| 20分钟 | 8 | 92 |
| 90 | 29 | 71 |
参照物溶液的制备 取菊苣酸对照品适量，加50%甲醇制成每1ml含0.05mg的溶液，即得。
标准提取物溶液的制备 取本品约0.1g，置25ml量瓶中，加50%甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
供试品溶液的制备 取本品适量，用0.45μm滤膜滤过，即得。
测定法 精密吸取上述叁种溶液，注入高效液相色谱仪，记录90分钟内的色谱图。供试品液相色谱图应与对照指纹图谱基本一致，有相对应的10个特征峰。按中药色谱指纹图谱相似度评价系统，供试品指纹图谱与对照指纹图谱经相似度计算，相似度为0.982-0.995，不低于0.8，符合相关规定。
Claims (7)
1.菊苣酸，其特征在于其结构式为：
分子量：474.37
分子式：C22H18O12。
2.根据权利要求1所述的菊苣酸的制备方法，其特征在于包括以下步骤：将抱茎苦荬菜药材加入6—8倍量水，煎煮两次，合并煎煮液，浓缩，加盐酸调节pH值至3～4，加乙醇至含醇量60%～70%，静置12小时，离心，分取上清液，减压回收乙醇至浓缩液无醇味，过滤，滤液通过预先处理好的大孔吸附树脂柱，先用水洗脱至洗液无色，再用60%乙醇洗脱，醇液减压浓缩，浓缩液通过聚酰胺柱，用水洗脱后，再用30%乙醇洗脱，醇液减压浓缩，浓缩液用NaOH溶液调节pH至6.0-7.0，再用正丁醇萃取3次，水溶液用盐酸溶液调节pH值至2-3，再用正丁醇萃取3-5次，合并正丁醇液，减压浓缩至干，干燥物用甲醇溶解和洗涤处理1次，不溶物白色结晶状体用热甲醇重结晶2次，得到白色针状结晶菊苣酸。
3.根据权利要求1所述的菊苣酸，其特征是能用于治疗心脑血管疾病、改善微循环疾病。
4.根据权利要求1所述的菊苣酸，其特征是用于测定抱茎苦荬菜药材的方法为：
色谱条件与系统适用性试验 用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；乙腈－0.4％磷酸溶液单位为ml/ml，以16：84配比为流动相；检测波长为327nm，理论板数按菊苣酸计算应不低于5000；
对照品溶液的制备 取菊苣酸对照品适量，加甲醇制成毎1ml含菊苣酸0.05mg的溶液，即得；
供试品溶液的制备 取本品粗粉，60%甲醇提取，用0.45μm滤膜滤过，即得；
测定法 分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各5μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
5.根据权利要求1所述的菊苣酸，其特征在于能制备成注射液、冻干粉针剂、片剂、胶囊和颗粒剂以及缓控释制剂。
6.根据权利要求1所述的菊苣酸，其特征在于测定抱茎苦荬菜制剂质量控制方法为：
色谱条件与系统适用性试验 用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；乙腈－0.4％磷酸溶液单位为ml/ml，以16：84配比为流动相；检测波长为327nm；理论板数按菊苣酸峰计算应不低于5000；
对照品溶液的制备 取菊苣酸对照品适量，加甲醇制成毎1ml含菊苣酸0.05mg的溶液，即得；
供试品溶液的制备 取本品适量，用0.45μm滤膜滤过，即得；
测定法 分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各5μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
7.根据权利要求1所述的菊苣酸，其特征在于测定抱茎苦荬菜制剂质量控制方法为：
色谱条件 色谱柱Phenomenex Luna C18 4.6mm×250mm 5μ;流动相A为乙腈，B为0.4％磷酸溶液单位为ml/ml,按下表程序进行梯度洗脱，流速0.9ml/min;检测波长为327nm;柱温40℃；
参照物溶液的制备 取菊苣酸对照品适量，加50%甲醇制成每1ml含0.05mg的溶液，即得；
供试品溶液的制备 取本品适量，用0.45μm滤膜滤过，即得；
测定法 精密吸取上述叁种溶液，注入高效液相色谱仪，记录90分钟内的色谱图；供试品液相色谱图应与对照指纹图谱基本一致，有相对应的10个特征峰；按中药色谱指纹图谱相似度评价系统，供试品指纹图谱与对照指纹图谱经相似度计算，相似度不得低于0.8。
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