CN102247600B - 一种伪狂犬活疫苗用稀释液的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种伪狂犬活疫苗用稀释液的制备方法，将纳米免疫粒子液体置于装有稀释液的反应容器中，控制纳米免疫粒子液体的浓度为15wt％，开启搅拌装置搅拌20～40min，控制反应容器温度为2～8℃，静置10～20h，然后置于115℃高温灭菌10～20min，即得到产品。与现有技术相比，本发明制备得到的疫苗稀释液能够提高伪狂犬疫苗的免疫效果，增强伪狂犬病毒在淋巴细胞和脑神经的占位复制，有效的避免了伪狂犬野毒的潜伏感染，为伪狂犬病的预防和根除提供了保障，控制PRV潜伏感染的建立与重新激活。

Description

一种伪狂犬活疫苗用稀释液的制备方法

技术领域

本发明涉及一种疫苗稀释液的制备方法，尤其是涉及一种伪狂犬活疫苗用稀释液的制备方法。

背景技术

伪狂犬病毒(Pseudorabies virus，PRV)是一种a-疱疹病毒，可引起多种家畜和野生动物的伪狂犬病。除猪以外的其它动物表现为致死性感染，猪是PRV的天然宿主和贮存宿主，呈流行性感染。成年猪常常表现为隐性感染和呼吸道症状，母猪流产、产死胎和木乃伊胎，公猪表现为睾丸炎。仔猪表现出发热、昏迷和神经症状，死亡率很高。因此，伪狂犬病是养猪业的一种重要繁殖障碍性传染病。西方发达国家均投入大量物力和人力先后启动和完成了猪伪狂犬病的净化与根除计划。在该计划的实施中，PRV的潜伏感染问题是其中最重要的困难。

疱疹病毒的潜伏感染分为三个阶段，即潜伏感染的建立、维持和激活。在建立阶段，病毒必须进入特定的细胞，并且随着进入，必须建立起特定的病毒基因表达以保证不会出现病毒有效感染的病理变化。因此，许多与复制有关的基因，在转录和机能上静止。在这个时期只有很少的一部分病毒基因进行表达。潜伏状态的病毒DNA不仅稳定，而且还可抑制其它毒株建立潜伏感染。这种机制究竟是依赖病毒的功能还是需要细胞因子的辅助目前还不清楚，但建立潜伏感染的弱毒活疫苗株可以阻止野生型毒株造成的重复感染。

最近研究表明，疫苗株会移植到免疫猪的阴性靶组织即三叉神经元，并通过与PR野毒的超感染竞争，从而阻断隐性感染的发生(Schang，1994)。疫苗对野生型毒株病毒的阻断效果取决于疫苗毒株和毒株的占位作用。缺乏糖蛋白gE、Gg编码基因或者致弱基因毒株的疫苗，在三叉神经节的移植能力很弱。所以现有的疫苗不能阻止伪狂犬野毒的潜伏感染。

潜伏感染是病毒存在的一种特殊状态，是疱疹病毒科成员的共同特征之一。处于潜伏感染的病毒在动物机体内长期存在，但不产生有感染性的病毒粒子，因此带毒动物无任何症状，也不排毒。PRV不仅能建立潜伏感染，而且可不定期被激活进入增殖性状态，产毒并排出，使得带毒动物成为潜在的传染源，引起其它易感动物的感染，对伪狂犬病的防治带来很大困难，因而PRV的潜伏感染倍受人们重视。而疫苗免疫只能阻止动物发病和临床症状的出现，但不能控制PRV潜伏感染的建立与重新激活。如果淘汰全部PRV潜伏感染猪，需要付出巨大的经济和社会代价，不符合我国当前的国情。因此，PRV的潜伏感染问题是当前我国伪狂犬病预防与根除计划的主要障碍。

另外，疫苗免疫会产生一定的应激，比如体温升高等，这也影响病毒的复制和抗原的识别，从而影响免疫效果。

如何增强疫苗的在神经系统和淋巴系统的占位效应，是净化伪狂犬的关键。

发明内容

本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种提高免疫效果，增强占位复制、避免潜伏感染的伪狂犬活疫苗用稀释液的制备方法。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

一种伪狂犬活疫苗用稀释液的制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：将纳米免疫粒子液体置于装有稀释液的反应容器中，控制纳米免疫粒子液体的浓度为15wt％，开启搅拌装置搅拌20～40min，控制反应容器温度为2～8℃，静置10～20h，然后置于115℃高温灭菌10～20min，即得到产品。

所述的纳米免疫粒子液体通过以下步骤制备：向亚硒酸钠水溶液中加入糖苷皂甙单体、胆固醇、维生素C及谷氨酸胺，搅拌5～6min后加入聚乙二醇，继续搅拌20～40min，得到金黄色含纳米免疫粒子的液体。

所述的亚硒酸钠水溶液中亚硒酸钠的浓度为55～58μg/ml，糖苷皂甙单体的含量为0.1～1wt％，胆固醇的含量为0.1～1wt％，维生素C及谷氨酸胺的含量符合以下条件：

所述的亚硒酸钠水溶液中亚硒酸钠与聚乙二醇的重量比为1∶(0.1～1)。

所述的稀释液包括生理盐水或市售的PBS缓冲液。

所述的稀释液优选市售的PBS缓冲液。

所述的搅拌装置为磁力搅拌器或三叶刀片。

所述的产品的保存温度为0～35℃。

所述的产品的保存温度优选2～8℃。

与现有技术相比，本发明制备得到的疫苗稀释液能够提高伪狂犬疫苗的免疫效果，增强伪狂犬病毒在淋巴细胞和脑神经的占位复制，有效的避免了伪狂犬野毒的潜伏感染，为伪狂犬病的预防和根除提供了保障，控制PRV潜伏感染的建立与重新激活。

附图说明

图1为正常细胞的电镜照片；

图2为细胞病变后的电镜照片。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。

实施例1

一种伪狂犬活疫苗用稀释液的制备方法，该方法包括以下步骤：

(1)取25ml亚硒酸钠浓度为56.4μg/ml的水溶液，搅拌下加入中加入糖苷皂甙单体、胆固醇、维生素C及谷氨酸胺，其中糖苷皂甙单体的含量为0.1wt％，胆固醇的含量为0.1wt％，维生素C及谷氨酸胺的总摩尔数∶亚硒酸钠的摩尔数为2，继续搅拌5min至溶液颜色不再改变后加入聚乙二醇，聚乙二醇与亚硒酸钠的重量比为0.1∶1，再继续搅拌20min，得到金黄色含纳米免疫粒子的液体，利用原子显微镜观察，得到的纳米免疫粒子直径为50nm，液体分装与棕色收集瓶内，充入液氮做无菌保存，保质期可达2年；

(2)精确称量纳米免疫粒子，将纳米免疫粒子液体置于装有PBS缓冲液的反应容器中，控制纳米免疫粒子液体的浓度为15wt％，开启磁力搅拌器搅拌20min，转速以最大不产生气泡为宜，控制反应容器温度为2℃，静置20h过夜，然后置于115℃高温灭菌10min，即得到产品。得到的产品的保存在0℃的环境中，pH控制在6.5。

实施例2

一种伪狂犬活疫苗用稀释液的制备方法，该方法包括以下步骤：

(1)取25ml亚硒酸钠浓度为56.4μg/ml的水溶液，搅拌下加入中加入糖苷皂甙单体、胆固醇、维生素C及谷氨酸胺，其中糖苷皂甙单体的含量为1wt％，胆固醇的含量为1wt％，维生素C及谷氨酸胺的总摩尔数∶亚硒酸钠的摩尔数为4，继续搅拌6min至溶液颜色不再改变后加入聚乙二醇，聚乙二醇与亚硒酸钠的重量比为1∶1，再继续搅拌40min，得到金黄色含纳米免疫粒子的液体，利用原子显微镜观察，得到的纳米免疫粒子直径为120nm，液体分装与棕色收集瓶内，充入液氮做无菌保存，保质期可达2年；

(2)精确称量纳米免疫粒子，将纳米免疫粒子液体置于装有生理盐水的反应容器中，控制纳米免疫粒子液体的浓度为15wt％，开启三叶刀片搅拌40min，转速以最大不产生气泡为宜，控制反应容器温度为8℃，静置10h，然后置于115℃高温灭菌20min，即得到产品。得到的产品的保存在2℃的环境中，pH控制在7.5。

实施例3

一种伪狂犬活疫苗用稀释液的制备方法，该方法包括以下步骤：

(1)取25ml亚硒酸钠浓度为56.4μg/ml的水溶液，搅拌下加入中加入糖苷皂甙单体、胆固醇、维生素C及谷氨酸胺，其中糖苷皂甙单体的含量为0.5wt％，胆固醇的含量为0.5wt％，维生素C及谷氨酸胺的总摩尔数∶亚硒酸钠的摩尔数为3，继续搅拌6min至溶液颜色不再改变后加入聚乙二醇，聚乙二醇与亚硒酸钠的重量比为0.5∶1，再继续搅拌40min，得到金黄色含纳米免疫粒子的液体，利用原子显微镜观察，得到的纳米免疫粒子直径为100nm，液体分装与棕色收集瓶内，充入液氮做无菌保存，保质期可达2年；

(2)精确称量纳米免疫粒子，将纳米免疫粒子液体置于装有生理盐水的反应容器中，控制纳米免疫粒子液体的浓度为15wt％，开启三叶刀片搅拌40min，转速以最大不产生气泡为宜，控制反应容器温度为8℃，静置10h，然后置于115℃高温灭菌20min，即得到产品。得到的产品的保存在8℃的环境中，pH控制在7.5。

实施例4

一种伪狂犬活疫苗用稀释液的制备方法，该方法包括以下步骤：

(1)取25ml亚硒酸钠浓度为56.4μg/ml的水溶液，搅拌下加入中加入糖苷皂甙单体、胆固醇、维生素C及谷氨酸胺，其中糖苷皂甙单体的含量为0.5wt％，胆固醇的含量为0.5wt％，维生素C及谷氨酸胺的总摩尔数∶亚硒酸钠的摩尔数为3，继续搅拌6min至溶液颜色不再改变后加入聚乙二醇，聚乙二醇与亚硒酸钠的重量比为0.8∶1，再继续搅拌40min，得到金黄色含纳米免疫粒子的液体，利用原子显微镜观察，得到的纳米免疫粒子直径为100nm，液体分装与棕色收集瓶内，充入液氮做无菌保存，保质期可达2年；

(2)精确称量纳米免疫粒子，将纳米免疫粒子液体置于装有生理盐水的反应容器中，控制纳米免疫粒子液体的浓度为15wt％，开启三叶刀片搅拌40min，转速以最大不产生气泡为宜，控制反应容器温度为8℃，静置10h，然后置于115℃高温灭菌20min，即得到产品。得到的产品的保存在35℃的环境中，pH控制在7。表1为制备得到的稀释液的稳定性数据。

表1

利用配制好的稀释液对伪狂犬病毒活性的影响进行测试。

(1)VIRO细胞的复苏、培养：

将冻存的BHK细胞从液氮罐中取出，复苏，待长成单层后，用0.25％胰酶一EDTA溶液消化，当适度时，倒出胰酶一EDTA溶液，加入含10％犊牛血清的DMEM培养液，用灭菌吸管吹打分散，分装小瓶，置37℃温箱中培养。

(2)伪狂犬抗原滴度的测定：

TCID₅₀方法：将稀释液与猪伪狂犬病毒混合，放室温(25℃)环境下分别放置30min、2h，接种到敏感细胞上，测定TCID₅₀的变化。设置PBS组、DMEM培养液组和进口PRV疫苗稀释液为对照组。

将伪狂犬病毒用DMEM培养液按10倍系列稀释，即10^-1，10^-2，10^-3，一10^-10等。将100μl不同稀释度的病毒液加入96孔细胞反应板各孔中，每个滴度为8孔，随后加入100μl已消化分散的VIRO细胞，细胞含量以1x10⁶细胞/mL为宜，或以细胞于24小时内长成单层为标准。置37℃，5％CO₂培养箱中培养，每日观察，连续观察1周。记录细胞病变孔，按Reed-MuenCh两氏法计算TCIDS₅₀。正常细胞如图1所示，细胞病变如图2所示。表2为病毒TCID ₅₀的测试数据。

表2

检测稀释液对猪安全性的研究，对猪颈部肌肉注射10ml实施例1中制备得到的稀释液，观察14天猪群反应，结果表明，三种佐剂均表现为良好的安全性，结果见表3。

表3大剂量注射安全性实验结果表

利用实施例1制备得到的稀释液配合疫苗对伪狂犬阴性猪进行免疫，检测24h内体温，免疫后体温的变化结果如表4所示。

表4

用实施例1制备得到的稀释液配合国产疫苗、PBS配合国产疫苗、进口疫苗和原配稀释液各免疫小猪5头，48h后运用SABC法研究PRV在三叉神经和扁桃体部位的定植。SABC(Streptavidin-Biotin-Peroxidase Complex)法，即链霉亲合素-生物素-过氧化物酶复合物法，是一种快速极敏感的免疫组织化学染色法。本专用稀释液有助于伪狂犬病毒在神经和淋巴细胞上的占位，有助于防止隐性感染。

Claims (4)

1.一种伪狂犬活疫苗用稀释液的制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：将纳米免疫粒子液体置于装有生理盐水或市售的PBS缓冲液的反应容器中，控制纳米免疫粒子液体的浓度为15wt％，开启搅拌装置搅拌20～40min，控制反应容器温度为2～8℃，静置10～20h，然后置于115℃高温灭菌10～20min，即得到产品；

所述的纳米免疫粒子液体通过以下步骤制备：向亚硒酸钠水溶液中加入糖苷皂甙单体、胆固醇、维生素C及谷氨酸胺，搅拌5～6min后加入聚乙二醇，继续搅拌20～40min，得到金黄色含纳米免疫粒子的液体；

所述的亚硒酸钠水溶液中亚硒酸钠的浓度为55～58μg/ml，糖苷皂甙单体的含量为0.1～1wt％，胆固醇的含量为0.1～1wt％，维生素C及谷氨酸胺的含量符合以下条件：

所述的亚硒酸钠水溶液中亚硒酸钠与聚乙二醇的重量比为1∶(0.1～1)。

2.根据权利要求1所述的一种伪狂犬活疫苗用稀释液的制备方法，其特征在于，所述的搅拌装置为磁力搅拌器或三叶刀片。

3.根据权利要求1所述的一种伪狂犬活疫苗用稀释液的制备方法，其特征在于，所述的产品的保存温度为0～35℃。

4.根据权利要求1所述的一种伪狂犬活疫苗用稀释液的制备方法，其特征在于，所述的产品的保存温度优选2～8℃。

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