CN102247420A

CN102247420A - 一种墨旱莲提取物的制备方法及用途

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Publication number: CN102247420A
Application number: CN 201110184589
Authority: CN
Inventors: 田景奎; 马鲁豫; 戚中杰; 李锡敏; 郑雯; 傅之容
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2011-07-04
Filing date: 2011-07-04
Publication date: 2011-11-23
Anticipated expiration: 2031-07-04
Also published as: CN102247420B

Abstract

本发明公开了一种墨旱莲提取物的制备方法及用途。它的步骤如下：1）选取鳢肠属植物墨旱莲，用体积百比浓度为5～95%的乙醇/水浸泡0.5小时后，乙醇/水是墨旱莲药材20倍重量的提取1h和乙醇/水是墨旱莲药材16倍重量的提取0.5h，合并提取液，提取液浓缩成0.25～1.0g生药/mL，静置6h，过滤，得到墨旱莲提取液；2）墨旱莲提取液采用预处理好的大孔树脂进行吸附，墨旱莲提取液与大孔树脂的重量比为1:1～1:5上样流速1～3BV/h，树脂柱径高比1:4～1:7，吸附后先用水洗3～6BV，洗脱流速为2～4BV/h，水洗脱液弃去；再用体积百分比浓度为20～90%乙醇/水洗脱3～6BV，流速为2～4BV/h，收集乙醇/水洗脱液，浓缩，干燥，得到墨旱莲提取物。本发明降低了纯化成本，容易实现工业化生产，并且对环境无污染。

Description

一种墨旱莲提取物的制备方法及用途

技术领域

本发明属中药领域，尤其涉及一种墨旱莲提取物的制备方法及用途。

背景技术

墨旱莲为菊科鳢肠属植物鳢肠（Eclipta prostrata）的干燥地上部分，是传统中药，具有滋补肝肾,凉血止血之功效，主治牙齿松动,须发早白,眩晕耳鸣,腰膝酸软,阴虚血热,吐血,衄血,尿血,血痢,崩漏下血,外伤出血。墨旱莲常作为复方用药，如传统名方二至丸来源于明王三才《医便》，由女贞子及墨旱莲二味药等量组成，功能补益肝肾，滋阴止血，主治肝肾阴虚所致的眩晕耳鸣，口鼻干燥，烦热失眠，吐血血，崩中漏下，须发早白等，临床主要用于治神经衰弱、慢性虚弱疾病、慢性肝炎等症。

现代研究表明，墨旱莲具有抗炎、保肝、增强免疫、抗缺氧等多种药理作用，从该植物分离鉴定的主要化学成分包括三萜皂苷类，如旱莲皂苷Ａ、鳢肠皂苷Ｂ、鳢肠皂苷Ｃ、刺囊酸和齐墩果酸等；蟛其菊内酯类，如蟛其菊内酯、去甲基蟛其菊内酯、去甲基蟛其菊内酯-7-菊萄糖苷；黄酮类，如芹菜素、木犀草素、芹菜素-3-O-葡萄糖苷和木犀草素-3-O-葡萄糖苷，以及噻吩类、甾醇类、硬脂酸等，详参营大礼“墨旱莲化学成分、药理作用及临床应用研究进展” [中国药房，2008，19（36），2876-2878]一文。林朝朋、芮汉明等“应用大孔吸附树脂吸附分离墨旱莲总黄酮的研究”[河南工业大学学报(自然科学版)，2005，26（1），50-54]公开了一种墨旱莲总黄酮的大孔吸附树脂制备工艺，主要采用HPD-700 树脂和40%乙醇溶液洗脱获得。陈启源、万玉华等“一种墨旱莲皂苷类化合物的提取方法”（专利申请号CN200810031092.4）公开了一种墨旱莲皂苷类化合物的提取方法，其主要步骤为：（1）墨旱莲粗粉末采用70％的乙醇微波提取3次，回收乙醇，得到墨旱莲提取浓缩液；（2）将上述墨旱莲浓缩液加水稀释，装于泡沫逆流色谱仪中，用正丁醇连续萃取，收集正丁醇泡沫流出部分，回收，得墨旱莲总皂苷粗品；（3）利用大孔吸附树脂纯化墨旱莲总皂苷；（4）选用反渗透膜对得到的总皂苷进行过滤，进一步去除水溶性杂质，得到高纯度的总皂苷类化合物。但该法需使用特别设备和有机溶剂处理，不适于工业化生产使用；另一方面，该皂苷类化合物的成份组成和比例并未确定。现有技术方案中组成稳定、工艺可控性好的墨旱莲提取物尚未公开。

本发明人在临床实践中，发现二至丸方具有较好的降血脂作用。药理筛选结果表明，该方的墨旱莲提取物和女贞子总三萜提取物均具有降血脂活性。通过对墨旱莲皂苷提取物的进一步研究，明确了其中的化学组成和制备工艺，从而完成了本发明。

发明内容

本发明的目的是提供一种组成稳定、工艺可控的墨旱莲提取物的制备方法及用途。

墨旱莲提取物的制备方法的步骤如下：

1）选取鳢肠属植物墨旱莲，用体积百比浓度为5～95%的乙醇/水浸泡0.5小时后，乙醇/水是墨旱莲药材20倍重量的提取1h和乙醇/水是墨旱莲药材16倍重量的提取0.5h，合并提取液，提取液浓缩成0.25～1.0g生药/mL，静置6h，过滤，得到墨旱莲提取液；

2）墨旱莲提取液采用预处理好的大孔树脂进行吸附，墨旱莲提取液与大孔树脂的重量比为1:1～1:5上样流速1～3 BV/h，树脂柱径高比1:4～1:7，吸附后先用水洗3～6 BV，洗脱流速为2～4BV/h，水洗脱液弃去；再用体积百比浓度为20-90%乙醇/水洗脱3～6 BV，流速为2～4BV/h，收集乙醇/水洗脱液，浓缩，干燥，得到墨旱莲提取物。

所述步骤1）中药材为鳢肠属植物墨旱莲；提取溶剂为乙醇/水的体积百比浓度为5～95%中任意一种醇类溶剂；提取方法为冷浸、渗漉、煎煮、超声提取、加热回流、微波提取中的任意一种。

所述步骤2）墨旱莲提取液的大孔树脂为非极性或弱极性大孔树脂，如D101、AB-8、HPD450、LX60等。

所述步骤2）洗脱溶媒优选体积百分比浓度50～75%乙醇/水洗脱。

所述的墨旱莲提取物用于制备降血脂保健品或药物。

所述的降血脂保健品或药物为：墨旱莲提取物与女贞子总三萜提取物的组合。所述的墨旱莲提取物主要含有旱莲皂苷B、旱莲皂苷A、旱莲皂苷C、旱莲皂苷D、墨旱莲黄酮类成分及蟛其菊内酯类成分，其中墨旱莲皂苷B的质量百分比含量不低于10%。所述的墨旱莲黄酮类成分包括芹菜素、木犀草素、芹菜素-3-O-葡萄糖苷和木犀草素-3-O-葡萄糖苷。所述的女贞子总三萜提取物，包括齐墩果酸、熊果酸、乙酰齐墩果酸、2α-羟基齐墩果酸、2α-羟基-3β-反式对羟基肉桂酰氧基齐墩果酸。

本发明通过墨旱莲提取物工艺研究，采用优选大孔树脂进行选择性洗脱，获得墨旱莲皂苷提取物中总皂苷质量百分比含量不低于40%；同时明确了该提取物中主要的指标性成份含量，以及四种化学成分及其组成，为其质量控制提供了参考依据。该生产工艺降低了纯化成本，容易实现工业化生产，并且对环境无污染。

附图说明

附图为墨旱莲皂苷提取物的液相色谱图。图中，色谱峰1、2、3依次为旱莲皂苷B、旱莲皂苷C和旱莲皂苷A。

具体实施方式

墨旱莲提取物的制备方法的步骤如下：

2）墨旱莲提取液采用预处理好的大孔树脂进行吸附，墨旱莲提取液与大孔树脂的重量比为1:1～1:5上样流速1～3 BV/h，树脂柱径高比1:4～1:7，吸附后先用水洗3～6 BV，洗脱流速为2～4BV/h，水洗脱液弃去；再用体积百比浓度为20～90%乙醇/水洗脱3～6 BV，流速为2～4BV/h，收集乙醇/水洗脱液，浓缩，干燥，得到墨旱莲提取物。

所述步骤1）中药材为鳢肠属植物墨旱莲；提取溶剂为乙醇/水的体积百比浓度为5-95%中任意一种醇类溶剂；提取方法为冷浸、渗漉、煎煮、超声提取、加热回流、微波提取中的任意一种。

所述的墨旱莲提取物用于制备降血脂保健品或药物。

本发明同时对墨旱莲提取物及其组合物的降血脂作用进行了考察。研究结果：1）高脂血症大鼠模型试验结果表明，所述墨旱莲提取物（150，300mg/kg）和二至新方（墨旱莲提取物和女贞子总三萜35：65，150mg/kg）剂量组在给药6 W后能显著降低高血脂模型大鼠TC、TG和LDL-C含量，并且其作用呈现一定的量效关系。结果表明，所述墨旱莲提取物及其组合物具有较好的降血脂作用，可以根据使用需要应用于不同的食品和药品中。

2）体外活性筛选试验结果表明，墨旱莲提取物对HMG-CoA还原酶、脂蛋白脂酶LPL、脂肪酸合成酶的IC50值依次为18.5、83.2、11.8 μg/ml，墨旱莲提取物和女贞子总三萜（65：35）对该3种酶的IC50值依次为12.5、13.3、7.0 μg/ml。

下面实验例用于进一步说明但不限于本发明。

实施例1：墨旱莲提取物的制备

墨旱莲药材10kg，用体积百比浓度为5%乙醇/水浸泡0.5小时，乙醇/水是墨旱莲药材20倍重量的提取1h和乙醇/水是墨旱莲药材16倍重量的提取0.5h，合并提取液，提取液浓缩成0.25 g生药/mL，静置6h，过滤，得到墨旱莲提取液；墨旱莲提取液通过AB-8大孔树脂，墨旱莲提取液与大孔树脂的重量比为1:1，上样流速1 BV/h，树脂柱径高比1:4，吸附后先用水洗3BV，洗脱流速为2BV/h，水洗脱液弃去；再用体积百比浓度为20%乙醇/水洗脱3 BV，流速为2BV/h，收集体积百比浓度为20%的乙醇/水的洗脱液，浓缩，干燥，得到墨旱莲提取物。测得墨旱莲提取物中旱莲皂苷B和A、C的质量百分比含量分别为32.7％、6.2％、5.7％，三者总和44.6％。

实施例2：墨旱莲提取物的制备

墨旱莲药材10kg，用体积百比浓度为95%乙醇/水浸泡0.5小时，乙醇/水是墨旱莲药材20倍重量的提取1h和乙醇/水是墨旱莲药材16倍重量的提取0.5h，合并提取液，提取液浓缩成1.0 g生药/mL，静置6h，过滤，得到墨旱莲提取液；墨旱莲提取液通过LX60大孔树脂，墨旱莲提取液与大孔树脂的重量比为1:5，上样流速3BV/h，树脂柱径高比1:7，吸附后先用水洗6BV，洗脱流速为4BV/h，水洗脱液弃去；再用体积百比浓度为90%乙醇/水洗脱6 BV，流速为4BV/h，收集体积百比浓度为90%的乙醇/水的洗脱液，浓缩，干燥，得到墨旱莲提取物。测得墨旱莲提取物中旱莲皂苷B和A、C的质量百分比含量分别为34.1％、6.8％、5.2％，三者总和46.1％。

实施例3：墨旱莲提取物的制备

墨旱莲药材10kg，用体积百比浓度为50%乙醇/水浸泡0.5小时，乙醇/水是墨旱莲药材20倍重量的提取1h和乙醇/水是墨旱莲药材16倍重量的提取0.5h，合并提取液，提取液浓缩成0. 5 g生药/mL，静置6h，过滤，得到墨旱莲提取液；墨旱莲提取液通过AB-8大孔树脂，墨旱莲提取液与大孔树脂的重量比为1:3，上样流速2BV/h，树脂柱径高比1:5，吸附后先用水洗5BV，洗脱流速为3BV/h，水洗脱液弃去；再用体积百比浓度为50%乙醇/水洗脱5 BV，流速为3BV/h，收集体积百比浓度为50%的乙醇/水的洗脱液，浓缩，干燥，得到墨旱莲提取物。测得墨旱莲提取物中旱莲皂苷B和A、C的质量百分比含量分别为40.3％、7.5％、6.3％，三者总和54.1％。

实施例4：墨旱莲提取物中成分的分离鉴定

取实施例1所得墨旱莲提取物40g，经减压硅胶H柱色谱粗分，氯仿-甲醇（100∶5至70∶30）梯度洗脱，TLC检识合并为6个部分，其中Fr-2经反复硅胶柱色谱及半制备高效液相分离纯化，得到化合物1（14.9 mg），2 （13.4 mg）；Fr-3经反复硅胶柱色谱及Sephadex LH-20纯化，得到化合物3（82.5 mg），Fr-4经反复硅胶柱色谱及Sephadex LH-20纯化，得到化合物4（12.5 mg）。

化合物1 （旱莲皂苷A）：白色结晶性粉末, FAB-MS 657 [M+Na]+。1HNMR (300 MHz, C5D5N,δ): 0.83,0.96,0.99,1.03,1.15,1.25,1.83 (各3H, s, 7 × CH3), 3.38(1H,m,18-H), 3.58(1H, br d, 10.2, 3-H), 4.91 (1H,d, 7.6, 3-Glc-1-H), 5.22 (1H,br s, 16-H), 5.61 (1H, br s, 12-H)。

化合物2 （旱莲皂苷D）：白色结晶性粉末, FAB-MS 819 [M+Na]+。1HNMR (300 MHz, C5D5N,δ): 0.85, 0.97, 0.97, 1.01, 1.10, 1.25, 1.81(各3H, s, 7 × CH3), 3.37(1H,m,18-H), 3.48(1H, br d, 9.9, 3-H), 4.90 (1H,d, 7.7, 3-Glc-1-H), 5.27 (1H,br s, 16-H), 5.58 (1H, br s, 12-H)。

化合物3 （旱莲皂苷C）：白色结晶性粉末, FAB-MS 819 [M+Na]+。1HNMR (300 MHz, C5D5N,δ): 0.85, 0.97, 0.97, 1.01, 1.10, 1.25, 1.81(各3H, s, 7 × CH3), 3.37(1H,m,18-H), 3.48(1H, br d, 9.9, 3-H), 4.90 (1H,d, 7.7, 3-Glc-1-H), 5.27 (1H,br s, 16-H), 5.58 (1H, br s, 12-H), 6.28 (1H,d, 8.0, 28-Glc-1-H)。

化合物4 （旱莲皂苷B）：白色结晶性粉末, FAB-MS 981 [M+Na]+。1HNMR (300 MHz, C5D5N,δ): 0.83,0.97,1.00,1.06,1.09,1.22,1.79 (各3H, s, 7 × CH3), 3.25(1H,m,18-H), 3.42(1H, br d, 11.0, 3-H), 4.87 (1H,d, 7.5, 3-Glc-1-H), 4.87 (1H,d, 7.5, 3-Glc-1-H),5.30 (1H,br s, 16-H), 5.33 (1H, d, 7.5, 3-Glc-4′-Glc -1-H), 5.58 (1H, br s, 12-H), 6.30 (1H,d, 8.0, 28-Glc-1-H)。

实验例5：墨旱莲提取物及其组合物的降血脂作用试验

本试验考察墨旱莲提取物、二至新方（墨旱莲提取物和女贞子总三萜提取物65：35组成）的降血脂作用。其中女贞子总三萜提取物为自制，包括齐墩果酸、熊果酸、乙酰齐墩果酸、2α-羟基齐墩果酸、2α-羟基-3β-反式对羟基肉桂酰氧基齐墩果酸等成分，采用HPLC-ELSD面积归一化法分析总三萜质量百分比含量按齐墩果酸计为67.1%。

高脂血症大鼠模型的建立：给200g左右雄性Wistar大鼠饲喂高脂饲料，自由进食和饮水。另设饲喂正常饲料的大鼠作阴性对照。两周后从眼睛取血测定血脂含量，以判断模型成功。

分组和给药：将血脂代谢异常大鼠随机分为模型对照组、供试墨旱莲提取物A组（150mg/kg）和B组（300mg/kg）、二至新方C组（150mg/kg）、和阳性药血脂康组（600mg/kg）对照组，每组5只，分别给予相应的药物或溶剂两周后，从眼睛取血。

血脂含量测定：血脂四项，包括总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白（LDL）和高密度脂蛋白（HDL），由全自动生化仪测定。试验结果：见表1和2。

表1 二至降脂胶囊对高血脂模型大鼠TC、TG含量影响（n=5）

表2 二至降脂胶囊对高血脂模型大鼠LDL-C、HDL-C含量影响

表1结果表明，墨旱莲提取物（150，300mg/kg）和二至新方（150mg/kg）剂量组在给药6 W后能显著降低高血脂模型大鼠TC、TG含量(P<0.05，P<0.01)，并且其作用呈现一定的量效关系。

表2结果表明，墨旱莲提取物（150，300mg/kg）和二至新方（150mg/kg）剂量组在给药6 W时，和血脂康组给药4 W和6 W时LDL-C与模型组比较显著下降(P<0.01)，HDL-C含量显著增加(P<0.01)。可见，二至新方对HLP大鼠有降低As作用，并且其作用在实验中的三个剂量间呈一定的量效关系。

实验例6：墨旱莲提取物及其组合物的体外试验

我们将脂代谢相关关键靶点HMG-CoA还原酶(调节TC)、脂蛋白脂酶LPL(调节TG)、脂肪酸合成酶FAS(调节TG)的3种分子模型相结合，应用于降血脂作用筛选。分别对以上女贞子总三萜酸、女贞子总多糖、墨旱莲总皂苷、墨旱莲总黄酮四类组份物质及其不同配伍组份对进行了活性筛选。

HMG-CoA还原酶(调节TC)、脂蛋白脂酶LPL(调节TG)、脂肪酸合成酶FAS(调节TG)的3种分子模型相结合，组份女贞子总三萜和墨旱莲提取物有明显的抑制HMG-CoA还原酶、增强脂蛋白脂酶LPL、抑制脂肪酸合成酶FAS的活性，另两种组份女贞子总多糖、墨旱莲总黄酮有作用趋势但与模型对照组比较无统计学意义。除女贞子总三萜酸+墨旱莲提取物组份配伍的效果最强且优于它们各自单组份的效果外，其它组份亦有一定改善作用。但效果明显低于女贞子总三萜酸+墨旱莲提取物组份配伍，见表3。

表3 女贞子与墨旱莲组份脂代谢相关关键靶点活性筛选 (ug/ml)

组份	HMG-CoA还原酶（IC50）	LPL (EC50)	FAS (IC50)
				女贞子总三萜酸	77.1	17.0	59.8
女贞子总多糖	170.7	195.6	188.6
				墨旱莲总皂苷	18.5	83.2	11.8
墨旱莲总黄酮	94.9	131.8	120.1
				女贞子总三萜酸+墨旱莲总皂苷（35:65）	12.5	13.3	7.0

Claims

1.一种墨旱莲提取物的制备方法，其特征在于它的步骤如下：

1）选取鳢肠属植物墨旱莲药材，用体积百比浓度为5～95%的乙醇/水浸泡0.5小时后，乙醇/水是墨旱莲药材20倍重量的提取1h和乙醇/水是墨旱莲药材16倍重量的提取0.5h，合并提取液，提取液浓缩成0.25～1 g生药/mL，静置6h，过滤，得到墨旱莲提取液；

2.根据权利要求1所述的一种墨旱莲提取物的制备方法，其特征在于所述提取溶媒优选体积百分比浓度50～80%乙醇/水。

3.根据权利要求1所述的一种墨旱莲提取物的制备方法，其特征在于所述的大孔树脂为非极性或弱极性大孔树脂。

4.根据权利要求1所述的一种墨旱莲提取物的制备方法，其特征在于所述洗脱溶媒优选体积百分比浓度50～75%乙醇/水洗脱。

5.一种如权利要求1所述方法制备的墨旱莲提取物的用途，其特征在于用于制备降血脂保健品或药物。

6.根据权利要求5所述的一种墨旱莲提取物的用途，其特征在于所述的降血脂保健品或药物为：墨旱莲提取物与女贞子总三萜提取物的组合。

7.根据权利要求6所述的一种墨旱莲提取物的用途，其特征在于所述的墨旱莲提取物主要含有旱莲皂苷B、旱莲皂苷A、旱莲皂苷C、旱莲皂苷D、墨旱莲黄酮类成分及蟛其菊内酯类成分，其中墨旱莲皂苷B的质量百分比含量不低于10%。

8.根据权利要求7所述的一种墨旱莲提取物的用途，其特征在于所述的墨旱莲黄酮类成分包括芹菜素、木犀草素、芹菜素-3-O-葡萄糖苷和木犀草素-3-O-葡萄糖苷。

9.根据权利要求6所述的一种墨旱莲提取物的用途，其特征在于所述的女贞子总三萜提取物，包括齐墩果酸、熊果酸、乙酰齐墩果酸、2α-羟基齐墩果酸、2α-羟基-3β-反式对羟基肉桂酰氧基齐墩果酸。