CN102245194B - 用于预防和治疗病毒感染的组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于预防和/或治疗病毒感染的包含茶藨子(Ribes)属提取物的组合物。具体而言，所述组合物可用于预防和/或治疗由反转录病毒导致的流行性感冒、普通感冒病或病毒感染的症状。

Description

用于预防和治疗病毒感染的组合物
本发明涉及用于预防和/或治疗病毒感染的包含茶藨子(Ribes)属提取物的组合物。
大量人疾病由病毒导致，包括流行性感冒(influenza)、普通感冒(common cold)、水痘(chickenpox)和感冒疮(cold sores)。疾病如AIDS、肝炎(hepatitis)、疱疹感染(herpes infections)、柯萨奇病毒感染(Coxsackieinfections)、麻疹(measles)、风疹(rubella)、巨细胞(cytomegaly)、流行性腮腺炎(mumps)、狂犬病(rabies)、腹泻(diarrhea)、SARS、埃博拉(Ebola)、黄热病(Yellow fever)、西尼罗河热(West-Nile fever)、汉坦热(Hanta fever)、登革热(Dengue fever)、马尔堡热(Marburg fever)、拉沙热(Lassa fever)、天花(smallpox)、人乳头瘤病毒感染(human papillomaviral infections)、传染性单核细胞增多症(infectious mononucleosis)、伯基特淋巴瘤(Burkittlymphoma)、脊髓灰质炎(polyomyelitis)、脑炎(encephalitits)、咽扁桃体炎(adenopharyngitis)也是病毒传播的。
然而，人中最常见病毒感染是流行性感冒和普通感冒病。每年世界人口的大约10至20％由于流行性感冒而患病，普通感冒病根本是人最常见的感染。通常成人每年受侵袭二至三次，儿童甚至更多。这导致重大经济损失，由于人在感染过程中必须获得治疗并通常不能工作。另外，流行性感冒和普通感冒病的标准治疗花费高并且显示可能是严重的副作用。
流行性感冒(influenza)，也叫作流感(flu)，是一种传染性病毒感染，其以季节性流行性方式在世界范围内传播。有人区分了三种病毒类型，甲型、乙型和丙型。乙型和丙型局限于人，而甲型扩展到哺乳动物和鸟类。
世界卫生组织(World Health Organization)，WHO，警告全球性流行性感冒将在即将到来的几年内广泛流行。流行发作和广泛流行主要由甲型流行性感冒病毒引起。流行性感冒病毒遗传物质的主要遗传改变已经在20世纪引起了三次广泛流行，它们的传染原(infective agent)都是甲型。
目前，禽流感，也是甲型病毒，代表广泛流行的主要危险。最近几年发生日益增加，特别是在东南亚。它的传播由野生鸟类辅助，所述鸟类作为所述疾病的抗性载体。专家们担心禽流感病毒可能与人流感的传染原交叉。原则上，当猪或人同时感染禽流感和人流感的传染原时，这是可能的。这可能导致对人高感染性和致死性的病毒，其可以导致全球蔓延。迄今为止，禽流感到人类的传播只在局部地区发生。然而，还没有观察到在人类之间的禽流感传播。
接种疫苗代表预防病毒疾病的最重要的方式。然而，在预防情形中，接种依赖于抗某种病毒的疫苗的制备。这需要所述病毒必须已经存在。这一点，以及开发疫苗所需要的长时间(大约4个月)导致它在全球流行病中的应用的重大局限性。在这样的情形中，疫苗应用只通过抗病毒剂的预先和伴随应用来保障(WHO Guidelines on the Use of Vaccines and Antiviralsduring Influenza Pandemics(在流行性感冒广泛流行期间关于使用疫苗和抗病毒剂的WHO方针)；World Health Organization(世界卫生组织)2004)。
有效治疗流行性感冒的抗病毒剂包括金刚烷胺(amantadine)、金刚乙胺(rimantadine)、扎那米韦(zanamivir)和奥塞米韦(oseltamivir)和利巴韦林(ribavirin)。所列出的药物全都有副作用，其在某些情形中可能是严重的。例如，奥塞米韦，其以名称Tamiflu出售，表现出频繁的反胃、呕吐和胃痛的副作用。它的应用指示只在13岁以后，原因为在某些情形中，在低于所述年龄限制的年轻人中观察到严重的副作用，如耳部感染、肺炎、鼻窦感染、支气管炎、淋巴结肿胀和结膜炎(Red List，Catalogue of Medicationfor Germany(红表，德国医药目录)，2004)。
抗病毒药物在病毒疾病的预防以及在其治疗中有效。迄今为止病毒疾病的直接药物治愈尚未成功。
接骨木(elderberry)提取物因其在某些情形中缩短流行性感冒的持续时间的作用而为人所知，然而，其没有表现出任何适当的预防作用(Zakay-Rones，Z.；Varsano，N.；Zlotnik，M.；Manor，O.；Regev，L.；Schlesinger，M.；Mumcuoglu，M.J.Altern.Complement.Med(备选和互补医学杂志).1995，1(4)，361-9)。
WO-A-99/44578描述了使用异槲皮素(isoquercetin)，一种天然类黄酮，在医学制剂中作为光保护过滤器和抗病毒物质。具体而言，异槲皮素，其例如存在于黑茶藨子(Ribes nigrum L.)中，被描述为显示针对单纯疱疹病毒I型的抗病毒活性。然而，尚未证明由黑茶藨子(Ribes nigrum L.)制备提取物，也未证明来自于黑茶藨子(Ribes nigrum L.)的此类提取物的抗病毒活性的特别效应。
此外，JP-A-2001-328941公开了分离自黑茶藨子(Ribes nigrum L.)提取物的花色素苷。所述花色素苷被描述为显示针对甲型流行性感冒或乙型流行性感冒的抗病毒活性。然而，仅对分离自黑茶藨子(Ribes nigrum L.)提取物的纯的花色素苷对于它们抗人甲型流行性感冒的活性进行了研究，尚未检查提取物本身的活性。
作为用于可能由禽流感引起的即将到来的广泛流行的情形的预防措施，世界范围的国家依赖抗病毒药物。例如，尽管担心在紧急情况中药物可能很快用光，但是一些国家仍以显著量定购上文提及的药物奥塞米韦(Tamiflu；Hoffman La Roche(霍夫曼-拉罗奇))作为广泛流行情形的储备。另外，巨大的需要已经导致生产瓶颈。
另外，(已知)抗病毒剂的应用受到这些抗病毒剂在畜牧业中用作广谱药物的事实的日益增加的危害。不顾国际禁令，例如在中国，这样的实施已经引起一些禽流感毒株对这些药剂的抗性。此外，这些药剂的常见副作用，在某些情形中可能是严重的。此外，在一些情形中，这些药物只指定某些年龄组，诸如例如奥塞米韦(Tamiflu)，其只能在年龄大于13岁以后应用。
除了流行性感冒以外，另一种典型的病毒感染是普通感冒病。典型的普通感冒病中包括的是呼吸道感染，诸如头伤风(head cold)和扁桃腺炎和咽炎，以及咳嗽和支气管炎。通常这些相继发生，但是感冒还能够保持仅限于鼻子、咽喉或支气管。这种类型的普通感冒病也称为“病毒性感冒”。这些不应该与由流行性感冒病毒产生的流行性感冒混淆，所述流行性感冒显示出明显更长和更严重的疾病进程，且通常与发烧相关。
提及的普通感冒病也是由病毒引起的。因为，例如，存在着超过一百种不同类型的能够引起头伤风的病毒，所以几乎不可能开发针对它的疫苗。因此，头伤风或一般的感冒的治疗以减轻症状为目标。在这些情形中，通常使用试验证明效果良好的家庭治疗法。例如，非常堵塞的鼻子能够通过吸入热蒸汽得到帮助。这容许鼻粘膜中肿胀的减小并促进粘液的流出。例如，通过向热水中添加几滴茶树油或甘菊油能够对其起到辅助作用。还已知用盐溶液日常冲洗鼻子能够降低对头伤风的易感性。
除自助式措施外，药物能够帮助收缩肿胀的鼻粘膜中的血管，从而引起对鼻粘膜的缓解作用。然而，用于减轻鼻粘膜肿胀的滴鼻试剂不应该使用长于2或3天。这段时间后，当停止所述滴剂后，鼻粘膜可能会更加肿胀，并且发展为“回弹肿胀”(药物性鼻炎(rhinitis medicamentosa))。
与化学合成的鼻喷雾不同，植物药物几乎没有副作用。即使在较长时期内使用，它们不损伤鼻粘膜，且不引起药物性鼻炎。越早应用植物药物，它们越有效。已经能够将它们用于支持感冒的第一征兆。它们还抵制感染的传播。
例如，松果菊属(echinacea)制剂常常用于普通感冒病，由此市场上存在大量处于不同植物化学组合物中的多种药物。然而，对这些植物治疗剂功效的受控研究仅以有限的程度存在，并具有矛盾的结果。然而，最近，新研究揭示松果菊属不具有假定的功效。该研究使用具有不同植物化学特征的三种松果菊属制剂进行，其中这些制剂是通过用二氧化碳、60％乙醇或20％乙醇提取狭叶松果菊(E.-angustifolia)根获得的。参加该研究的总共437名患有鼻病毒感染的志愿者在暴露于该病毒前7天时作为预防或在暴露时为了治疗接受该药物。该研究包括接受安慰剂的对照组。关于感染率、症状的严重性、鼻分泌物的体积、白细胞水平、鼻冲洗水中的白介素-8浓度或定量的病毒滴度，在这三种松果菊属提取物和安慰剂之间不存在显著差别(Deutsches102，来自2005年12月2日第48期，第A-3341/B-2822/C-2640页和新英格兰医学杂志(New England Journal ofMedicine)，2005，353，341-348)。
基于植物的其他药物是来自荷叶天竺葵(Pelargonium reniforme)或狭花天竺葵(Pelargonium sidoides)的根的提取物，它们以名称Umckaloabo出售。Umckaloabo传统上不仅用于呼吸道疾病，还用于胃肠疾病。现认为决定功效的成分是许多抗菌和免疫调节成分，诸如香豆素和单宁(tannins)。假定该提取物产生抗菌、抗病毒和分泌物分解(secretolytic)效应，由此怀孕或哺乳期女性或患有肝病或肾病或增加的出血倾向的患者不应该使用该药物，因为在该领域中还不可能收集到足够的经验。而且，与其他植物药物相比，Umckaloabo非常昂贵。
反转录病毒导致其它严重疾病。
反转录病毒是RNA病毒，其使用酶反转录酶从其RNA基因组产生DNA。反转录酶是DNA聚合酶，其将单链RNA转录成单链DNA。此外，一旦RNA已经被反转录成单链DNA，反转录酶帮助双螺旋DNA的形成。如此形成的病毒的DNA然后通过整合酶结合到宿主基因组中并以其进行复制。反转录病毒是有包膜病毒，属于反转录病毒科(Retroviridae)，可分为内源性和外源性反转录病毒。
内源性反转录病毒作为遗传成分存在于染色体DNA中。其来源于人、哺乳动物和其它脊椎动物中的远古病毒感染并传递到下一代并保留在基因组中。怀疑人内源性反转录病毒在一些自身免疫疾病(特别是多发性硬化(multiple sclerosis))中发挥作用。
外源性反转录病毒是水平传播的传染性含有RNA的病毒，其从动物传播至动物或人传播至人。水平传播几乎专门地通过体液发生，通过污迹(smear)传播极其少见，并且可排除空气传播。外源性反转录病毒诱导的或相关的疾病是，例如，猫白血病(leukemia)或肉瘤(sarcomas)、鸡白血病或肉瘤、小鼠白血病或肉瘤、马传染性贫血(equine infectious anemia)、牛白血病(bovine leukemia)、羊关节炎脑炎(caprine arthritis-encephalitis)、成人T细胞白血病(human adult T-cell leukemia)、人热带痉挛性轻截瘫(human tropic spastic paraparesis)和AIDS。
然而，人中最严重的病毒感染之一是HIV(人免疫缺陷症病毒)感染。人中HIV感染已经变成大流行的。大部分HIV感染的个体最终发展为AIDS，一种人的病症，其中免疫系统开始破坏，导致威胁生命的机会性感染。自1981年AIDS第一次被认识以来，其已经杀死超过二千五百万人。在2007年，认为三千零六十万和三千六百一十万之间的人与HIV一起生活，大约二百一十万人死亡并且报道了二百五十万新感染。在具有最高HIV流行的非洲，平均预期寿命比没有该疾病大约少6.5年。这导致重大经济损失和贫困增加。
HIV感染可分为四个阶段：原发感染、临床无症状阶段、有症状HIV感染和从HIV进展至AIDS。
感染的第一阶段，原发HIV感染，持续数周并可包括感冒(flue)样症状。在这一阶段，由于外周血中大量HIV，免疫系统开始产生HIV抗体和细胞毒性淋巴细胞。
在阶段2，临床无症状阶段或潜伏阶段，外周血中的病毒颗粒的数目通过强烈的免疫防御(uimmune defense)而降低。所述阶段持续大约10年并且没有大的症状。然而，HIV在淋巴结中是有活性的并且人保持传染性。
在感染的阶段3，有症状HIV感染为该阶段的特征，其中免疫系统被HIV高度损伤。由于数年的活性，淋巴结和组织受损，HIV突变并变得更有致病性，导致更大数目的T辅助细胞破坏，受感染的身体不能跟上替换损失的T辅助细胞。由于T辅助细胞数目的降低，丧失了细胞介导的免疫性，出现多种机会性感染。这种阶段最终导致感染的阶段4，即从HIV进展到AIDS。
疫苗接种代表最重要的预防病毒病的方式。然而，目前不存在对于HIV感染的疫苗或治愈。
一般而言，反转录病毒导致的感染用抗反转录病毒药物治疗。HIV感染目前通过高效抗反转录病毒疗法(HAART)治疗。所述疗法是属于至少两类抗反转录病毒剂的至少三种不同药物的组合。如果仅服用一种药物，HIV将对所述药物产生抗性。同时服用数种抗反转录病毒药物降低抗性发展率，使得治疗在长的时期中更有效。目前，可获得分为5组的超过20种批准的抗反转录病毒药物。这些组中的每种以不同的方式攻击HIV。第一组抗反转录病毒剂是核苷/核苷酸反转录酶抑制剂(NRTI)。所述抑制剂干扰病毒制造自身新拷贝需要的反转录酶蛋白。第二组化合物是非-核苷反转录酶抑制剂(NNRTI)，其通过抑制反转录酶蛋白阻碍HIV复制。第三组抗反转录病毒剂是蛋白酶抑制剂(PI)。所述药剂抑制蛋白酶，该蛋白酶是HIV复制过程中必需的。第四类药物是融合或进入抑制剂，其阻止HIV结合或进入人免疫细胞。所述药物特别用于感染已经对普通疗法具有抗性的病毒的患者。第五类抑制剂是干扰整合酶的整合酶抑制剂。病毒需要所述酶来将其遗传物质插入人细胞中。
高效抗反转录病毒疗法不能治愈患者，但改善了HIV感染患者的整体健康和生活质量。HIV感染者的平均预期寿命现在大约是从感染时32年。没有HAART时，从HIV进展至AIDS通常发生在9至10年后，发展AIDS后的中值存活时间仅仅是9个月。开发HAART作为HIV感染的有效疗法在该药物广泛可得的那些区域大量降低了死亡率。
高效抗反转录病毒疗法中最常见的药物组合由两种NRTI联合NNRTI或者蛋白酶抑制剂组成。最常见地，利托那韦(ritonavir)用作蛋白酶抑制剂。抗反转录病毒药物组合的实例含有两种NRTI，即齐多夫定(zidovudine)和拉米夫定(lamivudine)，联合NNRTI依法韦仑(efavirenz)。常用NRTI是拉米夫定(lamivudine)、阿巴卡韦(abacavir)、齐多夫定(zidovudine)、司他夫定(stavudine)、扎西他滨(zalcitabine)、去羟肌苷(didanosine)、恩曲他滨(emtricitabine)和替诺福韦(tenofovir)。典型使用的NNRTI是地拉韦啶(delavirdine)、依法韦仑(efavirenz)、依曲韦林(etravirine)和奈韦拉平(nevirapine)。标准蛋白酶抑制剂是安泼那韦(amprenavir)、福沙那韦(fosamprenavir)、阿扎那韦(atazanavir)、达芦那韦(darunavir)、茚地那韦(indinavir)、洛匹那韦(lopinavir)、利托那韦(ritonavir)、那非那韦(nelfinavir)、沙奎那韦(saquinavir)和替拉那韦(tipranavir)。作为融合或进入抑制剂，正常使用恩夫韦肽(enfuvirtide)和马拉韦罗(maraviroc)。常用整合酶抑制剂是raltegravir。
然而，有些患者显示药物耐受，高效抗反转录病毒疗法在一些情形中导致严重副作用，在稀有情形中甚至可能是威胁生命的。此外，不坚持和不持续是疗法失败的主要原因。不坚持和不持续的原因是心理社会问题，例如，获得药学支持差、不足的社会支持、精神病和药物滥用。此外，方案非常复杂，需要大量丸剂，特别的给药频率，膳食限制和其它问题。在该疗法中发生的典型的副作用是脂肪营养障碍(lipodystrophy)、血脂障碍(dyslipidemia)、胰岛素抵抗(insulin resistance)、心血管风险和先天缺陷的增加。在用抗反转录病毒药物治疗过程中发生的进一步的副作用是腹泻、恶心、呕吐、皮疹、超敏反应、食欲不振、中枢神经系统的影响，诸如头晕、情绪变化、抑郁、焦虑和偏执、疲劳、失眠、肾损伤、肝损伤、胰腺损伤、乳酸性酸中毒(lactic acidosis)和神经损伤。所述副作用对健康和生活治疗可具有大的影响。
另外，抗反转录病毒药物昂贵，大部分受感染的个体没有获得对于HIV和AIDS的药物和治疗。例如，融合和进入抑制剂，以及整合酶抑制剂仅在资源丰富的国家可以获得。
因此，本发明的目的是提供用于预防和/或治疗病毒感染的抗病毒组合物，该组合物能够经济地制备，并且当施用时，完全不引起副作用或仅引起微小的副作用。
通过使用来自茶藨子属(genus Ribes)植物的提取物用于预防和/或治疗病毒感染达到该目的。
附图简述
图1显示黑茶藨子(Ribes nigrum)桠枝和叶的提取物针对甲型流行性感冒病毒A/波多黎各(Puerto-Rico)/8/34(H1N1)(PR8)(人)的抗病毒活性的结果。
图2显示黑茶藨子(Ribes nigrum)桠枝和叶的提取物和T20针对HIV-1的抗病毒活性的结果。
图3显示黑茶藨子(Ribes nigrum)桠枝和叶的提取物和T20的细胞毒性测定的结果。
发明详述
本发明涉及用于预防和/或治疗病毒感染的组合物，其中所述组合物包含来自于茶藨子属植物的至少一个气生部分的提取物，其中所述气生部分选自由叶和桠枝组成的组。
在优选的实施方案中，与上文或下文所列举的任何一个实施方案组合，所述病毒感染包括普通感冒病。
更优选地，所述普通感冒病包括由鼻病毒、腺病毒或冠状病毒导致的原发感染。
在进一步优选的实施方案中，与上文或下文所列举的任何一个实施方案组合，所述组合物用于治疗头伤风。
在另一个优选的实施方案中，与上文或下文所列举的任何一个实施方案组合，所述病毒感染包括流行性感冒。更优选地，所述流行性感冒是禽流感。
在进一步优选的实施方案中，与上文或下文所列举的任何一个实施方案组合，所述病毒感染是由反转录病毒导致的，更优选由慢病毒(lentiviruses)导致。特别地，所述病毒感染是由HIV-1和/或HIV-2导致的。
在优选的实施方案中，与上文或下文所列举的任何一个实施方案组合，所述植物是黑茶藨子(Ribes nigrum L.)。
在另一个优选的实施方案中，与上文或下文所列举的任何一个实施方案组合，所述植物是红茶藨子(Ribes rubrum L.).
在优选的实施方案中，与上文或下文所列举的任何一个实施方案组合，所述组合物还包含茶藨子属植物果实的提取物。
在优选的实施方案中，与上文或下文所列举的任何一个实施方案组合，所述组合物处于液体、干燥或半固体形式。
在优选的实施方案中，与上文或下文所列举的任何一个实施方案组合，所述提取物是水提取物或醇提取物。
在优选的实施方案中，与上文或下文所列举的任何一个实施方案组合，所述组合物口服、鼻内或局部施用。
在备选的优选实施方案中，所述组合物作为鼻试剂、吸入混合物、气溶胶或房间喷雾剂存在。
所述组合物还可以优选地以片剂、包衣片剂、泡腾片剂、胶囊剂、粉剂、颗粒剂、糖衣片剂、软膏剂、凝胶剂、霜剂、含漱液或植物汁的形式存在。
本发明还涉及来自于茶藨子属植物的至少一个气生部分的提取物在制备用于预防和/或治疗病毒感染的药物中的用途，其中所述气生部分选自由叶和桠枝组成的组。
在本发明中，术语“植物的气生部分(aerial parts)”是指地面上的所有部分，包括叶、桠枝、花、果实和种子。为制备根据本发明使用的提取物，优选地使用叶和桠枝。
在本发明中，术语“桠枝(twig)”是指具有直径至多3cm的小的芽(shoot)或枝(branch)。优选地，所述桠枝的直径至多1cm。
根据本发明，术语“提取物(extract)”代表性地用于通过用溶剂提取的方式(如用浸渍(maceration)和渗滤(percolation)从草药对象(herbal subject)中获得的所有产物。
在本发明中，术语“预防(prophylaxis)”是指防止疾病的程序。预防措施可分为初级预防(防止疾病的发生)和次级预防(当疾病已经发生时防止恶化)。
流行性感冒传染原是甲、乙和丙型病毒。在人类中季节性发生的流行性感冒是由具有H1、H2和H3亚型的甲型流行性感冒病毒以及由乙型流行性感冒病毒引起的。禽流感主要由H5、H7和H9亚型引起。
所述提取物特别适合预防和/或治疗禽流感。特别地，所述提取物可以用于预防和/或治疗由H5和H7亚型引起的禽流感。
为了本发明的目的普通感冒病理解为是呼吸道，通常意指，鼻、咽、喉、气管和支气管的炎症。在该情形中，术语“普通感冒病”和“病毒性感冒”同义使用。病毒性感冒区别于流行性感冒，因为后者是仅由流行性感冒病毒引起的。
另一方面，病毒性感冒通常由腺病毒、冠形病毒和/或鼻病毒引起。
腺病毒(腺病毒科(Adenoviridae))属于无包膜立方DNA病毒家族，并具有60-90nm的直径。基因组由大约36kb长的线性双链DNA组成。人们区分了大约50种免疫学上不同的腺病毒类型，在亚属A-F中有大约35种人类致病类型。腺病毒科家族分为能够感染哺乳动物的哺乳动物腺病毒属(Mastadenoviruses)和局限于多种鸟类物种的禽腺病毒属(Aviadenoviruses)。腺病毒的特征在于面对化学和物理作用时不寻常的稳定性，并耐受最不利的pH水平，这容许它们在宿主体外具有相当长的生存时间。
腺病毒主要引起呼吸道疾病。然而，依据具体的血清型，还能够引起许多其他疾病，例如，肠胃炎(gastroenteritis)、结膜炎(conjunctivitis)、膀胱炎(cystitis)、咽炎(pharyngitis)或腹泻(diarrhoeas)。由腺病毒引起的呼吸道疾病的症状在普通感冒到支气管炎到肺炎的范围内变化。在具有衰弱的免疫系统患者的情形中，存在着对来自腺病毒感染的严重并发症的特殊易感性，诸如例如，ARDS(急性呼吸困难综合征(Acute Respiratory DistressSyndrome))。此外，怀疑病毒类型Ad-36和人类肥胖之间存在相关性。
冠状病毒，其属于冠状病毒科属(genus Coronaviridae)，通常引起人类的轻度上呼吸道疾病，罕见引起肠胃炎和由与SARS-相关的冠状病毒SARS-CoV引起的严重急性呼吸综合征(Serious Acute RespiratorySyndrome，SARS)。
冠状病毒被分类在有包膜多晶RNA病毒家族中，且具有70-160nm的直径。它们具有长度为20-30kb的单链正义RNA。冠状病毒科属(Coronaviridae genus)分为三个属：冠状病毒属(coronaviruses)、动脉炎病毒属(arteriviruses)和环状病毒属(toroviruses)。其中，只有冠状病毒包括人类致病病毒。病毒的传播通过飞沫传染(产气的)发生，以污物或污迹感染(粪-口的)或甚至通过与被感染的人的简单接触(机械的)发生。该情形中，较年轻的被感染生物体能够变得比年长的生物体病得更重。冠状病毒引起人类中15-30％的具有轻微发烧、头伤风、咳嗽和喉咙痛的普通感冒病。
具有由传染性、过敏和非过敏机制引起的发痒、打喷嚏、分泌物和堵塞症状的急性或慢性鼻粘膜炎症称为鼻炎、鼻粘膜炎(nasal catarrh)、鼻卡他(coryza)或俗称头伤风。病原体通常是小RNA病毒属-鼻病毒。鼻病毒的感染通过直接传播，例如，通过污染的手或还通过飞沫传染而发生。
迄今，已经鉴定了该属中超过115种血清型。鼻病毒具有长度为7.2-8.5kb的单链正义RNA(信使RNA)。这些是具有二十面结构且具有24-30nm的直径的裸露病毒。包围着该RNA的10-15nm厚的蛋白质包膜(衣壳)由60个对称性排列的亚单位组成，所述亚单位称为原聚体。每个原聚体由四种衣壳蛋白VP1、VP2、VP3和VP4组成。认为原聚体的多重数量是鼻病毒抗原多功能性的原因。
如已经提及地，普通感冒病通常由腺病毒、冠状病毒和/或鼻病毒引起。依赖于感染病毒的类型，能够发生感冒病症诸如头伤风、咳嗽、嘶哑、喉咙痛例如由扁桃腺和咽部炎症引起的喉咙痛、关节疼痛和头痛、寒战、轻微发烧和疲劳。为了本发明的目的，支气管炎和支气管肺炎也认为是普通感冒病。
这些普通感冒病中，在冬季月份中头伤风发生得最频繁。这是由鼻病毒，或较少见地，腺病毒感染引起的。所述组合物或制剂优选地用于预防和/或治疗头伤风，特别是用于预防和/或治疗鼻病毒导致的头伤风。
此外，细菌感染，其“建立”在已经存在的病毒感染上，能够伴随普通感冒病发生。这种类型的感染称为继发性细菌感染或细菌重复感染。本发明所述的组合物的用途还涉及预防和/或治疗这些继发性细菌感染。
反转录病毒的病毒体由具有大约100nm直径的颗粒的有包膜的颗粒组成，并且还含有两个长度为7至10kb的相同的单链RNA分子。反转录病毒的组要成分是
●包膜，其由从宿主质膜获得的脂双层构成，
●二聚体RNA，其具有5’端的帽和3’端的聚腺苷酸和
●蛋白质，其含有作为病毒衣壳主要成分的gag蛋白，在病毒体成熟过程中的蛋白水解分裂中发挥功能的蛋白酶，负责合成病毒DNA和感染后整合进入宿主DNA的pol蛋白，和在病毒体结合和
进入宿主细胞中发挥作用的env蛋白。
HIV是属于反转录病毒科(Retroviridae)家族和慢病毒属(lentivirus)的病毒。其大体是球形的，具有大约120nm的直径，由两个拷贝的正单链RNA构成，该RNA结合核衣壳蛋白和病毒体发育所需的酶(例如反转录酶、蛋白酶、核糖核酸酶和整合酶)。所述衣壳被由病毒蛋白构成的基质包围，所述病毒蛋白进一步被病毒包膜包围，该包膜由两层来自于人细胞膜的磷脂构成。在所述包膜中嵌入了来自于宿主细胞的其他蛋白和复杂HIV蛋白的拷贝。蛋白由帽和将该结构锚定到病毒包膜中的茎组成，所述帽由三个分子的糖蛋白构成。糖蛋白使病毒能够与靶细胞附着和融合从而起始感染周期。
HIV感染免疫系统和中枢神经系统的细胞。具体而言，HIV通过糖蛋白与靶细胞上的受体的吸附、病毒包膜与细胞膜的融合和释放HIV衣壳到细胞中而进入巨噬细胞和T辅助细胞，特别是CD4+T细胞。穿透到细胞中后，HIV产生自身的新的拷贝，其继续感染其它细胞。因此，HIV感染最终导致T辅助细胞数目的降低，这是通过三种主要机制：通过直接病毒杀死受感染的细胞，增加受感染细胞中的凋亡率和通过识别受感染细胞的CD8细胞毒性淋巴细胞杀死受感染的CD4+T细胞。如果CD4+T细胞的水平降低到低于临界水平，细胞介导的免疫性丧失，身体对机会性感染更易感。
HIV可进一步分为HIV-1和HIV-2。对于HIV-1，存在亚型A至J，最常见亚型是1A，1B，1C和1D。HIV-2可分为亚型A至E。其比HIV-1致病性更低。
除了HIV以外，另一种人反转录病毒是人嗜T淋巴细胞病毒(humanT-lymphotropic virus)，特别是人嗜T淋巴细胞病毒1型(HTLV-1)。HTLV-1是人RNA反转录病毒，其导致T细胞白血病和T细胞淋巴瘤，并且也可参与脱髓鞘性疾病(demyelinating disease)，诸如热带痉挛性轻截瘫。
其它反转录病毒包括禽白血病病毒(Avian leukosis virus)、劳斯肉瘤病毒(Rous sarcome virus)、小鼠乳腺瘤病毒(Mouse mammary tumor virus)、鼠白血病病毒(Murin leukemia virus)、猫白血病病毒(Feline leukemia virus)、牛白血病病毒(Bovine leukemia virus)、大眼梭鲈皮肤肉瘤病毒(Walleydermal sarcoma virus)、猿和猫免疫缺陷病毒(Simian and Felineimmunodeficency virus)、马传染性贫血病毒(Equine infectious anemia virus)和猿泡沫病毒(Simian foamy virus)，它们导致疾病诸如猫白血病(leukemia)或肉瘤(sarcomas)，鸡白血病或肉瘤，小鼠白血病或肉瘤，马传染性贫血，牛白血病和羊关节炎-脑炎(arthritis-encephalitis)。
按照本发明，使用茶藨子属植物生产用于预防和/或治疗病毒感染的组合物。
茶藨子属是包括大约150种开花植物的属，其天然遍及北半球温带地区和中美洲和南美洲的山脉中。茶藨子属包括醋栗(currants)和鹅莓(gooseberries)。
本发明中特别感兴趣的是：
黑茶藨子(Ribes nigrum L.)(R.nigrum L.)
红茶藨子(Ribes rubrum L.)(R.rubrum L.)
黑茶藨子(R.nigrum L.)和红茶藨子(R.rubrum L.)含有不同浓度的类黄酮、萜类化合物和精油。例如，对于茶藨子属植物的叶和果实浓度可不同。因此，在下文中，叶和果实分别进行考虑。
科学术语“黑茶藨子叶(Ribes nigri folium(R.nigri folium))”是指黑茶藨子(R.nigrum L.)的叶，而术语“黑茶藨子果实(Ribes nigri fructus(R.nigrifructus))”是指黑茶藨子(R.nigrum L.)的果实。因此，红茶藨子叶(Ribes rubrifolium(R.rubri folium))是指红茶藨子(R.rubrum L.)的叶，红茶藨子果实(Ribes rubri fructus(R.rubri fructus))是指红茶藨子(R.rubrum L.)的果实。
类黄酮基本由两个芳香的和一个氧化的杂环组成。利用O-杂环上的结构差别，可将类黄酮分为下列六组：黄酮醇、黄烷醇、黄烷酮、黄酮、花色素苷和异类黄酮(isoflavanoid)。黑茶藨子(R.nigrum L.)中检测到一些成分是黄酮醇，诸如栎精和杨梅黄酮和它们的糖苷，以及原花色素的二聚物或低聚物。
黑茶藨子叶(R.nigri folium)包含痕量精油、黄酮醇苷(flavonolgylcoside)和原花色素(proanthocyanidine)。黑茶藨子果实(R.nigri fructus)含有花色素(anthocyanidins)和黄酮醇苷(flavonolglycosides)，特别是异槲皮素(isoquecitrin)，杨梅黄酮-D-吡喃葡萄糖苷(myricetin-D-glucopyranosid)和rutosin。黑茶藨子果实(R.nigri fructus)的其它成分是果酸，诸如柠檬酸、异柠檬酸和苹果酸，羟基肉桂酸(hydroxycinammic acid)衍生物，维生素C和种子中的γ-亚油酸。
红茶藨子叶(R.rubri folium)含有黄酮醇苷，诸如紫云英苷(astragalin)和异槲皮素，原花色素(porcyanidines)和儿茶素(catechin)衍生物。红茶藨子果实(R.rubri fructus)含有维生素C，果酸，果胶，原花色素和单宁。种子包含γ-亚油酸[Hager’s Handbuch der pharmazeutischen Praxis，Drogen P-Z，5.，neubearbeitete Auflage，Springer-Verlag，1993，Seite 466-474]。
按照本发明使用的组合物是从选自叶和桠枝的组的植物的至少一个气生部分生产的。优选地，使用在同一年中长回到原来状态的植物气生芽。通常，能够使用植物气生部分的所有元件，诸如叶、桠枝、花、果实和种子。优选地，使用带有叶和花的桠枝。
在另一个优选实施方案中，与上文或下文所列举的任何一个实施方案组合，来自于果实的提取物被加入到由叶和桠枝产生的组合物中。
可以在收获后对植物的所述部分(包括叶、桠枝和果实)进行干燥或直接挤压，意指处于自然状态，当合适时，在打碎后，从而由挤压产生汁。
在进一步的实施方案中，与上文或下文所列举的任何一个实施方案组合，所述植物部分在自然状态下经历使用溶剂的提取，诸如例如浸渍或渗滤。备选地，还可以对植物部分进行干燥和/或随后在提取前，以适当的方式打碎成小块，例如通过研磨或切断它们的方法。
在一个优选的实施方案中，与上文或下文所列举的任何一个实施方案组合，黑茶藨子叶(R.nigri folium)和/或红茶藨子叶(R.rubri folium)用于制备本发明的提取物。在另一个优选的实施方案中，与上文或下文所列举的任何一个实施方案组合，黑茶藨子叶(R.nigri folium)和黑茶藨子果实(R.nigri fructus)用于制备提取物。在进一步优选的实施方案中，与上文或下文所列举的任何一个实施方案组合，使用红茶藨子叶(R.rubri folium)和红茶藨子果实(R.rubri fructus)。在另一个优选实施方案中，与上文或下文所列举的任何一个实施方案组合，黑茶藨子叶(R.nigri folium)和红茶藨子果实(R.rubri fructus)用于制备提取物。在另一个优选实施方案中，与上文或下文所列举的任何一个实施方案组合，红茶藨子叶(R.rubri folium)和黑茶藨子果实(R.nigri fructus)用于制备提取物。
在一个实施方案中，与上文或下文所列举的任何一个实施方案组合，所述组合物处于来自茶藨子属植物的提取物形式。通常，进行利用合适溶剂对植物部分(包括叶、桠枝和果实)的提取。合适的溶剂是水，醇诸如甲醇、乙醇或异丙醇，或氯化了的溶剂诸如二氯甲烷，以及丙酮，乙酰丙酮，乙酸乙酯，氨水或冰醋酸，还有超临界的二氧化碳。也能够使用所提及的溶剂的混合物。在优选实施方案中，与上文或下文所列举的任何一个实施方案组合，使用水或水与甲醇或乙醇的混合物。
提取通常在25℃到当合适时，高至所用溶剂的沸点的温度下进行。优选的是在95-100℃下提取。
提取通常进行2至8小时。优选地，提取进行3至6小时，更优选地进行4至5小时。此外，脂肪诸如猪肉脂肪，蜡诸如蜂蜡，或油诸如橄榄油和杏仁油可以用于提取。优选地，使用杏仁油。
为了获得最高的可能产率，可以对植物材料提取许多次。优选地，提取重复2至6次，更优选地3次。在该情形中，还可能在不同的提取步骤中使用不同的溶剂，或者在利用溶剂提取后可以进行利用脂肪、蜡或油的提取，或反之亦然。
通过提取，获得液体、半固体或固体初级产物，它们可以该形式用来生产用于预防和/或治疗病毒感染的组合物。
浸渍过程通常在室温下，利用水和乙醇的混合物进行5-9天，优选地，7天，该过程是通过将所述溶剂混合物倒在植物元件上，并容许其静置所述的一段时间。
按照本发明，植物部分的渗滤通常通过将该部分在95-100℃下，利用水处理4-5小时获得的，该过程是通过引导水流过植物部分实现的。
在使用前，还可以浓缩和/或干燥和/或进一步处理获自利用溶剂提取，诸如浸渍或渗滤的粗制品。进一步的处理可以，例如，包括本领域技术人员已知的清洗步骤，诸如离心、过滤和倾析，从而从提取物中去除悬浮的物质。层析，诸如柱层析、气相层析或HPLC或蒸汽蒸馏也可以用于纯化。在优选实施方案中，在不进行进一步的纯化步骤的条件下，使用粗制品。
随后，可以将以该方法获得的提取物进一步处理为干燥的提取物。为了生产干燥的提取物，可以通过例如喷雾干燥、冷冻干燥或真空干燥，从液体初级提取物、浓缩的提取物或清洗的提取物中去除溶剂。
来自茶藨子属植物的组合物能够以上述各种形式用于预防和/或治疗病毒感染。
所述组合物优选地用于预防和/或治疗由鼻病毒、腺病毒或冠状病毒引起的普通感冒病。
在一个优选实施方案中，与上文或下文所列举的任何一个实施方案组合，黑茶藨子(R.nigrum L.)的提取物用于预防和/或治疗由鼻病毒导致的感冒病。特别地，所述提取物是黑茶藨子叶(R.nigri folium)的提取物。
在另一个优选实施方案中，与上文或下文所列举的任何一个实施方案组合，黑茶藨子(R.nigrum L.)的提取物用于预防和/或治疗由腺病毒导致的感冒病。特别地，所述提取物是黑茶藨子叶(R.nigri folium)的提取物。
在进一步优选的实施方案中，与上文或下文所列举的任何一个实施方案组合，黑茶藨子(R.nigrum L.)的提取物用于预防和/或治疗由冠状病毒导致的感冒病。更优选的，所述提取物是黑茶藨子叶(R.nigri folium)的提取物。
所描述的提取物进一步用于预防和/或治疗甲型和乙型流行性感冒。在一个优选实施方案中，与上文或下文所列举的任何一个实施方案组合，所述提取物适合用于预防和/或治疗禽流感。特别地，所述提取物可用于预防和/或治疗由亚型H7导致的禽流感。
优选地，黑茶藨子(R.nigrum L.)的提取物用于预防和/或治疗甲型和乙型流行性感冒，更优选地使用黑茶藨子叶(R.nigri folium)的提取物。
在另一个优选实施方案中，来自于茶藨子属植物的组合物可用于预防和/或治疗由处于上文描述的每一种形式的反转录病毒导致的病毒感染。所述组合物优选地用于预防和/或治疗由慢病毒(lentiviruses)，特别是HIV-1和/或HIV-2导致的病毒感染。
在进一步优选的实施方案中，与上文或下文所列举的任何一个实施方案组合，黑茶藨子(R.nigrum L.)的提取物用于预防和/或治疗由反转录病毒导致的病毒感染。特别地，所述提取物是黑茶藨子叶(R.nigri folium)的提取物。特别地，所述提取物可用于预防和/或治疗由HIV-1和/或HIV-2导致的病毒感染。
因此本发明所述的组合物能够作为药物施用。除治疗用途外，该组合物还适合于非-治疗性的预防和/或治疗普通感冒病。
所述组合物可以以关于医学和非-医学应用领域中技术人员所熟悉的各种应用方式应用，例如，作为片剂、包衣片剂、泡腾片剂、胶囊剂、粉剂、颗粒剂、糖衣片剂、软膏剂、霜剂、凝胶剂、溶液剂或喷雾剂。优选地，所述组合物作为鼻腔喷雾剂应用。
在植物制剂和其他应用形式中，可以用常规植物制剂辅助物，诸如片剂粘合剂、填充剂、防腐剂、片剂打开剂、流量调节剂、软化剂、润湿剂、分散剂、乳化剂、溶剂、阻滞剂、抗-氧化剂、稠度调节剂、渗透性促进剂和/或推进气体，处理所述组合物。
可以向按照本发明使用的组合物中加入其他成分，诸如维生素和矿物。
还能够，例如将该组合物添加到动物饲料或食料，诸如饮料中。以提取物的形式，该组合物本身还可以作为茶进行沏泡。然而，对于茶制备，将热水直接倒到所述植物部分，例如茶藨子属植物的叶上也是可能的。此外，所述组合物能够是食物添加剂的成分，在冬季月份中对其的摄取能够促进加强身体的防卫，并从而防止例如，病毒感染。
在进一步的实施方案中，与上文或下文列举的任何一个实施方案组合，所述组合物能够按照本发明作为溶液，特别是含漱液使用，从而预防和/或治疗普通感冒病，特别是口和咽中的炎症。
所述组合物还能够与其他植物的成分混合使用，在该情形中，所述成分优选地处于植物提取物的形式。优选地，使用具有相似或协同作用的植物或植物提取物的成分。实例是岩蔷薇属(genus Cistus)植物，尤其是灰毛岩蔷薇(Cistus incanus)。
处于应用形式的所述组合物的浓度依据应用的类型而变化。通常，对于固体应用形式，组合物的量总计0.5-1,000mg/剂量单位。优选地，组合物的量总计1-500mg/单位。在液体应用形式中，组合物可以处于1μg/ml-100mg/ml的浓度，优选地，25μg/ml-50mg/ml。在半固体应用形式的情形中，组合物的含量总计1-90重量％，优选地5-75重量％。
在优选的实施方案中，与上文或下文列举的任何一个实施方案组合，该组合物以片剂的形式施用。在该情形中，优选地所述组合物处于提取物形式。最特别优选地，所述组合物处于干燥提取物的形式。
在进一步优选的实施方案中，与上文或下文列举的任何一个实施方案组合，为了局部的应用，以乳剂、软膏剂、凝胶或霜剂的形式施用所述组合物。在该情形中，所述组合物优选地以提取物的形式来使用，其中通过利用脂肪、蜡或油的提取方法从植物中抽出活性物质。此外优选地，进一步将该提取物处理为干燥的提取物，随后将其与脂肪、蜡或油混合或溶解于脂肪、蜡或油中。
在优选的实施方案中，与上文或下文列举的任何一个实施方案组合，所述组合物处于气溶胶或房间喷雾剂形式。优选地，为此使用茶藨子属的液体或固体提取物。除提取物外，气溶胶或房间喷雾剂还能包含药物无害物质、载体介质和助剂。气溶胶或房间喷雾剂能够用于消毒病毒接触到的或能够潜在接触到的物体和房间，特别是，在其中运送人、动物和/或食料的所有类型的交通工具。例如，可以在起飞前，用本发明所述的气溶胶或用按照本发明的房间喷雾剂喷洒飞机，从而防止病毒的传播，并且从而最小化人群感染的风险。所述气溶胶或房间喷雾剂还可以在人群面前，例如在等候室中喷洒，因为它无论如何不在人群中引起任何毒性作用。
在进一步优选的实施方案中，与上文或下文列举的任何一个实施方案组合，所述组合物还能够作为鼻试剂或作为吸入溶液施用。所述鼻试剂能够作为鼻喷雾或作为鼻凝胶使用。为了施药，可以使用多种施药器和分散系统。
按照本发明的茶藨子属用途不仅限于人，而是对动物，特别是哺乳动物诸如宠物或家畜也是可能的。
下列实施例解释本发明。
测试了茶藨子属提取物的细胞毒性和细胞生存能力，及其针对鼻病毒的抗病毒活性，针对甲型和乙型流行性感冒的抗病毒活性和针对HIV的抗病毒活性。
在测试针对鼻病毒的抗病毒活性的情形中，人类鼻病毒14型用作病毒分离群。
在测试针对流行性感冒的抗病毒活性的情形中，甲型流行性感冒病毒A/布拉迪斯拉发(Bratislava)/79(H7N7)(FPV)(禽类)，甲型流行性感冒病毒A/野鸭(Mallard)/巴伐利亚(Bavarian)/1/2006(H5N1)(禽类)以及甲型流行性感冒病毒A/波多黎各(Puerto-Rico)/8/34(H1N1)(PR8)(人)用作病毒分离群。Madin-Darby犬肾(Madin-Darby canine kidney(MDCK))细胞和A549细胞用作宿主细胞系。
为了确定提取物的特征，使用了下列检查方法。
另外，确定了提取物的毒物浓度。
MDCK II犬肾上皮细胞用不同浓度的提取物(95至950μg/ml)处理30分钟。然后，用同样浓度的提取物处理细胞48小时。
细胞病理学效应(CPE)的检查
在第一试验中，MDCK II犬肾上皮细胞用流行性感冒病毒株甲型流行性感冒病毒A/野鸭(Mallard)/巴伐利亚(Bavarian)/1/2006(H5N1)和A/FPV/布拉迪斯拉发(Bratislava)/79(H7N7)感染。受感染的细胞随后用不同浓度的提取物(95，190，285，380，475，570，665，760，855和950μg/ml)处理。
在第二试验中，细胞用不同浓度的提取物(95至950μg/ml)预处理30分钟，随后用流行性感冒病毒株甲型流行性感冒病毒A/野鸭(Mallard)/巴伐利亚(Bavarian)/1/2006(H5N1)和A/FPV/布拉迪斯拉发(Bratislava)/79(H7N7)感染。受感染的细胞随后用不同浓度的提取物(95，190，285，380，475，570，665，760，855和950μg/ml)处理。
在第三试验中，含有病毒的感染溶液用不同浓度的提取物(95至950μg/ml)预处理30分钟。细胞用不同浓度的提取物(95至950μg/ml)预处理30分钟，随后用预处理的流行性感冒病毒株甲型流行性感冒病毒A/野鸭(Mallard)/巴伐利亚(Bavarian)/1/2006(H5N1)和A/FPV/布拉迪斯拉发(Bratislava)/79(H7N7)感染。受感染的细胞随后用不同浓度的提取物(95，190，285，380，475，570，665，760，855和950μg/ml)处理。
确定CPE的50％的抑制的有效浓度(EC50)。
实施例
制备来自黑茶藨子(Ribes nigrum L.)的提取物
将桠枝和叶用于提取。将植物材料在室温下在室外阴凉处干燥，直到降至最多10％的残留水含量。随后，将植物部分切成≤8mm的大小。
将切割的植物部分在95-100℃用10倍量的纯水欧洲药典(Ph.Eur.)进行渗滤4-5小时。通过平板蒸发器，将得到的溶液在75-80℃的蒸汽温度下浓缩到初始体积的18-19％。干物质的含量总计约45％。
使用带有搅动器的蒸发器，通过将所述提取物在减压(0.6巴(bar))下在110-114℃加热4小时的方式，而将干物质含量增加到50-51％。
最后，在16毫巴(mbar)使用递减的温度梯度(140℃，120℃，90℃，20℃)进行真空传送干燥(vacuum belt drying)。干物质的含量总计＞92％，干燥的提取物总产率为22-25％。然后将提取物碾碎。然后从这一提取物制备上文所述的储液。
50％的MDCK II细胞死亡的浓度(TC50)是8512±11,40μg/ml。
因此得出结论，所述提取物是无毒的。
抗病毒活性的检查
人流行性感冒病毒
为了研究抗病毒活性，A549肺上皮细胞用50μg/ml的提取物预处理30分钟，随后用已经用50μg/ml的提取物预处理30分钟的流行性感冒病毒株A/PR8/34(H1N1)感染。感染后，细胞用50μg/ml的提取物再次处理30分钟。分离培养基上清液并在噬菌斑测定中研究新形成的流行性感冒病毒。
结果显示于图1中。
从图1中可知，观察到大于一个数量级的病毒滴度的降低。
在宿主细胞系中观察到对不同流行性感冒病毒的病毒繁殖的强烈的抑制效应。
禽流行性感冒病毒诱导的细胞病理学效应(CPE)的检查
第一试验(后处理细胞)显示提取物的EC50值对于甲型流行性感冒病毒A/FPV/布拉迪斯拉发(Bratislava)/79(H7N7)为390,93±85,5μg/ml，对于甲型流行性感冒病毒A/野鸭(Mallard)/巴伐利亚(Bavarian)/1/2006(H5N1)为165,3±8,55μg/ml。
第二试验(预处理和后处理细胞)显示提取物的EC50值对于甲型流行性感冒病毒A/FPV/布拉迪斯拉发(Bratislava)/79(H7N7)为278,35±48,45μg/ml，对于甲型流行性感冒病毒A/野鸭(Mallard)/巴伐利亚(Bavarian)/1/2006(H5N1)为83,6±2,85μg/ml。
第三试验(预处理和后处理细胞并且另外预处理病毒溶液)显示提取物的EC50值对于甲型流行性感冒病毒A/FPV/布拉迪斯拉发(Bratislava)/79(H7N7)为46,55±6,65μg/ml，对于甲型流行性感冒病毒A/野鸭(Mallard)/巴伐利亚(Bavarian)/1/2006(H5N1)为13,3±1,9μg/ml。
另外，没有观察到甲型流行性感冒病毒的神经氨酸酶的抑制。
因此，可见茶藨子属提取物能够抑制由高致病性禽流行性感冒病毒导致的感染。在所用的浓度，提取物对细胞没有任何可检测的损伤影响。这证明茶藨子属提取物对流行感冒的传染性的抑制效应。
鼻病毒培养
用人类鼻病毒14型(HRV)接种4个具有80％汇合的HeLa细胞的T175培养瓶，并在33℃培养一周。为此，在16ml感染培养基(DMEM(Dulbecco′sModified Eagle Medium)，2％FCS(胎牛血清)，10-20mM MgCl2)中混合50μlHRV14(病毒滴度108/ml TCID(组织培养感染剂量))，并将4ml加入到每个T175中。然后向每个T175中填入10ml感染培养基，因此每个T175中有14ml感染培养基。一旦溶解了70％的贴壁细胞，就收获病毒。
鼻病毒的纯化
首先以3,000rpm离心病毒上清液30分钟，从而去除细胞沉淀。在超速离心机中，在蔗糖缓冲物(cushions)(1.5ml处于水中的蔗糖65％，300μl10xPBS(磷酸盐缓冲盐水)，1.2ml水)上，以35,000rpm(转子类型SW41 Ti，在贝克曼(Beckman)异质同晶聚合物管中)，4℃，离心病毒上清液3小时，并将沉淀引入到100μl感染培养基中。用100kDa截留值的过滤器(Centricon YM 100)在3,300rpm，4℃，进行进一步的病毒浓缩1小时。保留物含有纯化的病毒浓缩物；丢弃滤出液。
为了检测茶藨子属提取物对HRV14传染性的效应，将茶藨子属提取物加入到感染培养基中，或者用茶藨子属提取物额外预处理病毒。
在结果中可见茶藨子属提取物能够防止感染和由此在感染培养基中和在进行的所有批次中病毒的额外预处理后防止细胞层的破坏。茶藨子属提取物对细胞没有任何可检测到的损害影响。这证明了茶藨子属提取物对鼻病毒传染性的抑制效应。
在HeLa-P4测定中体外测试物质的抗病毒活性
测定原理
HeLa-P4细胞(来自于NIH AIDS研究和参照规划(NIH AIDS Researchand Reference Program))是这样的细胞系，其已经被人CD4-和CCR5受体的基因转染并且其因此可用HIV-1感染(CXCR4-受体在该细胞上表达)。为了定量HIV感染，该细胞携带报道基因，即β-半乳糖苷酶基因，其在HIV-1启动子的控制下。感染后，HIV-1的Tat-蛋白反式激活报道基因，感染的程度可通过测量细胞裂解物中的酶活性来定量。关于没有物质添加的病毒感染，HIV-1感染的抑制导致更低的β-半乳糖苷酶活性。背景通过测量没有向其添加病毒的细胞中的酶活性来定义。由于原则上更低感染也可能是基于物质对细胞的毒性效应，所以除了所述测定以外，也进行了细胞毒性测定。
实验
测试物质如下制备：添加1mg的每种样品在Eppendorf管中，在涡旋下于60℃在1ml的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中溶解该样品。溶液在无菌条件下过滤并置于新的Eppendorf管中。作为阳性对照，使用T20-肽(已知的HIV-1进入抑制剂；Enfuvirtide)。制备测试化合物和T20在细胞培养基中的稀释系列，其中样品具有浓度78，15.6，7.8，3.9，0.8，0.4μg/ml，阳性对照T20以浓度39，19.5，3.9，1.95，0.78，0.39，0.039nM使用。每种物质的浓度进行三次重复测试。
第1天：在96-孔微量滴定板中每孔100μl培养基(DMEM，10％FCS，2％L-谷氨酰胺，1％青霉素/链霉素，500μg/ml geniticin，1μg/ml嘌呤霉素(puromycin))中铺板1.5x 104HeLa-P4细胞，在37℃温育过夜。
第2天：在L3实验室，78μl的每种物质的稀释物(78，15.6，7.8，3.9，0.8，0.4μg/ml)与22μl的HIV-1 Lai病毒在37℃预温育30分钟，T20稀释物(39，19.5，3.9，1.95，0.78，0.39，0.039nM)以相同方式处理。培养基从HeLa-P4细胞中去除，细胞用100μl的PBS洗涤，将物质-病毒混合物添加到细胞中。细胞在37℃温育2h，其后去除上清液，用PBS洗涤，添加100μl的新鲜培养基，细胞在37℃温育2天。
第4天：去除上清液，细胞用100μl的PBS洗涤，在每孔50μl的裂解缓冲液(2.5ml甘油；1.25ml MES-Tris，25μl 1M DTT，250μl Triton X100，H2O加至(ad)25ml)中冰上裂解10分钟并在-80℃移出。为从L3实验室移出，板外部用Biguanid喷洒。在白色微量滴定板中，34μl的反应缓冲液(15μl 1M MgCl2，3ml 0.5M NaH2PO4/Na2HPO4，150μl Galacton 100x，加至15ml H2O)放入每孔中并添加20μl的细胞裂解液。微量滴定板在暗中振荡45至60分钟，然后，在添加每孔25μl的增强剂(80μl 10M NaOH，400μl 10x Emerald(Applied Biosystems(应用生物系统))，加至4ml H2O)后，在光度计(Lumistar Galaxy，BMG Labtechnologies(BMG实验室技术)，Offenburg(奥芬堡)；settings(设置)：microplate(微板)：Dynatech 96，numberof intervals(间隔数)：50，measurement interval time(测量间隔时间)：0.2秒，positioning delay(定位延迟)：0.5秒，total measurement time/well(总测量时间/孔)：10秒，gain(增益)：250，start interval(起始间隔)：1，stop interval(终止间隔)：50)上测量酶活性。
细胞毒性测试
测定原理
细胞毒性测定根据对细胞的毒性效应分析物质。
HeLa-P4细胞用于细胞毒性测定。使用可商购试剂盒(ViaLightPlus试剂盒，Lonza(龙沙)，Rockland(罗克兰)，美国)。试剂盒的原理是基于测量代谢活性(即活的)细胞的细胞质中ATP的量。细胞生存能力的任何干扰导致ATP的量降低。ATP的量通过生物发光测量来确定，其中光通过来自于ATP的酶荧光素酶和底物荧光素在氧存在下形成。发光强度与ATP浓度成比例，并在光度计(Lumistar Galaxy，BMG Labtechnologies(BMG实验室技术)，Offenburg(奥芬堡))上确定。
实验
测试物质根据在HeLa-P4测定中体外测试抗病毒活性如上文所述进行制备。每种物质的浓度重复四次测试。
第1天：在96-孔微量滴定板中每孔100μl培养基(DMEM，10％FCS，2％L-谷氨酰胺，1％青霉素/链霉素，500μg/ml geniticin，1μg/ml嘌呤霉素)中铺板1.5x 104HeLa-P4细胞，在37℃温育过夜。
第2天：去除培养基并用100μl的PBS洗涤细胞。78μl的每种物质稀释物(78，15.6，7.8，3.9，0.8，0.4μg/ml)和22μl的培养基置于96-孔微量滴定板的每个孔中，并在37℃温育2h，T20稀释物(39，19.5，3.9，1.95，0.78，0.39，0.039nM)以相同的方式处理，细胞在37℃温育2天。
第4天：细胞从保温箱中取出，在室温放置10min。去除上清液，细胞用每孔150μl的培养基洗涤三次，在50μl的裂解缓冲液(2.5ml甘油；1.25ml MES-Tris，25μl 1M DTT，250μl Triton X100，H2O加至25ml)中裂解。板在室温放置10分钟。
在白色微量滴定板中，每孔中放置100μl的AMR-Plus试剂并且添加40μl的细胞裂解液(无气泡)。微量滴定板在室温温育2分钟，然后在光度计(Lumistar Galaxy，BMG Labtechnologies(BMG实验室技术)，Offenburg(奥芬堡)；settings(设置)：microplate(微板)：Dynatech 96，number of intervals(间隔数)：40，measurement interval time(测量间隔时间)：0.25秒，positioningdelay(定位延迟)：0.5秒，total measurement time/well(总测量时间/孔)：10秒，gain(增益)：190，start interval(起始间隔)：1，stop interval(终止间隔)：40，testtype(测试类型)：well mode(孔模式)，reading direction(读数方向)：horizontal(水平))上测量。
在结果中可见茶藨子属提取物能够抑制由HIV导致的感染。在所用的浓度，提取物对细胞没有任何可检测到的损害影响。这证明了茶藨子属提取物对HIV传染性的抑制效应。

Claims (16)

1.用于预防和/或治疗病毒感染的组合物，其中所述组合物包含来自于黑茶藨子(Ribes nigrum L.)或红茶藨子(Ribes rubrum L.)的至少一个气生部分的提取物，其中所述气生部分选自由叶和桠枝组成的组，并且所述提取物是水提取物或醇提取物。
2.根据权利要求1的组合物，其中所述病毒感染是由鼻病毒导致的原发感染。
3.根据权利要求2的组合物，其用于治疗头伤风。
4.根据权利要求1的组合物，其中所述病毒感染包括流行性感冒。
5.根据权利要求4的组合物，其中所述流行性感冒是禽流感。
6.根据权利要求1的组合物，其中所述病毒感染是由HIV-1或HIV-2导致的。
7.根据权利要求1至6中任一项的组合物，其中所述组合物还包含黑茶藨子(Ribes nigrum L.)或红茶藨子(Ribes rubrum L.)果实的提取物，其中所述果实的提取物是水提取物或醇提取物。
8.根据权利要求1至6中任一项的组合物，其中所述组合物处于液体、干燥或半固体形式。
9.根据权利要求1至6中任一项的组合物，其中所述提取物是水提取物。
10.根据权利要求1至6中任一项的组合物，其中所述提取物是醇提取物。
11.根据权利要求1至6中任一项的组合物，其中所述组合物口服、鼻内或局部施用。
12.根据权利要求1至6中任一项的组合物，其中所述组合物作为鼻试剂、吸入混合物、气溶胶或房间喷雾剂存在。
13.根据权利要求1至6中任一项的组合物，其中所述组合物处于片剂、胶囊剂、粉剂、颗粒剂、软膏剂、凝胶剂、霜剂、含漱液或植物汁的形式。
14.根据权利要求13的组合物，其中所述片剂是包衣片剂或泡腾片剂。
15.根据权利要求13的组合物，其中所述片剂是糖衣片剂。
16.来自于黑茶藨子(Ribes nigrum L.)或红茶藨子(Ribes rubrum L.)的至少一个气生部分的提取物在制备用于预防和/或治疗病毒感染的药物中的用途，其中所述气生部分选自由叶和桠枝组成的组，并且其中所述提取物是水提取物或醇提取物，并且所述病毒感染选自由鼻病毒导致的原发感染、流行性感冒、禽流感和由HIV-1或HIV-2导致的感染。
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