JP6336249B2 - ウイルス不活化剤、並びに、ウイルス不活化方法 - Google Patents
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Description
ここで「抗菌」には、細菌の可逆的な増殖抑制と不可逆的な増殖抑制(すなわち殺菌)の両方が含まれる。
例えば、カシス果実の搾りカスの溶媒抽出物から、粉末状のカシス果実の抽出物を得ることができる。例えば、カシス果実の搾りカスをエタノール等の溶媒で抽出し、溶媒抽出液を得る。この溶媒抽出液を濃縮した後、凍結乾燥することにより、固体形状のカシス果実の抽出物を得ることができる。また、この固形物を粉砕することにより、粉末状のカシス果実の抽出物を得ることができる。
例を挙げると、エンベロープを有さないRNAウイルス(カリシウイルス等)を対象とする場合には、カシス果皮のエタノール抽出乾燥物(アントシアニン10%含有)を100μg/mL以上、より好ましくは250μg/mL以上、さらに好ましくは1mg/mL含有するよう調製することができる。カシス果実の圧搾液濃縮物(6倍濃縮)であれば、12.5mg/mL以上、好ましくは25mg/mL以上含有するよう調製することができる。
エンベロープを有さないDNAウイルス(アデノウイルス等)を対象とする場合には、カシス果皮のエタノール抽出乾燥物(アントシアニン10%含有)を6.25mg/mL以上、好ましくは12.5mg/mL以上、より好ましくは25mg/mL以上含有するよう調製することができる。
液体状の場合における溶媒としては水が代表的であるが、他の溶媒、例えばエタノールやイソプロパノール等のアルコールであってもよい。例えば、これらの溶媒にカシス果実の抽出物を溶解あるいは分散させて、本発明の抗ウイルス剤・抗菌剤とすることができる。
好ましい実施形態では、カリシウイルス、口蹄疫ウイルス、及びアデノウイルスからなる群より選ばれた少なくとも1種を処理対象とする。
(a)「ドライカシスパウダー」(品番D0002):
カシス果実そのものを冷凍乾燥にし、それを粉末化した固形物
(b)「カシス濃縮果汁」(品番N10031):
カシス果実そのものを圧縮しそこから得られたカシス果汁の液体から水分を取り除き6倍濃縮して得られる液状物質
(c)「カシス搾りカス」(品番S0001):
カシス果実そのものを圧縮し水分を取り除いた果皮と種を乾燥し、それを粉末化した固形物
(d)「カシスアントシアニンパウダー10%」(品番A10010):
カシス果皮からエタノール抽出により得られた液状物質を乾燥し粉末化した10%のアントシアニン量を含む固形物
(e)「アントシアニンパウダー」(品番A0028):
カシス果皮からエタノール抽出により得られた液状物質を乾燥し粉末化した29.8%のアントシアニン量を含む固形物
(f)「アントシアニンエクストラクトパウダー」(品番A0057):
カシス果皮からエタノール抽出により得られた液状物質を乾燥し粉末化した58.3%のアントシアニン量を含む固形物
本実施例では、カシス抽出物のネコカリシウイルスに対する効果を調べた。
(1)カシス抽出物試料
(d)「カシスアントシアニンパウダー10%」(品番A10010)
(b)「カシス濃縮果汁」(品番N10031)
ネコカリシウイルスF9株を用いた。このウイルスをネコ腎臓株化細胞であるCRFK細胞に接種し、37℃で48時間培養し、十分に細胞変性効果(CPE)が認められたことを確認した上で、凍結融解を3回行った。その後、培養上清を遠心し、その上清をウイルス液とした。得られたウイルス液について50%組織培養感染価(TCID50)を算出後、試験に用いた。
CRFK細胞を用いた。
各カシス抽出物サンプルについて、濃度が0.2g/mLとなるようにリン酸緩衝生理食塩水(PBS)にて懸濁した。2時間静置後、2000rpmで1分間遠心処理を行った。遠心上清を500μL採取し、1.5mL容チューブに移した。
一方、ウイルス液を、約107.0TCID50/mLとなるようにPBSにて調整した。
1.5mL容チューブ内のサンプル(遠心上清)に等量のウイルス液を加えて撹拌し、氷上で10分間反応させた(以下、「反応液」と称する。)。反応液の一部をPBSにて10倍階段希釈し、96穴プレートで培養するCRFK細胞に、1穴あたり25μLずつ4穴に接種した。37℃で1時間吸着させた後、反応液を除去し、1%牛胎児血清含DMEM培地を1穴あたり100μLずつ分注した。37℃で2〜3日間培養した後、CPEの有無により、感染性ウイルスの有無を判定した。(試験1−1)
濃度0.2g/mLのサンプルを用いた結果を表1に示す。表1中、「+」は試験に用いた107.0TCID50/mLのウイルスが検出限界以下になったことを示し、「−」は感染性ウイルスが検出されたことを示し、「ND」は、細胞が傷害されたためウイルスを検出できなかったことを示す。
原液および10倍希釈した反応液を接種した細胞は、細胞傷害性が認められ細胞が死滅したため、ウイルス感染によるCPEを観察できず、ウイルスの不活化は判定できなかった。しかし、100倍希釈した反応液では細胞傷害性は認められず、ウイルスの不活化が認められた(表1)。また「カシスアントシアニンパウダー10%」は、ネコカリシウイルスの感染価を約10の7乗分の1以下に減少させた。
原液の反応液を接種した細胞は、細胞傷害性が認められたため、ウイルス感染によるCPEを観察できず、ウイルスの不活化は判定できなかった。しかし、10倍および100倍希釈反応液では細胞傷害性は認められず、ウイルスの不活化が認められた(表1)。また「カシス濃縮果汁」は、ネコカリシウイルスの感染価を約10の3乗分の1以下に減少させた。
濃度0.2g/mLにおける試験により、「カシスアントシアニンパウダー10%」と「カシス濃縮果汁」について抗ネコカリシウイルス効果が認められたことから、より低濃度の試験サンプルによる抗ウイルス効果を調べた。反応液原液を用いた試験結果を表2に、10倍希釈反応液を用いた試験結果を表3に、それぞれ示す。表2,3中、「+」は試験に用いた107.0TCID50/mLのウイルスが検出限界以下になったことを示し、「−」は感染性ウイルスが検出されたことを示す。空欄は試験を行わなかったことを示す。「ND」は細胞が傷害されたためウイルスを検出できなかったことを示す。
原液を用いた試験では、少なくとも1mg/mL以上でウイルスの不活化が認められた(表2)。10倍希釈反応液を用いた試験では、少なくとも250μg/mL以上でウイルスの不活化が認められた(表3)。10倍希釈反応液を用いた試験から、ウイルスを検出限界以下にする「カシスアントシアニンパウダー10%」の最低濃度は、250μg/mLと算出された。
10倍希釈反応液を用いた試験では、少なくとも25mg/mL以上でウイルスの不活化が認められた(表3)。原液を用いた試験では、細胞障害性が認められたためウイルスの不活化を検出できなかった(表2)。10倍希釈反応液を用いた試験から、ウイルスを検出限界以下にする「カシス濃縮果汁」の最低濃度は、25mg/mLと算出された。
本実施例では、カシス抽出物のアデノウイルスに対する効果を調べた。
(d)「カシスアントシアニンパウダー10%」(品番A10010)
(b)「カシス濃縮果汁」(品番N10031)
ヒトアデノウイルス3型G.B.株(ATCC)を用いた。このウイルスをヒト子宮頚癌由来株化細胞であるHeLa細胞に接種し、37℃で3〜5日間培養し、十分に細胞変性効果(CPE)が認められたことを確認した上で、凍結融解を3回行った。その後、培養上清を遠心し、その上清をウイルス液とした。得られたウイルス液について50%組織培養感染価(TCID50)を算出後、試験に用いた。
ヒト胎児腎細胞HEK−293細胞を用いた。
各カシス抽出物サンプルについて、濃度が0.2g/mLとなるようにリン酸緩衝生理食塩水(PBS)にて懸濁した。2時間静置後、2000rpmで1分間遠心処理を行った。遠心上清を500μL採取し、1.5mL容チューブに移した。
一方、ウイルス液を、約8×106.0TCID50/mLとなるようにPBSにて調整した。
1.5mL容チューブ内のサンプル(遠心上清)に等量のウイルス液を加えて撹拌し、氷上で10分間反応させた(以下、「反応液」と称する。)。96穴プレートにあらかじめMEM培地を1穴あたり25μLずつ入れ、10%牛胎児血清含MEMで懸濁したHEK−293細胞液を1穴あたり50μLずつ入れた。さらに、反応液の一部をPBSにて10倍階段希釈し、1穴あたり25μLずつ4穴に接種した。37℃で11〜13日間培養した後、CPEの有無により、感染性ウイルスの有無を判定した。(試験2−1)
濃度0.2/mLのサンプルを用いた結果を表4に示す。表4中、「+」は試験に用いた107.0TCID50/mLのウイルスが検出限界以下になったことを示し、「−」は感染性ウイルスが検出されたことを示し、「ND」は、細胞が傷害されたためウイルスを検出できなかったことを示す。
原液および10倍希釈した反応液を接種した細胞は、細胞傷害性が認められ細胞が死滅したため、ウイルス感染によるCPEを観察できず、ウイルスの不活化は判定できなかった。しかし、100倍希釈した反応液では細胞傷害性は認められず、ウイルスの不活化が認められた(表4)。また「カシスアントシアニンパウダー10%」は、ヒトアデノウイルスの感染価を約10の4乗分の1以下に減少させた。
原液の反応液を接種した細胞は、細胞傷害性が認められたため、ウイルス感染によるCPEを観察できず、ウイルスの不活化は判定できなかった。また10倍および100倍希釈反応液において、ウイルスの不活化は認められなかった(表4)。
(1)「カシスアントシアニンパウダー10%」による抗ウイルス効果
濃度0.2g/mLにおける試験により、「カシスアントシアニンパウダー10%」について抗ヒトアデノウイルス効果が認められた(表4)ことから、より低濃度の試験サンプルによる抗ウイルス効果を調べた。反応液原液、10倍希釈反応液、及び100倍希釈反応液について試験を行った結果、100倍希釈反応液を用いた場合に抗ウイルス効果が認められた。100倍希釈反応液を用いた場合の試験結果を表5に示す。表5中、「+」は試験に用いた8×106.0TCID50/mLのヒトアデノウイルスによる細胞変性効果が50%以下になったことを示す。「−」は試験に用いた8×106.0TCID50/mLのヒトアデノウイルスによる細胞変性効果が50%以上になったことを示す。「ND」は細胞が傷害されたためウイルスを検出できなかったことを示す。
すなわち、100倍希釈反応液を用いた試験では、少なくとも25mg/mL以上でウイルスの不活化が認められた。このことから、ウイルスを検出限界以下にする「カシスアントシアニンパウダー10%」の最低濃度は、25mg/mLと算出された。
本実施例では、カシス抽出物の緑膿菌及び黄色ブドウ球菌に対する効果を調べた。
(1)カシス抽出物
(d)「カシスアントシアニンパウダー10%」(品番A10010)
(b)「カシス濃縮果汁」(品番N10031)
緑膿菌としてPseudomonas aeruginosa ATCC 27853株を用いた。黄色ブドウ球菌としてStaphylococcus aureus ATCC29213株を用いた。凍結保存された菌株をLB寒天平板培地またはMueller-Hinton寒天培地に接種し、37℃で一晩培養した。PBS2mLに菌体を0.5 McFarland(およそ108CFU/mL)相当に懸濁した。懸濁液をPBSで100倍希釈し、試験に供した。
「カシスアントシアニンパウダー10%」を、濃度が200mg/mL〜25mg/mLとなるようにPBSにて懸濁した。2時間静置後、2000rpmで1分間遠心処理を行った。遠心上清を300μL採取し、1.5mL容チューブに移した。「カシス濃縮果汁」は、原液もしくは2〜10倍希釈したものを300μL採取し、1.5mL容チューブに移した。陰性コントロールとして、PBSのみを300μLを1.5mL容チューブに移した。
1.5mL容チューブ内のサンプルに等量の菌液(菌懸濁液の100倍希釈液)を加えて撹拌し、氷上で10分間、1時間、6時間、又は24時間反応させた(以下、「反応液」と称する。)。反応液を10倍希釈し、希釈した反応液を100μLずつ、2枚のMueller-Hinton培地に接種した。接種菌数を確認するため、供試菌液を10、102、103、及び104希釈し、希釈した菌液を10μLずつMueller-Hinton培地に接種した。37℃で一晩培養した後、菌の発育の有無を確認し、コロニー数を計測した。
表6に、「アントシアニンパウダー10%」の緑膿菌に対する効果を調べた実験結果を示す。表7に、「アントシアニンパウダー10%」の黄色ブドウ球菌に対する効果を調べた実験結果を示す。表8に、「カシス濃縮果汁」の緑膿菌に対する効果を調べた実験結果を示す。表9に、「カシス濃縮果汁」の黄色ブドウ球菌に対する効果を調べた実験結果を示す。表6〜9中、「+」の数はコロニー数の多寡を表す。NDは試験を行わなかったことを表す。接種菌数はMueller-Hinton寒天培地に塗布した際の菌数である。
表6に示すように、緑膿菌については、濃度200mg/mL(反応時の濃度;100mg/mL)の試験サンプルと6時間反応させた際、コロニー数が1/100〜1/1000以下に減少し、24時間では菌の発育が認められなかった。濃度100mg/mL(反応時の濃度;50mg/mL)では、6時間後にコロニー数の減少が認められ、24時間後には菌の発育を阻止した。濃度50mg/mL(反応時の濃度25mg/mL)では、24時間後にコロニー数の減少を認めた。
表8に示すように、緑膿菌については、試験サンプルの原液(反応時の濃度;50%)では、10分間の反応でコロニー数が減少し、1時間後にはコロニー数が1/100以下となり、4回の試験のうち3回は、菌が発育しなかった。2倍希釈液(反応時の濃度;25%)では、10分後からコロニー数の減少が認められ、4倍希釈液(反応時の濃度;12.5%)では、1時間後にコロニー数の減少が認められた。6時間後には試験したすべての濃度において、菌の発育を阻止した。
本実施例では、カシス抽出物の鳥インフルエンザウイルスに対する効果を調べた。
(1)カシス抽出物試料
(a)「ドライカシスパウダー」(品番D0002)
(b)「カシス濃縮果汁」(品番N10031)
(c)「カシス搾りカス」(品番S0001)
(d)「カシスアントシアニンパウダー10%」(品番A10010)
(e)「アントシアニンパウダー」(品番A0028)
(f)「アントシアニンエクストラクトパウダー」(品番A0057)
鳥インフルエンザウイルスA/whistling swan/Shimane/499/83 (H5N3) 株を用いた。これは、1983年に大槻らが、島根県に飛来したコハクチョウの糞便から分離した低病原性鳥インフルエンザウイルスである(Research in Veterinary Science, 1987, 43, pp. 177-179、及びActa. Virol., 28:534, 1987)。本ウイルス株についてはヒナで継代することにより、強毒化させることに成功している。このウイルスを10日齢の発育鶏卵の尿膜腔内に接種し35℃で48時間培養した後、尿液を採取し、ウイルス液とした。本試験に供したウイルスは、50%鶏卵感染価(EID50)を算出後、試験に用いた。
10日齢のSPF発育鶏卵を用いた。栃木県那須市の青木種鶏場から有精卵を導入し、京都産業大学鳥インフルエンザ研究センターにおいて孵卵させ、10日齢に達した時点で試験に供した。
各カシス抽出物サンプルについて、濃度が0.2g/mLとなるようにPBSにて懸濁した。2時間静置後、2000rpmで1分間遠心処理を行った。遠心上清を500μL採取し、1.5mL容チューブに移した。
一方、ウイルス液を、約107.0EID50/0.2mLとなるようにPBSにて調整した。
1.5mL容チューブ内のサンプル(遠心上清)に等量のウイルス液を加えて撹拌し、氷上で10分間反応させた(以下、「反応液」と称する。)。反応液を0.2mLずつ、3個の10日齢発育鶏卵の尿膜腔内に接種した。35℃で48時間培養した後、発育鶏卵の尿液を採取し、0.5%鶏赤血球浮遊液と反応させ、赤血球の凝集によりウイルス増殖の有無を判定した。残存ウイルス感染価はReed and Muench の方法によりEID50を算出した。(試験4−1)
(a)「ドライカシスパウダー」、(b)「カシス濃縮果汁」、及び(c)「カシス搾りカス」を用いた場合には、感染性ウイルスが検出された。一方、(d)「カシスアントシアニンパウダー10%」、(e)「アントシアニンパウダー」、(f)「アントシアニンエクストラクトパウダー」を用いた場合には、107.0EID50/0.2mLのウイルスが検出限界以下となった。このように、(d)「カシスアントシアニンパウダー10%」、(e)「アントシアニンパウダー」、(f)「アントシアニンエクストラクトパウダー」について、抗ウイルス効果が認められた。
抗ウイルス効果が認められた(d)「カシスアントシアニンパウダー10%」、(e)「アントシアニンパウダー」、(f)「アントシアニンエクストラクトパウダー」について、より低濃度における抗ウイルス効果を調べた。結果を表10に示す。表10中、「+」は試験に用いた107.0EID50/0.2mLのウイルスが検出限界以下になったことを示し、「−」は感染性ウイルスが検出されたことを示す。空欄は試験を行わなかったことを示す。
すなわち、(d)「カシスアントシアニンパウダー10%」の場合には、50mg/mL以上でウイルスが検出限界以下となった。また(e)「アントシアニンパウダー」の場合には、25mg/mL以上でウイルスが検出限界以下となった。また(f)「アントシアニンエクストラクトパウダー」の場合には、50mg/mL以上でウイルスが検出限界以下となった。
Claims (6)
- 消毒剤として使用され、カシス果実の抽出物を有効成分として含有することを特徴とするカリシウイルスに対するウイルス不活化剤。
- 前記カリシウイルスは、ネコカリシウイルスであることを特徴とする請求項1に記載のウイルス不活化剤。
- ウイルスを不活化すべき対象物又は対象場所に散布、噴霧、又は塗布するか、ウイルスを不活化すべき対象物を浸漬するか、ウイルスを不活化すべき対象物に配合して使用されることを特徴とする請求項1又は2に記載のウイルス不活化剤。
- ヒト以外の対象物又は対象場所に存在するカリシウイルスにカシス果実の抽出物を接触させることにより、前記カリシウイルスを不活化することを特徴とするウイルス不活化方法。
- 前記カリシウイルスは、ネコカリシウイルスであることを特徴とする請求項4に記載のウイルス不活化方法。
- 前記対象物又は対象場所にカシス果実の抽出物を散布、噴霧、又は塗布するか、カシス果実の抽出物に前記対象物を浸漬するか、前記対象物にカシス果実の抽出物を配合することを特徴とする請求項4又は5に記載のウイルス不活化方法。
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