CN101262873B - 灰白岩蔷薇提取物用于制备预防和/或治疗流感的药物的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及应用来自岩蔷薇属植物的提取物制备预防和治疗流行性感冒，特别是禽流感和在即将到来的广泛流行过程中来源于禽流感的病毒毒株的药物的应用。

Description

灰白岩蔷薇提取物用于制备预防和/或治疗流感的药物的应用
本发明涉及应用一种提取物制备用于预防和/或治疗流感的药物的应用。 
流行性感冒(influenza)，也叫作流感(flu)，是一种传染性病毒疾病，其在季节性流行期间在世界范围内传播。有人区分了三种病毒类型，A，B和C。B和C局限于人，而A型扩展到哺乳动物和鸟类。 
世界卫生组织，WHO，警告全球性流行性感冒将在即将到来的几年内广泛流行。流行发作和广泛流行主要由A型流感病毒引起。流感病毒遗传物质的主要遗传改变已经在20世纪引起了三次广泛流行，它们的传染病原体都是A型。 
目前，禽类流感，也是A型病毒，代表广泛流行的主要危险。最近几年发生日益增加，特别是在东南亚。它的传播由野生鸟类辅助，它们作为所述疾病的抗性载体。专家们担心禽流感病毒可能与人流感的传染病原体交叉。原则上，当猪或人同时感染禽流感和人流感的传染病原体时，这是可能的。这可能导致对人高感染性和致死性的病毒，其可以导致全球蔓延。迄今为止，禽流感到人类的传播只在局部地区发生。然而，还没有观察到在人类之间的禽流感传播。 
接种疫苗代表预防病毒疾病的最重要的方式。然而，在预防情形中，接种依赖于抗某种病毒的疫苗的制备。这需要所述病毒必须已经存在。这以及开发疫苗所需要的长时间(大约4个月)导致它在全球流行病中的应用的基本局限性。在这样的情形中，疫苗应用只是得到抗病毒药剂的现有和伴随应用的保障(WHO Guidelines on the Use of Vaccines and Antiviralsduring Influenza Pandemics(在流行性感冒广泛流行期间关于使用疫苗和抗病毒剂的WHO方针)；World Health Organization(世界卫生组织)2004)。 
有效治疗流行性感冒的抗病毒剂包括金刚烷胺，金刚乙胺，扎那米韦，和奥塞米韦和利巴韦林。所列出的药物全都有副作用，其在某些情形中可能是严重的。例如，奥塞米韦，其以名称Tamiflu
Figure 2006800336143_0
出售，表现出反胃、呕吐和胃痛的常见副作用。它的应用指示只在13岁以后，原因为在某些情形中，在低于所述年龄限制的年轻人中观察到严重的副作用，如听力影响、肺炎、鼻窦感染、支气管炎、淋巴结肿胀，和结膜炎(Red List，Catalogueof Medication for Germany(红表，德国医药目录)，2004)。 
抗病毒药物在病毒疾病的预防以及在其治疗中有效。迄今为止病毒疾病的直接药物治愈尚未成功。 
此外，接骨木(elderberry)提取物因其在某些情形中缩短流行性感冒的持续时间的作用而为人所知，然而，其没有表现出任何适当的预防作用(Zakay-Rones，Z.；Varsano，N.；Zlotnik，M.；Manor，O.；Regev，L.；Schlesinger，M.；Mumcuoglu，M.J.Altern.Complement.Med(备选和互补医学杂志).1995，1(4)，361-9)。 
在来自岩蔷薇(Cistus)属植物的提取物中还已知杀菌作用。岩蔷薇物种incanus(灰白岩蔷薇)和其亚种tauricus，其都是地中海地区普遍的，已经用在这一地区的传统医药中。灰白岩蔷薇(Cistus incanus)作为天然药物用于家畜管理，以及通常用于增加动物的健康状况(Pieroni，A.；Howard，P.；Volpato，G.；Santoro，R.F.Vet.Res.Commun(兽医研究通讯).2004，28(1)，55-80)。在希腊北部地区，灰白岩蔷薇亚种tauricus传统上用于皮肤病的治疗(Petereit F.，Kolodziej H.，Nahrstedt A.Phytochemistry(植物化学)1991，30(3)，981-985)。 
除了其它物质外，岩蔷薇物种特别包含黄烷类和原花色素(Petereit F.，Kolodziej H.，Nahrstedt A.Phytochemistry(植物化学)1991，30(3)，981-985)，其可以在机体内作为抗氧化剂(Attaguile，G.；Russo，A.；Campisi，A.；Savoca，F.；Acquaviva，R.；Ragusa，N.；Vanella，A.Cell Biol Toxicol(细胞和生物毒物学).2000，16(2)，83-90)。灰白岩蔷薇叶片的提取物具有抗细菌和抗真菌活性(Bouamama，H.等.Therapie(治疗)1999，54(6)，731-3)。 
作为用于可能由禽流感引起的即将到来的广泛流行的情形的预防措施，世界范围的国家依赖抗病毒药物。例如，尽管担心在紧急情况中药物可能很快用光，但是一些国家仍以显著量定购上文提及的药物奥塞米韦(Tamiflu
Figure 2006800336143_1
；Hoffman La Roche(霍夫曼-拉罗奇))作为广泛流行情形的储备。 另外，巨大的需要已经导致生产瓶颈。 
另外，(已知)抗病毒剂的应用受到这些抗病毒剂在动物管理中用作广谱药物的事实的日益增加的危害。不管国际禁令，例如在中国，这样的实施已经引起一些禽流感毒株对这些药剂的抗性。此外，这些药剂的常见副作用，在某些情形中可能是严重的。此外，在一些情形中，这些药物只是特定的年龄组，诸如例如奥塞米韦(Tamiflu
Figure 2006800336143_2
)，其只能在年龄大于13岁以后应用。 
因此，本发明的目的是提供用于预防和/或治疗流行性感冒的抗病毒药物，其可以经济地制备，并且其在它的施用中不会引起任何副作用。 
这一目的通过使用来自岩蔷薇属植物的提取物制备预防和/或治疗流行性感冒的药物而实现。 
所述提取物从岩蔷薇属植物分离。已知岩蔷薇属的20种类型：微白岩蔷薇(C.albidus L.) 
C.chinamadensis Banares & P.Romero 
C.clusii Dunal 
C.crispus L. 
C.heterophyllus Desf. 
灰白岩蔷薇(C.incanus(也叫作C.creticus)) 
C.infiatus Pourr.Ex Demoly(也叫作C.hirsutus Lam.或C.psilosepalusSweet) 
黑脂岩蔷薇(C.ladanifer L). 
桂叶岩蔷薇(C.laurifolius L.) 
C.libanotis L. 
蒙山岩蔷薇(C.monspeliensis L). 
C.munbyi Pomel 
C.ochreatus Chr.Sm.ex Buch 
C.osbeckiifolius Webb ex Christ. 
C.parviflorus Lam. 
C.populifolius L. 
C.pouzolzii Delile 
C.salviifolius L. 
C.sintenisii Litard.(也叫作C.albanicus E.F.Warburg ex Heywood) 
合生花叶岩蔷薇(C.symphytifolius Lam.) 
所述提取物优选从灰白岩蔷薇(C.incanus)物种分离。灰白岩蔷薇包括两个亚种，灰白岩蔷薇亚种tauricus以及灰白岩蔷薇亚种undulatus。在这些当中，亚种灰白岩蔷薇亚种tauricus特别优选地用于提取。 
所述提取物从植物的气生部分分离。优选地，使用在同一年内再生的植物的气生苗。在收获后直接将所述植物部分进行提取，即，在原始条件下。备选地，将所述植物部分在提取之前干燥。随后，将植物的叶片以适当的方式切碎，例如通过摩擦它们或切割它们。 
提取使用适当的溶剂进行。适当的溶剂为水，醇如甲醇、乙醇或异丙醇，或氯化溶剂如二氯甲烷，以及丙酮，乙酰丙酮，氨，或冰醋酸。还可以使用指定的溶剂的混合物。优选地，使用水与甲醇或乙醇的混合物。 
提取典型地在室温下进行。然而，还可能在从25℃直到，如果需要，所用溶剂的沸点的升高的温度进行提取。优选在室温下提取。 
脂肪如猪油，蜡如蜂蜡，或油如橄榄油和杏仁油也可以用于提取。优选地使用杏仁油。 
为了获得尽可能高的产量，可以将植物材料提取多次。这里，不同的溶剂可以用于不同的提取步骤，或使用溶剂的提取后可以接着进行使用脂肪、蜡或油的提取，反之亦然。 
通过提取获得液体或半固体的粗产物，其可以以这种形式用于制备预防和/或治疗流行性感冒的药物。 
在加工成药物之前，粗产物还可以进一步浓缩和/或干燥和/或后处理(work up)。例如，后处理可以包括本领域普通技术人员已知的纯化步骤，诸如离心、过滤和倾析，以从所述提取物去除悬浮的物质。 
因此，本发明还涉及干燥的提取物。为了制备所述干燥的提取物，可以从液体粗提取物、浓缩的提取物或纯化的提取物去除溶剂，例如通过喷雾干燥、冷冻干燥或真空干燥去除。 
所述提取物用于预防和/或治疗流行性感冒。 
流行性感冒传染病原体是A、B和C型病毒。在人类中季节性发生的流行性感冒是由具有H1、H2和H3亚型的A型流感病毒以及由B型流感病毒引起的。禽流感主要由H5、H7和H9亚型引起。 
所述提取物特别适合预防和/或治疗禽流感。特别地，所述提取物可以用于预防和/或治疗由H7亚型引起的禽流感。 
所述提取物可以以本领域的普通技术人员已知的任何草本制剂应用形式应用，例如，用作片剂、薄膜片剂、胶囊、散剂、颗粒剂、糖衣丸、软膏、乳膏、凝胶、溶液剂或喷雾剂。所述提取物还可以以混合在食物中特别是混合在动物饲料中的粉末形式使用。 
在本文中，所述提取物可以用常规草本制剂佐剂处理，常规草本制剂佐剂如片剂粘合剂、填充剂、防腐剂、片剂崩解剂、流动调控剂、软化剂、湿润剂、分散剂、乳化剂、溶剂、阻滞剂、抗氧化剂、致稠剂、提高渗透的试剂和/或推进剂。 
所述提取物还可以与其它植物提取物混合，特别是与具有相似的或协同作用的植物提取物混合。 
取决于应用类型，提取物的浓度应该随使用的形式而不同。通常，在固体应用形式中，提取物的量为每剂量单位1-1,000mg。优选地，提取物的量为每单位5-500mg。在流体应用形式中，提取物可以以1μg/ml-100mg/ml的浓度存在，优选地25μg/ml-50mg/ml。在半固体应用形式中，提取物的含量为1-90wt％，优选地5-75wt％。 
所述提取物优选地以片剂形式施用，其中所述提取物以干提取物存在。 
还优选地施用软膏或乳膏形式的提取物用于局部应用。此处，使用通过用脂肪、蜡或油提取而从植物中提取活性剂的提取物。还优选所述干提取物与脂肪、蜡或油混合，或者溶解在这些中。 
还优选所述提取物是气雾剂。气雾剂可以用于已经接触或可能潜在地接触引起流感的病原体的目标和建筑物的消毒，特别是动物管理设备以及运输人、动物和/或食品的任何类型的运输工具的消毒。例如，在起飞之前，飞机可以用按照本发明的气雾剂喷雾，以阻止禽流感的传播，并且因 此将传染人的危险减小到最小。由于它在人当中不引起任何毒性作用，所以按照本发明的气雾剂还可以在有人存在时喷雾，例如在等候室中喷雾。 
下述实例举例说明本发明。 
所述提取物关于其细胞毒性和细胞存活力以及其针对流感病毒的抗病毒活性进行检测。为了这一目的，通过加热(1h/100℃)将所述提取物溶解在PBS(无菌)(储液1mg/ml)中。体外研究的剂量是2，10，25，和50μg/ml系统。 
A型流感病毒A/布拉迪斯拉发/79(H7N7)(FPV)(禽类)以及A型流感病毒A/波多黎各/8/34(H1N1)(PR8)(人)作为病毒分离物。 
Madin-Darby犬科动物肾(MDCK)细胞，狗的肾上皮细胞系A549细胞和人肺上皮细胞系作为宿主细胞系。 
下述检测方法用于确定所述提取物的性质。 
显微镜研究： 
在显微镜研究中，将A549肺上皮细胞和MDCK狗肾上皮细胞用不同浓度的提取物(2，10，25，50μg/ml)处理不同的时间点(9小时，24小时，32小时，48小时)，并且随后通过光学显微镜研究。实验以一式两份使用对照进行。 
存活力检测： 
在存活力检测中，将A549肺上皮细胞和MDCK狗肾上皮细胞用不同浓度的提取物(2，10，25，50μg/ml)处理不同的时间点(24小时，48小时，56小时，72小时)，并且随后用碘化丙锭染色，以通过流式细胞术确定死亡的和活细胞的比例。实验总共进行4次。 
凋亡胱天蛋白酶激活的研究： 
关于凋亡胱天蛋白酶激活的研究，除了一致的实验之外，将A549细胞用25和50μg/ml的提取物处理48小时。在这之后，裂解细胞，细胞蛋白通过凝胶电泳分离，并且使用抗-PARP抗体(聚(ADP-核糖)聚合酶，胱天蛋白酶底物)通过蛋白质印记研究胱天蛋白酶对这种蛋白的凋亡裂解。程 序性细胞死亡诱导剂星形孢菌素作为阳性对照刺激物。本实验以两个平行的批次进行。 
抗病毒活性研究： 
对于抗病毒活性的研究，将A549肺上皮细胞和MDCK狗肾上皮细胞在不同的时间点用不同浓度的提取物(2，10，25，50μg/ml)预处理30分钟，并且随后在所述提取物的存在下用流感病毒毒株A/FPV/布拉迪斯拉发/79(H7N7)和A/PR8/34(H1N1)进行感染。在感染后不同时间点(8小时或9小时，24小时，36小时或48小时)分离培养基上清液，并且在噬菌斑测定中研究最新形成的流感病毒。 
作用动力学研究： 
为了研究作用动力学，将MDCK细胞用50μg/ml的提取物处理不同的时间点(30分钟预培养，感染后直接，或感染后2小时，4小时和8小时)。24小时后研究培养基上清液的子代病毒。 
研究在将病毒与提取物预培养后的抗病毒活性： 
关于在将病毒与提取物预培养后的抗病毒活性的研究，将含有病毒的感染溶液(FPV)用50μg/ml的提取物预培养2小时。然后，使用这一感染溶液进行A549细胞中的感染实验，与未处理的病毒比较，并且在24小时后在病毒滴定中检测新形成的病毒。在这一时间过程中，在上清液中不再存在任何提取物。将用于感染的预处理病毒进一步直接在噬菌斑测定中研究它们在MDCK细胞中的感染性，与未处理的病毒相比。 
使用预处理的病毒进行免疫荧光显微镜研究： 
将含有病毒的感染溶液(FPV)用50μg/ml提取物预培养30分钟或过夜。未处理的病毒以及用未经过预处理的病毒感染预处理的细胞作为比较。然后，使用高感染剂量(MOI＝200)，进行使用未处理病毒的比较感染实验，并且在1小时后，在针对病毒蛋白(核蛋白(NP))的特异性抗体帮 助下，通过免疫荧光检测感染的病毒或新形成的蛋白。早期检测时间点和高感染剂量也允许感染的病毒或病毒聚集物的检测。 
上述研究的结果在图1-9中绘图显示。 
实施例 
制备来自灰白岩蔷薇亚种tauricus的提取物 
将再生的气生苗(叶、花瓣和茎)用于提取。将植物材料在室温下在阴凉处室外晾干，直到它具有不大于10％的残留水份含量。随后，将植物部分切成≤8mm的大小。 
将切割的植物部分在95℃用10倍量的纯水欧洲药典(Ph.Eur.)进行浸泡4-5小时。通过平板蒸发器，将得到的溶液在75-80℃的蒸汽温度下浓缩到初始体积的18-19％。干物质的含量为约45％。 
通过搅动蒸发器的方式，通过将所述提取物在减压(0.6bar)下在110-114℃加热4小时，而将干物质含量增加到50-51％。随后，将提取物在100.3℃煮沸1小时，以获得约53％的干物质含量。 
最后，在16mbar使用下降的温度梯度(140℃，120℃，90℃，20℃)进行真空传送干燥。干物质的含量是92-93％。然后将提取物碾碎。然后从这一提取物制备上文所述的储液。 
显微镜研究 
在显微镜照片中，当与未处理的对照样品比较时，对于使用MDCK细胞和A549细胞的研究系列关于所用的任何提取物浓度或所研究的时间值，可以确定关于细胞数目和细胞形态没有显著的变化。 
存活力检测 
存活力检测的结果显示在图1和2中，其中将来自每个个体样品的活细胞数目比较总结为进行的四次测定的平均值。结果是，在72小时的整个观察期间没有检测到所述提取物对MDCK或A549细胞的存活的不利影响。 
凋亡胱天蛋白酶激活的研究 
来自凋亡胱天蛋白酶激活的研究的结果显示在图3中，其举例说明用于确定胱天蛋白酶活性的蛋白质印迹分析的结果。尽管对照刺激物星形孢菌素(stauro)导致胱天蛋白酶底物的有效裂解(聚(ADP-核糖)聚合酶，条带PARP裂解)，但是在未处理的(模拟物)或在提取物-处理的细胞(25μg/ml，50μg/ml)中没有检测到这样的活性。针对蛋白ERK2的对照印迹作为均一蛋白上样的对照。结果可以推论出，在所用的浓度和在所观察的期间，使用植物提取物处理没有导致胱天蛋白酶激活和程序性细胞死亡的诱导。 
抗病毒活性研究 
在提取物的抗病毒活性研究中，图4-7显示来自使用多滴度确定的两次独立实验的每一次的代表性结果。显示病毒滴度，与来自未处理的感染样品的滴度比较。在FPV-感染的A549细胞中，在9小时和24小时后甚至更低的浓度引起病毒滴度的显著减少，在活性剂的最高浓度它的病毒滴度减少大于2个数量级。由于高的感染剂量，48小时后，未处理的样品已经处于病毒生长的平台期，以致抑制作用不再能够这样清楚地显示。然而，甚至在这里，对于最高浓度的活性剂观察到病毒滴度的减少。病毒滴度的最大减少还可以在用25-50μg/ml的提取物处理样品的MDCK细胞中使用相同的病毒分离物而发现，其中还获得多数量级的抑制。令人惊讶地，在更低的活性剂浓度，在一些批次中观察到病毒滴度的轻微增加。然而，由于这不是始终在所有样品中发生，并且特别是没有在最长的观察期限36小时内观察到，所以可以假定这是实验假象。 
对于备选使用的人病毒分离物PR8，在所有的研究时间值，也观察到MDCK细胞中病毒增殖的浓度-依赖性抑制。与先前的实验一致，在50μg/ml的最高活性剂浓度这里也存在病毒滴度的减少。 
总之，可以进行这样的陈述，特别是在25μg/ml和50μg/ml的提取物浓度，在两种宿主细胞系中都观察到对不同流感病毒的病毒增殖的强抑制作用。 
作用动力学研究 
来自在用提取物预培养病毒之后的抗病毒活性研究的结果绘图显示在图8中。这种比较病毒滴度的作用动力学研究表明，只对于用所述提取物预培养的细胞可以观察到对病毒增殖的强抑制作用。当在感染后＞2h加入时，所述提取物没有表现出任何进一步的作用。 
在用提取物预培养病毒之后的抗病毒活性研究 
使用用提取物预培养2小时的感染溶液进行使用未处理的病毒的比较感染实验，并且在24小时后在病毒滴定中确定新形成的病毒(图9B)。此外，预处理的病毒直接在噬菌斑测定中研究它们的与未处理的病毒比较的感染性(图9A)。结果，预培养已经在噬菌斑测定中对感染性的直接测定起作用。当使提取物-处理的病毒与未处理的病毒在24小时的感染周期中进行对比时，这都变得更加明显。这里，可观察到约一个数量级的滴度减少。总之，人们可以认为，用提取物预培养病毒已经足以提供病毒感染性的显著减少。 
使用预处理的病毒的免疫荧光显微镜研究： 
在使用预处理的病毒的免疫荧光显微镜研究中，在1小时后已经观察到细胞核中升高的核蛋白质(NP)浓度，这表明，含有NP的病毒核糖核蛋白复合物的主要部分已经迁移进入细胞核，或者新病毒蛋白的生产已经开始。尽管这种分布只是在用提取物预处理的感染细胞中稍稍不同，但是特别是在感染的病毒过夜预培养后可观察到显著的变化。这里，病毒颗粒或聚集物只在某些点被染色，并且在细胞核中染色的浓度很难以发现。从这种现象，人们可以推论出预处理的病毒只能不充分地感染细胞或被摄入到细胞中。 
用提取物处理的细胞的形态、存活力和胱天蛋白酶激活的研究表明，达到50μg/ml的提取物浓度没有导致对这里所用的宿主细胞A549和MDCK的任何显著的毒性作用，并且也不诱导增强的细胞坏死或程序性细胞死亡。此外，在细胞数目中没能观察到显著的减少，以致细胞生长也不被提取物的作用减少。总之，考虑实验方差，提取物抗病毒活性结果的评 估允许进行这样的陈述，所述提取物在25-50μg/ml的浓度表现出对流感病毒在细胞培养物中增殖的显著的和强的抗病毒作用。 
检测的植物提取物在细胞培养物中表现出针对流感病毒的抗病毒活性，而对宿主细胞没有显著的毒性。在分子水平上，假定抗病毒活性更大部分是通过所述提取物的成分与病毒颗粒的直接物理相互作用而调控，但是不能排除所述提取物对细胞的其它另外的作用。 
在另外的研究中，已经研究了岩蔷薇对高致病性流感病毒亚型H5N1(亚洲流感)和H7N7的病毒抑制性质。病毒分离物A/泰国/1(KAN-1)/2005(H5N1)(人)以及A型流感病毒A/布拉迪斯拉发/79(H7N7)(FPV)(禽类)作为下述研究中的病毒分离物。 
抑制高致病性H5N1和H7N7病毒的凝聚能力： 
将岩蔷薇提取物稀释至储液浓度的1/2，1/4，1/8 1/16和1/32的浓度。将H5N1和H7N7病毒分离物稀释至初始浓度的1/64的最终浓度。在96孔平板中将每种岩蔷薇溶液分别与每孔50μl H5N1溶液(PFU：4.5×108)和H7N7溶液(PFU：5.7×108)混合。将平板在CO2培养箱中在37℃培养1小时，然后每孔加入50μl稀释至1/20的鸡血，并且将那个平板再在冰箱中温育30-45分钟。作为对照，将红细胞未处理或分别用H5N1和H7N7处理，由此省略岩蔷薇提取物。 
结果，发现所述提取物具有有效抑制红细胞在H5N1和H7N7病毒分离物中的交联的能力。因此，岩蔷薇提取物能够显著减小血凝素在H5N1和H7N7中细胞受体上的结合能力。 
高致病性H5N1病毒增殖能力的抑制： 
将A549细胞传代(disseminated)并且允许生长24小时。然后，将所述细胞用岩蔷薇提取物预培养30分钟。使用50μg/ml，75μg/ml和100μg/ml的提取物浓度。同样地，将H5N1病毒用所述提取物(50μg/ml，75μg/ml和100μg/ml)在室温下预培养30分钟。预培养后，在37℃在CO2培养箱中，将细胞用A型流感病毒亚型H5N1(MOI：0.001)感染30分钟，偶尔转动。随后，用PBS洗涤细胞，以去除未结合的病毒，并且使用岩蔷薇提取物(50 μg/ml，75μg/ml和100μg/ml)在37℃在CO2培养箱中培养20小时。在培养20小时后，去除上清，并且通过噬菌斑测定测量病毒滴度。未处理的感染的样品用作对照。 
结果显示在图10中，其中设置未处理的对照样品代表100％。研究了提取物的两种不同负载(charges)(A和B)。 
可以从图10看出，所述提取物显著减少子代病毒的数目。 

Claims (8)

1.来自岩蔷薇(Cistus)属植物的提取物的应用，其用于制备预防和/或治疗流行性感冒的药物。
2.按照权利要求1的应用，其中所述提取物从灰白岩蔷薇(Cistusincanus)获得。
3.按照权利要求1或2的应用，其中所述提取物从所述植物的气生部分分离。
4.按照权利要求1或2的应用，其中所述提取物是液体、干的或半固体形式。
5.按照权利要求1或2的应用，其中所述提取物是水性提取物或醇提取物。
6.按照权利要求1或2的应用，其用于预防和/或治疗禽流感。
7.按照权利要求1或2的应用，其中所述提取物口服或局部施用。
8.按照权利要求1或2的应用，其中所述提取物是喷雾的。
CN2006800336143A 2005-09-13 2006-09-13 灰白岩蔷薇提取物用于制备预防和/或治疗流感的药物的应用 Expired - Fee Related CN101262873B (zh)

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