CN102241775B - 聚乙二醇胸腺肽1衍生物的纯化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及聚乙二醇胸腺肽1衍生物的纯化方法。所述方法主要采用离子交换层析方法，通过一步层析有效地得到高活性、高纯度和高回收率的聚乙二醇胸腺肽1衍生物，该方法简单、高效，特别适合于产业化生产。
Description
技术领域
本发明涉及多肽的聚乙二醇修饰物纯化领域，具体而言就是简单高效地制备高纯度的聚乙二醇修饰多肽产品。本发明涉及相当简单的方法，通过一个步骤纯化处高纯度的聚乙二醇胸腺肽1衍生物的方法，特别适合于该产品在医药工业中的大规模生产工艺。
技术背景
随着基因工程技术和多肽合成技术的发展，多肽药物在20世纪90年代后期有了长足的发展，在国际医药市场中所占份额不断提高。与其他药品相比，多肽药物具备高效、低毒和特异性强的显著优势。多肽类药物目前已广泛应用于临床研究或治疗过程中。
但是，由于多肽类药物自身的特性，使得这类药物在临床上的使用受到了一些的限制，比如较短的体内半衰期、注射次数频繁、容易受到体内的酶解作用从而被迅速清除出体外、容易产生免疫原和抗原、较低的溶解性。目前解决多肽药物以上临床缺陷最有效的办法之一是聚乙二醇化学修饰技术。
胸腺素α1(Thymosin-α1，Tα1)是人体中枢免疫器官胸腺所分泌的一种免疫活性极强的多肽激素，最早发现于1966年，1975年被成功分离得到单体并确定了氨基酸序列与核苷酸序列。目前临床上使用最广泛的胸腺素产品是赛生公司的日达仙(Zadaxin)，于1998在美国上市。但是胸腺肽1本身的药物动力学性质较差，在体内逗留时间较短而被排除，其半衰期仅为2小时。因此导致治疗的不方便和治疗成本升高，同时因为价格昂贵普通病人难以承受，治疗质量下降。
聚乙二醇修饰胸腺肽1衍生物可以解决胸腺素α1药代动力学性质差的问题，目前是国内外研究热点之一。专利WO 03/037272、ZL200410037523.X、CN 200610079506.1、ZL 03131498.8、ZL200510117752.7均公开了聚乙二醇修饰胸腺肽1衍生物的方法。相关专利和文献中，对聚乙二醇修饰胸腺肽1衍生物的纯化均使用反相高效液相色谱层析(rp-HPLC)纯化方法。但是分子量较低的肽与聚乙二醇反应时很难使得聚乙二醇反应完全，由于聚乙二醇为高分子聚合物，在使用rp-HPLC制备层析时很难将未参与反应的聚乙二醇有效除掉。做为药物的开发，必须得到较高纯度的产品。但是由于聚乙二醇残留，很难得到高纯度的产品，且质量难以控制。另外，为了达到较好的分离效果，rp-HPLC制备层析一般使用价格昂贵色谱纯乙腈，在产业化生产中成本太高。
发明内容
为了克服现有技术的不足之处，对本发明的目的在于一种简单高效的聚乙二醇胸腺肽1衍生物的纯化方法。同时，该方法还易于放大及产业化生产工艺。
本发明的目的在于提供一种用阴离子交换层析纯化聚乙二醇胸腺肽1衍生物的方法，其特征在于一步纯化，纯度高，游离聚乙二醇含量低，回收率高。
其中，优选地，
所述的聚乙二醇胸腺肽1衍生物具有以下结构特征：
A-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-B-Asp-Leu-C-Glu-D-E-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-X-Y-Z，其中，A选自H或Ac；B，C，D，E选自Lys或Arg；X选自(Gly)n，(Gly-Ser)n，(Gly-Gly-Ser)n，(Ser-Gly-Gly)n，n＝1-10；Y是Cys、高Cys、Lys、Arg或His，并且Y聚乙二醇修饰的残基；Z是OH或NH2；优选A为Ac；B，C，D，E是Lys；X＝Gly-Gly；Y为PEG40K修饰的Cys；
所述的阴离子交换层析指弱阴离子交换介质和强阴离子交换介质。
所述的阴离子交换层析介质聚合物包括Sephadex、Sepharose、Cellulose、Source、Toyopearl及Proteomix；
所述的阴离子交换层析条件为：
(1)平衡缓冲液离子强度为5～50mmol/L，酸碱度为4.0～9.0；
(2)洗脱缓冲液离子强度为5～200mmol/L，酸碱度为3.0～9.0；
(3)洗脱缓冲液盐离子梯度为0～1000mmol/L氯化钠。
其中缓冲液为乙酸/乙酸钠、磷酸钠盐、碳酸钠盐、柠檬酸钠盐或/和甘氨酸的缓冲液体系；缓冲液中含有0～40％水溶性有机溶剂，该水溶性有机溶剂选自乙腈、甲醇、乙醇或/和异丙醇，优选乙腈，优选地乙腈在缓冲液中的比例为5～20％，更优选10％；洗脱条件为pH梯度或/和氯化钠梯度，优选氯化钠梯度；缓冲液酸碱度为5.6。
本发明所公开的聚乙二醇胸腺肽1衍生物的纯化方法，是在研究国内外较为成熟的多肽及蛋白的PEG修饰物的一些纯化方法的基础上，通过试验研究聚乙二醇胸腺肽1衍生物的一些特性及其与阴离子层析介质的一些特殊作用关系，总结并发明该方法。
本发明所述胸腺肽1衍生物的制备方法可使用本领域公知的任何方法进行制备，此制备方法优选为固相和液相化学合成法。固相方法包括使用Fmoc或Boc保护的氨基酸，用多肽合成仪自动合成或手工依次合成法进行氨基酸序列的合成，再经切割，经高效液相(HPLC)分离纯化，冻干所得肽为进行聚乙二醇修饰的中间体前体。
本发明所述的PEG修饰方法，是通过共价反应使活性PEG(40kD)与胸腺肽1衍生物中C末端Cys残基的巯基连接。其中活性PEG(40kD)优选分支型聚乙二醇mPEG2-MAL(40kD)。
胸腺肽1衍生物经PEG修饰后，所得样品中主要含有一下几种物质：(1)聚乙二醇胸腺肽1衍生物；(2)未被修饰的胸腺肽1衍生物；(3)胸腺肽l衍生物二聚体；(4)未参与反应的PEG。使用阴离子交换层析进行纯化，如Q Sepharose F.F。层析上样和平衡缓冲液pH为5.6，反应产物能很好的结合在层析介质上，未参与反应的PEG直接透过。充分平衡后，使用含1M氯化钠的缓冲液(pH5.6)设置线性梯度洗脱，随着离子强度随梯度洗脱逐渐增大，聚乙二醇胸腺肽1衍生物首先被洗脱出来，随后未被修饰的胸腺肽1衍生物和胸腺肽1衍生物二聚体才被洗脱下来，其中所得的聚乙二醇胸腺肽1衍生物纯度大于98％，回收率大于60％。经蒸发光散射检测器检测均不含游离PEG。
附图说明
附图1：mPEG-MAL(40kD)修饰胸腺肽1衍生物反应液HPLC分析图谱，其中：a：聚乙二醇胸腺肽1衍生物；b：未被修饰的胸腺肽1衍生物；c：胸腺肽1衍生物二聚体；d：未参与反应的PEG
附图2：Q Sepharose F.F纯化mPEG-MAL(40kD)修饰胸腺肽1衍生物的示意图
附图3：纯化后聚乙二醇胸腺肽1衍生物HPLC-UV分析图谱
附图4：纯化后聚乙二醇胸腺肽l衍生物HPLC-ELSD分析图谱
具体实施方式
下面的实施是对本发明的进一步阐述，而不是对发明的限制。
实施例1：胸腺肽1衍生物的聚乙二醇修饰
步骤1：固相化学合成法制备供聚乙二醇修饰的前体---C端半胱氨酸胸腺肽1衍生物，结构如下：
Ac-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-Gly-Gly-Cys-OH
(1)所用氨基酸衍生物如下：
Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Gly-OH.
上式中缩写表示：
Fmoc：9-芴甲氧羰基(9-fluorenylmethoxycarbonyl)
Boc：叔丁氧羰基(tert-butyloxycarbonyl)
Trt：三苯甲基(trityl)
OtBu：叔丁氧基(tert-butyl ester)
tBu：叔丁基(tert-butyl)
(2)合成所用设备及试剂
仪器：多肽序列的合成采用手动依次合成方法，反应器均为专制。
试剂：N，N-二甲基甲酰胺(DMF)，二氯甲烷(DCM)，六氢吡啶，异丙醇，DIC(N，N-Diisopropylcarbodimide)，1-羟基苯并三唑(HOBt)
(3)操作
以10克Fmoc-Cys(Trt)-WANG RESIN为起始原料(0.6mmol/g，6mmol)，依次经过：用20％六氢吡啶/DMF溶液300mL脱去N末端氨基酸的氨基保护基→DMF洗涤树脂以除去脱保护成分，在活化剂HOBt(2.0g，15mmol)和缩合剂DIC(1.9g，15mmol)作用下与下一个氨基酸(15mmol)缩合，进行链延伸→链延伸反应结束后，DMF和异丙醇洗涤除去活化剂和缩合剂以及过量的氨基酸→20％六氢吡啶/DMF溶液300mL脱去新引入氨基酸的α氨基保护基→开始下一个氨基酸的耦合，依次循环。偶合次序为：Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH偶合，投料量分别见下表：
| 反应步骤 | 延伸氨基酸 | 投料量(g) |
| 第一步反应 | Fmoc-Gly-OH | 4.5 |
| 第二步反应 | Fmoc-Gly-OH | 4.5 |
| 第三步反应 | Fmoc-Asn(Trt)-OH | 9.0 |
| 第四步反应 | Fmoc-Glu(OtBu)-OH | 6.4 |
| 第五步反应 | Fmoc-Ala-OH | 4.7 |
| 第六步反应 | Fmoc-Glu(OtBu)-OH | 6.4 |
| 第七步反应 | Fmoc-Glu(OtBu)-OH | 6.4 |
| 第八步反应 | Fmoc-Val-OH | 5.1 |
| 第九步反应 | Fmoc-Val-OH | 5.1 |
| 第十步反应 | Fmoc-Glu(OtBu)-OH | 6.4 |
| 第十一步反应 | Fmoc-Lys(Boc)-OH | 7.0 |
| 第十二步反应 | Fmoc-Lys(Boc)-OH | 7.0 |
| 第十三步反应 | Fmoc-Glu(OtBu)-OH | 6.4 |
| 第十四步反应 | Fmoc-Lys(Boc)-OH | 7.0 |
| 第十五步反应 | Fmoc-Leu-OH | 5.3 |
| 第十六步反应 | Fmoc-Asp(OtBu)-OH | 6.2 |
| 第十七步反应 | Fmoc-Lys(Boc)-OH | 7.0 |
| 第十八步反应 | Fmoc-Thr(tBu)-OH | 6.0 |
| 第十九步反应 | Fmoc-Thr(tBu)-OH | 6.0 |
| 第二十步反应 | Fmoc-Ile-OH | 5.3 |
| 第二一步反应 | Fmoc-Glu(OtBu)-OH | 6.4 |
| 第二二步反应 | Fmoc-Ser(tBu)-OH | 5.8 |
| 第二三步反应 | Fmoc-Ser(tBu)-OH | 5.8 |
| 第二四步反应 | Fmoc-Thr(tBu)-OH | 6.0 |
| 第二五步反应 | Fmoc-Asp(OtBu)-OH | 6.2 |
| 第二六步反应 | Fmoc-Val-OH | 5.1 |
| 第二七步反应 | Fmoc-Ala-OH | 4.7 |
| 第二八步反应 | Fmoc-Ala-OH | 4.7 |
| 第二九步反应 | Fmoc-Asp(OtBu)-OH | 6.2 |
| 第三十步反应 | Fmoc-Ser(tBu)-OH | 5.8 |
偶合结束N末端进行乙酰化，N端乙酰化的31肽从树脂上切割下来，同时各氨基酸上活性基团的保护基亦被脱下，干燥后即得到含31个氨基酸的胸腺素α1粗品4.0g，纯化冻干得到胸腺素α1原料0.6g。
步骤2：聚乙二醇修饰胸腺肽1衍生物
将C端半胱氨酸胸腺肽1衍生物(50mg)和500mg用马来酰亚胺取代了末端的分支型甲氧基聚乙二醇(mPEG2-MAL，分子量40,000Dalton)溶于10mL 0.1M磷酸盐缓冲液中，室温搅拌反应1小时，即为聚乙二醇修饰胸腺肽1衍生物反应液。HPLC分析柱(PhenomenexLuna 5μ
C18)检测反应后溶液见附图1。
实施例2：聚乙二醇修饰胸腺肽1衍生物反应液的一步纯化
(1)纯化所用设备及材料
仪 器：AKTA explore 100液相色谱系统。
层析柱：Q Sepharose F.F，XK 16×20层析柱。
试 剂：冰乙酸，乙酸钠，乙腈，氯化钠。
(2)样品处理
将实施例1中得到的聚乙二醇修饰胸腺肽1衍生物反应液约15mL装入透析袋中，于1.5L 10mM乙酸缓冲液，pH5.6透析过夜，置换体系。
(3)离子交换层析纯化
取25mL阴离子交换层析填料Q Sepharose F.F，于XK 16×20层析柱管装柱，装柱完毕后测得填料柱床体积为30mL。然后用缓冲液A(10mM乙酸缓冲液，pH5.6(含10％乙腈))平衡3倍柱体积。
将透析后的聚乙二醇修饰胸腺肽1衍生物反应液用0.45μm滤膜过滤后于平衡好的离子交换柱上样，流速6mL/min。上样完毕后，用缓冲液A(10mM乙酸缓冲液，pH5.6(含10％乙腈))继续平衡2倍柱体积。
然后用缓冲液A(10mM乙酸缓冲液，pH5.6(含10％乙腈))与缓冲液B(10mM乙酸缓冲液，pH5.6+1M氯化钠(含10％乙腈))设置线性梯度洗脱，梯度设置：10倍柱体积内将缓冲液B比例由0％增至50％，流速6mL/min。梯度洗脱过程中收集主峰约25mL即为聚乙二醇胸腺肽1衍生物洗脱峰。梯度末端未参与反应的胸腺肽1衍生物及其二聚体被洗出(纯化图谱见附图2)。
(4)样品后处理
将收集得到的聚乙二醇胸腺肽1衍生物溶液约25mL装入透析袋中，于纯化水中透析除盐，冷冻干燥得聚乙二醇胸腺肽1衍生物400mg，性状为白色固体，收率74％。
实施例3：产品纯度分析
取实施例2中得到聚乙二醇胸腺肽1衍生物纯品做为供试品。用RP-HPLC法进行纯度分析。由于游离PEG可能在UV检测条件下吸收很低，故用UV检测器和蒸发光散射(ELSD)检测器进行了纯度对比研究(检测图谱见附图3和附图4)。
(1)RP-HPLC联UV检测器测定纯度
色谱条件如下：
仪器：Agilent 1100高效液相色谱仪
色谱柱：Phenomenex Luna 200*4.6mm 5u C18
流速：1.0mL/min
检测波长：220nm
流动相：A：0.05％ TFA/水 B：0.05％ TFA/乙腈
(2)RP-HPLC联UV检测器测定纯度
色谱条件如下：
仪 器：Waters 2695高效液相色谱仪
色谱柱：Waters SymmetryShieldTM RP18 3.5μm，4.6*100mm
ELSD设置：Gass presure：30Psi Gain：1000 Drift Tube：60℃±20℃Heater：60％ 进气压力：0.5MPa
流 速：1.0mL/min
流动相：A：0.05％TFA/水 B：0.05％ TFA/乙腈
(3)测定结果统计
Claims (1)
1.一种用阴离子交换层析纯化聚乙二醇胸腺肽1衍生物的方法，其特征在于一步纯化，所述的聚乙二醇胸腺肽1衍生物结构如下：
A-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-B-Asp-Leu-C-Glu-D-E-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-X-Y-Z
其中：
A为Ac；
B，C，D，E是Lys；
X＝Gly-Gly；
Y为PEG40K修饰的Cys；
Z是OH；
所述阴离子交换层析介质聚合物选自Q Sepharose F.F，所述阴离子交换层析条件为：
(1)平衡缓冲液A离子强度为10mmol/L，酸碱度为5.6，其中含10％乙腈；
(2)洗脱缓冲液B离子强度为10mmol/L，酸碱度为5.6，其中含10％乙腈；
(3)洗脱缓冲液B的盐离子梯度为0～1000mmol/L氯化钠；
所述平衡缓冲液A和洗脱缓冲液B为乙酸/乙酸钠缓冲液体系，洗脱条件为氯化钠线性梯度，用平衡缓冲液A与洗脱缓冲液B设置线性梯度洗脱，梯度设置：10倍柱体积内将洗脱缓冲液B比例由0％增至50％，流速6mL/min，所用层析柱为Q Sepharose F.F，XK16×20层析柱。
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