CN102241762A - 固相合成人工e选择素的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种固相合成人工 E 选择素的方法，其特征在于所述方法包括以下步骤：（ 1 ）以芴甲氧羰基保护的 RinkAmideResin 为载体，按照固相多肽合成的方法依次连接 Fmoc-Gln(Trt)-OH 、 Fmoc-Ile-OH 、 Fmoc-Ala-OH 、 Fmoc-Val-OH 、 Fmoc-Leu-OH 、 Fmoc-His(Trt)-OH 、 Fmoc-Thr(tBu)-OH 、 Fmoc-Tyr(otBu) ，获得肽树脂；（ 2 ）将肽树脂脱去芴甲氧羰基保护后使用切肽试剂对肽树脂切肽，获得人工 E 选择素粗品；（ 3 ）对人工 E 选择素粗品采用高效液相柱层析法分离纯化获得人工 E 选择素。该工艺较为稳定，原材料来源方便，生产周期短，生产成本低，收率高，质量稳定。

Description

固相合成人工E选择素的方法
技术领域
本发明属于制药技术领域，具体涉及一种固相合成人工E选择素的方法。
背景技术
粘附分子(adhesion molecules)是指由细胞产生、存在于细胞表面、介导细胞与细胞间或细胞与基质间相互接触和结合的一类分子。粘附分子大多为糖蛋白，少数为糖脂，分布于细胞表面或细胞外基质(extracellularmatrix，ECM)中。到目前为止，已被发现的细胞粘附分子有百余种，脑缺血再灌注时，参与的细胞粘附分子有3组：(1)整合素组(integrin family)：所有的整合素的亚单位都含有CD11和CD18。具有代表性的整合素是整合素1、整合素2、淋巴细胞功能相关抗原1和溶膜附着复合体1。(2)免疫球蛋白组(immunoglubilin family)：免疫球蛋白组的粘附分子包括CD4、CD8、CD2、细胞间粘附分子1(ICAM-1)、细胞间粘附分子2(ICAM2)、血管粘附分子、以及血小板内皮细胞粘附分子1(ICAM-1)等。(3)选择素组(selectinfamily)：根据细胞表面的糖蛋白的不同，被分为L-选择素、E-选择素，以及P-选择素。它们都有共同的结构，即N-末端Ca依赖性凝集素、上皮生长因子、补体、膜通道以及细胞质。L、E、P选择素在结构上的区别在于补体数目不同。E-选择素在白细胞介素，肿瘤坏死因子等细胞因子以及缺血再灌注等因素的诱导下，4～6小时在血管内皮细胞表面缓慢地表达。
现有技术中，抗细胞粘附分子抗体可以抑制白细胞在血管内皮的粘附，该方法用于治疗缺血性心肌梗塞、出血性休克、脊髓缺血等，均取得了减轻组织损伤的效果，特别是P、E、L选择素的23～30残基的寡肽能够有效地阻断白细胞的粘附。E-选择素的作用机理在于阻断白细胞对血管内皮细胞的粘附，增加局部脑血流，此外还有可能直接抑制局部损伤因子，炎性因子的释放，从而减轻脑组织损伤，在应用人工合成的可溶性P-选择素的实验中发现，不仅抑制白细胞对血管内皮的粘附，而且抑制白细胞释放的超氧化阴离子。现有技术中还公开了E选择素的一些应用，如中国专利申请CN 1698904(200510072152.3)于2005年11月23公开了一种抑制人异种器官移植中免疫排斥反应的方法，是将人α1，3-半乳糖苷酶基因，人α1，2岩藻糖转移酶基因和人A20基因导入猪体细胞，得到Gal-α1，3-Gal抗原和E-选择素表达量降低的猪体细胞，将该猪体细胞用于人异种器官移植。中国专利申请CN101292162于2008年10月22日公开了一种胆固醇在动脉粥样硬化斑块中氧化生成的能用作巨噬细胞趋化引诱剂的胆固醇氧化或臭氧化产物通过促进单核细胞分化为巨噬细胞并能提高E-选择素和A类清道夫受体(SR-A)的表达来进行治疗动脉硬化症和其它炎性动脉疾病。
然而，虽然E选择素的23～30残基的寡肽的一级结构为：H-YTHLVALQ-NH2；现有技术中该寡肽仅从E选择素中提取分离得到，还没有人工合成E选择素的23～30残基的寡肽的方法。
多肽合成是一个重复添加氨基酸的过程，固相合成顺序一般从C端(羧基端)向N端(氨基端)合成。具体合成通过以下循环的步骤完成，Fmoc保护的载体去除氨基的保护基团，下一个氨基酸的羧基被一种活化剂所活化，活化的单体与游离的氨基反应交联，形成肽键。在此步骤需要使用大量的超浓度试剂驱使反应完成。然后使接肽反应反复循环直到合成完成得到肽树脂。将多肽从肽树脂上洗脱下来，其保护基团使用脱保护剂(TFA)洗脱和脱保护。本发明从多肽固相合成的原理触发进行努力研究开发出来。
发明内容
本发明目的在于提供一种固相合成人工E选择素的方法，提供了一种高效经济、生产稳定的工业化生产方法，弥补了现有技术中人工E选择素缺少合成工艺的缺陷。
为了解决现有技术中的这些问题，本发明提供的技术方案是：
一种固相合成人工E选择素的方法，其特征在于所述方法包括以下步骤：
(1)以芴甲氧羰基保护的Rink Amide Resin为载体，按照固相多肽合成的方法依次连接Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Tyr(otBu)，获得肽树脂；
(2)将肽树脂脱去芴甲氧羰基保护后使用切肽试剂对肽树脂切肽，获得人工E选择素粗品；
(3)对人工E选择素粗品采用高效液相柱层析法分离纯化获得人工E选择素。
优选的，所述方法步骤(1)通过以下步骤完成接肽反应：
(a)脱去芴甲氧羰基反应：将Rink Amide Resin树脂或Rink AmideResin固相合成形成的中间树脂在脱去芴甲氧羰基试剂存在的条件下20～30℃反应脱去Fmoc基团；
(b)缩合反应：按照接肽的顺序使脱去芴甲氧羰基的Rink Amide Resin树脂或Rink Amide Resin固相合成形成的中间树脂与活化的氨基酸单体在缩合剂存在的条件下反应形成接上新氨基酸的中间树脂；所述活化氨基酸单体使用的活化剂选自1-羟基苯并三唑；反应采用的缩合剂选用苯并三氮唑-N，N，N′，N′-四甲基脲六氟磷酸盐或N，N-二异丙基碳化二亚胺。
优选的，所述方法中脱去芴甲氧羰基的试剂是体积比为20％～25％六氢吡啶/N，N-二甲基甲酰胺的脱帽溶液。
优选的，所述方法中切肽试剂选用体积比为96∶4的三氟乙酸和对甲酚的混合试剂，所述切肽试剂与脱去芴甲氧羰基保护的肽树脂的质量比为1∶6；切肽反应的温度在20～40℃，反应时间为1.5～3小时。
优选的，所述方法中切肽后过滤去除树脂，真空减压浓缩滤液，加入甲基叔丁基醚将多肽沉淀，析出多肽并洗涤至白色，过滤减压干燥获得人工E选择素粗品。
优选的，所述方法中高效液相柱层析法分离纯化法为采用C18或C8柱分离纯化，采用的流动相为三氟乙酸∶乙腈的体积比为(0.1～100)∶(100～0.1)，检测波长为280nm，用液相色谱仪跟踪收集所需的流出液，样品峰合并后冷冻干燥得到人工E选择素干粉。
本发明技术方案中进行纯化可以采用Toyopearl TSK HW-40S柱(D＝2.5cm，H＝85cm，V＝240ml)分离纯化，采用，含5％乙腈的1N HAC为洗脱液，流速1.5ml/min做柱层析得到最终产品。
本发明先对载体Rink Amide Resin进行去保护，去除树脂的氨基的保护基团；然后加入羧基活化后的过量Fmoc-Gln(Trt)-OH，使活化后的Fmoc-Gln(Trt)-OH与树脂游离的氨基反应交联成肽键，形成初步肽树脂；然后以初步肽树脂为载体，通过上述的方法依次连接Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Tyr(otBu)，获得肽树脂；通过对肽树脂进行切割、分离纯化获得最终产品。
本发明技术方案氨基酸单体加入反应前，必须进行羟基活化，使用1-羟基苯并三唑作为本发明优选的活化剂，使活化后的氨基酸单体与肽树脂上游离的氨基反应交联成肽键；交联后再去除已合成的肽的氨基保护基团。每次接肽反应前均需要进行Fmoc脱保护反应，使已合成的肽上氨基充分暴露。为了反应完全，本发明每次使用过量的氨基酸单体。
具体的，本发明的合成工艺可以按照如下步骤进行：
起始Rink Amide Resin 0.41mmol/g 100～200Mesch，1％DVB，加入30mlDCM溶胀。以25％六氢吡啶/DMF脱去Fmoc基团，再以DCM，dmf，dcm交替洗涤10余次。将Fmoc-Gln(Trt)-OH(过量4倍)，HoBT(活化剂)，HBTU(缩合剂)和DIEA溶于DMF中，将此活化的保护氨基酸加入上述溶胀后的树脂中。室温反应2～3小时后，取少量肽树脂，以灵敏茚三酮试剂测定残余氨基。如反应完全，则以DMF，DCM洗涤至无剩余的Fmoc-Gln(Trt)-OH。依次类推再从多肽的C端至N端逐个合成上Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Tyr-OH。如茚三酮显阳性则重复合成一次。合成结束，干燥肽树脂，树脂增重符合理论值。
然后进行裂解和去保护基步骤：将肽树脂按每1g加入10ml(TFA∶p-cresol＝96∶4)的切割液，于室温振摇反应1小时，过滤去树脂，以少些TFA洗涤肽树脂，合并滤液。真空减压浓缩去除大部分溶剂。加入10倍量MTBE(四甲基醚)。将多肽沉淀，析出，再以MTBE洗至白色，过滤，干燥得干粉。
最后进行人工E-选择素的分离纯化步骤：以sephadex G10，1N HAC为洗脱液，做柱层析。所得样品再高压液相柱层析，C8，λ＝280nm，BufferA：0.1％TFA，Buffer B：0.08％TFA，90％乙腈。
本发明技术方案中，常用的缩写具有以下含义：
Fmoc：9-芴甲氧羰基，用于保护α-氨基，其在碱性条件下可以迅速脱除。
tBU：叔丁基；
MTBE，甲基叔丁基醚(methyl tert-butyl ether)；
HOBt：1-羟基苯并三唑；
HBTU：苯并三氮唑-N，N，N′，N′-四甲基脲六氟磷酸盐；
HAC：N，N-二异丙基碳化二亚胺；
DIEA：N，N-二异丙基乙胺；
DCM：二氯甲烷；
LEU为亮氨酸；Ala为丙氨酸；Thr为苏氨酸；Glu：谷氨酸；Ile：异亮氨酸；Tyr：酪氨酸；His：组氨酸；
Boc：叔丁氧羰基；
TFA：三氟乙酸；
DMF：N，N-二甲基甲酰胺；
Piperidine：六氢吡啶；
Fmoc-Rink Amide Resin采用Rink Amide-MBHA Resin：Product NO.：HCRAm04-1-1，Lot NO.：GRMH0706，规格：0.42mmol/g、100～200mesh、1％DVB，生产厂商：和成(Tianj ing Nankai Hecheng Sci&Tech.Co.Ltd.)。
Kniser Test检测试剂为：茚三酮。DVB为交联度。
保护氨基酸原料购自美国Applied Biosysterms公司和吉尔生化。DMF需经处理，采用3A分子筛浸泡，用FDNB(2，4硝基氟苯)OD≤0.15处理。六氢吡啶使用前重蒸处理。
经蛋白序列测定，E-选择素的测定结果与理论值相同，均为H-YTHLVALQ-NH2。E-选择素的分子量：943.09，E-选择素的疏水性＞50％。
相对于现有技术中的方案，本发明的优点是：
本发明采用固相多肽合成工艺进行人工E选择素的合成，具有工业化规模生产的潜力，工艺较为稳定，原材料来源方便，生产周期短，生产成本低，收率高，质量稳定。而且采用的切肽试剂为三氟乙酸和对甲基苯酚的混合液进行切肽，具有收率高的特点。本发明技术方案经分离纯化后，产品的收率在25％左右。
附图说明
下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述：
图1为本发明实施例通过HPLC高效液相层析进行纯化人工合成E-selectin的色谱图；
图2为本发明实施例通过HPLC高效液相法进行鉴定人工合成E-selectin的色谱图；
图3为本发明实施例通过质谱法进行鉴定人工合成E-selectin的色谱图。
具体实施方式
以下结合具体实施例对上述方案做进一步说明。应理解，这些实施例是用于说明本发明而不限于限制本发明的范围。实施例中采用的实施条件可以根据具体厂家的条件做进一步调整，未注明的实施条件通常为常规实验中的条件。
实施例1E-selectin(YTHLVAIQ-NH2)的制备
(1)原料准备和鉴定：
Rink Amide-MBHA Resin：Product NO.：HCRAm04-1-1，Lot NO.：GRMH0706，规格：0.42mmol/g、100～200mesh、1％DVB，生产厂商：和成(Tianj ing Nankai Hecheng Sci&Tech.Co.Ltd.)。
保护氨基酸原料购自美国Applied Biosysterms公司和吉尔生化，并需对这些原料进行鉴定，鉴定结果如表1所示，所购原料符合要求。
表1保护氨基酸原料的测定结果
DMF的处理：3A分子筛浸泡，用FDNB(2，4硝基氟苯)OD≤0.15。(以下所用DMF都是处理过的DMF)。
六氢吡啶处理：重蒸。
(2)具体合成步骤：
1)合成Fmoc-QTrt-树脂：
脱Fmoc步骤：称取5g(0.42mmol/g)Rink Amide-MBHA Resin基础树脂加入30ml DCM溶胀2小时或过夜。现配25％(V/V)重蒸六氢吡啶/DMF脱帽溶液30ml，25℃搅拌反应脱Fmoc，用DMF洗涤两次，DCM洗涤两次，DMF再洗涤4次。
缩合步骤：称取基础树脂(0.42＊5＝2.1mmol)四倍量的Fmoc-QTrt8.4mmol(MW：610)5.13g和四倍量的HOBT(MW：135)1.28g置于试管中，加入20mlDMF搅拌至全部溶解，加入四倍量的DIEA(MW：129.25)1.3g并补加5mlDMF，最后加入四倍量的HBtU(MW：379.25)3.5g，搅拌至全溶后，将溶液全部倒入脱帽的树脂中，25℃旋转反应2-3小时。
茚三酮检测：取样做Kaised(茚三酮)测定：取少量肽树脂置于小玻璃管中，以无水甲醇洗涤3次，吸出甲醇，沉淀的树脂做茚三酮测定，以脱帽的树脂作阳性对照，测定结果样品为阴性，说明缩合完全。测定通过后，滤干反应溶液，肽/树脂用30ml DMF洗涤两次，30mlDCM洗涤两次，30mlDMF洗涤4次。
2)合成Fmoc-I-QTrt树脂
脱Fmoc步骤：现配25％(V/V)重蒸六氢吡啶/DMF脱帽溶液30ml，25℃搅拌反应脱Fmoc，用DMF洗涤两次，DCM洗涤两次，DMF再洗涤4次。
缩合步骤：称取树脂(0.42＊5＝2.1mmol)四倍量的Fmoc-Ile-OH 8.4mmol(MW：353.4)3.49g和四倍量的HOBT(MW：135)1.26g置于试管中，加入20mlDMF搅拌至全部溶解，加入四倍量的DIEA(MW：129.25)1.3g并补加5mlDMF，最后加入四倍量的HBtU(MW：379.25)3.5g，搅拌至全溶后，将溶液全部倒入脱帽的树脂中，25℃旋转反应2-3小时。
茚三酮检测：取样做Kaised(茚三酮)测定：取少量肽树脂置于小玻璃管中，以无水甲醇洗涤3次，吸出甲醇，沉淀的树脂做茚三酮测定，以脱帽的树脂作阳性对照，测定结果样品为阴性，说明缩合完全。测定通过后，滤干反应溶液，肽/树脂用30ml DMF洗涤两次，30mlDCM洗涤两次，30mlDMF洗涤4次。
3)合成Fmoc-A-I-QTrt树脂
脱Fmoc步骤：现配25％(V/V)重蒸六氢吡啶/DMF脱帽溶液30ml，25℃搅拌反应脱Fmoc，用DMF洗涤两次，DCM洗涤两次，DMF再洗涤4次。
缩合步骤：称取树脂(0.42＊5＝2.1mmol)四倍量的Fmoc-Ala-OH 8.4mmol(MW：311.34)2.52g和四倍量的HOBT(MW：135)1.26g置于试管中，加入20mlDMF搅拌至全部溶解，加入四倍量的DIEA(MW：129.25)1.3g并补加5mlDMF，最后加入四倍量的HBtU(MW：379.25)3.5g，搅拌至全溶后，将溶液全部倒入脱帽的树脂中，25℃旋转反应2-3小时。
茚三酮检测：取样做Kaised(茚三酮)测定：取少量肽树脂置于小玻璃管中，以无水甲醇洗涤3次，吸出甲醇，沉淀的树脂做茚三酮测定，以脱帽的树脂作阳性对照，测定结果样品为阴性，说明缩合完全。测定通过后，滤干反应溶液，肽/树脂用30ml DMF洗涤两次，30mlDCM洗涤两次，30mlDMF洗涤4次。
4)合成Fmoc-V-A-I-QTrt树脂
脱Fmoc步骤：现配25％(V/V)重蒸六氢吡啶/DMF脱帽溶液30ml，25℃搅拌反应脱Fmoc，用DMF洗涤两次，DCM洗涤两次，DMF再洗涤4次。
缩合步骤：称取树脂(0.42＊5＝2.1mmol)四倍量的Fmoc-Val-OH 8.4mmol(MW：339.40)2.85g和四倍量的HOBT(MW：135)1.26g置于试管中，加入20mlDMF搅拌至全部溶解，加入四倍量的DIEA(MW：129.25)1.3g并补加5mlDMF，最后加入四倍量的HBtU(MW：379.25)3.5g，搅拌至全溶后，将溶液全部倒入脱帽的树脂中，25℃旋转反应2-3小时。
茚三酮检测：取样做Kaised(茚三酮)测定：取少量肽树脂置于小玻璃管中，以无水甲醇洗涤3次，吸出甲醇，沉淀的树脂做茚三酮测定，以脱帽的树脂作阳性对照，测定结果样品为阴性，说明缩合完全。测定通过后，滤干反应溶液，肽/树脂用30ml DMF洗涤两次，30mlDCM洗涤两次，30mlDMF洗涤4次。
5)合成Fmoc-L-V-A-I-QTrt树脂
脱Fmoc步骤：现配25％(V/V)重蒸六氢吡啶/DMF脱帽溶液30ml，25℃搅拌反应脱Fmoc，用DMF洗涤两次，DCM洗涤两次，DMF再洗涤4次。
缩合步骤：称取树脂(0.42＊5＝2.1mmol)四倍量的Fmoc-Leu-OH8.4mmol(MW：353.43)2.85g和四倍量的HOBT(MW：135)1.26g置于试管中，加入20mlDMF搅拌至全部溶解，加入四倍量的DIEA(MW：129.25)1.3g并补加5mlDMF，最后加入四倍量的HBtU(MW：379.25)3.5g，搅拌至全溶后，将溶液全部倒入脱帽的树脂中，25℃旋转反应2-3小时。
茚三酮检测：取样做Kaised(茚三酮)测定：取少量肽树脂置于小玻璃管中，以无水甲醇洗涤3次，吸出甲醇，沉淀的树脂做茚三酮测定，以脱帽的树脂作阳性对照，测定结果样品为阴性，说明缩合完全。测定通过后，滤干反应溶液，肽/树脂用30ml DMF洗涤两次，30mlDCM洗涤两次，30mlDMF洗涤4次。
6)合成Fmoc-HTrt-L-V-A-I-QTrt树脂
脱Fmoc步骤：现配25％(V/V)重蒸六氢吡啶/DMF脱帽溶液30ml，25℃搅拌反应脱Fmoc，用DMF洗涤两次，DCM洗涤两次，DMF再洗涤4次。
缩合步骤：称取树脂(0.42＊5＝2.1mmol)四倍量的Fmoc-His(Trt)-OH8.4mmol(MW：619.73)5.2g和四倍量的HOBT(MW：135)1.26g置于试管中，加入20mlDMF搅拌至全部溶解，加入四倍量的DIEA(MW：129.25)1.3g并补加5mlDMF，最后加入四倍量的HBtU(MW：379.25)3.5g，搅拌至全溶后，将溶液全部倒入脱帽的树脂中，25℃旋转反应2-3小时。
茚三酮检测：取样做Kaised(茚三酮)测定：取少量肽树脂置于小玻璃管中，以无水甲醇洗涤3次，吸出甲醇，沉淀的树脂做茚三酮测定，以脱帽的树脂作阳性对照，测定结果样品为阴性，说明缩合完全。测定通过后，滤干反应溶液，肽/树脂用30ml DMF洗涤两次，30mlDCM洗涤两次，30mlDMF洗涤4次。
7)合成Fmoc-TtBu-HTrt-L-V-A--I-QTrt树脂
脱Fmoc步骤：现配25％(V/V)重蒸六氢吡啶/DMF脱帽溶液30ml，25℃搅拌反应脱Fmoc，用DMF洗涤两次，DCM洗涤两次，DMF再洗涤4次。
缩合步骤：称取树脂(0.42＊5＝2.1mmol)四倍量的Fmoc-Thr(tBu)-OH8.4mmol(MW：397.48)3.34g和四倍量的HOBT(MW：135)1.26g置于试管中，加入20mlDMF搅拌至全部溶解，加入四倍量的DIEA(MW：129.25)1.3g并补加5mlDMF，最后加入四倍量的HBtU(MW：379.25)3.5g，搅拌至全溶后，将溶液全部倒入脱帽的树脂中，25℃旋转反应2-3小时。
茚三酮检测：取样做Kaised(茚三酮)测定：取少量肽树脂置于小玻璃管中，以无水甲醇洗涤3次，吸出甲醇，沉淀的树脂做茚三酮测定，以脱帽的树脂作阳性对照，测定结果样品为阴性，说明缩合完全。测定通过后，滤干反应溶液，肽/树脂用30ml DMF洗涤两次，30mlDCM洗涤两次，30mlDMF洗涤4次。
8)合成Fmoc-YtBu-TtBu-HTrt-L-V-A-I-QTrt树脂
脱Fmoc步骤：现配25％(V/V)重蒸六氢吡啶/DMF脱帽溶液30ml，25℃搅拌反应脱Fmoc，用DMF洗涤两次，DCM洗涤两次，DMF再洗涤4次。
缩合步骤：称取树脂(0.42＊5＝2.1mmol)四倍量的Fmoc-Tyr(tBu)-OH8.4mmol(MW：459.55)3.73g和四倍量的HOBT(MW：135)1.26g置于试管中，加入20mlDMF搅拌至全部溶解，加入四倍量的DIEA(MW：129.25)1.3g并补加5mlDMF，最后加入四倍量的HBtU(MW：379.25)3.5g，搅拌至全溶后，将溶液全部倒入脱帽的树脂中，25℃旋转反应2-3小时。
茚三酮检测：取样做Kaised(茚三酮)测定：取少量肽树脂置于小玻璃管中，以无水甲醇洗涤3次，吸出甲醇，沉淀的树脂做茚三酮测定，以脱帽的树脂作阳性对照，测定结果样品为阴性，说明缩合完全。测定通过后，滤干反应溶液，肽/树脂用30ml DMF洗涤两次，30mlDCM洗涤两次，30mlDMF洗涤4次。
9)合成H-YtBu-TtBu-HTrt-L-V-A-I-QTrt树脂
脱Fmoc步骤：现配25％(V/V)重蒸六氢吡啶/DMF脱帽溶液30ml，25℃搅拌反应脱Fmoc，用DMF洗涤两次，DCM洗涤两次，DMF再洗涤4次。无水乙醇洗涤两次，干燥，得到肽树脂，6.8g
裂解和去保护基步骤：将肽树脂6g按每1g加入10ml(TFA∶p-cresol＝96∶4)的切割液，于室温振摇反应1小时。过滤去树脂，以少些TFA洗涤肽树脂，合并滤液。真空减压浓缩去除大部分溶剂。将浓缩的TFA反滴至MTBE(四甲基醚)。将多肽沉淀，析出，再以MTBE洗至白色。过滤，干燥得干粉0.95g，理论上能得到1.46g粗肽。产率：65.07％。
实施例2E-selectin(YTHLVAIQ-NH2)的制备
材料准备类似实施例1，E-selectin(YTHLVAIQ-NH2)的制备在多路多肽合成仪上完成。接肽反应在30℃反应进行，反应2～3小时。最后产率在67.33％。
实施例3E-selectin(YTHLVAIQ-NH2)的纯化
制备得到的粗肽以TSK 40S(D＝2.5cm，H＝85cm，V＝240ml)，含5％乙腈的1N HAC为洗脱液，流速1.5ml/min做柱层析，回收率50％。HPLC纯化的条件：上样量：100mg，溶解于含有5％乙腈的50％醋酸；Buffer：含5％乙腈的1N醋酸；流速1.5ml/min；检测波长280nm；有三个峰P1，P2，P3，收集P2，冷冻干燥得松软固体。如图1，纯度达97％。纯化使用的TLC薄板层析条件(DCM∶MeOH∶HAC＝90∶8∶2)。HPLC高效液相层析，C18柱，Buffer A 0.1％TFA，Buffer B为含0.1％TFA 100％乙腈，洗脱梯度：0～5mins，0％Buffer B；5～35mins，40％～100％Buffer B；35～45mins，100％Buffer B；45～50mins，100％buffer A。
实施例4E-selectin(YTHLVAIQ-NH2)的鉴定
采用高效液相法和质谱联合方法进行鉴定：
高效液相条件(HPLC)：Agilent ZORBAX，4.6mm×250mm；C18，λ＝280nm，洗脱梯度：Buffer A：0.1％TFA，Buffer B：0.1％TFA90％腈。梯度：0～5mins，0～10％bufferB，5～45mins，10～80％buffer B，45～50mins，80～100％Buffer B，50～55mins，100％Buffer B，55～60mins，100％buffer A.收集保留时间24.6min的峰，再冷冻干燥，得到白色最终产品。结果如图2和表2所示，2号峰为E-selectin，E-selectin的纯度达97％。
表2高效液相的物质锋面积结果
Figure BDA0000056805650000121
质谱法的条件是：ABI公司Q-TRAP，电喷雾四极杆离子肼，LC-MS
如图3所示，LC-MS鉴定为944.2(m/z，mass to charge ratio，质核比)，实测分子量944.2＊1-1＝943.2，符合理论分子量943.09。
实施例5人工E-选择素的氨基酸组成分析
对合成得到的人工E-选择素的氨基酸组成进行分析，结果如表3：
表3人工E-选择素的氨基酸组成分析结果
Figure BDA0000056805650000122
上述实例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人是能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所做的等效变换或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种固相合成人工E选择素的方法，其特征在于所述方法包括以下步骤：
（1）以芴甲氧羰基保护的Rink Amide Resin为载体，按照固相多肽合成的方法依次连接Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Tyr(otBu)，获得肽树脂；
（2）将肽树脂脱去芴甲氧羰基保护后使用切肽试剂对肽树脂切肽，获得人工E选择素粗品；
（3）对人工E选择素粗品采用高效液相柱层析法分离纯化获得人工E选择素。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述方法步骤（1）通过以下步骤完成接肽反应：
（a）脱去芴甲氧羰基反应：将Rink Amide Resin树脂或Rink Amide Resin固相合成形成的中间树脂在脱去芴甲氧羰基试剂存在的条件下20～30℃反应脱去Fmoc基团；
（b）缩合反应：按照接肽的顺序使脱去芴甲氧羰基的Rink Amide Resin树脂或Rink Amide Resin固相合成形成的中间树脂与活化的氨基酸单体在缩合剂存在的条件下反应形成接上新氨基酸的中间树脂；所述活化氨基酸单体使用的活化剂选自1-羟基苯并三唑；反应采用的缩合剂选用苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐或N,N-二异丙基碳化二亚胺。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述方法中脱去芴甲氧羰基的试剂是体积比为20%～25%六氢吡啶/N,N-二甲基甲酰胺的脱帽溶液。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述方法中切肽试剂选用体积比为96：4的三氟乙酸和对甲酚的混合试剂，所述切肽试剂与脱去芴甲氧羰基保护的肽树脂的质量比为1：6；切肽反应的温度在20～40℃，反应时间为1.5～3小时。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于所述方法中切肽后过滤去除树脂，真空减压浓缩滤液，加入甲基叔丁基醚将多肽沉淀，析出多肽并洗涤至白色，过滤减压干燥获得人工E选择素粗品。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述方法中高效液相柱层析法分离纯化法为采用C18或C8柱分离纯化，采用的流动相为三氟乙酸：乙腈的体积比为（0.1～100）：（100～0.1），检测波长为280nm，用液相色谱仪跟踪收集所需的流出液，样品峰合并后冷冻干燥得到人工E选择素干粉。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
吴刚和张世明: "人工合成E-选择素对大鼠脑缺血再灌注损伤保护作用的实验研究", 《中国临床神经科学》, vol. 16, no. 2, 31 December 2008 (2008-12-31), pages 120 - 125 *
张世明和周岱: "人工合成E-选择素治疗鼠局灶脑缺血再灌注损伤的探讨", 《中风与神经疾病杂志》, vol. 17, no. 6, 31 December 2000 (2000-12-31), pages 333 - 334 *

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