CN102241732A - 一种脂肽化合物的纯化方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种脂肽化合物的纯化方法，尤其是一种达托霉素的沉淀方法：达托霉素溶液经浓缩后控制溶液浓度，调节pH，加入沉淀促进剂以及助滤剂，搅拌沉淀。该方法得到沉淀物重新溶解后，可以采用诸如反相色谱、离子交换等方法直接进行精制。本发明的方法具有经济、环保、适宜商业化等优点。

Description

一种脂肽化合物的纯化方法
技术领域
本发明涉及一种脂肽化合物的纯化方法，尤其是一种达托霉素的沉淀方法。
背景技术
革兰氏阳性菌感染以及细菌耐药性的迅速增加重新引起了人们开发新型抗生素的兴趣，其中一类是脂肽抗生素，包括达托霉素。达托霉素是一环脂肽类抗生素，用于治疗由一些革兰氏阳性敏感菌株引起的并发性皮肤及皮肤结构感染，如脓肿、手术切口感染和皮肤溃疡。还可以用于由金黄色葡萄球菌引起的右侧感染性心膜炎；与RIE或复杂性皮肤与软组织感染并发的由金黄色葡萄球菌引起的菌血症。专利WO01/53330、EP0294990A公开了一种达托霉素的制备方法，其中从发酵液中富集达托霉素主要通过大孔吸附、离子交换等完成，这些方法使用有机溶剂且树脂再生时产生大量废水。专利WO02055537A1公开了一种达托霉素的萃取分离方法，该方法用到大量正丁醇，成本高，环保压力大。因此迫切需要一种经济、环保、适宜商业化的达托霉素富集方法。
脂肽化合物由于其特殊的亲水性母环及憎水性脂肪链，在水溶液中容易以胶团形式存在。可以通过改变胶团的稳定性，使胶团凝聚沉淀，达到分离纯化效果。该方法具有不使用有机溶剂、三废少、经济、适合商业化生产等优点。但是尚没有任何报道公开过使用该方法分离达托霉素。
发明内容
本发明的目的是提供一种脂肽化合物的纯化方法，尤其是一种达托霉素的沉淀方法，该方法得到的沉淀物重新溶解后，可以采用诸如反相色谱、离子交换等方法直接进行精制。该方法具有经济、环保、适宜商业化的优点。
本发明提供一种脂肽化合物的纯化方法，包括如下步骤：
步骤(1)：发酵液预处理：通过过滤使脂肽化合物发酵液与菌丝体分离得到脂肽化合物滤液；
步骤(2)：滤液浓缩：步骤(1)得到的脂肽化合物滤液用纳滤膜浓缩得脂肽化合物的纳滤浓缩液；
步骤(3)：沉淀：步骤(2)得到的脂肽化合物的纳滤浓缩液调解pH后，向其中加入沉淀促进剂以及助滤剂进行沉淀；
步骤(4)：过滤：过滤分离母液得到沉淀物。
在本发明的优选实施方案中，其中所述脂肽化合物优选自晶霉素、安福霉素、天冬菌素、沙阿霉素、A1437、A-21978C、A-54145、津枝霉素、达托霉素，更优选达托霉素。
在本发明的优选实施方案中，其中所述脂肽化合物的纳滤浓缩液浓度优选≥2g/L。
在本发明的优选实施方案中，其中所述步骤(2)得到的脂肽化合物的纳滤浓缩液调解pH，pH优选为1.0-6.0，更优选3.0-4.5，最优为3.6。
在本发明的优选实施方案中，其中所述沉淀促进剂优选自电解质、絮凝剂、聚电解质等。
在本发明的优选实施方案中，其中所述电解质优选一价、二价或三价盐；更优选包括但不限于明矾、三氯化铝、三氯化铁、硫酸锌、硫酸铵、氯化钠；最优选的电解质为硫酸铵、氯化钠。电解质用量以使纳滤浓缩液中脂肽化合物析出为准，优选使脂肽化合物的纳滤浓缩液中电解质浓度达到1.0-4mol/L。
在本发明的优选实施方案中，其中所述絮凝剂优选自聚丙烯酰胺、聚乙烯亚胺、聚合铝盐、聚合铁盐。絮凝剂用量以使纳滤浓缩液中脂肽化合物析出为准，优选絮凝剂用量为：使絮凝剂在脂肽化合物的纳滤浓缩液中的体积百分含量为2％-8％(w/v，单位为g/mL)所需的量。
在本发明的优选实施方案中，其中所述聚电解质优选自羧甲基纤维素、海藻酸盐、聚丙烯酸等。聚电解质用量以使纳滤浓缩液中脂肽化合物析出为准，优选聚电解质用量为：使聚电解质在脂肽化合物的纳滤浓缩液中的体积百分含量为2％-10％(w/v，单位为g/mL)所需的量。
在本发明的优选实施方案中，其中所述助滤剂优选自硅藻土、珍珠岩。优选助滤剂用量为纳滤浓缩液中脂肽化合物的2-10倍。
在本发明的优选实施方案中，其中所述的沉淀优选在0-40℃温度下进行，更优选温度为0-15℃。
本发明根据脂肽化合物特殊的亲水性母环及憎水性脂肪链，在水溶液中容易以胶团形式存在的性质，通过控制脂肽化合物溶液的浓度、pH、并向脂肽化合物溶液中加入沉淀促进剂以及助滤剂，且在适合的温度下改变胶团的稳定性，使胶团凝聚沉淀，达到分离纯化脂肽化合物的效果。本发明方法具有不使用有机溶剂、三废少、经济、适合商业化生产等优点。本发明方法得到沉淀物重新溶解后，可以采用诸如反相色谱、离子交换等方法直接进行精制。
具体实施方式
以下实施例仅用于进一步说明本发明，而非用于限制本发明。，在本发明的构思前提下对本发明制备方法的简单改进都属于本发明要求保护的范围。
本发明采用HPLC方法对溶液进行定量检测，分析方法如下：
流速：1.0mL/min
检测波长：210nm
流动相：A：pH4.5 0.5％NH4H2PO4溶液；B：乙腈；A与B以2∶1混合
色谱柱：PHENOMENEX Ib_Sil C8 250*4.6mm 5μm
色谱系统：SHIMADZU SPD-20A
实施例1：达托霉素的纯化
达托霉素发酵液30L，加硅藻土过滤得到滤液，滤液用纳滤膜浓缩至5g/L，体积约6L。用1N盐酸调节pH3.6。搅拌下加入360g NaCl，加60g硅藻土，控制温度15℃，搅拌1小时，过滤得到滤饼102g，滤饼重新溶解过滤得到滤液1L，检测结果显示达托霉素的浓度为17.9g/L，计算收率为60％。
实施例2：达托霉素的纯化
按实施例1处理达托霉素发酵液，浓缩至3.5L，分析结果显示达托霉素的浓度为8.2g/L。用1N盐酸调节pH4.5。搅拌下加入819gNaCl，加95g硅藻土，控制温度0℃搅拌1小时，过滤得到滤饼171g，滤饼重新溶解过滤得到滤液1.2L，检测结果显示达托霉素的浓度为20.8g/L，计算收率为87％。
实施例3：达托霉素的纯化
按实施例1处理达托霉素发酵液，浓缩至2.5L，分析结果显示达托霉素的浓度为12g/L。用1N盐酸调节pH2.0。搅拌下加入660g硫酸铵，加300g硅藻土，控制温度10℃搅拌1小时，过滤得到滤饼411g，滤饼重新溶解过滤得到滤液1.3L，检测结果显示达托霉素的浓度为21.8g/L，计算收率为94.4％。
实施例4：达托霉素的纯化
取浓度为8g/L的达托霉素发酵浓缩液2L，用1N盐酸调节pH3.6。搅拌下加入40g聚丙烯酰胺，加80g珍珠岩，控制温度5℃搅拌3小时，过滤得到滤饼123g，滤饼重新溶解过滤得到滤液0.8L，检测结果显示达托霉素的浓度为9.5g/L，计算收率为47.5％。
实施例5：达托霉素的纯化
取浓度为8g/L的达托霉素发酵浓缩液2L，用1N盐酸调节pH3.6。搅拌下加入100g聚乙烯亚胺，加80g硅藻土，控制温度10℃搅拌3小时，过滤得到滤饼141g，滤饼重新溶解过滤得到滤液1L，检测结果显示达托霉素的浓度为12.2g/L，计算收率为76％。
实施例6：达托霉素的纯化
取浓度为8g/L的达托霉素发酵浓缩液2L，用1N盐酸调节pH3.6。搅拌下加入160g聚丙烯酰胺，加80g硅藻土，控制温度10℃搅拌3小时，过滤得到滤饼152g，滤饼重新溶解过滤得到滤液1.2L，检测结果显示达托霉素的浓度为11.8g/L，计算收率为89％。
实施例7：达托霉素的纯化
取浓度为8g/L的达托霉素发酵浓缩液2L，用1N盐酸调节pH3.6。搅拌下加入40g羧甲基纤维素，加80g珍珠岩，控制温度15℃搅拌3小时，过滤得到滤饼128g，滤饼重新溶解过滤得到滤液1L，检测结果显示达托霉素的浓度为7.3g/L，计算收率为45.6％。
实施例8：达托霉素的纯化
取浓度为8g/L的达托霉素发酵浓缩液2L，用1N盐酸调节pH3.6。搅拌下加入120g海藻酸钠，加80g珍珠岩，控制温度8℃搅拌3小时，过滤得到滤饼142g，滤饼重新溶解过滤得到滤液1.1L，检测结果显示达托霉素的浓度为9.8g/L，计算收率为61.5％。
实施例9：达托霉素的纯化
取浓度为8g/L的达托霉素发酵浓缩液2L，用1N盐酸调节pH3.6。搅拌下加入200g聚丙烯酸，加80g硅藻土，控制温度10℃搅拌3小时，过滤得到滤饼162g，滤饼重新溶解过滤得到滤液1.2L，检测结果显示达托霉素的浓度为9.3g/L，计算收率为70％。

Claims (17)

1.一种脂肽化合物的纯化方法，其特征在于包括脂肽化合物的纳滤浓缩液调解pH后，向其中加入沉淀促进剂、助滤剂进行沉淀的步骤，其中所述的脂肽化合物选自晶霉素、安福霉素、天冬菌素、沙阿霉素、A1437、A-21978C、A-54145、津枝霉素、达托霉素。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述的脂肽化合物为达托霉素。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述的脂肽化合物的纳滤浓缩液的浓度≥2g/L。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述的pH为1.0-6.0，优选为3.0-4.5，更优选为3.6。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述的沉淀促进剂选自电解质、絮凝剂、聚电解质。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述的电解质选自一价、二价或三价盐。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述的盐选自明矾、三氯化铝、三氯化铁、硫酸锌、硫酸铵、氯化钠。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述的盐用量为：使所述盐在脂肽化合物的纳滤浓缩液中达到1-4mol/L浓度所需的量。
9.根据权利要求5所述的方法，其中所述的絮凝剂选自聚丙烯酰胺、聚乙烯亚胺、聚合铝盐、聚合铁盐。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述的絮凝剂用量为：使絮凝剂在脂肽化合物的纳滤浓缩液中的体积百分含量为2-8％(W/V，单位为g/mL)所需的量。
11.根据权利要求5所述的方法，其中所述的聚电解质选自羧甲基纤维素、海藻酸盐、聚丙烯酸。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述的聚电解质的用量为：使聚电解质在脂肽化合物的纳滤浓缩液中的体积百分含量为2-10％(W/V，单位为g/mL)所需的量。
13.根据权利要求1所述的方法，其中所述的助滤剂选自硅藻土、珍珠岩。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述的助滤剂的用量为纳滤浓缩液中脂肽化合物的2-10倍。
15.根据权利要求1所述的方法，其中所述的沉淀在0-40℃温度下进行，优选温度为0-15℃。
16.根据权利要求1所述的方法，其特征在于还包括过滤分离母液得到沉淀物的步骤。
17.根据权利要求1所述的方法，其特征在于包括以下步骤：
步骤(1)：发酵液预处理：通过过滤使脂肽化合物发酵液与菌丝体分离得到脂肽化合物滤液；
步骤(2)：滤液浓缩：步骤(1)得到的脂肽化合物滤液用纳滤膜浓缩得脂肽化合物的纳滤膜浓缩液；
步骤(3)：沉淀：步骤(2)得到的脂肽化合物的纳滤膜浓缩液调解pH后，向其中加入沉淀促进剂以及助滤剂进行沉淀；
步骤(4)：过滤：过滤分离母液得到沉淀物。
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