CN102232963A

CN102232963A - 一种建立溃疡性结肠炎化学诱癌动物模型的方法

Info

Publication number: CN102232963A
Application number: CN2010101537720A
Authority: CN
Inventors: 郑萍; 郑海明; 赵航
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2010-04-22
Filing date: 2010-04-22
Publication date: 2011-11-09

Abstract

本发明涉及生物医学领域，具体涉及一种溃疡性结肠炎化学诱癌的动物模型，建立该模型的方法及其用途。本发明采用雌性Balb/c小鼠，一次性AOM腹腔注射联合三循环DSS喂养，造模时间可缩短为9周，最终得到3％和5％DSS两种模型，病理分期分别为中度不典型增生和重度不典型增生或原位癌，可分别适用于筛选预防药物和研究分子机制。本发明缩短了常规造模时间，所述方法简便，结果稳定、实用。本发明提供一种建立溃疡性结肠炎化学诱癌模型的方法，本发明所提供方法建立的动物模型具有重要的实用价值和理论研究价值。

Description

一种建立溃疡性结肠炎化学诱癌动物模型的方法

技术领域本发明涉及生物医学领域，具体涉及炎症性肠病、结肠原位癌及动物模型制备领域，更具体涉及一种溃疡性结肠炎化学诱癌的动物模型，以及建立该模型的方法及其用途。

背景技术溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，UC)是一类病因未明的肠道非特异炎性疾病，本病具有难治性、易复发、癌变倾向的特点。调查发现，溃疡性结肠炎患者结直肠癌的发生率10年为2％，20年为8％，30年之后达18％。在UC患者的死因中，癌症占到10％～15％的比例，UC致癌已成为当前研究的热点之一。由于临床研究中收集患者标本耗时长，且药物干预受诸多条件限制，相对来说动物模型是较理想的替代研究途径。目前报道的此类模型主要有自发型、基因工程型和化学诱变型，后者具有造模价格低、方法简便的特点，且能在病理及分子机制方面较好模拟人类肠炎相关的结直肠癌，可应用于大部分相关研究。当前建立的该种动物模型要么造模时间较长，多在20周左右，要么死亡率高、致癌效果不稳定，目前尚无成熟稳定的动物模型出现，因此建立一种科学性、重复性、稳定性的动物模型具有重要意义，可以此为基础深入探讨非特异性肠炎癌变的分子机制，并进一步研究药物治疗UC化学致癌的疗效及作用机制。

发明内容

本发明的目的一方面是建立一种溃疡性结肠炎化学诱癌的动物模型，提供该模型的具体方法，另一目的是提供上述模型的用途。

本发明第一方面是提供溃疡性结肠炎化学诱癌的动物模型的方法，包括以下主要步骤：

(i)实验前一天给以雌性Balb/c小鼠一次性腹腔注射偶氮氧甲烷(azoxymethane，AOM)作为致癌刺激，剂量为100mg/kg。

(ii)实验第一天在饮水中加葡聚糖硫酸钠(dextran sulfate sodium，DSS)饲喂，浓度为3％和5％，喂养一周，然后撤下药水改正常饮水喂养2周。

(iii)重复(ii)2个循环。

(iv)在第9周末处死小鼠，纵行剖开结肠，拍摄大体肿瘤，取肿瘤肠段福尔马林固定，切片HE染色观察肿瘤病理分期。

另一方面，本发明的用途包括：本实验最终得到两种浓度的癌变模型，3％DSS者病理为中度不典型增生，药物治疗可以逆转，适用于研究比较药物的疗效及新药抗癌治疗观察。5％DSS者病理为重度不典型增生或原位癌，对药物治疗不如3％DSS敏感，更适合于研究肠炎癌变的分子机制。

本发明的主要优点在于：造模时间缩短为9周，因此可缩短药物实验的时间。3％和5％两组死亡率低，仅有后组10％(1/10)的死亡率。实施方法简单，仅实验前腹腔注射一次致癌剂，后续采用DSS维持炎症方便。最主要优点在于两组的病理分期具有明显差异，即3％组均为中度不典型增生，而5％组为重度不典型增生或原位癌，说明本发明非常稳定、实用。

附图说明

图1为本发明结肠肿瘤大体观，标尺11～13cm处可见远端结肠肿瘤

图2为本发明正常结肠病理光镜图(HE，×400)

图3为本发明3％DSS组结肠肿瘤病理光镜图(HE，×400)

图4为本发明5％DSS组结肠肿瘤病理光镜图(HE，×400)

具体实施方式

实施例1 建立3％ DSS溃疡性结肠炎AOM化学致癌动物模型

1.1实施步骤：

1.1.1选取体重17～20g的4～6周龄雌性Balb/c小鼠20只，清洁级，由中科院上海实验动物中心提供，生产许可证号“SCXK(沪)2007-0005”，随机分为正常组和实验组，每组10只。DSS选取分子量3.6～5万Da。全部小鼠每周称量体重一次。正常组不做任何药物干预。实验组于实验前一天腹腔注射AOM 10mg/kg。实验第一天饮水换为3％DSS溶液，喂养一周，然后换正常饮水2周，这样3周算一个循环，如此总共进行3个循环共9周时间。

1.1.2 9周末全部小鼠眼球采血，离心分装，ELISA法备测C-反应蛋白(CRP)含量反应炎症活动度。全部小鼠处死，分离结肠，纵行剖开生理盐水洗净拍照。选取肿瘤部位(正常组选取结肠中间部位)肠段中性甲醛固定24小时，脱水石蜡包埋切片，做HE染色观察。

1.2现象及结果

1.2.1动物表现：

实验组动物在喂养3％DSS第3天开始出现稀便，第5～7天出现血便，肛门口可见大便粘附，小鼠精神不振，毛色粗糙，失去原有白亮光泽。换正常饮水一周内恢复正常。第2个循环换正常饮水2周内大便及毛色可恢复正常。在第3个循环，换正常饮水2周内大便及毛色不能恢复正常，至实验结束时小鼠仍有肛口稀便粘附。本实施方法无动物死亡。

1.2.2血CRP指标变化：

ELISA法检测实验组与正常组血浆CRP变化发现，CRP数值在实验组明显高于正常组，t-检验P＜0.05，差异有统计学意义，如表1所示

表1

1.2.3结肠肿瘤：

实验组大体观察肠腔狭窄，远端结肠多见突向肠腔的肿物，病理切片HE染色示肠上皮结构紊乱，上皮内中度不典型增生，如图3。

1.3结论：

3％DSS可引发小鼠结肠炎表现，同时血CRP指标反应肠炎的活动情况。实验组小鼠无死亡例，结肠肿瘤病理证实有中度不典型增生形成，且结果稳定，证明建立3％DSS溃疡性结肠炎AOM化学致癌动物模型成功。

实施例2 建立5％DSS溃疡性结肠炎AOM化学致癌动物模型

2.1实施步骤：

2.1.1选取体重17～20g的4～6周龄雌性Balb/c小鼠20只，清洁级，由中科院上海实验动物中心提供，生产许可证号“SCXK(沪)2007-0005”，随机分为正常组和实验组，每组10只。DSS选取分子量3.6～5万Da。全部小鼠每周称量体重一次。正常组不做任何药物干预。实验组于实验前一天腹腔注射AOM 10mg/kg。实验第一天饮水换为5％DSS溶液，喂养一周，然后换正常饮水2周，这样3周算一个循环，如此总共进行3个循环共9周时间。

2.1.2 9周末全部小鼠眼球采血，离心分装，ELISA法备测C-反应蛋白(CRP)含量反应炎症活动度。全部小鼠处死，分离结肠，纵行剖开生理盐水洗净拍照。选取肿瘤部位(正常组选取结肠中间部位)肠段中性甲醛固定24小时，脱水石蜡包埋切片，做HE染色观察。

2.2现象及结果

2.2.1动物表现：

实验组动物在喂养5％DSS第1～2天开始出现稀便，第3天出现血便，肛门口可见血便粘附，笼具垫料下见大量黑便颗粒。小鼠明显精神不振，蜷缩少动，毛色粗糙，失去原有白亮光泽。换正常饮水一周内可恢复正常。第2个循环换正常饮水2周内毛色可恢复正常，2周内血便可减轻，但大便仍有稀便。在第3个循环，换正常饮水2周内不能恢复正常，至实验结束时小鼠仍有肛口血便粘附，并且体型瘦弱。实验第8周小鼠死亡一只，解剖观察见肝脏明显萎缩，因致癌剂AOM有较强的肝毒性，因此考虑死因可能为肝脏坏死。

2.2.2血CRP指标变化：

ELISA法检测实验组与正常组血浆CRP变化发现，CRP数值在实验组明显高于正常组，t-检验P＜0.05，差异有统计学意义，如表2所示。本组与3％组的CRP比较同样发现P＜0.05。

表2

2.2.3结肠肿瘤：

实验组大体观察肠腔明显狭窄，远端结肠多见突向肠腔的肿物，有的小鼠肠腔甚至被填满，病理切片HE染色示肠上皮结构紊乱，上皮内重度不典型增生或癌变，肿瘤未突破粘膜层。如图3。

2.3结论：

5％DSS较3％组结肠炎的表现加重，同时血CRP指标也证明炎症活动度加重。结肠肿瘤病理证实有重度不典型增生或原位癌，结果稳定，证明建立5％DSS溃疡性结肠炎AOM化学致癌动物模型成功。文献报道重度不典型增生或原位癌对药物治疗不敏感，同时有些实验室报道低度和中度不典型增生中发现基因突变的几率低，因此可将本发明用于进一步肠炎致癌的分子机制研究。

Claims

1.一种建立溃疡性结肠炎化学诱癌动物模型的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)小鼠随机分为正常组和实验组，每组10只。DSS选取分子量3.6～5万Da。全部小鼠每周称量体重一次。正常组不做任何药物干预。实验组于实验前一天腹腔注射AOM 10mg/kg。实验第一天饮水换为3％或5％DSS溶液，喂养一周，然后换正常饮水2周，这样3周算一个循环，如此总共进行3个循环共9周时间。

(2)9周末全部小鼠眼球采血，离心分装，ELISA法备测C-反应蛋白(CRP)含量反应炎症活动度。全部小鼠处死，分离结肠，纵行剖开生理盐水洗净拍照。选取肿瘤部位(正常组选取结肠中间部位)肠段中性甲醛固定24小时，脱水石蜡包埋切片，做HE染色观察。小鼠有精神不振、体型消瘦、毛色粗糙无光泽，血CRP升高，病理提示中度、重度不典型增生或原位癌，则该模型建立成功。

2.根据权利要求1所述的一种建立溃疡性结肠炎化学诱癌动物模型的方法，其特征在于选取动物为体重17～20g的4～6周龄雌性Balb/c小鼠。