CN102224163A

CN102224163A - 抗凋亡融合蛋白

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Publication number: CN102224163A
Application number: CN2009801463845A
Authority: CN
Inventors: 乌尔里希·坤赞多夫; 斯特凡·克劳特瓦德
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2008-11-10
Filing date: 2009-11-10
Publication date: 2011-10-19
Also published as: US9388219B2; ES2409607T3; JP2012508002A; US20110318318A1; EP2350121A1; WO2010052341A1; EP2184292A1; US20170152302A1; EP2350121B1; US10301375B2

Abstract

本发明涉及一种融合蛋白，该融合蛋白包括能够将融合蛋白引入哺乳动物细胞的蛋白转导结构域以及包含SEQ ID NO：1序列氨基酸的抗凋亡蛋白或其抗凋亡活性变异体或片段。本发明还涉及一种药物组合物，该药物组合物包含这种融合蛋白且尤其用于在有需要的患者体内阻断凋亡。本发明还提供一种编码这种融合蛋白的多核苷酸、一种包含该多核苷酸的表达载体和一种包含该表达载体的宿主细胞。另一方面，本发明涉及使用这些材料中的任一种来制备药物，用于在有需要的患者体内阻断凋亡。

Description

抗凋亡融合蛋白

技术领域

本发明涉及一种融合蛋白，该融合蛋白包括能够将该融合蛋白引入哺乳动物细胞的蛋白转导结构域以及包含SEQ ID NO：1序列氨基酸的抗凋亡蛋白或其抗凋亡活性变异体或片段。本发明还涉及一种药物组合物，该药物组合物包含所述融合蛋白，尤其用于在有需要的患者体内阻断凋亡。本发明还提供了一种编码所述融合蛋白的多核苷酸、一种包含该多核苷酸的表达载体和一种包含该表达载体的宿主细胞。另一方面，本发明涉及使用这些材料中的任一种来制备药物，用于在有需要的患者体内阻断凋亡。

背景技术

在多细胞生物中，细胞数量的调节对于机体的发育和其不同生命机能的维持是非常必要的。细胞凋亡是在发育的某一阶段不需要的细胞经历程序性细胞死亡的过程。例如，增殖和细胞凋亡的受到精确调节的相互作用是发育的胚胎中形成组织和器官的原因。细胞凋亡由许多不同的诱导物诱导并通过不同的途径进行。

外源性途径，尤其包括死亡受体配体(例如，TNF、TRAIL和CD95L)与细胞中各自的受体分子相结合，该结合最终激活半胱天冬酶(caspase)-8。通过使用如DNA损伤拓扑异构酶抑制剂阿霉素、依托泊苷和星孢菌素，TCR刺激，UV照射，DNA损伤等诱发内源性途径，导致细胞色素C从线粒体中释放，caspase-9被激活，以及通过颗粒酶B(granzyme B)依赖途径引起的caspase被激活。颗粒酶B可加工BID以及caspase-3和caspase-7，以引发细胞凋亡。这些途径相互联系，因此相互影响。凋亡的细胞一般表现出许多表征特点，如染色质凝聚、细胞收缩、细胞膜通透性增加和细胞核内DNA断裂。

受损的、增强的或有缺陷的细胞凋亡除了在发育过程中具有不同功能外，还涉及许多疾病或病理情况。例如，缺血和随后的再灌注会引起内源性和外源性途径诱导的细胞凋亡，该细胞凋亡会导致具有对机体至关重要功能的关键组织或器官的完全衰竭。例如，异常增强的细胞凋亡会导致肾衰竭和脑组织损伤。而且，已报道，增强的细胞凋亡还会带来胃肠疾病。相反，异常降低的细胞凋亡会引起不同形式的癌症。

尽管现有技术中已经提出了不同的细胞凋亡抑制剂，但是这些方法都还没有被证实在临床上适用。例如，已经对不同的抗凋亡蛋白作为治疗化合物进行了讨论。然而，目前这些蛋白的临床使用仅在使用转基因方法时才是可能的，而对经转基因方法治疗的患者存在不可预见的风险。因此，本发明的目的是提供安全并有效的治疗细胞凋亡异常增加的手段和方法。通过一种融合蛋白来实现该目的，其中该融合蛋白包括能够将融合蛋白引入哺乳动物细胞的蛋白转导结构域和如本文进一步定义的抗凋亡蛋白。

附图说明

图1示出了体外检测结果，证明TAT-CrmA能够阻断caspase-3(caspase-3是细胞凋亡的早期标志物)的活性。所用裂解液来自未处理过的Jurkat细胞(A)、经抗Fas抗体处理的Jurkat细胞(B)、或经TAT-CrmA处理后再加入抗Fas抗体的Jurkat细胞(C)。

图2示出了通过测量膜电位变化，对细胞凋亡的测定。分别在添加星孢菌素(staurosporine)或抗Fas抗体之前经融合蛋白TAT-CrmA处理细胞，可部分消除被这些诱导物诱导的细胞中的膜电位损失。

图3示出了通过流式细胞仪(fluorescence-activated cell sorting，FACS)分析法检测细胞凋亡(异硫氰酸荧光素(FITC)标记膜联蛋白(Annexin)V)，使用与TAT-CrmA和抗Fas抗体一起孵育的Jurkat细胞(A)、未处理的Jurkat细胞(B)或仅与抗Fas抗体一起孵育的Jurkat细胞(C)。与只使用抗Fas抗体的实验相比，使用TAT-CrmA的实验中出现凋亡的细胞数量明显减少。

图4描述了使用融合蛋白TAT-CrmA的小鼠的体内研究结果。融合蛋白有效保护小鼠免受Fas介导的体内细胞凋亡。

图5描述了接受融合蛋白TAT-CrmA的小鼠的体内研究结果。融合蛋白有效保护小鼠免受阿霉素诱导的体内细胞凋亡。

图6示出了经伊文氏蓝和TTC染色测定的再灌注后梗塞尺寸的对比。

具体实施方式

根据本发明，意外地发现牛痘病毒细胞因子效应修饰蛋白A(Cytokine response modifier，CrmA)和蛋白转导结构域(如HIV Tat蛋白的蛋白转导结构域)结合产生了具有抗凋亡活性的融合蛋白，该融合蛋白在需要抗凋亡治疗的患者体内能够有效阻断细胞凋亡，这些患者患有体内细胞或组织中发生致病水平的细胞凋亡为特征的疾病。

因而，本发明提供了一种融合蛋白，所述融合蛋白至少包括下列组分：

(a)蛋白转导结构域，该蛋白转导结构域能够将融合蛋白引入哺乳动物细胞；

(b)包含SEQ ID NO：1序列氨基酸的抗凋亡蛋白或其抗凋亡活性变异体或片段。

对于治疗活性的蛋白或多肽的应用在很长时间内受到这些蛋白或多肽不能够跨越细胞膜屏障的限制。用作穿梭分子(如HIV Tat蛋白)的蛋白中的蛋白转导结构域(Protein Transduction Domain，PTD)的发现促进了大蛋白或多肽转导进靶细胞。蛋白转导结构域使得PTD-蛋白复合物以非受体依赖的方式进入细胞。目前已经识别了若干不同的PTD，例如，果蝇(Drosophila)的触角足(Antennapedia)蛋白、单纯疱疹病毒的VP22蛋白和源自HIV-1型的TAT蛋白。这些PTD通常由大约10至50个氨基酸组成，而且结构上有一些相似性。PTD的一个显著特征是包含几个碱性氨基酸，这些碱性氨基酸标志一种常规机制，这些分子通过该常规机制进入细胞。据推测，靶细胞表面上的乙酰肝素结构与PTD序列中的碱性氨基酸相互作用，最终导致整个分子转导入细胞中。

如本发明的文中所用，术语“融合蛋白”指非天然存在的杂合蛋白，包括至少两个不同的蛋白或蛋白片段。本发明的融合蛋白包括适用于将融合蛋白引入细胞，优选地引入需要抗凋亡治疗的患者的哺乳动物细胞的蛋白转导结构域。优选地，患者是人类患者，而本发明的融合蛋白要通过PTD进入的细胞是人类细胞，例如，器官组织的细胞(如肾组织)。原则上，可使用任何不会对与其融合或结合的抗凋亡蛋白的折叠产生不利影响的PTD。这就意味着，PTD不会对包含SEQ ID NO：1序列氨基酸的蛋白或其抗凋亡活性片段或其变异体的抗凋亡活性干扰达到破坏所需抗凋亡活性的程度。然而，应该理解，当特定融合蛋白具有其它有利特点时，如稳定性增加、保存期限延长或药理特性改进，如免疫原性降低，那么20％、30％、40％、50％、60％、70％或甚至高达80％的抗凋亡蛋白活性的缺失也是可以接受的。技术人员能够容易地评价给定的融合蛋白是否适合在所需的治疗环境中使用。

根据本发明优选方面，融合蛋白中使用的蛋白转导结构域源自果蝇的触角足蛋白、单纯疱疹病毒的VP22蛋白或人免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus，HIV)1型中的TAT蛋白。根据特别优选的实施例，融合蛋白包括源自HIV-1型Tat蛋白转导结构域的蛋白转导结构域。人免疫缺陷病毒1型Tat蛋白的蛋白转导结构域已经在本领域的许多出版物中有所描述，例如在Bhorade，R.等(2000)，Bioconjug.Chem.11：301-305中，Becker-Hapak，M.等(2001)，Methods 24：247-256中和Dietz，G.等(2002)，Mol.Cell Neurosci.21：29-37中。经突变研究发现，HIV Tat转导结构域的11个氨基酸的核心结构足以使蛋白透过细胞膜进行高效传递。HIV Tat转导结构域的最小结构由11-氨基酸序列YGRKKRRQRRR(SEQ ID NO：3)表示。因此，在优选实施例中，该融合蛋白包括蛋白转导结构域，该蛋白转导结构域包括或由SEQ ID NO：3的氨基酸序列或具有与其有至少80％，优选地至少95％一致度的氨基酸序列组成。

本发明的融合蛋白还包括另一个组分，SEQ ID NO：1的氨基酸序列或其抗凋亡活性片段或变异体。SEQ ID NO：1中提出的氨基酸序列描述了源自牛痘病毒的细胞因子效应修饰蛋白A(CrmA)蛋白的一级结构。已经证明该蛋白为细胞凋亡的有效抑制物。牛痘病毒通过在进化过程中产生抗凋亡蛋白，获得了保护该病毒用以增殖的宿主细胞的能力。与其它凋亡抑制物不同的是，CrmA通过同时抑制外源途径的caspase-1和caspase-8、内源途径的caspase-9和效应因子caspase-3、caspase-6和caspase-7起作用。由于有多种作用方式，CrmA是一个非常高效的凋亡抑制剂。

现有技术中进行了许多尝试以使用CrmA蛋白阻断体外(in vitro)系统和动物模型中的细胞凋亡。这些尝试是基于细胞系或转基因动物中CrmA蛋白的异源表达，异源表达的主要缺点是一旦表达载体被引入靶细胞，CrmA表达就不能停止。而本发明的独特优点在于可以在有限时间内抑制不希望的细胞凋亡。在需要短暂抑制细胞死亡的情况下，本发明的融合蛋白可以短时间抑制凋亡。研究表明，本发明的融合蛋白表现出约8小时的半衰期，这样可以很容易通过融合蛋白的给药频率来调整治疗的范围和持续时间。换言之，借助于蛋白转导结构域引入CrmA蛋白使得从业人员能够根据待治疗患者的临床情况调整抗凋亡治疗。

技术人员应该理解，由于病毒基因组的高突变率，会对牛痘病毒进行永久饰变。因此，在数据库中有CrmA蛋白的许多氨基酸序列，这些序列与SEQ IDNO：1的氨基酸序列有一个或多个氨基酸不同。如果这些CrmA变异体具有抗凋亡活性，就包含在本发明中。本文所用的SEQ ID NO：1蛋白变异体是通过一个或多个氨基酸取代、添加和缺失而与SEQ ID NO：1蛋白氨基酸序列不同的蛋白。一般而言，SEQ ID NO：1所示序列中的任何氨基酸残基都可被另一个氨基酸残基所取代，前提是产生的蛋白变异体仍然表现抗凋亡活性。例如，可通过Wender等(2000)，97(24)：13003-8中描述的方法进行抗凋亡活性的检测。尤其还包括与SEQ ID NO：1中所示氨基酸序列有5、10、15、20甚至25个氨基酸位点不同的蛋白变异体。

优选的，取代是保守取代，即用具有相似极性且功能相当的另一个氨基酸取代氨基酸残基。优选地，用作取代基的氨基酸残基选自与待取代氨基酸残基同族的氨基酸。例如，疏水残基可以用另一个疏水残基取代，或极性残基可以被另一个具有相同电荷的极性残基取代。可用于保守取代的功能同源性氨基酸包括，如非极性氨基酸诸如甘氨酸、缬氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、脯氨酸、苯基丙氨酸和色氨酸。不带电荷的极性氨基酸的例子包括丝氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、酪氨酸和半胱氨酸。带电的极性(碱性)氨基酸的例子包括组氨酸、精氨酸和赖氨酸。带电的极性(酸性)氨基酸的例子包括天冬氨酸和谷氨酸。

术语“变异体”还包括比SEQ ID NO：1序列更多氨基酸的蛋白序列，即蛋白序列中插入了一个或多个氨基酸。该插入原则上可能发生在SEQ ID NO：1蛋白的任何位置。该插入可能是相邻氨基酸的延伸，包括例如2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸。同样，术语“变异体”还包括与SEQ ID NO：1的蛋白相比缺失一个或多个氨基酸的蛋白序列。该缺失可能包括SEQ ID NO：1的蛋白上几个相邻的氨基酸残基，如2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸。一个特别优选的CrmA蛋白的变异体具有如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。该变异体尤其不同于SEQ ID NO：1的CrmA蛋白的是缺少SEQ ID NO：1上第55-57位的缬氨酸-丝氨酸-丙氨酸。该缺失不影响变异体的抗凋亡活性。SEQID NO：1蛋白变异体还可包含结构修饰，如经修饰的氨基酸例如通过磷酸化、糖基化、乙酰化、硫醇化、支化和/或环化改变的氨基酸。

通过氨基酸的取代、添加或缺失修改的SEQ ID NO：1的CrmA蛋白变异体通常显示与SEQ ID NO：1的CrmA蛋白有相当程度的氨基酸序列同源性或一致性。优选地，如果变异体的序列与SEQ ID NO：1的序列进行最优比对，氨基酸水平的同源性或一致性至少为70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。用于检测氨基酸同源性的方法和计算机程序是本领域公知的。

本发明还考虑了抗凋亡活性片段的使用，该抗凋亡活性片段源自SEQ IDNO：1的蛋白或其变异体。SEQ ID NO：1或其变异体的抗凋亡活性片段包含肽或多肽，该肽或多肽由于在蛋白的N-端和/或C-端缺失一个或多个氨基酸而不同于SEQ ID NO：1所示氨基酸序列或其变异体。例如，下列实施例中使用的融合蛋白的CrmA组分缺少SEQ ID NO：1中所述序列第1位的蛋氨酸残基，这意味着，该融合蛋白的CrmA组分实际上表示SEQ ID NO：1序列的片段。通过现有技术中详细描述的常用方法，本领域技术人员将能够确定SEQ ID NO：1所描述的序列或其变异体的其它活性片段。

优选地，本发明的融合蛋白还包含蛋白转导结构域和抗凋亡蛋白之间的连接子。只要可以保持CrmA部分的抗凋亡活性，并且融合蛋白仍然能有效地通过PTD进入细胞，则该连接子可包含任意数量的氨基酸。连接子通常包含5至30个氨基酸，优选地8至25个氨基酸，且更为优选地10至20个氨基酸。连接子通常包含几个甘氨酸残基，因为甘氨酸不太可能影响融合蛋白活性部位的蛋白折叠。融合蛋白还可包括附加的组分，例如亲和标签，该亲和标签促进融合蛋白和与该标签有亲和力的化合物结合。例如，亲和标签可以是多聚组氨酸标签，包含6至12个组氨酸残基，可与镍离子螯合基质特异性相互作用。本发明实施例使用的由SEQ ID NO：4描述的融合蛋白(表示为TAT-CrmA)包括一种用于蛋白纯化的6个组氨酸残基的标签。可选地，标签可以是允许在谷胱甘肽基质上进行蛋白纯化的谷胱甘肽-S-转移酶(glutathione-S-transferase)。其它亲和标签是本领域公知的。亲和标签-亲和配体对的非限制性例子包括麦芽糖结合蛋白(Maltose-Binding-Protein，MBP)和麦芽糖、亲和素和生物素、链霉结合肽和抗生蛋白链霉素或中性亲和素。可以通过将标签的编码序列融合/连接到感兴趣分子的cDNA上，从而将该亲和标签附着于该分子。其中亲和标签为肽或多肽，该标签能够很方便地与本发明的融合蛋白一起作为单一的表达产物被表达。在其它实施例中，可通过化学耦合反应使亲和标签附着。例如，生物素可化学耦合到融合蛋白上。

已证明当本发明的融合蛋白以适于递送治疗性蛋白的方式给药时，可有效抑制或阻断细胞凋亡。因此，本发明提供的融合蛋白用于阻断有需要的患者体内的细胞凋亡。该融合蛋白可用于如治疗失调性过量凋亡的疾病，诸如再灌注损伤、中风、心肌梗塞、中毒和缺血性器官衰竭、暴发性肝衰竭、艾滋病(Acquired Immune Deficiency Syndrome，AIDS)、神经退行性疾病、移植物抗宿主病、酒精诱导性肝硬化、脊髓损伤、急性白血病或病毒性肝炎。

优选地，本发明的融合蛋白作为药物组合物进行给药。因此，本发明还提供一种包含上述定义的融合蛋白的药物组合物。该药物组合物用于在有需要的患者体内阻断凋亡。尤其是，该组合物用于治疗再灌注损伤、中风、心肌梗塞、中毒和缺血性器官衰竭、暴发性肝衰竭、AIDS、神经退行性疾病、移植物抗宿主病、酒精诱导性肝硬化、脊髓损伤、急性白血病或病毒性肝炎。包含一种或多种治疗性蛋白的药物组合物的制备是药学领域的工作人员所熟知的。通常，该组合物被制备成液体溶液或悬浮液用于注射。当用于人类患者时，有效成分(即融合蛋白)可与药学上可接受的且可与融合蛋白兼容的赋形剂混合。本发明的药物组合物通常包含生理上可接受的载体及溶解或分散在该载体中的融合蛋白，二者一起作为有效成分。药学上可接受的载体包括例如水、生理盐水、林格氏溶液(Ringer’s Solution)或葡萄糖溶液。其它适用于包含本发明的抗凋亡融合蛋白的组合物的载体在标准教科书中有描述，例如在“Remington′s Pharmaceutical Sciences”，Mack Pub.Co.，New Jersey(1991)中。除了载体，本发明的药物组合物还可包含任何浓度的润湿剂、缓冲剂、稳定剂、染料、防腐剂等，前提是这些化合物不干扰本发明融合蛋白的抗凋亡活性。

可用不同的给药途径给需要抑制细胞凋亡的部位或器官提供融合蛋白。优选地，将药物组合物配制为用于全身给药，例如用于肠胃外给药。肠胃外给药包括静脉内、皮内、动脉内、皮下、局部、经粘膜或直肠给药。根据特别优选的实施例，将药物组合物配制为用于注射。

适用于注射的药物组合物通常包括无菌水溶液或水分散体，和用于临时配制无菌注射液或水分散体的无菌粉末。在正常制作和保存条件下，组合物还应该稳定。用于注射的组合物必须是无菌的，以避免在接受注射的患者体内产生严重的免疫反应。为保持无菌状态，药物组合物通常包含防腐剂，例如对羟苯甲酸酯、三氯叔丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等以抑制产品中微生物的生长。对于静脉内或动脉内给药，合适的载体可包括生理盐水、抑菌水、聚氧乙烯蓖麻油^TM(Cremophor EL^TM)(BASF)或磷酸缓冲生理盐水(Phosphate Buffered Saline，PBS)。载体可能是溶剂或分散介质，包括例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、液体聚乙二醇等)及适当的其混合物。通过在组合物中加入延迟吸收的药剂(如单硬脂酸铝或明胶)，可实现注射组合物的延长吸收。将所需量的有效成分(融合蛋白)加入具有一个或上述成分的组合的合适溶剂中，随后进行无菌过滤，以制备无菌注射液。同样地，通过将融合蛋白加入包含上述分散介质和上述其它可选成分的无菌赋形剂中，以制备水分散体。还可通过本领域已知的方法(如真空干燥或冷冻干燥)，以无菌粉末的方式提供融合蛋白，并用无菌液体重构粉末以产生用于注射的最终溶液，从而获得无菌溶液。可选地，根据本发明的药物组合物还可通过连续输注进行给药。

该药物组合物还可通过经粘膜或穿皮递送来给药。若经粘膜或穿皮给药，包含本发明融合蛋白的药物组合物会包含适于穿透皮肤或粘膜屏障的渗透剂。该渗透剂是本领域已知的，并且用于经粘膜给药的渗透剂包括例如去垢剂、胆盐和梭链孢酸衍生物。经粘膜给药可通过使用鼻喷雾剂或栓剂完成。对于穿皮给药，会将有效化合物配制成本领域通常已知的药膏、软膏、凝胶或乳膏。优选地，这些化合物制备成栓剂形式，并以传统栓剂为基质，例如可可脂和其它甘油酯，以用于直肠递送。

在一个实施例中，该活性化合物与载体一同制备，该载体(例如控释剂)保护肽免于从体内消除，该载体包含移植物和微胶囊递送系统。可使用可生物降解的具有生物兼容性的聚合物，如乙烯醋酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。制备控释剂的方法是本领域已知的。此外，还可制备缓释组合物。缓释制剂的合适例子包括固体疏水聚合物的半渗透基质，该基质为成形物质的形式，如薄膜或微胶囊。缓释基质的例子包括聚酯、水凝胶、聚乳酸、L-谷氨酸和L-谷氨酸-乙酯的共聚物、不可降解的乙烯醋酸乙烯酯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物等。

在另一个方面，本发明提供一种治疗有需要的患者体内的病理性细胞凋亡的方法，包括施用有效治疗剂量的如上所定义的抗凋亡融合蛋白。优选地，患者患有涉及失调性过量凋亡的疾病，例如再灌注损伤、中风、心肌梗塞、中毒和缺血性器官衰竭、暴发性肝衰竭、AIDS、神经退行性疾病、移植物抗宿主病、酒精诱导性肝硬化、脊髓损伤、急性白血病或病毒性肝炎。

抗凋亡融合蛋白的有效治疗剂量通常指给药时足以有效阻断或抑制待治疗患者体内靶器官或组织中细胞凋亡的剂量。通常，单位体重的融合蛋白剂量为约0.1mg每kg患者体重到约50mg每kg患者体重之间，且更优选的是约0.5mg每kg患者体重到约20mg每kg患者体重之间，且尤其更优选的是约1mg每kg患者体重到约10mg每kg患者体重之间。给药方案可包括每天施用该蛋白一次或多次。本领域技术人员应该理解，给予患者的融合蛋白的具体剂量将取决于几个因素，如患者的年龄和体重，以及待治疗医学症状的性质和严重程度。借助于常规实验，可确定每个个案中发挥所需治疗效果的剂量。

在另一个方面，本发明涉及编码如上所定义的融合蛋白的多核苷酸。编码本发明融合蛋白的多核苷酸可由DNA或RNA构成。编码本发明融合蛋白的多核苷酸是指指导所需融合蛋白表达的DNA或RNA分子。在SEQ ID NO：5中描述了编码本发明融合蛋白的示例性多核苷酸；该多核苷酸编码SEQ ID NO：4的TAT-CmrA融合蛋白。然而，应理解，由于遗传密码的简并性，该多核苷酸也包括虽然与SEQ ID NO：5的序列在一个或多个核苷酸位置上不同但可编码SEQ ID NO：1蛋白的其它多核苷酸。同样该多核苷酸也包括编码SEQ IDNO：1蛋白的变异体或片段的多核苷酸。

可以将编码本发明融合蛋白的多核苷酸在表达载体中克隆，以提供融合蛋白重组制备的方法。通常，表达载体是自我复制的DNA或RNA构建体，在其中插入感兴趣的多核苷酸，这样多核苷酸的编码序列以可操作方式与适当的调控元件连接，该调控元件使编码序列能够在宿主细胞中可控表达。多核苷酸表达所需的特定控制元件取决于所用的宿主细胞，且包括转录启动子、操纵基因、可提高mRNA表达水平的增强子、核糖体结合位点和合适的转录和翻译终止子。启动子可以是组成型启动子或诱导型启动子，例如通常使用的半乳糖激酶、尿甙基转移酶、磷酸甘油酸激酶、3-磷酸甘油醛脱氢酶、乙醇脱氢酶，或病毒性启动子(如源自SV40、巨细胞病毒(Cytomegalovirus，CMV)或鼠白血病病毒(Molony Murine Leukemia Virus，MMLV)等的启动子)等启动子。表达载体还包含用于宿主细胞内载体自我复制的复制起点，和一个或多个用于检测转染进宿主细胞的筛选标记物。

表达载体还可设计为用于在原核或真核宿主中表达重组蛋白。优选地，表达载体具有在宿主细胞内稳定复制的能力，这样编码感兴趣的融合蛋白的多核苷酸数量在细胞内增加。然而，还可能使用不能在细胞内复制，而仅允许融合蛋白瞬时表达的表达载体。可选地，还可使用能够整合到宿主细胞基因组上的表达载体，该宿主细胞被该表达载体转导或转染。本领域已知多种表达载体，这些表达载体适用于介导本发明抗凋亡融合蛋白在原核或真核宿主细胞中的表达。将表达载体引入宿主细胞的方法也在文献中有大量的讨论。很多不同的方法可用于将本发明的表达载体转导或转染进宿主细胞中，如电穿孔、显微注射、转化、转染、原生质体融合、微粒轰击等。

相应地，本发明还涉及一种宿主细胞，包含内有编码本发明融合蛋白的多核苷酸的表达载体。该细胞可源自原核生物或低等或高等真核生物。可被编码本发明融合蛋白的表达载体转导或转染的合适的原核生物包括，例如，细菌如枯草杆菌(Bacillus subtilis)、大肠杆菌(Escherichia coli，E.coli)等。可用于本发明方法的低等真核生物包括酵母，尤其是酵母(Saccharomyces)属的酵母(如酿酒酵母(S.cerevisiae)、拜耳氏酵母(S.bailii)、贝酵母(S.bayanus)、布拉酵母(S.boulardii)、啤酒酵母(S.carlsbergensis))、毕赤酵母(Pichia)属的酵母(如毕赤酵母(P.pastoris)、嗜甲醇比赤酵母(P.methanolica)和树干毕赤酵母(P.stipitis))或网柄菌(Dictyostelium)属的酵母(如盘基网柄菌酵母(D.discoideum))。高等真核生物包括动物细胞系，尤其是哺乳动物细胞系，如源自啮齿、灵长类和人的细胞系。根据本发明所使用的有用的细胞系包括中国仓鼠卵巢(Chinese hamster ovary，CHO)细胞系、大鼠婴肾(baby rat kidney，BRK)细胞系、马丁达比犬肾(Madin Darby canine kidney，MDCK)细胞系、NSO骨髓瘤细胞、猴肾COS细胞、人胚肾293细胞和癌细胞系(如SKBR3细胞、Jurket T细胞或HeLa细胞)。

包含编码本发明抗凋亡融合蛋白的多核苷酸的宿主细胞优选地为表达载体适用于指导在各自宿主细胞中表达的形式，可方便地用于制备融合蛋白。优选地，将表达载体引入宿主细胞，如此通过宿主细胞的增殖实现融合蛋白的表达。因此，本发明还提供了用于制备如本文所定义的融合蛋白的方法，包括在适合融合蛋白表达的条件下培养宿主细胞，该宿主细胞包含编码抗凋亡融合蛋白的多核苷酸或包含该多核苷酸的表达载体。

本发明提供的融合蛋白可以用来制备与所述融合蛋白结合的抗体。该方法包括使用融合蛋白对非人动物进行免疫接种，并从所述动物血清中获得对融合蛋白反应而产生的抗体。

因此，本发明还涉及使用本文所定义的融合蛋白或编码所述融合蛋白的多核苷酸，来制备用于在有需要患者体内阻断细胞凋亡的药物组合物。同样地，本发明还涉及使用包含编码本发明融合蛋白的多核苷酸的表达载体和包含该多核苷酸或表达载体的宿主细胞，来制备用于在有需要患者体内阻断细胞凋亡的药物组合物。优选地，这些材料用于制备治疗以下疾病的药物组合物：再灌注损伤、中风、心肌梗塞、中毒和缺血性器官衰竭、暴发性肝衰竭、AIDS、神经退行性疾病、移植物抗宿主病、酒精诱导性肝硬化、脊髓损伤、急性白血病或病毒性肝炎。

最后，本发明还设想了试剂盒，包含本发明融合蛋白、编码该融合蛋白的多核苷酸、包含编码该融合蛋白的多核苷酸的表达载体和/或包含多核苷酸或表达载体的宿主细胞。所述试剂盒可包含用于制备向患者给药的组合物的其它材料。例如，试剂盒可包含缓冲剂、稳定剂、载体等，用于在给药前与融合蛋白混合。所述试剂盒还包含使用所述组分制备药物组合物的说明书，该药物组合物用于在患有细胞凋亡增加性或失调性疾病的患者体内阻断细胞凋亡。例如，说明书可涉及向患者施用融合蛋白，例如按照优选的给药方案。如果试剂盒包含其内包含编码本发明融合蛋白的多核苷酸的表达载体，则该说明书还会涉及将所述载体引入合适的宿主细胞，以及适于表达和回收本发明融合蛋白的条件。

实施例

实施例1：TAT-CrmA的克隆和表达

使用Rneasy微型柱(RNeasy minicolumn)(Qiagen，Hilden，Germany(德国希尔登的Qiagen公司))从牛痘病毒引起的人的皮损中分离出总RNA。使用Thermoscript RT-PCR System(Invitrogen，Karlsruhe，Germany(德国卡尔斯鲁厄的Invitrogen公司))，正向引物(5′-CCGGGTACCGATATCTTCAGGGAAATCGCATC-3′，SEQ ID NO：6)和反向引物(5′-CCGGAATTCTTAATTAGTTGTTGGAGAGCAATATCTA-3′，SEQ ID NO：7)来产生cDNA。将PCR产物克隆到KpnI/EcoRI剪切的pTAT-载体上。基于pRSE(Invitrogen公司)构建载体。该载体包含用于纯化的6-组氨酸(histidine)前导和多克隆位点。在该载体中插入11-氨基酸TAT蛋白转导结构域的编码序列(见Green，M.和Loewenstein，P.M.(1988)，Cell 55：1179-1188)。

将得到的通过TAT-CrmA cDNA的选定菌落的质粒转化进入能够T7表达的l^q大肠杆菌(E.coli)(New England BioLabs公司)中，然后用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(最终浓度为0.4mM)在LB培养基中诱导表达。37℃诱导2小时后，通过离心(6500×g，10分钟，4℃)收集细胞，然后在结合缓冲液(500mM NaCI，20mM Tris-HCI，5mM咪唑(imidazole)，pH 7.9)中超声破碎。

实施例2：TAT-CrmA的纯化

将按照实施例1所得的悬浮液通过离心(14000×g，20分钟，4℃)进行澄清，并且使用预平衡的Ni-NTA柱(Qiagen，Hilden，Germany(德国希尔登的Qiagen公司))在常温常压下纯化包含融合蛋白的上清液。为了除去较高的细菌蛋白的背景污染，通过浓度逐步增加的咪唑对柱子进行洗涤。最后，用含有500mM NaCI、20mM Tris-HCI和100mM咪唑(pH 7.9)的洗脱缓冲液对目标蛋白进行洗脱。使用已在RPMI培养基中平衡的一次性PD-10(Sephadex G-25)脱盐柱去除盐。融合蛋白可在纯化后立即使用，或在+4℃或-20℃下保存。

实施例3：caspase活性的荧光分析

在用加有10％胎牛血清(Fetal Calf Serum，FCS)和青霉素-链霉素的RPMI培养基中培养人T淋巴细胞Jurkat细胞。在实验中，以1.0×10⁶个细胞/ml(cells/ml)的密度播种细胞。这些细胞为没有进行处理(A)、仅用100ng/ml抗Fas抗体(克隆7C11，Immunotech公司)处理(B)或者用500nM TAT-CrmA处理30分钟后加入抗Fas抗体(C)。通过吸走培养基并用冰冷(ice-cold)的PBS洗涤细胞两次来终止对细胞的诱导。随后，将细胞悬浮在冷的细胞裂解缓冲液(BD Biosciences公司)中，并在冰上孵育30分钟。然后裂解液单独与caspase-3的底物Ac-DEVD-AMC(Ac-天冬氨酰基-谷氨酰基-缬氨酰基-天冬氨酰基-氨甲基豆香素)孵育，或与该底物及caspase-3特异性抑制剂Ac-DEVD-CHO孵育，并且用荧光光谱测定法进行分析。对于每个反应，向50μl细胞裂解液中单独加入5μl重组的caspase-3底物(黑色)，或底物和caspase-3抑制剂(白色)，并在37℃下孵育1小时。在激发光波长为380nm和发射光波长为440nm下，用酶标仪(Infinite M200，Tecan公司)检测Ac-DEVD-AMC释放的AMC的量。

结果如图1所示。用抑制剂Ac-DEVD-CHO和caspase-3底物Ac-DEVD-AMC处理的细胞裂解液中没有发射荧光，表明caspase-3的活性被抑制(白色框)。未处理的细胞(A)中，在仅用Ac-DEVD-AMC而不用抑制剂孵育的细胞中也没有检测到显著的荧光(黑色框)，表明caspase-3在这些细胞中没有活性。相反，对于用抗Fas抗体处理的细胞(B)，在仅用Ac-DEVD-AMC孵育的细胞中检测到与氨甲基豆香素相关荧光的显著释放，证明caspase-3是有活性的。与(B)相比，在用抗Fas抗体和融合蛋白TAT-CrmA处理的细胞(C)中，与氨甲基豆香素相关的荧光有相当多的减少。这表明将细胞与融合蛋白TAT-CrmA进行预孵育抑制了caspase-3的活性，因此降低了细胞凋亡的程度。

实施例4：线粒体膜电位的测定

线粒体通透性的改变是细胞凋亡的早期标志，这种改变通过使用Mito-PT^TM试剂盒(Immunochemistry Technologies，LLC)检测膜电位的变化(Δψ)来检测。该试剂盒可区分非凋亡细胞(红色荧光)和凋亡细胞(绿色荧光)，可按照制造商的说明书使用。

每个实验中，使用2×10⁶个Jurkat T细胞，用DMSO(阴性，非诱导的细胞)、2.5μM星孢菌素或100ng/ml抗Fas抗体(凋亡，诱导的细胞)在37℃下处理4小时，然后用1×MitoPT^TM溶液标记15分钟。对于诱导的细胞，准备平行的实验处理，分别在添加星孢菌素或抗Fas抗体之前加入500nM TAT-CrmA。如上所述进行孵育和标记(37℃孵育4小时，用1×MitoPT^TM溶液标记15分钟)。在激发光波长为490nm和发射光波长为600nm下，用酶标仪(Infinite M200，Tecan公司)检测线粒体的降低Δψ。实验进行三个重复。

结果如图2所示。可以看出，在仅使用诱导细胞凋亡的星孢菌素或抗Fas抗体处理的细胞中观察到膜电位损失，而分别在添加星孢菌素或抗Fas抗体之前加入融合蛋白TAT-CrmA则消除了该膜电位的损失。

实施例5：Annexin V染色

使用FITC标记的Annexin V，通过FACS分析来定量检测细胞凋亡。Annexin V蛋白与细胞凋亡早期暴露在细胞表面的磷脂酰丝氨酸残基结合。对Jurkat细胞的处理有：与500nM TAT-CrmA孵育30分钟，然后加入抗Fas抗体，37℃下孵育4小时(A)；或不进行处理而与赋形剂在37℃下孵育4小时(B)；或者与100ng/ml抗Fas抗体(克隆7C11，Immunotech公司)在37℃下孵育4小时(C)。收集诱导后的细胞，用添加有2％FCS的RPMI洗涤，并根据制造商的说明书进行Annexin V染色(ApoAlert，Annexin V-FITC，BD Biosciences，Heidelberg，Germany(德国海德堡的BD Biosciences公司))。通过EPICS(Coulter，Krefeld，Germany(德国克雷费尔德的Coulter公司))进行荧光分析。使用EPICS System II软件分析流式细胞数据。

图3描述的标绘图显示单个代表性实验的结果。可以看出，与仅使用抗Fas抗体的实验(C)相比，在使用抗Fas抗体和TAT-CrmA的实验(A)中发生凋亡的细胞数量显著减少。经测定呈Annexin V阳性的染色有80％的减少，说明α-Fas诱导4小时后，细胞再与500nM TAT-CrmA孵育，可保护细胞免于外源性凋亡。

实施例6：抗Fas抗体介导的体内细胞凋亡

从查士睿华(Charles River)(Sulzfeld，Germany(德国苏尔茨费尔德))获得雌性Balb/c小鼠，在6到8周龄时用于实验。为了评估体内外源性凋亡途径，通过腹腔注射1mg/kg体重的单克隆功能性α-Fas抗体(monoclonal agonisticα-Fas antibo dy，α-Fas mAb)Jo-2(BD Pharmingen公司)来诱导凋亡。该抗体在Fas阳性细胞内诱导凋亡，并导致小鼠体内多器官衰竭。在存活研究中，两组小鼠(10只动物/组)仅接受抗Fas抗体Jo-2或接受与7.5mg/kg体重的TAT-CrmA组合。在注射α-Fas 20分钟和5分钟前，施用TAT-CrmA。

在施用α-Fas 5或8小时后，处死小鼠进行组织学分析。用丙酮固定切片，用苏木精-伊红(Haematoxylin-Eosin，HE)染色，并在200×和400×放大倍数下用光学显微镜观察。使用末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口端标记(TUNEL，In situ cell death detection kit，TMR red；Roche Molecular Biochemicals，Mannheim，Germany(TUNEL，细胞死亡原位检测试剂盒，TMR红色；德国曼海姆的罗氏分子生物化学药剂公司))标记多聚甲醛固定的组织切片(5μm)中的凋亡细胞。根据制造商的说明书进行染色。在200×和400×放大倍数下通过荧光显微镜可观察到TUNEL阳性细胞。用DAPI(Dianova，Hamburg，Germany(德国汉堡的Dianova公司))对细胞核进行复染。

与单独接受α-Fas mAb的小鼠相比，接受α-Fas抗体和TAT-CrmA的小鼠的累积存活率显著较好(图4)。接受α-Fas mAb和TAT-CrmA的小鼠中有90％存活超过3个月(图中示出的是第一天)，而α-Fas组的所有小鼠在开始的10个小时内死亡。单独用TAT-CrmA处理的小鼠都没显示任何毒性效应。

宏观上，α-Fas处理的动物中，肝脏看起来为深褐色，但是与对照相比，与TAT-CrmA伴随处理则保持肝脏的正常外貌。通过组织学评估证实α-Fas处理的动物有严重的结构性肝脏损伤。α-Fas处理的5和8小时后，HE染色的肝组织呈现严重的肝细胞死亡，而通过加入TAT-CrmA阻止了这种肝细胞死亡。TUNEL染色显示在TAT-CrmA处理的动物中没有细胞凋亡。这些结果显示本发明的融合蛋白能够保护小鼠免受抗Fas抗体诱导的体内细胞凋亡。

实施例7：阿霉素介导的体内细胞凋亡

从查士睿华(Charles River)(Sulzfeld，Germany(德国苏尔茨费尔德))获得雌性Balb/c小鼠，在6到8周龄时用于实验。通过腹腔注射阿霉素来诱导细胞凋亡。DNA损伤拓扑异构酶抑制剂阿霉素诱导细胞凋亡的内源性途径。在存活研究中，对两组小鼠(5只动物/组)的处理是，单次腹腔(intraperitoneal，i.p.)注射15mg/kg体重的阿霉素，并分别进行和不进行两次施用150μgTAT-CrmA。在注射阿霉素20分钟和5分钟前，施用TAT-CrmA。

在另外注射致命的阿霉素后，通过在开始的7天中每半天施用TAT-CrmA延长了存活时间(图5)。虽然所有经阿霉素处理的小鼠在31天内死亡，但是伴随接受腹腔注射TAT-CrmA的小鼠中显示有40％的存活率(n＝5，p＜0.05)(图5)。TAT-CrmA防止了阿霉素处理小鼠的器官衰竭。整体来看，这些结果为TAT-CrmA融合蛋白在体外和体内能有效抑制内源性和外源性凋亡途径提供了证据。

实施例8：TAT-CrmA在小鼠心肌梗塞后减小梗塞尺寸并改善心脏收缩功能

由于在缺血组织中，细胞凋亡是主要的病理事件，因此在患有心肌梗塞的小鼠模型中对TAT-CrmA进行测试。用盐酸氯胺酮(100mg/kg，i.p.)和甲苯噻嗪(4mg/kg，i.p.)对12周的雄性C57BL/6小鼠进行麻醉。气管插管后，用2％异氟烷维持麻醉。小鼠经短暂的冠状动脉结扎1小时后，进行再灌注24小时。通过伊文氏蓝和TTC(Triphenyltetrazolium Chloride，氯代三苯基四氮唑)染色测定风险区域和梗塞尺寸，并如Kempf，T等(2006)，Circ.Res.98：351-360中所述进行面积计算。在用2％异氟烷镇静的小鼠中用线性15-MHz传感器进行经胸超声心动图检测。记录[测定左心室舒张末期容积(left ventricular end-diastolic volume，LVEDV)和左心室收缩末期容积(left ventricular end-systolic volume，LVESV)]的长轴图像和M模式追踪。射血分数以百分数形式计算为[(LVEDV-LVESV)/LVEDV]×100。

在结扎左前降动脉(left anterior descending artery，LAD)之前，用7.5mg/kg体重的TAT-CrmA(i.p.)处理C57BL/6小鼠。结扎1小时后进行再灌注24小时。心肌梗塞期间处于风险区域在用赋形剂处理(30.5±4.2mm²)和用TAT-CrmA处理(32.8±9.1mm²)的小鼠中相当。相反，用伊文氏蓝和TTC染色测定表明，与TAT-CrmA处理(7.0±2.0mm²)的小鼠相比，赋形剂处理(11.6±2.8mm²)的小鼠中，再灌注后的梗塞尺寸显著较大(p＜0.05)(图6)。如超声波心动描记术测定，假手术小鼠的射血分数是71.0±3.7％。再灌注后，与赋形剂处理的小鼠的射血分数(22.6±1.7％)相比，TAT-CrmA处理的小鼠的射血分数(50.7±4.9％)的减小显著较少(p＜0.001)。随后，在相同的条件下，对缺血1小时后再灌注时施用TAT-CrmA的疗效进行分析。当再灌注开始的同时施用TAT-CrmA时，梗塞尺寸可减少约40％(表1)。与赋形剂处理的小鼠的射血分数23.2±4.9％相比，TAT-CrmA处理的小鼠的射血分数为39.3±4.2％，这与TAT-CrmA处理组中左心室收缩末期容积的显著减小相一致。赋形剂处理的小鼠心肌的苏木精-伊红染色的截面图显示梗塞的典型心肌形态学，包括心肌细胞空泡、水肿以及粒细胞和单核细胞的浸润。在TAT-CrmA处理的小鼠心脏组织中，这些组织学标志显著不明显。

因此，在急性缺血性梗塞期间，即使在再灌注开始的同时施用TAT-CrmA，TAT-CrmA也会保护心肌组织免于凋亡性的细胞死亡。通过TUNEL染色检测凋亡的心肌细胞，缺血-再灌注损伤后，与TAT-CrmA处理的同窝出生的仔畜相比，赋形剂处理的小鼠在梗塞边缘区域出现了更大尺寸的梗塞和更多凋亡的心肌细胞，这表明CrmA在体内限制了心肌组织损伤。

表1：缺血-再灌注研究的分析

Claims

1.一种融合蛋白，其特征在于，包括

(a)蛋白转导结构域，该蛋白转导结构域能够将融合蛋白引入哺乳动物细胞中；

2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述蛋白转导结构域源自人免疫缺陷病毒1型的Tat蛋白的转导结构域。

3.根据权利要求2所述的融合蛋白，其特征在于，所述蛋白转导结构域包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列或与SEQ ID NO：3的氨基酸序列至少有80％一致性的氨基酸序列。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白还包含所述蛋白转导结构域和所述抗凋亡蛋白之间的连接子。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白用于在有需要的患者体内阻断凋亡。

6.根据权利要求5所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白用于治疗再灌注损伤、中风、心肌梗塞、中毒和缺血性器官衰竭、暴发性肝衰竭、AIDS、神经退行性疾病、移植物抗宿主病、酒精诱导性肝硬化、脊髓损伤、急性白血病或病毒性肝炎。

7.一种药物组合物，其特征在于，包含权利要求1-6中任一项所述的融合蛋白。

8.根据权利要求7所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物用于在有需要的患者体内阻断凋亡。

9.根据权利要求8所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物用于治疗再灌注损伤、中风、心肌梗塞、中毒和缺血性器官衰竭、暴发性肝衰竭、AIDS、神经退行性疾病、移植物抗宿主病、酒精诱导性肝硬化、脊髓损伤、急性白血病或病毒性肝炎。

10.一种多核苷酸，其特征在于，编码权利要求1-6中任一项所述的融合蛋白。

11.一种表达载体，其特征在于，包含权利要求10所述的多核苷酸。

12.一种宿主细胞，其特征在于，包含权利要求10所述的多核苷酸或权利要求11所述的表达载体。

13.一种用于制备权利要求1-6中任一项所述的融合蛋白的方法，其特征在于，该方法包括在适合所述融合蛋白表达的条件下培养权利要求12所述的宿主细胞。

14.权利要求1-6任一项所述的融合蛋白、权利要求10所述的多核苷酸、权利要求11所述的表达载体或权利要求12所述的宿主细胞的应用，其特征在于，该融合蛋白、该多核苷酸、该表达载体或该宿主细胞用于制备在有需要的患者体内阻断凋亡的药物组合物。

15.根据权利要求14所述的应用，其特征在于，所述药物组合物用于治疗再灌注损伤、中风、心肌梗塞、中毒和缺血性器官衰竭、暴发性肝衰竭、AIDS、神经退行性疾病、移植物抗宿主病、酒精诱导性肝硬化、脊髓损伤、急性白血病或病毒性肝炎。

16.一种试剂盒，其特征在于，包含权利要求1-6中任一项所述的融合蛋白、权利要求10所述的多核苷酸、权利要求11所述的表达载体和/或权利要求12所述的宿主细胞。