CN109954136B - 人sDR5-Fc重组融合蛋白作为脑卒中治疗药物的应用 - Google Patents

人sDR5-Fc重组融合蛋白作为脑卒中治疗药物的应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了人sDR5‑Fc重组融合蛋白作为治疗脑卒中的药物中的应用，具体公开了一种人sDR5‑Fc重组融合蛋白在制备治疗脑卒中的药物中的应用，所述人sDR5‑Fc重组融合蛋白序列如SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3或SEQ ID No.4所示，或具有与SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3或SEQ ID No.4 95％以上同源性并具有相同功能的重组融合蛋白。本发明的sDR5‑Fc融合蛋白能显著降低脑卒中患者神经细胞凋亡。

Description

人sDR5-Fc重组融合蛋白作为脑卒中治疗药物的应用
技术领域
本发明涉及一种融合蛋白的用途，具体涉及一种人sDR5-Fc重组融合蛋白在作为制备治疗脑卒中的药物中的应用。
背景技术
1.脑卒中
“脑卒中”(cerebral stroke)又称“中风”、“脑血管意外”(cerebralvascularaccident，CVA)，是由于脑部血管突然破裂或因血管阻塞导致血液不能流入大脑而引起脑细胞死亡和脑组织损伤的一种急性脑血管疾病。
脑卒中包括缺血性脑卒中和出血性脑卒中，其中缺血性脑卒中约占脑卒中总数的75％～85％。出血性卒中的死亡率较高。据卫生部统计，我国每年脑卒中新发病250万人，死亡约150万人，是中国成年人残疾的首要原因。存活的患者中，约四分之三有不同程度致残，重度致残者约占40％。全国每年用于该病的治疗费用达100亿元以上，给国家和家庭造成沉重的经济负担。世界卫生组织预计，脑中风所导致的全球死亡人数将在2030年达到780万，因此，开展脑卒中治疗新药的研发具有重要的实用价值和社会意义。
2.脑卒中发病机制
目前公认的关于脑卒中的发病机制的学说主要有能量耗竭、兴奋性氨基酸毒性作用、梗死灶周边半暗带去极化、炎性细胞因子、一氧化氮和自由基损伤以及细胞凋亡等。脑卒中的病因及形成机制是复杂的，目前的研究资料尚不能充分阐明其本质。
传统观点认为，细胞坏死是缺血后神经细胞死亡的主要形式。Linnik等人的实验改变了上述观点，他们认为，细胞凋亡才是脑缺血后神经细胞死亡的主要形式，而不是传统认为的坏死。Macmanus的研究也指出，在大鼠脑缺血模型的半影区，发现有大量的细胞凋亡。随着进一步的研究，越来越多的证据表明，细胞凋亡参与缺血性细胞损害，作为脑缺血后迟发性神经元死亡的重要形式、与神经细胞坏死同时并存，在缺血缺氧性脑损伤中具有重要的病理生理学意义。
脑梗死病灶由两部分构成，分别为缺血中心区和半影区。发生脑梗死后，位于缺血中心区的脑细胞很快就死亡了，因为这个区域在脑梗死后即出现完全缺血或供血严重不足。而在缺血半影区，因侧枝循环的存在，在脑梗死刚发生的前几个小时仍然可以获得部分血液供应，这个时候的脑神经细胞虽然受到一定程度的损伤但尚存活，处于可逆状态。这时，如果能够抑制细胞死亡，及时恢复血液供给，就可消除脑代谢障碍，使缺血半影区神经细胞的功能得以恢复；否则，缺血半影区脑细胞将遭到不可逆性损伤。因此，干预缺血后神经细胞的凋亡过程、抢救半暗带的神经细胞是治疗脑梗死的有效方式。
3.脑卒中现有治疗药物
脑卒中的治疗方式主要包括手术治疗和药物治疗。其中对缺血性脑卒中，改善脑血循环和神经保护是研究的热点。改善脑血循环的措施主要是抗血栓治疗。抗血栓药分为溶栓药、抗血小板聚集药和抗凝血药。FDA唯一获准的药物只有组织型纤溶酶原激活剂(tissue plasminogen ativator，tPA)，该溶栓治疗用于缺血性脑卒中。但是，由于tPA治疗时间窗狭窄，禁忌证限制，并发症危险，仅3％～5％患者获得治疗；又因tPA治疗的血管再通率较低，使得这一疗法的总体有效性较低。
理论上，神经保护是治疗缺血性和出血性脑卒中的共性策略。因此，神经保护剂研发一直是这一领域的关注焦点。神经细胞保护的治疗目的在于延迟神经细胞死亡，以争取时间恢复脑灌注，挽救缺血半暗带部分残留的尚具活力的可逆性损伤的神经元和脑组织，延长治疗时间窗。神经细胞保护治疗不仅能增强神经细胞对缺血的耐受性，而且能调动内源性抗缺血和抗氧化机制，从而保护濒临死亡的神经细胞，促进神经功能的恢复。
2010年以来神经保护剂的临床研究主要有3方面：
1)靶向兴奋毒性。谷氨酸和钙离子在缺血性神经元死亡中发挥重要作用，被称为神经兴奋毒性(excitotoxicity)。作用于谷氨酸受体的药物(例如：硫酸镁，突触后致密蛋白95)在临床试验均显示无效。钙通道拮抗药可阻断谷氨酸下游信号通路钙内流，被认为可作为脑卒中治疗药物，且尼莫地平被用于临床治疗脑卒中。但是，迄今为止，大量临床试验循证医学证明，钙通道阻滞药治疗脑卒中未能获得治疗效果。
2)靶向氧化和硝化应激。氧化和硝化应激在缺血性脑损伤病理过程中扮演重要角色，中和氧化和硝化应激可作为潜在的脑卒中治疗策略。依达拉奉(edaravone)是日本2001年批准上市的自由基清除剂，可清除超氧阴离子、过氧化氢和羟自由基。该药也在我国被批准上市，广泛用于治疗缺血性脑卒中。然而针对8项临床试验的系统性回顾表明，依达拉奉在脑卒中患者治疗中的有效性无确凿证据。
3)靶向炎症损伤。脑缺血后会释放许多损伤相关模式分子，进而触发免疫应答，引起炎症反应。因此，免疫介导的炎症反应成为脑卒中治疗的研究靶点。芬戈莫德(fingolimod)是用于治疗多发性硬化症的新型免疫抑制剂。芬戈莫德是几种神经胺-1-磷酸盐受体的高亲和受体激动剂，阻止淋巴细胞从淋巴结外出，限制淋巴细胞浸润到脑，抑制小胶质细胞和巨噬细胞的局部激活。在临床试验中，脑卒中发生72h内给予芬戈莫德治疗，可限制继发性脑组织损伤，提高功能恢复；脑卒中发生4.5h内联合tPA用药可减少神经功能缺陷。那他珠单抗(natalizumab)是一个人源化的CD49d抗体，可阻断α4-整合素，被批准用于多发性硬化症的治疗。临床试验中，该药联合应用tPA，对脑梗体积无影响，但可改善认知功能。白细胞介素1受体拮抗剂(interleukin-1receptor antagonist，IL-1ra)是促炎因子IL-1的竞争性拮抗剂，被广泛用于治疗炎症性疾病。重组IL-1ra联合tPA或血管内血栓切除术治疗的临床研究进行到Ⅱ期。急性脑卒中后血浆中IL-1ra升高被证明与高感染风险有关。因此，该药的治疗护理需要格外小心。二甲胺四环素(minocycline)是一个四环素衍生物抗生素，可减少动物脑卒中后的细胞凋亡，抑制聚腺苷二磷酸核糖聚合酶1和基质金属蛋白酶的表达，进而表现出抗炎效果。临床试验表明，二甲胺四环素治疗窗时间较长，单独用药达4h，联合应用tPA可达6h；联合tPA用药时，不仅提供血管保护作用，而且减少tPA治疗引发的出血事件。但一项小型临床试验发现，脑卒中发生24h内静脉给予二甲胺四环素治疗对患者的致残率无改善作用。
总之，大量神经保护剂在经过上千项实验研究和上百项临床试验之后，最终被证明转化失败，使得脑卒中治疗药物研发成为世界性难题，研发新的安全有效的药物迫在眉睫。
4、sDR5、sDR5-Fc治疗脑卒中
TRAIL(tumor necrosis factor related apoptosis inducing ligand，肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体)是人类所发现的第10个肿瘤坏死因子超家族成员(tumornecrosis factor superfamily member10，TNFSF10)。人TRAIL含有281个氨基酸残基，是一种II型跨膜蛋白，其C端的胞外区形成三明治样片层的三聚体结构，有利于其与受体的结合。目前，已发现的TRAIL受体共有5种：TRAIL-R1(又称DR4)、TRAIL-R2(又称DR5)、TRAIL-R3(又称DcR1)、TRAIL-R4(又称DcR2)和骨保护素(osteoprotegerin，OPG)。其中，TRAIL-R1和TRAIL-R2为死亡受体，胞内具有死亡结构域(death domain，DD)，与TRAIL特异性结合后可通过死亡结构域变构激活、传导凋亡信号，诱导细胞凋亡。
已有研究表明，神经元表达TRAIL-R1、TRAIL-R2以及TRAIL-R3，脑血管内皮细胞也表达TRAIL-R2和TRAIL-R3。TRAIL可诱导神经元、少突胶质细胞等死亡。1999年，AnaMartin-villalba通过实验证实，TRAIL在出现缺血以后的脑组织中有表达，并且在脑梗死后的神经元凋亡中发挥着重要作用。在人脑卒中患者中，TRAIL和TRAIL受体的mRNA水平也升高，且TRAIL+CD11b+单核细胞的数量也增加。在急性脑梗死时，患者血清sTRAIL浓度与梗死面积有关，sTRAIL诱导的细胞凋亡可能是脑梗死后神经元损伤的重要因素之一。神经酰胺是中风引起的细胞应激反应、导致细胞死亡的关键性调节因子。高水平的神经酰胺能增加神经母细胞瘤细胞c-jun、FasL、TRAIL及TNF-α等凋亡信号的表达。以上结果表明，TRAIL通路的相关分子可能成为治疗脑卒中的关键药物靶点。
死亡受体5(Death Receptor 5，DR5)是TRAIL亲和力最高的受体，与TRAIL相结合后可引发细胞凋亡。人DR5蛋白由411个氨基酸组成，属于Ⅰ型跨膜蛋白，其184～206位氨基酸为跨膜区。可溶性DR5(soluble DR5,sDR5)为DR5不含跨膜区域的可溶性形式，因缺乏跨膜区域不能定位在细胞膜上而被分泌至细胞外。sDR5保留有与TRAIL配体相结合的活性，但不能向细胞内传导凋亡信号，可阻断TRAIL-DR5介导的细胞凋亡反应。并且sDR5是人体自身蛋白，具有毒性小、无免疫原性的优点，极具作为治疗脑卒中神经保护性药物的潜质。有研究表明：在短暂全脑缺血模型中，星形胶质细胞及激活的小胶质细胞、巨噬细胞TRAIL表达显著，而神经元却显著表达DR5，通过脑室注射毕赤酵母表达的全长人DR5胞外域[2]可以减少神经元细胞死亡[1]。因此，DR5具有作为脑卒中治疗新靶点的潜力。目前，sDR5-Fc对于脑卒中是否存在治疗作用，国内外尚无报道。
“脑卒中”具有高发病率、高致残率、高复发率、高死亡率和医疗费高等特点，是非常严重的健康和社会问题。在中国和全球，脑卒中分别为第一和第二致死以及主要致残原因。神经保护是治疗缺血性和出血性脑卒中的共性策略。神经细胞保护治疗能使脑梗死区面积相对缩小，有助于血管内皮的修复，能延长治疗时间窗，再配合其他药物的使用，其治疗效果和前景非常乐观。但目前所使用的神经保护药物在动物模型中虽然可取的明显的效果，但在临床应用中结果却不理想。另外，目前使用的神经保护药物因对人体有一定的毒性、故在临床应用时为避免毒性，使用剂量远低于动物实验中的有效剂量，导致达不到预期的治疗效果。因此，开发针对新靶点的神经保护治疗药物，具有非常重要的实用价值和社会意义。
发明内容
为了解决上述问题，本发明涉及一种人可溶性死亡受体5(soluble DR5，简称sDR5)-Fc抗体融合蛋白(sDR5-Fc)的药用用途，尤其是人sDR5-Fc抗体融合蛋白作为脑卒中治疗药物的应用。
由于sDR5-Fc融合蛋白通过与TRAIL分子结合，中和TRAIL，因此，可以阻断内源性TRAIL与DR5的结合，从而起到延迟神经元细胞凋亡的作用，以争取时间恢复脑灌注，挽救缺血半暗带部分残留的尚具活力的可逆性损伤的神经元和脑组织，延长治疗时间窗。本发明经实验证实，所述的人sDR5-Fc抗体融合蛋白在小鼠脑卒中模型中通过脑室注射或静脉注射途径均可明显减轻脑卒中后脑细胞死亡，降低脑组织损伤。
同时，人sDR5-Fc抗体融合蛋白来源于人体自身的蛋白，代谢产物为氨基酸，因此安全性较其它治疗药物更优。人sDR5-Fc抗体融合蛋白相对于已有的脑卒中治疗药物，选择了一种全新的治疗作用机理和靶点，因此能够与其它治疗药物联用，增强疗效，促进康复。另外人sDR5-Fc融合蛋白不仅可以通过脑室注射起效，而且可以通过静脉注射进行治疗脑卒中。一般脑室注射创伤较大，病人难以接受，采用静脉注射，病人的依从性会大大提高。综上所述，本发明作为治疗脑卒中的一种新型候选药物，作用机理新颖、靶点明确，疗效显著，给药方便，安全性高，极具开发潜力。
本发明一个方面提供了一种人sDR5-Fc重组融合蛋白在制备治疗或预防脑卒中的药物中的应用，所述人sDR5-Fc重组融合蛋白序列如SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ IDNo.3或SEQ ID No.4所示，或具有与SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3或SEQ IDNo.4 95％以上同源性并具有相同功能的重组融合蛋白。
本发明再一个方面提供了一种肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体拮抗剂在制备治疗或预防脑卒中的药物中的应用。
本发明再一个方面提供了一种肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体拮抗剂在制备降低缺血脑组织中神经细胞凋亡的药物中的用途。
本发明再一个方面提供了一种治疗或预防脑中风的方法，其包括给与受试者一种肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体拮抗剂。
本发明再一个方面提供了一种降低缺血脑组织中神经细胞凋亡的方法，其包括给与受试者一种肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体拮抗剂。
在本发明中，所述的肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体拮抗剂选自人sDR5-Fc重组融合蛋白，优选为，SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3或SEQ ID No.4所示，或具有与SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3或SEQ ID No.495％以上同源性并具有相同功能的重组融合蛋白。
本发明再一个方面提供了一种治疗脑中风的药物组合物，其包含sDR5-Fc重组融合蛋白序列或编码该蛋白序列的核苷酸序列及其药学上可接受的辅料。
所述的药物组合物为注射剂，可以为注射液、无菌注射用粉末等任意能够进行静脉注射或脑室注射的制剂形式。
本发明公开上述重组融合蛋白，可以和药学上可以接受的辅料一起组成药物制剂组合物从而更稳定地发挥疗效，制剂可为制药领域常用的混悬、水针、冻干等制剂，优选水针或冻干制剂，对于本发明公开的上述重组融合蛋白的水针或冻干制剂，药学上可以接受的辅料包括表面活性剂、溶液稳定剂、等渗调节剂和缓冲液之一或其组合，其中表面活性剂包括非离子型表面活性剂如聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯(吐温20或80)；Triton；十二烷基硫酸钠(SDS)；poloxamer(如poloxamer 188)；Pluronics；月桂硫酸钠；十四烷基、亚油基或十八烷基肌氨酸等，其加入量应使重组融合蛋白颗粒化趋势最小，溶液稳定剂可以为糖类，包括还原性糖和非还原性糖，氨基酸类包括谷氨酸单钠或组氨酸，醇类包括丙二醇、聚乙二醇、三元醇、高级糖醇之一或其组合，溶液稳定剂的加入量应该使最后形成的制剂在本领域的技术人员认为达到稳定的时间内保持稳定状态，等渗调节剂可以为氯化钠、甘露醇之一，缓冲液可以为TRIS、磷酸盐缓冲液、组氨酸缓冲液之一。
本发明再一个方面提供了一种治疗脑中风的药物组合物，其包含sDR5-Fc重组融合蛋白序列或编码该蛋白序列的核苷酸序列及至少一种治疗或预防脑中风的活性成分。
所述治疗或预防脑中风的活性成分选自血管扩张活性成分、微循环改善活性成分、扩充血容量活性成分、溶血栓活性成分、抗凝活性成分、钙离子拮抗剂、防血小板凝集活性成分、神经保护成分中的一种或多种，例如，尿激酶、链激酶、阿司匹林、尼莫地平、肝素、低分子右旋糖酐、潘丁生、单唾液酸四己糖神经节苷脂、奥拉西坦、鼠神经生长因子等。
在本发明中，所述“脑卒中”是指脑内分布的血管发生堵塞或破裂而导致脑组织受到障碍或达到坏死的疾病，该疾病通常也被称为“脑中风”，因此在本发明中这两个术语有时可互换使用。
本发明中sDR5-Fc重组融合蛋白在对包括人在内的动物给药时，给药剂量因病人的年龄和体重，疾病特性和严重性，以及给药途径而异，可以参考动物实验的结果和种种情况，总给药量不能超过一定范围。具体而言,静脉注射的剂量是0.001～3000mg/天。
有益效果：
1、本发明的sDR5-Fc融合蛋白能显著减少缺血脑组织中的神经细胞凋亡。
2、人sDR5-Fc抗体融合蛋白来源于人体自身的蛋白，代谢产物为氨基酸，因此安全性较其它治疗药物更优。
3、人sDR5-Fc抗体融合蛋白相对于已有的脑卒中治疗药物，选择了一种全新的治疗作用机理和靶点，因此能够与其它治疗药物联用，增强疗效，促进康复。
附图说明
图1为静脉注射溶剂或sDR5-Fc治疗脑缺血结果图。
图2为脑室注射溶剂或sDR5-Fc治疗脑缺血结果图。
图3为TUNEL染色结果图。
具体实施方式
通过以下实施例对本发明作进一步的说明，但本发明的保护范围并不局限于此。
实施例1实施例1重组sDR5-Fc表达序列的设计和重组
发明人经过长期的经验积累，构建融合蛋白，将人sDR5与Fc进行多种方式的融合，质谱分析结果显示目的蛋白N端不稳定，会出现多个氨基酸剪切，据此设计并制备多条氨基酸序列SEQ ID No.1～4，其中SEQ ID No.1的蛋白所含氨基酸数目最少，分子最小，且所含剪接异构体比例最低，在37度下为1％，而其它序列所含氨基酸数目均多于SEQ ID No.1，且剪接异构体比例也高，SEQ ID No.2为31％；SEQ ID No.3为49％；SEQ ID No.4为52％，均显著性高于SEQ ID No.1的剪接异构体比例，因此SEQ ID No.1的蛋白最小，纯度最优，最稳定。
SEQ ID No.1(341个氨基酸)：
SSPSEGLCPPGHHISEDGRDCISCKYGQDYSTHWNDLLFCLRCTRCDSGEVELSPCTTTRNTVCQCEEGTFREEDSPEMCRKCRTGCPRGMVKVGDCTPWSDIECVHKEEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK；
SEQ ID No.2(370个氨基酸)：
ITQQDLAPQQRAAPQQKRSSPSEGLCPPGHHISEDGRDCISCKYGQDYSTHWNDLLFCLRCTRCDSGEVELSPCTTTRNTVCQCEEGTFREEDSPEMCRKCRTGCPRGMVKVGDCTPWSDIECVHKEGSSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK；
SEQ ID No.3(359个氨基酸)：
ITQQDLAPQQRAAPQQKRSSPSEGLCPPGHHISEDGRDCISCKYGQDYSTHWNDLLFCLRCTRCDSGEVELSPCTTTRNTVCQCEEGTFREEDSPEMCRKCRTGCPRGMVKVGDCTPWSDIECVHKEEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK；
SEQ ID No.4(348个氨基酸)：
AAPQQKRSSPSEGLCPPGHHISEDGRDCISCKYGQDYSTHWNDLLFCLRCTRCDSGEVELSPCTTTRNTVCQCEEGTFREEDSPEMCRKCRTGCPRGMVKVGDCTPWSDIECVHKEEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
所述SEQ ID No.1-4融合蛋白的氨基端是人死亡受体5可溶片段；羧基端是人免疫球蛋白1(IgG1)的Fc片段。
所述的人死亡受体5可溶片段具有如SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID No.7或SEQ ID No.8所示的氨基酸序列，或具有与SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID No.7或SEQID No.8 95％以上同源性并具有相同功能的蛋白。
所述的人免疫球蛋白1(IgG1)的Fc片段序列如SEQ ID NO.9所示。
人死亡受体5可溶片段与人免疫球蛋白1的Fc片段之间直接连接。
SEQ ID NO.5(109个氨基酸，截短的人DR5胞外区)：
SSPSEGLCPPGHHISEDGRDCISCKYGQDYSTHWNDLLFCLRCTRCDSGEVELSPCTTTRNTVCQCEEGTFREEDSPEMCRKCRTGCPRGMVKVGDCTPWSDIECVHKE；
SEQ ID NO.6(138个氨基酸)：
ITQQDLAPQQRAAPQQKRSSPSEGLCPPGHHISEDGRDCISCKYGQDYSTHWNDLLFCLRCTRCDSGEVELSPCTTTRNTVCQCEEGTFREEDSPEMCRKCRTGCPRGMVKVGDCTPWSDIECVHKEGSSNTKVDKKV；
SEQ ID NO.7(127个氨基酸，全长的人DR5胞外区)：
ITQQDLAPQQRAAPQQKRSSPSEGLCPPGHHISEDGRDCISCKYGQDYSTHWNDLLFCLRCTRCDSGEVELSPCTTTRNTVCQCEEGTFREEDSPEMCRKCRTGCPRGMVKVGDCTPWSDIECVHKE；
SEQ ID No.8(116个氨基酸，截短的人DR5胞外区)：
AAPQQKRSSPSEGLCPPGHHISEDGRDCISCKYGQDYSTHWNDLLFCLRCTRCDSGEVELSPCTTTRNTVCQCEEGTFREEDSPEMCRKCRTGCPRGMVKVGDCTPWSDIECVHKE；
SEQ ID NO.9：
EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK。
实施例2人sDR5-Fc蛋白在小鼠缺血性脑卒中模型中的治疗效果研究
雄性C57BL/6小鼠，8～10周，30只，SPF级，体重26～28g，自由摄食和饮水，动物适应1周后进行实验。
实验分组如下：
Figure BDA0001507506340000101
造模方法如下：
异氟烷吸入性麻醉小鼠，颈部正中切口，分离双侧颈总动脉，待动物清醒后通过BCCA闭塞法(bilateral common carotid artery，闭塞20min)诱导短暂的全脑缺血，即用无创性动脉夹夹闭双侧颈总动脉20min。然后解除颈动脉夹，脑血流迅速恢复。缝合颈部切口。手术中监测体温，通过加热垫保持体温在36.5–37.5℃。使用血流监测仪监测大脑皮层的微灌注(3mm lateral to bregma)。只有在闭塞的第一分钟，小鼠的微灌注低于基线对照微灌注的20％，这样的小鼠才能用于后续试验。神经学指标，例如无反应性，翻正反射缺失，紧张性姿势和瞳孔扩张，被认为是前脑缺血的标志。未出现上述神经病学体征的动物弃之不用。假手术对照组动物经异氟烷麻醉，颈部正中切口，暴露双侧颈总动脉，但不闭塞，然后缝合颈部切口。在再灌注后的72h进行小鼠采血分离血清，血清冻存于-80度冰箱。处死小鼠取脑组织固定，石蜡包埋切片，TUNEL染色。
脑室给药方法：在再灌注后2h将小鼠放置在脑立体定位仪下，10μl sDR5-Fc药物或生理盐水通过微量控制注射器在600s内注射进脑室给药。用牙科钻在Bregma-0.58mm，中线右侧旁开1.2mm处将颅骨钻薄，将微量注射器快速垂直刺穿颅骨，深入2.2mm，即到达小鼠侧脑室，用微量注射器缓慢注入药物或溶剂。
静脉给药方法：在再灌注后2h经尾静脉注射100μl sDR5-Fc药物或生理盐水到小鼠体内。
通过荧光显微镜观察脑切片组织中的细胞凋亡情况，所有有核细胞均能被DAPI染上蓝色，而只有凋亡细胞会被TUNEL染上绿色，对TUNEL阳性细胞数量进行统计分析。实验结果参见附图1-3，其中附图1为静脉注射溶剂或sDR5-Fc治疗脑缺血结果图，通过图1可以看出通过注射sDR5-Fc，相比于溶剂对照组能够大幅降低TUNEL阳染细胞数量，而通过与假手术组进行对比可以发现，其基本上能够使小鼠脑细胞恢复至接近未发生脑缺血的状态。图2为脑室注射溶剂或sDR5-Fc治疗脑缺血结果图，其结果与经静脉注射组结果类似，sDR5-Fc组相比于溶剂对照组能够大幅降低TUNEL阳染细胞数量，而与假手术组相比可知，sDR5-Fc组基本上能够使小鼠细胞恢复至接近未发生脑缺血的状态。图3为典型TUNEL染色结果图；通过附图也可以直观的发现，假手术组中TUNEL阳染细胞几乎没有，而溶剂组阳染细胞数量较多，而sDR5-Fc组无论是通过静脉注射，还是通过脑室注射，TUNEL阳染细胞很少。通过实施例的结果可知，sDR5-Fc无论通过静脉注射还是脑室注射的方式均能大幅降低脑缺血小鼠脑组织中细胞的凋亡。无论是缺血性还是出血性脑卒中，无论具体的诱发病因是什么，脑卒中导致的最终结果均是脑细胞的大量死亡和脑组织损伤，从而导致病人的死亡或残疾。sDR5-Fc作为一种神经保护剂，能有效的减少脑细胞的死亡，降低脑卒中带来的脑组织损伤，提高治疗的预后效果。
参考文献：
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SEQUENCE LISTING
<110> 深圳市中科艾深医药有限公司
<120> 人sDR5-Fc重组融合蛋白作为脑卒中治疗药物的应用
<130> CP11701158C
<160> 9
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 341
<212> PRT
<213> 融合蛋白
<400> 1
Ser Ser Pro Ser Glu Gly Leu Cys Pro Pro Gly His His Ile Ser Glu
1 5 10 15
Asp Gly Arg Asp Cys Ile Ser Cys Lys Tyr Gly Gln Asp Tyr Ser Thr
20 25 30
His Trp Asn Asp Leu Leu Phe Cys Leu Arg Cys Thr Arg Cys Asp Ser
35 40 45
Gly Glu Val Glu Leu Ser Pro Cys Thr Thr Thr Arg Asn Thr Val Cys
50 55 60
Gln Cys Glu Glu Gly Thr Phe Arg Glu Glu Asp Ser Pro Glu Met Cys
65 70 75 80
Arg Lys Cys Arg Thr Gly Cys Pro Arg Gly Met Val Lys Val Gly Asp
85 90 95
Cys Thr Pro Trp Ser Asp Ile Glu Cys Val His Lys Glu Glu Pro Lys
100 105 110
Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu
115 120 125
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
130 135 140
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
145 150 155 160
Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
165 170 175
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser
180 185 190
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
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Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala
210 215 220
Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
225 230 235 240
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln
245 250 255
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
260 265 270
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
275 280 285
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu
290 295 300
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
305 310 315 320
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
325 330 335
Leu Ser Pro Gly Lys
340
<210> 2
<211> 370
<212> PRT
<213> 融合蛋白
<400> 2
Ile Thr Gln Gln Asp Leu Ala Pro Gln Gln Arg Ala Ala Pro Gln Gln
1 5 10 15
Lys Arg Ser Ser Pro Ser Glu Gly Leu Cys Pro Pro Gly His His Ile
20 25 30
Ser Glu Asp Gly Arg Asp Cys Ile Ser Cys Lys Tyr Gly Gln Asp Tyr
35 40 45
Ser Thr His Trp Asn Asp Leu Leu Phe Cys Leu Arg Cys Thr Arg Cys
50 55 60
Asp Ser Gly Glu Val Glu Leu Ser Pro Cys Thr Thr Thr Arg Asn Thr
65 70 75 80
Val Cys Gln Cys Glu Glu Gly Thr Phe Arg Glu Glu Asp Ser Pro Glu
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Met Cys Arg Lys Cys Arg Thr Gly Cys Pro Arg Gly Met Val Lys Val
100 105 110
Gly Asp Cys Thr Pro Trp Ser Asp Ile Glu Cys Val His Lys Glu Gly
115 120 125
Ser Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
130 135 140
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
145 150 155 160
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
165 170 175
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
180 185 190
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
195 200 205
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
210 215 220
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
225 230 235 240
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
245 250 255
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
260 265 270
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
275 280 285
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
290 295 300
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
305 310 315 320
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
325 330 335
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
340 345 350
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
355 360 365
Gly Lys
370
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<212> PRT
<213> 融合蛋白
<400> 3
Ile Thr Gln Gln Asp Leu Ala Pro Gln Gln Arg Ala Ala Pro Gln Gln
1 5 10 15
Lys Arg Ser Ser Pro Ser Glu Gly Leu Cys Pro Pro Gly His His Ile
20 25 30
Ser Glu Asp Gly Arg Asp Cys Ile Ser Cys Lys Tyr Gly Gln Asp Tyr
35 40 45
Ser Thr His Trp Asn Asp Leu Leu Phe Cys Leu Arg Cys Thr Arg Cys
50 55 60
Asp Ser Gly Glu Val Glu Leu Ser Pro Cys Thr Thr Thr Arg Asn Thr
65 70 75 80
Val Cys Gln Cys Glu Glu Gly Thr Phe Arg Glu Glu Asp Ser Pro Glu
85 90 95
Met Cys Arg Lys Cys Arg Thr Gly Cys Pro Arg Gly Met Val Lys Val
100 105 110
Gly Asp Cys Thr Pro Trp Ser Asp Ile Glu Cys Val His Lys Glu Glu
115 120 125
Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
130 135 140
Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
145 150 155 160
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
165 170 175
Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
180 185 190
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
195 200 205
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
210 215 220
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu
225 230 235 240
Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
245 250 255
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260 265 270
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
275 280 285
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
290 295 300
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
305 310 315 320
Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser
325 330 335
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
340 345 350
Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
355
<210> 4
<211> 348
<212> PRT
<213> 融合蛋白
<400> 4
Ala Ala Pro Gln Gln Lys Arg Ser Ser Pro Ser Glu Gly Leu Cys Pro
1 5 10 15
Pro Gly His His Ile Ser Glu Asp Gly Arg Asp Cys Ile Ser Cys Lys
20 25 30
Tyr Gly Gln Asp Tyr Ser Thr His Trp Asn Asp Leu Leu Phe Cys Leu
35 40 45
Arg Cys Thr Arg Cys Asp Ser Gly Glu Val Glu Leu Ser Pro Cys Thr
50 55 60
Thr Thr Arg Asn Thr Val Cys Gln Cys Glu Glu Gly Thr Phe Arg Glu
65 70 75 80
Glu Asp Ser Pro Glu Met Cys Arg Lys Cys Arg Thr Gly Cys Pro Arg
85 90 95
Gly Met Val Lys Val Gly Asp Cys Thr Pro Trp Ser Asp Ile Glu Cys
100 105 110
Val His Lys Glu Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro
115 120 125
Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe
130 135 140
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val
145 150 155 160
Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe
165 170 175
Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro
180 185 190
Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr
195 200 205
Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val
210 215 220
Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala
225 230 235 240
Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg
245 250 255
Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly
260 265 270
Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro
275 280 285
Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser
290 295 300
Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln
305 310 315 320
Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His
325 330 335
Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
340 345
<210> 5
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 5
Ser Ser Pro Ser Glu Gly Leu Cys Pro Pro Gly His His Ile Ser Glu
1 5 10 15
Asp Gly Arg Asp Cys Ile Ser Cys Lys Tyr Gly Gln Asp Tyr Ser Thr
20 25 30
His Trp Asn Asp Leu Leu Phe Cys Leu Arg Cys Thr Arg Cys Asp Ser
35 40 45
Gly Glu Val Glu Leu Ser Pro Cys Thr Thr Thr Arg Asn Thr Val Cys
50 55 60
Gln Cys Glu Glu Gly Thr Phe Arg Glu Glu Asp Ser Pro Glu Met Cys
65 70 75 80
Arg Lys Cys Arg Thr Gly Cys Pro Arg Gly Met Val Lys Val Gly Asp
85 90 95
Cys Thr Pro Trp Ser Asp Ile Glu Cys Val His Lys Glu
100 105
<210> 6
<211> 138
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 6
Ile Thr Gln Gln Asp Leu Ala Pro Gln Gln Arg Ala Ala Pro Gln Gln
1 5 10 15
Lys Arg Ser Ser Pro Ser Glu Gly Leu Cys Pro Pro Gly His His Ile
20 25 30
Ser Glu Asp Gly Arg Asp Cys Ile Ser Cys Lys Tyr Gly Gln Asp Tyr
35 40 45
Ser Thr His Trp Asn Asp Leu Leu Phe Cys Leu Arg Cys Thr Arg Cys
50 55 60
Asp Ser Gly Glu Val Glu Leu Ser Pro Cys Thr Thr Thr Arg Asn Thr
65 70 75 80
Val Cys Gln Cys Glu Glu Gly Thr Phe Arg Glu Glu Asp Ser Pro Glu
85 90 95
Met Cys Arg Lys Cys Arg Thr Gly Cys Pro Arg Gly Met Val Lys Val
100 105 110
Gly Asp Cys Thr Pro Trp Ser Asp Ile Glu Cys Val His Lys Glu Gly
115 120 125
Ser Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val
130 135
<210> 7
<211> 127
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 7
Ile Thr Gln Gln Asp Leu Ala Pro Gln Gln Arg Ala Ala Pro Gln Gln
1 5 10 15
Lys Arg Ser Ser Pro Ser Glu Gly Leu Cys Pro Pro Gly His His Ile
20 25 30
Ser Glu Asp Gly Arg Asp Cys Ile Ser Cys Lys Tyr Gly Gln Asp Tyr
35 40 45
Ser Thr His Trp Asn Asp Leu Leu Phe Cys Leu Arg Cys Thr Arg Cys
50 55 60
Asp Ser Gly Glu Val Glu Leu Ser Pro Cys Thr Thr Thr Arg Asn Thr
65 70 75 80
Val Cys Gln Cys Glu Glu Gly Thr Phe Arg Glu Glu Asp Ser Pro Glu
85 90 95
Met Cys Arg Lys Cys Arg Thr Gly Cys Pro Arg Gly Met Val Lys Val
100 105 110
Gly Asp Cys Thr Pro Trp Ser Asp Ile Glu Cys Val His Lys Glu
115 120 125
<210> 8
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 8
Ala Ala Pro Gln Gln Lys Arg Ser Ser Pro Ser Glu Gly Leu Cys Pro
1 5 10 15
Pro Gly His His Ile Ser Glu Asp Gly Arg Asp Cys Ile Ser Cys Lys
20 25 30
Tyr Gly Gln Asp Tyr Ser Thr His Trp Asn Asp Leu Leu Phe Cys Leu
35 40 45
Arg Cys Thr Arg Cys Asp Ser Gly Glu Val Glu Leu Ser Pro Cys Thr
50 55 60
Thr Thr Arg Asn Thr Val Cys Gln Cys Glu Glu Gly Thr Phe Arg Glu
65 70 75 80
Glu Asp Ser Pro Glu Met Cys Arg Lys Cys Arg Thr Gly Cys Pro Arg
85 90 95
Gly Met Val Lys Val Gly Asp Cys Thr Pro Trp Ser Asp Ile Glu Cys
100 105 110
Val His Lys Glu
115
<210> 9
<211> 232
<212> PRT
<213> 人免疫球蛋白
<400> 9
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
1 5 10 15
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
20 25 30
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
35 40 45
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
50 55 60
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
65 70 75 80
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
85 90 95
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
100 105 110
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
115 120 125
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr
130 135 140
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
145 150 155 160
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
165 170 175
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
180 185 190
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
195 200 205
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
210 215 220
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
225 230

Claims (2)

1.一种人sDR5-Fc重组融合蛋白在制备治疗或预防脑卒中的药物中的应用，所述人sDR5-Fc重组融合蛋白序列如SEQ ID No.1所示。
2.根据权利要求1所述的应用，其中所述的脑卒中为缺血性脑卒中或失血性脑卒中。
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