CN102221490B - 一种人血清中酶活性稳定的处理方法 - Google Patents

Abstract

一种人血清中酶活性稳定的处理方法，包括以下步骤：步骤一，血清收集；步骤二，不稳定成分去除；步骤三、纤维蛋白等杂质去除；步骤四、无菌处理；步骤五、分装保存；步骤六、无菌状态检查。本发明立足于采用与测量样本基质相同的人血清来有效解决互通性问题，将收集的人血清通过一系列技术处理，使人血清中酶活性在一定时期内稳定，以满足临床使用需求，采用上述方案制备的人血清中酶活性至少能够稳定一年以上。

Description

一种人血清中酶活性稳定的处理方法

技术领域

本发明涉及医学量值溯源领域，特别是涉及一种人体血清的处理方法。

背景技术

量值溯源是近年检验医学领域的热点问题，其目的是解决临床常规方法测量的准确可比，核心问题在于临床常规方法的校准品应具有溯源性和与测量样本良好的互通性。2005年后中国已逐步建立起参考体系，校准品的溯源性问题从技术角度已基本解+决，互通性问题仍是困扰临床常规方法测量准确可比的难题。由于人血清样本的高度复杂性和不稳定性，寻找并建立与人血清具有很好互通性并符合稳定性要求的校准品是解决临床酶学项目量值溯源的核心问题。

互通性是指制备物与待测量样本在相同分析系统中进行测量时表现出的与待测量样本在分析系统中的反应一致的特性。在检验医学定量分析领域，待测量样本为人血清，由于其成分的高度复杂性、储存的不稳定性、来源的局限性等多种原因导致在医学实验室使用人血清基质样本为校准品进行人血清样本测量的理想测量状况无法实现，产品制造业不得不采用与人血清具有某些相似特性的易获取的牛血清白蛋白溶液作校准品的基质或直接对一些分子结构简单的无机小分子采用水溶液作校准品的基质。但对于一些生物大分子类物质尤其是具有空间结构的蛋白质如酶的测量采用上述基质校准品时，常导致校准品中酶与待测量样本人血清中同种酶在同一分析系统中表现出不一致的特性，即校准品的基质效应。这是目前医学实验室酶学定量测量中导致实验室间测量变异大，缺乏准确可比性的重要原因；也是北京市政府提出检验结果统一、互认的最大技术障碍之一。

酶是人体内最重要的蛋白质之一，其具有复杂的空间结构，它的催化活性通过其分子结构中的催化活性中心暴露并与其催化底物结合实现催化人体内各种复杂代谢反应的作用。由于酶本质是蛋白质，多种因素如温度、pH、离子浓度、渗透压等变化均可致其变性，导致酶催化活性的改变或消失，实验室通过对酶催化活性的测量可监测酶的变性与失活。因此，校准品中酶的稳定性对酶的准确测量至关重要。由于酶本身易变性和实验室的酶测量绝大多数是基于催化活性测量的特性，校准品的基质即酶的载体对酶活性的稳定作用明显。既往的研究有二类：一类是基于牛血清白蛋白基质的血清酶校准品和标准物质。此类校准品特点是校准品（酶活性）稳定期长，但通常有明显的基质效应，常导致不同分析系统测量结果变异大、缺乏可比性，以此类校准品校准的各常规方法测量结果多不具有溯源性，即与国际公认的参考方法的测量结果不一致；另一类是基于人血清的校准品，此类校准品的最大问题是不稳定。目前，国内外均还没有关于立足于采用与测量样本基质相同的人血清有效地解决互通性问题的人血清中酶活性稳定的研究成果。

发明内容

通过研究发现人血清中含有多种蛋白质、代谢物、离子和微量元素等物质，这些物质在离体后仍会发生不断变化，变化程度与处理过程、保存条件密切相关。某些因素的变化不导致酶活性的改变，但某些因素的微小变化都有可能导致酶活性的明显改变或完全丧失。因此在人血清处理与保存过程中，对可能引起人血清中酶活性变化的关键因素进行控制是解决酶活性稳定的核心。

本发明的目的在于提供一种人血清中酶活性稳定的处理方法，立足于采用与测量样本基质相同的人血清来有效地解决互通性问题。

为实现上述目的，本发明的及技术方案为，一种人血清中酶活性稳定的处理方法，包括以下步骤：

步骤一，血清收集:收集血液采集当日新鲜人血清，放置在密闭容器中，冻至-20℃以下，在冰柜中保存；

步骤二，不稳定成分去除

（1）将装有人血清的容器从冰柜取出，在室温下自然放置4-8小时，至肉眼观察容器中块状冰冻血清完全溶解后，在-20℃以下冷冻2小时以上；

（2）将装有人血清的容器在2-10℃下放置10小时以上，至肉眼观察容器中块状冰冻血清完全溶解后，再在-20℃以下冷冻2小时以上；

（3）用10——20℃水冲洗装有人血清容器的外表面，冲至肉眼观察容器中块状冰冻血清完全溶解。使人血清中引起酶活性不稳定的各种蛋白质、凝血因子、离子、代谢物由易变状态转化为处于相对稳定的状态；

由于人血清成分相当复杂，不仅含有K、Na等多种稳定的电解质，也含有葡萄糖、尿素等小分子代谢物，同时还含有大量蛋白质、蛋白质属性的各种代谢中间产物、各型维生素、甾体化合物等，通常认为蛋白质及具有蛋白质属性的各种代谢中间产物是引起人血清不稳定的重要因素。经冷冻、快速溶解、自然溶解和缓慢溶解四个物理过程，血清中绝大多数蛋白质及具有蛋白质属性的各种代谢中间产物空间结构发生变化，在采用以保护酶活性为主要目的的多种复溶方式复溶后后，人血清中酶活性的稳定性明显提高。既往采用单一冻融方式时仍表现为部分酶活性的不稳定，实质是致酶易变因素去除不完全；

步骤三、采用滤纸滤除血清中的纤维蛋白丝、各种抗原抗体复合物和蛋白复合颗粒；完成杂质去除；步骤四、无菌处理，经步骤三处理过的人血清在常规无菌条件下使用微孔滤膜进行无菌过滤；

步骤五、分装保存，包括以下步骤；

（1）选用可密闭、防冻、不易破损的血清存储容器分装血清样本；

（2）对血清存储容器进行无菌处理；

（3）在无菌状态下检查各血清存储容器是否密闭；

（4）无菌处理后的血清样本在无菌条件下采用各种移液装置如吸管、移液器、连续或不连续样品分配器、自动化分配装置或仪器等进行分装，分装过程应控制在3小时以内；

（5）密闭各血清存储容器并确认；

（6）标记；

（7）存储于-80℃以下冰柜储存；

步骤六、无菌状态检查，分别取分装过程的开始、中间、最后三支人血清样品进行血液培养，验证人血清是否处于无菌状态；如果三支人血清样品均为无菌状态，则表明血清制备无菌过程合格，操作步骤结束；如果一个或多个人血清样品未处于无菌状态，则重复操作步骤四、步骤五和步骤六，直至血清制备无菌过程合格为止。

进一步，如上所述的一种人血清中酶活性稳定的处理方法，其中，步骤一中新鲜人血清冷冻保存温度范围为-60℃以下。

进一步，如上所述的一种人血清中酶活性稳定的处理方法，其中，步骤二中第（1）步和第（2）步中的冷冻温度均为-60℃以下。

进一步，如上所述的一种人血清中酶活性稳定的处理方法，其中，步骤三中使用的滤纸为低——高速∮15-30cm定性滤纸。

进一步，如上所述的一种人血清中酶活性稳定的处理方法，其中，步骤四中使用的微孔滤膜为∮50-2000mm、孔径0.20-0.80μm的微孔滤膜无菌过滤。

本发明的有益效果：本发明立足于采用与测量样本基质相同的人血清来有效解决互通性问题，将收集的人血清通过一系列技术处理，使人血清中酶活性在一定时期内稳定，以满足临床使用需求，采用上述方案制备的人血清中酶活性至少能够稳定一年以上。

具体实施方式

实施例

步骤一、收集实验当日的新鲜人血清放置到封闭的冻融管中，将其冻至-60℃以下，至收集至约1000ml。

步骤二、将血清从冰柜取出，在室温下自然放置4个小时，至肉眼观察完全溶解，在-60℃以下冷冻2小时以上；再将血清在4℃下放置10小时，至肉眼观察完全溶解，然后在-60℃以下冷冻2小时；再用10℃的水冲洗装血清的冻融管，冲至肉眼观察完全溶解。

步骤三、采用低——高速∮15-30cm定性滤纸滤除血清中的纤维蛋白丝、各种抗原抗体复合物和蛋白复合颗粒。

步骤四、初滤后的人血清在常规无菌条件下进行无菌过滤，使用∮50-2000mm、孔径0.20-0.80um的微孔滤膜，滤菌使用天津奥特赛恩斯仪器有限公司生产的autoscience滤菌器。

步骤五、在无菌状态下检查1.0ml的冻溶管的密闭性，对能够密闭的容量为1.0ml的冻溶管采用紫外线照射30分钟方法消毒，进行无菌处理，然后用液体分配器进行血清分装、标记，并存储于-80℃以下的冰柜中。

步骤六、无菌状态检查：取分装过程开始、中间、最后三支样品进行血液培养，经验证，人血清皆处于无菌状态,无菌状态检查采用现有技术进行。

试验例

针对上述实施例中制备的人血清样品，进行γ-谷氨酰基转移酶（GGT）、肌酸激酶（CK）和淀粉酶（AMY）的稳定性试验，试验中的稳定性评价方法、测量参数、数据有效性判断标准均为现有技术。

试验结果和结论如下：

经试验，采用本发明的方案处理的人血清中酶活性至少能够稳定一年以上，能够满足临床使用的要求。

以上对本发明的实施例作了详细说明，但是本发明并不局限于上述实施例，在本领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。

Claims (5)

1.一种人血清中酶活性稳定的处理方法，包括以下步骤：

步骤一，血清收集:收集血液采集当日新鲜人血清，放置在密闭容器中，冻至-20℃以下，在冰柜中保存；

步骤二，不稳定成分去除

（1）将装有人血清的容器从冰柜取出，在室温下自然放置4-8小时，至肉眼观察容器中块状冰冻血清完全溶解后，在-20℃以下冷冻2小时以上；

（2）将装有人血清的容器在2-10℃下放置10小时以上，至肉眼观察容器中块状冰冻血清完全溶解后，再在-20℃以下冷冻2小时以上；

（3）用10——20℃水冲洗装有人血清容器的外表面，冲至肉眼观察容器中块状冰冻血清完全溶解，使人血清中引起酶活性不稳定的各种蛋白质、凝血因子、离子、代谢物由易变状态转化为处于相对稳定的状态；

步骤三、采用滤纸滤除血清中的纤维蛋白丝、各种抗原抗体复合物和蛋白复合颗粒，完成杂质去除；

步骤四、无菌处理，经步骤三处理过的人血清在常规无菌条件下使用微孔滤膜进行无菌过滤；

步骤五、分装保存，包括以下步骤；

（1）选用可密闭、防冻、不易破损的血清存储容器分装血清样本；

（2）对血清存储容器进行无菌处理；

（3）在无菌状态下检查各血清存储容器是否密闭；

（4）无菌处理后的血清样本在无菌条件下采用移液装置进行分装，分装过程应控制在3小时以内；

（5）密闭各血清存储容器并确认；

（6）标记；

（7）存储于-80℃以下冰柜储存；

步骤六、无菌状态检查，分别取分装过程的开始、中间、最后三支人血清样品进行血液培养，验证人血清是否处于无菌状态；如果三支人血清样品均为无菌状态，则表明血清制备无菌过程合格，操作步骤结束；如果一个或多个人血清样品未处于无菌状态，则重复操作步骤四、步骤五和步骤六，直至血清制备无菌过程合格为止。

2.如权利要求1所述的一种人血清中酶活性稳定的处理方法，其特征在于步骤一中新鲜人血清冷冻保存温度范围为-60℃以下。

3.如权利要求1所述的一种人血清中酶活性稳定的处理方法，其特征在于步骤二第（1）步和第（2）步中的冷冻温度均为-60℃以下。

4.如权利要求1所述的一种人血清中酶活性稳定的处理方法，其特征在于步骤三中使用的滤纸为低——高速∮15-30cm定性滤纸。

5.如权利要求1所述的一种人血清中酶活性稳定的处理方法，其特征在于步骤四中使用的微孔滤膜为∮50-2000mm、孔径0.20-0.80μm的微孔滤膜无菌过滤。