CN102218226A

CN102218226A - 一种高效液相逆向色谱制备技术

Info

Publication number: CN102218226A
Application number: CN2011100986093A
Authority: CN
Inventors: 梁冰; 曾国城
Original assignee: Sichuan University
Current assignee: Sichuan University
Priority date: 2011-04-20
Filing date: 2011-04-20
Publication date: 2011-10-19

Abstract

一种高效液相逆向色谱制备技术，采用了采用锥形逆向高效液相色谱制备柱，自下往上的逆向流动方式，和毛细作用流速。锥形逆向高效液相色谱制备柱由柱体、筛板、柱尾、密封支撑架及外接除气泡装置五部分组成，且柱尾入口内径大于柱头出口内径，柱尾入口内径2R=22mm~500mm、柱头出口内径2r=9mm~200mm，柱长L=50mm~350mm，锥体锥角在5°~20°范围内。流动相从柱尾进入，自下往上流动，由柱头流出，柱内采用毛细作用为主要动力，前沿线速度为0.256~0.512cm/min的毛细作用流速。该技术分离效能比普通圆柱形及正向色谱制备柱高，适用于制药、生物技术、中药有效成分分离等需要获取纯产品的领域。

Description

一种高效液相逆向色谱制备技术

技术领域

本发明属于一种用于制备分离的色谱技术,通过采用锥形逆向高效液相色谱制备柱,并对柱内流速和流向的研究发现其分离效能比普通圆柱形及正向色谱制备柱高,适用于制药、生物技术、中药有效成分分离等需要获取纯产品的领域。

背景技术

色谱技术是几十年来分析化学中最富活力的领域之一。作为一种物理化学分离分析的方法, 色谱技术是从混合物中分离组分的重要方法之一, 能够分离物化性能差别很小的化合物。近年来随着生物技术的迅猛发展, 人们逐渐把这种分离手段与检测系统连接起来, 成为在环境、生化药物、精细化工产品分析等领域中广泛应用的物质分离分析的一种重要手段,色谱技术在科学研究和工业生产中发挥着越来越重要的作用。

早期的制备液相色谱主要用于有机化合物和石油产品的分离提纯,人们追求的是高产率,对产品的纯度要求不高,因此希望柱子载样量大,分离效率高、分离速度快。制备级色谱常过载进样,是期望产量的提高,但是进样量过大常导致分离效率降低,产品的纯度就会降低。样品过载通常在色谱柱入口处发生,在样品沿色谱柱流动过程中,由于流动相对样品的稀释效应,样品过载情况逐渐减弱。因此,加大色谱柱入口内径是提高色谱柱负载能力的主要手段。早在1966年在Analytical Chemistry上就发表了一篇有关锥型制备柱的报道:美国Philip Marris研究中心H. M. Stahr等人首次制作低压锥型液相色谱柱。比较谱带体积以衡量柱效率表明锥型柱柱效为圆柱型柱的2倍。1981年,Said将锥型柱视为多个串联的圆柱型柱,利用积分方法计算得出锥型柱比固定相质量相同、总长度相同的二级串联圆柱型柱有更高的效率（1.8倍）。1990年,瑞士的Moerker Theophile发明了入口内径小于出口内径的锥型玻璃制备柱,指出锥型柱比相同柱长的圆柱型柱柱效更高,但由于入口内径小,负载样品能力要小于同长度、同体积的圆柱型柱。1997年,Slovenia国家化学研究所的A. Pecavar等人对锥型分析色谱柱进行了研究。结果表明:锥形柱的保留时间、压降、每秒塔板数与圆柱形色谱柱相比都有明显优势。2003年,马继平等对正向锥形色谱制备柱柱内谱带流型进行了动态可视化处理,并在不同锥角锥形色谱柱中对比,找出了10°锥角的锥形柱内流动相流型为塞子状,并与圆柱形色谱柱进行比较。结果表明:锥型柱的样品容量约为相同容积圆柱型柱的2 倍,柱效比相同长度圆柱型的高36 % ,色谱流出曲线峰值高于圆柱型柱12 %。2006年他们用可视化的方法对10°锥角的台锥色谱进行了放大研究,表明继续按比例放大成为工业规模色谱柱后仍能保持塞子状流型。

色谱技术另一个应用较成熟的分支是薄层色谱（TLC）技术,用于分析检测及制备分离, TLC的优点在于利用毛细作用作为主要动力,流速较慢,削弱了重力作用及湍流引起的同一平面上线速度的不均一性,分析速度较快,分离效率高。其缺点在于存在边缘效应,且上样量较小,后续分离步骤较繁琐,不适于放大及工业化生产。

至今仍无利用毛细作用作为主要动力进行分离制备的逆向台锥色谱柱及相关技术。

发明内容

针对上述背景,本发明的目的是提供一种分离效率更高、上样量大、对样品稀释效应更低的逆向台锥色谱柱及相应分离技术,提出了利用毛细作用作为主要动力的分离方法,适用于制药、生物技术、中药有效成分提取等需要高度纯化的复杂样品的分离制备。

发明了一种逆向锥形高效液相色谱制备柱,主要由柱体、筛板、柱尾、密封支撑架四部分组成（图1）,是柱尾入口内径（2R）大于柱头出口内径（2r）的锥形柱体。锥形柱体入口内径2R=22mm~500mm、出口内径2r=9mm~200mm,柱长L=50mm~350mm的锥台,锥角在5°~20°范围内。

本发明的本质特征在于锥形制备柱与同入口内径（2R）同高的圆柱形柱相比,负载能力相同,但体积为圆柱形柱的约1/3,可以显著减少填料量及流动相消耗量；相同体积流速条件下,锥型柱出口比圆柱形柱有更高的线速度,保留时间更短,流动相消耗进一步减少；锥形柱的锥体内径逐渐减小还可以减小对样品的稀释作用,流出液样品浓度更高,便于后处理。

本发明用到的柱尾（图2）有多个辐射状液流通道、同心圆液流导向槽,能使流动相进入柱内后迅速在柱尾和筛板之间均匀分布,便于活塞流的顺利进行。另外,本发明柱内可直接干法装填,不需流动相“压柱”,减少了流动相用量,但在毛细过程中,前沿部分可能夹带小气泡,因此需外接除气泡装置（图2）,能自动收集排除流动相流动过程中夹带及压降中生成的气泡。

本发明实验过程中采用毛细作用作为主要动力,其优点在于削弱了正向柱中因重力作用导致的同一面上各处线速度差异,提高了色谱柱的理论板数及分离效率。另一方面,随色谱过程时间的增加,毛细前沿逐渐升高,势能差逐渐增大,流速会逐渐减小。对此,我们采用外接柱塞泵提供相应流动相使柱内液面逐渐升高,消除因势差引起的毛细速度变慢。实验测定了2R=22.3mm的锥形柱初期的毛细流速约为1.5ml/min,柱内线速度为0.384ml/min,柱塞泵流速采用毛细作用流速1.5ml/min。

本发明因柱内流速较低,阻力较小,柱压较低,所以填料可采用粒径更小的薄层硅胶、超薄层硅胶及小粒径改性硅胶,使相同高度及容积的色谱柱柱效更高,分离效果更好,能进一步提高负载能力,减少流动相用量。

以上这些特征对于色谱分析柱可以提高其灵敏度,对于制备柱可以降低填料和流动相用量,简化工艺,降低生产成本。

附图说明

图1为逆向锥形高效液相色谱柱各部件示意图；

图2为柱尾示意图和外接除气泡装置示意图；

图3为丁基玫瑰红B混合组分用逆向圆柱的色谱图；

图4为丁基玫瑰红B混合组分用逆向锥形柱的色谱图；

图5为丁基玫瑰红B混合组分用正向锥形柱的色谱图；

图中：

1-螺帽；2-筛板；3-密封支撑部件；4-螺杆；5-柱体；6-筛板；7-柱尾；8-密封垫圈。

具体实施方案

以下结合发明人给出的具体实例,对所发明的逆向锥形色谱柱及其制备技术作进一步的详细阐述。需要指出的是,本发明并不局限于这些实施例,对于在本发明给出的范畴内,进行放大及填料更换等技术特征的添加和替换,均属于本发明的保护范畴。

逆向锥形色谱柱先倒置,依次装入出口筛板、填料、含需分离物的填料干样、支撑填料、入口筛板,再连接密封圈及柱尾,用密封支撑架进行密封固定,入口连接流动相输送泵,出口连接除气泡装置,除气泡装置连接检测器及收集装置。

实施例1：逆向锥形色谱柱入口内径（2R）为22.3mm,出口内径（2r）为9.1mm,锥形部分长度70mm,锥角15°。

圆柱形柱内径（2R）为22.3mm,长为70mm。

两种色谱柱具有相同的入口内径,负载能力相同,样品为含丁基玫瑰红B （含结构相似的两种物质）0.294mg的硅胶0.147g,两柱均采用干法填充10~40μm薄层色谱硅胶,流动相为0.1M乙酸铵：甲醇=3:7,用紫外-可见检测器在波长559nm处检测,流动相由下端进入色谱柱,上端流出,流速1.5ml/min。图3为锥形柱的紫外检测谱图,图4为圆柱形柱的紫外检测谱图,结果表明两种柱均能分开两种物质,但锥形柱流出液中含的两组份浓度更高,完全流出耗时更短,消耗的固定相、流动相更少。

实施例2：逆向锥形色谱柱入口内径（2R）为22.3mm,出口内径（2r）为9.1mm,锥形部分长度70mm,锥角15°。

正向锥形色谱柱入口内径（2R）为22.3mm,出口内径（2r）为9.1mm,锥形部分长度70mm,锥角15°。

两种柱规格相同,均采用干法填充10~40μm薄层色谱硅胶,样品为含丁基玫瑰红B 0.294mg的硅胶0.147g,流动相为0.1M乙酸铵：甲醇=3:7,用紫外-可见检测器在波长559nm处检测,逆向色谱柱流动相由下往上,正向色谱柱流动相由上往下,流速均为1.5ml/min。图4为逆向锥形柱的色谱图,图5为正向锥形柱形柱的紫外检测谱图,结果表明：逆向锥形柱与正向锥形柱相比,其谱图中两峰分离度更大,且第二组分峰值更高,说明逆向锥形柱对样品的稀释更低,对结构相似物质的分离能力更好。

实施例3：逆向锥形色谱柱入口内径（2R）为90mm,出口内径（2r）为36mm,锥形部分长度180mm,由柱头、柱体及柱尾三部分组成,各部分间有筛板,且用螺纹对接密封。

实验用干法填充10~40μm薄层色谱硅胶,样品为含丁基玫瑰红B 2.94mg的硅胶3.0g,流动相为0.1M乙酸铵:甲醇=3:7,流速为30ml/min,用紫外-可见检测器在波长559nm处检测,图4为逆向锥形柱放大的色谱图。进一步说明逆向锥形色谱制备技术可用于放大及生产。

Claims

1.一种高效液相逆向色谱制备技术，其特征在于，采用锥形逆向高效液相色谱制备柱，自下往上的逆向流动方式，和毛细作用流速。

2.根据权利要求书1所述的锥形逆向高效液相色谱制备柱，其特征在于其为均匀过渡的锥形柱体，由柱体、筛板、柱尾、密封支撑架及外接除气泡装置五部分组成，且柱尾入口内径大于柱头出口内径。

3.根据权利要求2所述的锥形柱，其特征在于，柱尾入口内径2R=22mm~500mm、柱头出口内径2r=9mm~200mm，柱长L=50mm~350mm，锥体锥角在5°~20°范围内。

4.根据权利要求书1所述的高效液相逆向色谱制备技术，其特征在于，流动相从柱尾进入，自下往上流动，由柱头流出。

5.根据权利要求书1所述的高效液相逆向色谱制备技术，其特征在于，柱内采用毛细作用为主要动力，前沿线速度为0.256~0.512cm/min的毛细作用流速。