CN106552443B - 一种反相层析柱的装柱方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种反相层析柱的装柱方法，包括以下步骤：1)将反相填料的浆液装入到反相层析柱中；2)对反相层析柱的柱头进行赶气泡；3)压实反相层析柱内的反相填料。本发明中的反相层析柱的装柱方法通过对反相层析柱的柱头进行赶气泡，使得反相层析柱的装柱操作简单，装柱效果好，可以减少反复装柱，节约操作时间和人力、物力。

Description

一种反相层析柱的装柱方法

技术领域

本发明属于分离纯化和分析技术领域，具体涉及一种反相层析柱的装柱方法。

背景技术

反向层析广泛应用于蛋白、肽和寡核苷酸的分离纯化和分析领域，但反相层析柱的装填效果的好坏，直接影响产品的收率和质量。反相层析柱装填效果的好坏主要由两个指标来衡量：理论塔板数和对称性。通常对于一个好的柱效，理论塔板数>1/3×1/填料平均粒径，对称性为0.8～1.8，这样，装柱方法的选择显得尤为重要。对于反相层析填料来讲，由于其耐压高(0-10MPa),在安装过程中，难以装填均匀，对称性难以达到0.8～1.8的标准，很多时候反复装填可能仍旧无法达到要求。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对现有技术中存在的上述不足，提供一种反相层析柱的装柱方法，本发明中的反相层析柱的装柱方法通过对反相层析柱的柱头进行赶气泡，使得反相层析柱的装柱操作简单，装柱效果好，可以减少反复装柱，节约操作时间和人力、物力。

解决本发明技术问题所采用的技术方案是提供一种反相层析柱的装柱方法，包括以下步骤：

1)将反相填料的浆液装入到反相层析柱中；

2)对反相层析柱的柱头进行赶气泡；

3)压实反相层析柱内的反相填料。

优选的是，在所述步骤1)之前还包括步骤i)对反相层析柱的柱底进行赶气泡。

优选的是，所述步骤i)对反相层析柱的柱底进行赶气泡的具体方法为：向反相层析柱内加入装柱溶液，并维持装柱溶液的液面距离反相层析柱的柱底2～4cm进行赶气泡。

优选的是，所述步骤1)将反相填料的浆液装入到反相层析柱中的具体方法为：将所需的反相填料倒入反相层析柱内，按照反相层析柱的额定压力或反相填料的额定压力压实反相填料，使用无水乙醇置换两倍柱体积，取出反相填料后再使用无水乙醇配制成反相填料的浆液，反相填料的浆液体积按照如下公式计算：浆液体积＝反相层析柱的底面积×(反相层析柱的柱高-7cm),将反相填料的浆液装入到反相层析柱中，使用无水乙醇加至液面离反相层析柱的柱高2cm处。

优选的是，所述步骤2)对反相层析柱的柱头进行赶气泡的具体方法为：关闭反相层析柱的柱底的阀门，开启反相层析柱的柱头的阀门，向反相层析柱内泵入装柱溶液，该装柱溶液按照预设的反相层析柱的最大压力以0.5～1cm/min的线速度压实反相填料，反相填料的浆液中的液体由反相层析柱的柱头的阀门流出，对反相层析柱的柱头进行赶气泡。

优选的是，所述步骤3)压实反相层析柱内的反相填料的具体方法为：反相层析柱的柱头的气泡全部排出后，打开反相层析柱的柱底的阀门，关闭反相层析柱的柱头的阀门，向反相层析柱内泵入装柱溶液达到反相层析柱的最大压力后，再以0.4～0.5cm/min的线速度向反相层析柱内泵入装柱溶液，再以0.1～0.2cm/min的线速度向反相层析柱内泵入装柱溶液压实反相填料。

优选的是，所述装柱溶液为20～100％(ml/ml)的乙醇水溶液。

优选的是，在所述步骤3)后还包括步骤j)对反相层析柱检测柱效。

优选的是，所述步骤j)对反相层析柱检测柱效的具体方法为：设定液相泵入反相层析柱的流速为1cm/min线速度，

使用置换溶液平衡反相层析柱至电导稳定；

使用上样溶液对反相层析柱上样，上样量为柱体积的1％；

使用置换溶液平衡反相层析柱至电导峰出峰完毕。

优选的是，所述置换溶液为0.4～0.5mol/L的NaCl溶液，所述上样溶液为0.8～1mol/L的NaCl溶液；

或者，所述置换溶液为0.8～1％(ml/ml)的丙酮水溶液，所述上样溶液为1.6～2％(ml/ml)的丙酮水溶液。

本发明中的反相层析柱的装柱方法通过对反相层析柱的柱头进行赶气泡，使得反相层析柱的装柱操作简单，装柱效果好，可以减少反复装柱，节约操作时间和人力、物力。

附图说明

图1是本发明的实施例1～4中所使用的反相层析柱的装置结构示意图；

图2是本发明的实施例1中的反相层析柱的电导率图；

图3是现有技术的反相层析柱的电导率图。

图中：1-反相层析柱；2-柱头；3-柱底；4-柱头的阀门；5-柱底的阀门；6-第一泵；7-导液管；8-第二泵；9-导液管的阀门。

具体实施方式

为使本领域技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细描述。

实施例1

如图1所示，本实施例提供一种反相层析柱1的装柱方法，包括以下步骤：

1)将反相填料的浆液装入到反相层析柱1中；

2)对反相层析柱的柱头2进行赶气泡；

3)压实反相层析柱1内的反相填料。

本实施例中的反相层析柱1的装柱方法通过对反相层析柱的柱头2进行赶气泡，使得反相层析柱1的装柱操作简单，装柱效果好，可以减少反复装柱，节约操作时间和人力、物力。

具体的，本实施例中的反相层析柱1为FINELINE层析柱，以GE SOURCE为反相层析填料。

反相层析柱1装置包括：反相层析柱1、反相层析柱的柱头2、反相层析柱的柱底3、在反相层析柱的柱头2设置的柱头的阀门4、在反相层析柱的柱底3设置的柱底的阀门5、用于通过柱头2向反相层析柱1泵入液体的第一泵6、与反相层析柱的柱头2在同一端的导液管7、导液管7上设置的导液管的阀门9、用于通过导液管7向反相层析柱1泵入液体的第二泵8。其中，导液管7和第二泵8仅仅在对反相层析柱的柱头2进行赶气泡和压实反相填料时使用。具体的，本实施例中的柱头的阀门4为四通阀，柱底的阀门5为四通阀。

优选的是，在所述步骤1)之前还包括步骤i)对反相层析柱的柱底3进行赶气泡。

优选的是，所述步骤i)对反相层析柱的柱底3进行赶气泡的具体方法为：向反相层析柱1内加入20％(ml/ml)的乙醇水溶液，并维持乙醇水溶液的液面距离反相层析柱的柱底3为2cm进行赶气泡。

优选的是，所述步骤1)将反相填料的浆液装入到反相层析柱1中的具体方法为：将所需的反相填料倒入反相层析柱1内，按照反相层析柱1的额定压力或反相填料的额定压力压实反相填料，使用无水乙醇置换两倍柱体积，取出反相填料后再使用无水乙醇配制成反相填料的浆液，反相填料的浆液体积按照如下公式计算：浆液体积＝反相层析柱1的底面积×(反相层析柱1的柱高-7cm),将反相填料的浆液装入到反相层析柱1中，使用无水乙醇加至液面离反相层析柱1的柱高2cm处。使用无水乙醇置换两倍柱体积，速度快。使用无水乙醇配制成反相填料的浆液，无水乙醇置换能够提高反相填料的溶胀性，且无水乙醇无毒，可减少对操作人员的伤害。

优选的是，所述步骤2)对反相层析柱的柱头2进行赶气泡的具体方法为：关闭反相层析柱1的柱底的阀门5，开启反相层析柱1的柱头的阀门4，通过第二泵8向反相层析柱1内泵入20％(ml/ml)的乙醇水溶液，该20％(ml/ml)的乙醇水溶液按照预设的反相层析柱1的最大压力以1cm/min的线速度压实反相填料，反相填料的浆液中的液体由反相层析柱1的柱头的阀门4流出，对反相层析柱的柱头2进行赶气泡。通过该步骤2)可以很轻松的将反相层析柱的柱头2的气泡排除干净，这是反相层析柱1装填好坏的关键(即N/m理论塔板数高低的关键)，使得本实施例中的反相层析柱1合格。具体的步骤2)中，第二泵8通过导液管7向反相层析柱1泵入20％(ml/ml)的乙醇水溶液。

优选的是，所述步骤3)压实反相层析柱1内的反相填料的具体方法为：反相层析柱的柱头2的气泡全部排出后，打开反相层析柱1的柱底的阀门5，关闭反相层析柱1的柱头的阀门4，打开导液管的阀门9，通过第二泵8向反相层析柱1内泵入20％(ml/ml)的乙醇水溶液达到反相层析柱1的最大压力后，再以0.5cm/min的线速度向反相层析柱1内泵入20％(ml/ml)的乙醇水溶液，再以0.1cm/min的线速度向反相层析柱1内泵入20％(ml/ml)的乙醇水溶液压实反相填料，关闭导液管的阀门9。通过该步骤3)可以很轻松的将反相层析柱1内的反相填料压实，这是反相层析柱1的峰对称性是否合格的关键，使得本实施例中的反相层析柱1合格。峰对称性：As，即1/10峰高处在右半峰宽与左半峰宽的比值。

优选的是，在所述步骤3)后还包括步骤j)对反相层析柱1检测柱效。柱效：N/m，即每米理论塔板数。

优选的是，所述步骤j)对反相层析柱1检测柱效的具体方法为：设定液相泵入反相层析柱1的流速为1cm/min线速度，

使用0.4mol/L的NaCl溶液平衡反相层析柱1至电导稳定；

使用0.8mol/L的NaCl对反相层析柱1上样，上样量为柱体积的1％；

使用0.4mol/L的NaCl平衡反相层析柱1至电导峰出峰完毕。

如图2所示，本实施例中的反相层析柱1的保留时间(Retention)831.99ml。

现有技术中，反相层析柱1的装柱方法，包括以下步骤：1)将反相填料的浆液装入到反相层析柱1中；2)压实反相层析柱1内的反相填料，现有技术的方法与本实施例中的区别为现有技术不对反相层析柱的柱头2进行赶气泡，如图3所示，现有技术获得的反相层析柱1的保留时间(Retention)936.3ml，理论塔板数(Plates/meter)N/m＝14615，对称性2.26。

具体的，本实施例中的反相层析柱1检测柱效通常由色谱软件采集色谱峰自动计算得出。对于SOURCE填料，平均粒径为15微米，则好的柱效的理论塔板数(Plates/meter)N/m＝22222，对称性0.8～1.8，将SOURCE填料装入本实施例中的反相层析柱1中1实测理论塔板数(Plates/meter)N/m＝33845,对称性：1.18，均符合要求。

实施例2

如图1所示，本实施例提供一种反相层析柱1的装柱方法，包括以下步骤：

1)将反相填料的浆液装入到反相层析柱1中；

2)对反相层析柱的柱头2进行赶气泡；

3)压实反相层析柱1内的反相填料。

本实施例中的反相层析柱1的装柱方法通过对反相层析柱的柱头2进行赶气泡，使得反相层析柱1的装柱操作简单，装柱效果好，可以减少反复装柱，节约操作时间和人力、物力。

具体的，本实施例中的反相层析柱1为FINELINE层析柱，以GE SOURCE为反相层析填料。

反相层析柱1装置包括：反相层析柱1、反相层析柱的柱头2、反相层析柱的柱底3、在反相层析柱的柱头2设置的柱头的阀门4、在反相层析柱的柱底3设置的柱底的阀门5、用于通过柱头2向反相层析柱1泵入液体的第一泵6、与反相层析柱的柱头2在同一端的导液管7、导液管7上设置的导液管的阀门9、用于通过导液管7向反相层析柱1泵入液体的第二泵8。其中，导液管7和第二泵8仅仅在对反相层析柱的柱头2进行赶气泡和压实反相填料时使用。具体的，本实施例中的柱头的阀门4为四通阀，柱底的阀门5为四通阀。

优选的是，在所述步骤1)之前还包括步骤i)对反相层析柱的柱底3进行赶气泡。

优选的是，所述步骤i)对反相层析柱的柱底3进行赶气泡的具体方法为：向反相层析柱1内加入80％(ml/ml)的乙醇水溶液，并维持乙醇水溶液的液面距离反相层析柱的柱底3为3cm进行赶气泡。

优选的是，所述步骤1)将反相填料的浆液装入到反相层析柱1中的具体方法为：将所需的反相填料倒入反相层析柱1内，按照反相层析柱1的额定压力或反相填料的额定压力压实反相填料，使用无水乙醇置换两倍柱体积，取出反相填料后再使用无水乙醇配制成反相填料的浆液，反相填料的浆液体积按照如下公式计算：浆液体积＝反相层析柱1的底面积×(反相层析柱1的柱高-7cm),将反相填料的浆液装入到反相层析柱1中，使用无水乙醇加至液面离反相层析柱1的柱高2cm处。使用无水乙醇置换两倍柱体积，速度快。使用无水乙醇配制成反相填料的浆液，无水乙醇置换能够提高反相填料的溶胀性，且无水乙醇无毒，可减少对操作人员的伤害。

优选的是，所述步骤2)对反相层析柱的柱头2进行赶气泡的具体方法为：关闭反相层析柱1的柱底的阀门5，开启反相层析柱1的柱头的阀门4，通过第二泵8向反相层析柱1内泵入80％(ml/ml)的乙醇水溶液，该80％(ml/ml)的乙醇水溶液按照预设的反相层析柱1的最大压力以0.8cm/min的线速度压实反相填料，反相填料的浆液中的液体由反相层析柱1的柱头的阀门4流出，对反相层析柱的柱头2进行赶气泡。通过该步骤2)可以很轻松的将反相层析柱的柱头2的气泡排除干净，这是反相层析柱1装填好坏的关键(即N/m理论塔板数高低的关键)，使得本实施例中的反相层析柱1合格。具体的步骤2)中，第二泵8通过导液管7向反相层析柱1泵入80％(ml/ml)的乙醇水溶液。

优选的是，所述步骤3)压实反相层析柱1内的反相填料的具体方法为：反相层析柱的柱头2的气泡全部排出后，打开反相层析柱1的柱底的阀门5，关闭反相层析柱1的柱头的阀门4，打开导液管的阀门9，通过第二泵8向反相层析柱1内泵入80％(ml/ml)的乙醇水溶液达到反相层析柱1的最大压力后，再以0.4cm/min的线速度向反相层析柱1内泵入80％(ml/ml)的乙醇水溶液，再以0.1 5cm/min的线速度向反相层析柱1内泵入80％(ml/ml)的乙醇水溶液压实反相填料，关闭导液管的阀门9。通过该步骤3)可以很轻松的将反相层析柱1内的反相填料压实，这是反相层析柱1的峰对称性是否合格的关键，使得本实施例中的反相层析柱1合格。峰对称性：As，即1/10峰高处在右半峰宽与左半峰宽的比值。

优选的是，在所述步骤3)后还包括步骤j)对反相层析柱1检测柱效。柱效：N/m，即每米理论塔板数。

优选的是，所述步骤j)对反相层析柱1检测柱效的具体方法为：设定液相泵入反相层析柱1的流速为1cm/min线速度，

使用0.5mol/L的NaCl溶液平衡反相层析柱1至电导稳定；

使用1mol/L的NaCl对反相层析柱1上样，上样量为柱体积的1％；

使用0.5mol/L的NaCl平衡反相层析柱1至电导峰出峰完毕。

本实施例中的反相层析柱1的保留时间(Retention)820.21ml。

具体的，本实施例中的反相层析柱1检测柱效通常由色谱软件采集色谱峰自动计算得出。对于SOURCE填料，平均粒径为15微米，则好的柱效的理论塔板数(Plates/meter)N/m＝22222，对称性0.8～1.8，将SOURCE填料装入本实施例中的反相层析柱1中1实测理论塔板数(Plates/meter)N/m＝33265,对称性：1.32，均符合要求。

实施例3

如图1所示，本实施例提供一种反相层析柱1的装柱方法，包括以下步骤：

1)将反相填料的浆液装入到反相层析柱1中；

2)对反相层析柱的柱头2进行赶气泡；

3)压实反相层析柱1内的反相填料。

本实施例中的反相层析柱1的装柱方法通过对反相层析柱的柱头2进行赶气泡，使得反相层析柱1的装柱操作简单，装柱效果好，可以减少反复装柱，节约操作时间和人力、物力。

具体的，本实施例中的反相层析柱1为FINELINE层析柱，以GE SOURCE为反相层析填料。

反相层析柱1装置包括：反相层析柱1、反相层析柱的柱头2、反相层析柱的柱底3、在反相层析柱的柱头2设置的柱头的阀门4、在反相层析柱的柱底3设置的柱底的阀门5、用于通过柱头2向反相层析柱1泵入液体的第一泵6、与反相层析柱的柱头2在同一端的导液管7、导液管7上设置的导液管的阀门9、用于通过导液管7向反相层析柱1泵入液体的第二泵8。其中，导液管7和第二泵8仅仅在对反相层析柱的柱头2进行赶气泡和压实反相填料时使用。具体的，本实施例中的柱头的阀门4为四通阀，柱底的阀门5为四通阀。

优选的是，在所述步骤1)之前还包括步骤i)对反相层析柱的柱底3进行赶气泡。

优选的是，所述步骤i)对反相层析柱的柱底3进行赶气泡的具体方法为：向反相层析柱1内加入无水乙醇水溶液，并维持乙醇水溶液的液面距离反相层析柱的柱底3为4cm进行赶气泡。

优选的是，所述步骤1)将反相填料的浆液装入到反相层析柱1中的具体方法为：将所需的反相填料倒入反相层析柱1内，按照反相层析柱1的额定压力或反相填料的额定压力压实反相填料，使用无水乙醇置换两倍柱体积，取出反相填料后再使用无水乙醇配制成反相填料的浆液，反相填料的浆液体积按照如下公式计算：浆液体积＝反相层析柱1的底面积×(反相层析柱1的柱高-7cm),将反相填料的浆液装入到反相层析柱1中，使用无水乙醇加至液面离反相层析柱1的柱高2cm处。使用无水乙醇置换两倍柱体积，速度快。使用无水乙醇配制成反相填料的浆液，无水乙醇置换能够提高反相填料的溶胀性，且无水乙醇无毒，可减少对操作人员的伤害。

优选的是，所述步骤2)对反相层析柱的柱头2进行赶气泡的具体方法为：关闭反相层析柱1的柱底的阀门5，开启反相层析柱1的柱头的阀门4，通过第二泵8向反相层析柱1内泵入无水乙醇，该无水乙醇按照预设的反相层析柱1的最大压力以0.5cm/min的线速度压实反相填料，反相填料的浆液中的液体由反相层析柱1的柱头的阀门4流出，对反相层析柱的柱头2进行赶气泡。通过该步骤2)可以很轻松的将反相层析柱的柱头2的气泡排除干净，这是反相层析柱1装填好坏的关键(即N/m理论塔板数高低的关键)，使得本实施例中的反相层析柱1合格。具体的步骤2)中，第二泵8通过导液管7向反相层析柱1泵入无水乙醇。

优选的是，所述步骤3)压实反相层析柱1内的反相填料的具体方法为：反相层析柱的柱头2的气泡全部排出后，打开反相层析柱1的柱底的阀门5，关闭反相层析柱1的柱头的阀门4，打开导液管的阀门9，通过第二泵8向反相层析柱1内泵入无水乙醇达到反相层析柱1的最大压力后，再以0.45cm/min的线速度向反相层析柱1内泵入无水乙醇，再以0.2cm/min的线速度向反相层析柱1内泵入无水乙醇压实反相填料，关闭导液管的阀门9。通过该步骤3)可以很轻松的将反相层析柱1内的反相填料压实，这是反相层析柱1的峰对称性是否合格的关键，使得本实施例中的反相层析柱1合格。峰对称性：As，即1/10峰高处在右半峰宽与左半峰宽的比值。

优选的是，在所述步骤3)后还包括步骤j)对反相层析柱1检测柱效。柱效：N/m，即每米理论塔板数。

优选的是，所述步骤j)对反相层析柱1检测柱效的具体方法为：设定液相泵入反相层析柱1的流速为1cm/min线速度，

使用0.45mol/L的NaCl溶液平衡反相层析柱1至电导稳定；

使用0.9mol/L的NaCl对反相层析柱1上样，上样量为柱体积的1％；

使用0.45mol/L的NaCl平衡反相层析柱1至电导峰出峰完毕。

本实施例中的反相层析柱1的保留时间(Retention)843.59ml。

具体的，本实施例中的反相层析柱1检测柱效通常由色谱软件采集色谱峰自动计算得出。对于SOURCE填料，平均粒径为15微米，则好的柱效的理论塔板数(Plates/meter)N/m＝22222，对称性0.8～1.8，将SOURCE填料装入本实施例中的反相层析柱1中1实测理论塔板数(Plates/meter)N/m＝32156,对称性：1.26，均符合要求。

实施例4

如图1所示，本实施例中的反相层析柱的装柱方法与实施例1中的区别为本实施例中的置换溶液为1％(ml/ml)的丙酮水溶液，上样溶液为2％(ml/ml)的丙酮水溶液。

本实施例中的反相层析柱1的保留时间(Retention)850.51ml。

具体的，本实施例中的反相层析柱1检测柱效通常由色谱软件采集色谱峰自动计算得出。对于SOURCE填料，平均粒径为15微米，则好的柱效的理论塔板数(Plates/meter)N/m＝22222，对称性0.8～1.8，将SOURCE填料装入本实施例中的反相层析柱1中1实测理论塔板数(Plates/meter)N/m＝34295,对称性：1.41，均符合要求。

实施例5

如图1所示，本实施例中的反相层析柱的装柱方法与实施例1中的区别为本实施例中的置换溶液为0.8％(ml/ml)的丙酮水溶液，上样溶液为1.6％(ml/ml)的丙酮水溶液。

本实施例中的反相层析柱1的保留时间(Retention)867.48ml。

具体的，本实施例中的反相层析柱1检测柱效通常由色谱软件采集色谱峰自动计算得出，实测理论塔板数和对称性都符合要求。

实施例6

如图1所示，本实施例中的反相层析柱的装柱方法与实施例1中的区别为本实施例中的置换溶液为0.9％(ml/ml)的丙酮水溶液，上样溶液为1.8％(ml/ml)的丙酮水溶液。

本实施例中的反相层析柱1的保留时间(Retention)832.69ml。

具体的，本实施例中的反相层析柱1检测柱效通常由色谱软件采集色谱峰自动计算得出，实测理论塔板数和对称性都符合要求。

可以理解的是，以上实施方式仅仅是为了说明本发明的原理而采用的示例性实施方式，然而本发明并不局限于此。对于本领域内的普通技术人员而言，在不脱离本发明的精神和实质的情况下，可以做出各种变型和改进，这些变型和改进也视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种反相层析柱的装柱方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)将反相填料的浆液装入到反相层析柱中；

2)对反相层析柱的柱头进行赶气泡，对反相层析柱的柱头进行赶气泡的具体方法为：关闭反相层析柱的柱底的阀门，开启反相层析柱的柱头的阀门，向反相层析柱内泵入装柱溶液，该装柱溶液按照预设的反相层析柱的最大压力以0.5～1cm/min的线速度压实反相填料，反相填料的浆液中的液体由反相层析柱的柱头的阀门流出，对反相层析柱的柱头进行赶气泡；

3)压实反相层析柱内的反相填料。

2.根据权利要求1所述的反相层析柱的装柱方法，其特征在于，在所述步骤1)之前还包括步骤i)对反相层析柱的柱底进行赶气泡。

3.根据权利要求2所述的反相层析柱的装柱方法，其特征在于，所述步骤i)对反相层析柱的柱底进行赶气泡的具体方法为：向反相层析柱内加入装柱溶液，并维持装柱溶液的液面距离反相层析柱的柱底2～4cm进行赶气泡。

4.根据权利要求1所述的反相层析柱的装柱方法，其特征在于，所述步骤1)将反相填料的浆液装入到反相层析柱中的具体方法为：将所需的反相填料倒入反相层析柱内，按照反相层析柱的额定压力或反相填料的额定压力压实反相填料，使用无水乙醇置换两倍柱体积，取出反相填料后再使用无水乙醇配制成反相填料的浆液，反相填料的浆液体积按照如下公式计算：浆液体积＝反相层析柱的底面积×(反相层析柱的柱高-7cm),将反相填料的浆液装入到反相层析柱中，使用无水乙醇加至液面离反相层析柱的柱高2cm处。

5.根据权利要求1所述的反相层析柱的装柱方法，其特征在于，所述步骤3)压实反相层析柱内的反相填料的具体方法为：反相层析柱的柱头的气泡全部排出后，打开反相层析柱的柱底的阀门，关闭反相层析柱的柱头的阀门，向反相层析柱内泵入装柱溶液达到反相层析柱的最大压力后，再以0.4～0.5cm/min的线速度向反相层析柱内泵入装柱溶液，再以0.1～0.2cm/min的线速度向反相层析柱内泵入装柱溶液压实反相填料。

6.根据权利要求3、5任一项所述的反相层析柱的装柱方法，其特征在于，所述装柱溶液为20～100％(ml/ml)的乙醇水溶液。

7.根据权利要求1所述的反相层析柱的装柱方法，其特征在于，在所述步骤3)后还包括步骤j)对反相层析柱检测柱效。

8.根据权利要求7所述的反相层析柱的装柱方法，其特征在于，所述步骤j)对反相层析柱检测柱效的具体方法为：设定液相泵入反相层析柱的流速为1cm/min线速度，

使用置换溶液平衡反相层析柱至电导稳定；

使用上样溶液对反相层析柱上样，上样量为柱体积的1％；

使用置换溶液平衡反相层析柱至电导峰出峰完毕。

9.根据权利要求8所述的反相层析柱的装柱方法，其特征在于，所述置换溶液为0.4～0.5mol/L的NaCl溶液，所述上样溶液为0.8～1mol/L的NaCl溶液；

或者，所述置换溶液为0.8～1％(ml/ml)的丙酮水溶液，所述上样溶液为1.6～2％(ml/ml)的丙酮水溶液。