CN102212518B - 小麦印度腥黑穗病菌检测标准分子及其构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种小麦印度腥黑穗病菌检测标准分子，为能够进行复制的质粒，所述质粒中含有序列A和B中至少一种，A(Seq ID No.1)与小麦印度腥黑穗病菌线粒体DNA上一段2.3kb的核酸序列(AF218059)同源性为99.56％，B(Seq ID No.2)与小麦印度腥黑穗病菌核糖体内转录间隔区的DNA序列(AF399888)同源性为99.85％。本发明还公开了上述标准分子的制备和检测方法。本发明构建的标准分子可以代替小麦印度腥黑穗病菌DNA作为小麦印度腥黑穗病菌分子检测的阳性对照，适用于对小麦印度腥黑穗病菌的定性PCR和定量PCR检测，适合于口岸检验检疫、农业生产、植物保护等。

Description

小麦印度腥黑穗病菌检测标准分子及其构建方法

技术领域

本发明涉及一种口岸检验检疫、农业生产、植物保护领域检测用的标准分子，特别是涉及一种小麦印度腥黑穗病菌检测用标准分子及其制备方法。

背景技术

小麦印度腥黑穗病菌(Tilletia indica Mitra异名Neovossia indica(Mitra)Mundkur)是一种扩散较快、危害性很大的病原真菌，已有40多个国家将其列为检疫性有害生物(OEPP/EPPO，1980；CABI/EPPO，1992)。迄今为止，除原产地印度外，该病已在巴基斯坦、伊拉克、尼泊尔、阿富汗、墨西哥、南非和美国等地都有报道(Warham，1986；Singh et al.，1989；Bonde et al.，1997)，成为威胁世界小麦生产和贸易的最具危险性的真菌病害之一。

小麦印度腥黑穗病菌主要危害小麦(Triticum aestivum L.)，也可以危害硬质小麦(T.durum Desf.)。它不仅能引起小麦减产，使一些田块的损失高达89％(Matsumoto et al.，1989)，还降低小麦种子的萌发率(Goel et al.，1992)，而且更重要的是影响小麦的品质(Singh et al.，1990)。小麦印度腥黑穗病的症状在田间不易被发现(Bonde et al.，1997)，通常对寄主造成局部侵染，沿腹沟在种皮下产生粉状孢子堆，在籽粒表面形成疱斑；只有感染严重时病粒的大部分或全部形成黑粉腔(Zhang et al.，1984)。

对小麦印度腥黑穗病菌的鉴定，早期主要在于比较小麦印度腥黑穗病菌和水稻腥黑粉菌之间的区别。Aggarwal等、Peterson等分别对小麦印度腥黑穗病菌冬孢子形态特征进行研究，并建立形态学鉴定方法，但由于这些方法未包括美国于1997年报道的黑麦草腥黑粉菌，从而使该方法失去了应用价值。Castlebury等对小麦印度腥黑穗病菌和黑麦草上腥黑粉菌(当时还未定名)等近似种进行了比较形态学研究，认为小麦印度腥黑穗病菌与黑麦草上的腥黑粉菌冬孢子则在大小和颜色上较为接近。章桂明等对小麦印度腥黑穗病菌及其近似种在光学显微镜和扫描电镜下冬孢子的形态特征进行了比较，认为小麦印度腥黑穗病菌与黑麦草腥黑粉菌非常接近，只获得少量孢子的情况下难以从形态学方面将两菌区别。1997年后，对小麦印度腥黑穗病菌检测方法的研究主要集中在区分小麦印度腥黑穗病菌与黑麦草腥黑粉菌。

在实际检测过程中分子检测方法需要设置阳性参考物质对照，以作为检测结果判定和评价以及质量控制的依据，对分子检测方法有重要意义。现阶段小麦印度腥黑穗病菌分子检测方法研究中所用的阳性参考物质通常是小麦印度腥黑穗病菌的基因组DNA。其抽提过程较复杂，制备不方便，抽提的基因组DNA稳定性也不能满足长期及经常性使用的需要，并且由于不同检测方法或检测实验室间所用的基因组DNA质量存在差异，从而制约了小麦印度腥黑穗病菌检测标准及其它分子检测方法的推广应用。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种制备简便、特异性强、具有良好均匀性和稳定性的小麦印度腥黑穗病菌检测标准分子。

本发明的另一目的在于提供上述标准分子的制备方法。

本发明的再一目的在于提供上述标准分子的检测方法。

为实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：

本发明公开了一种小麦印度腥黑穗病菌检测标准分子，所述标准分子为能够进行复制的质粒，且所述质粒含有以下序列A和序列B中的至少一种，

所述序列A与Genebank中编号为AF218059的序列99.56％同源；

所述序列B与Genebank中编号为AF399888的序列99.85％同源；。

在本发明具体的实施方式中，所述序列A为Seq ID No.1所示的序列，所述序列B为Seq ID No.2所示的序列。

所述质粒优选为T载体，更优选为pMD19-T。

本发明还公开了上述小麦印度腥黑穗病菌检测标准分子的制备方法，所述方法包括：以小麦印度腥黑穗病菌DNA为模板进行PCR扩增，所述PCR扩增的引物包括下述引物对a和引物对b中的至少一对，将扩增得到的DNA序列转化质粒，

引物对a：

Seq ID No.3：5′-TGGGCTGAGTCTGAGATGC-3′

Seq ID No.4：5′-AGTAATACCTGCGTCTCATAGC-3′

引物对b：

Seq ID No.5：5′-TAGGTACCTCCTCCGCTTATTGATATGC-3′

Seq ID No.6：5′-GTTCTAGAGGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′。

在本发明具体的实施方式中，是采用所述引物对a和引物对b分别进行PCR扩增，将引物对a扩增得到的片段与pMD19-T载体进行连接，将连接后得到的重组子以及引物对b扩增得到的片段分别用限制性内切酶XbaI和KpnI进行双酶切，分别回收酶切产物的大片段，将回收的片段进行连接。

本发明还公开了上述小麦印度腥黑穗病菌检测标准分子的检测方法，所述方法包括，利用特异性检测引物和探针，以所述标准分子为模板进行实时荧光PCR反应，并且所述探针5′端和3′端分别标记有荧光报告基团和荧光淬灭基团。

所述特异性检测引物分别含有Seq ID No.7和Seq ID No.8所示的序列，探针含有Seq ID No.9所示的序列：

Seq ID No.7：5′-AGCCATCACTGGAGTTGTCATG-3′

Seq ID No.8：5′-CCCAGCAAGGTCACCTTTGA-3′

Seq ID No.9：5′-CCGACCGTATCGGTCT-3′

由于采用了以上技术方案，使本发明具备的有益效果在于：

利用本发明的方法制备得到的小麦印度腥黑穗病菌检测标准分子，具有可以长期稳定保存、高拷贝数、易获得、纯度高和制备方便等特点，并且制备简便、特异性强、具有良好的均匀性和稳定性，可以替代小麦印度腥黑穗病菌的基因组DNA用于小麦印度腥黑穗病菌的定性PCR、定量PCR检测及分析，解决了小麦印度腥黑穗病菌检测中标准分子缺乏的难题。该标准分子适合于口岸检验检疫、农业生产、植物保护等部门使用。

附图说明

图1为本发明所述标准分子示意图。

图2为以引物SZFP254-1、SZFP254-2和探针SZFPb255对本发明所述标准分子以及小麦印度腥黑穗病菌基因组DNA的实时荧光PCR特异性检测结果图。

图3为以引物SZFP254-1、SZFP254-2和探针SZFPb255对本发明所述标准分子的实时荧光PCR灵敏度检测结果图。

图4为以引物SZFP254-1、SZFP254-2和探针SZFPb255对本发明所述标准分子的实时荧光PCR扩增标准曲线。

图5为本发明所述标准分子测序结果与网上公布的小麦印度腥黑穗病菌及其近似种线粒体2.3kb序列比对结果。

图6为本发明所述标准分子测序结果与网上公布的小麦印度腥黑穗病菌及其近似种ITS序列比对结果。

具体实施方式

以下实施例仅仅对本发明进行进一步的说明，不应理解为对本发明的限制。

实施例1小麦印度腥黑穗病菌检测标准分子的构建

一、实验材料

1、供试菌株

小麦印度腥黑穗病菌截获来自印度、巴西和墨西哥小麦，黑麦草腥黑粉菌截获来自美国小麦，上述供试菌株均由深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术研究中心保存(表1)。

表1供试菌株

注：标“*”为本研究用于克隆的菌株。

2、实验材料

限制性内切酶XbaI，KpnI以及限制性内切酶缓冲液，pMD19-T载体，T4DNA连接酶及其缓冲液，dNTPs，Taq DNA聚合酶及其缓冲液、DL2000Marker，Agarose Gel DNA Purification Kit和MiniBEST Plasmid Purification Kit购自大连宝生物工程有限公司。DH5α感受态细胞购自北京天根生物公司。TaqMan探针及引物由上海超世生物科技有限公司合成。

其它生化试剂均为进口分装或国产分析纯。

二、实验仪器

DY-8型核酸电泳仪(北京六一仪器有限公司)，Biometra Grident PCR仪，Syngene凝胶成像系统，其他仪器包括：离心机，恒温水浴锅，培养箱，天平等。

三、制备方法

1、序列获得

在GenBank中搜索小麦印度腥黑穗病菌及其近似种线粒体2.3kb片段序列和核糖体内转录间隔区序列。

2、引物设计

根据获得的线粒体2.3kb片段序列和核糖体内转录间隔区序列，利用软件Primer premier 5.0设计PCR扩增引物(表2)。

表2供试引物

3、小麦印度腥黑穗病菌线粒体2.3kb片段克隆

根据表2中的引物Ti-1和Ti-4对小麦印度腥黑穗病菌DNA进行线粒体2.3kb片段扩增。扩增得到的序列如Seq ID No.1所示，扩增反应体系25μL(表3)，扩增条件为94℃预变性7min；然后进入30个循环：94℃变性30s，65℃退火30s，72℃延伸90s；循环结束后72℃延伸7min(Frederick R D，2000)。PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分离纯化。将PCR纯化产物与pMD19-T Vector进行连接，连接体系体积10μL，各成分为：Ligation Mix 5μL，PCR纯化严物3.5μL，pMD19-T Vector 1μL，加灭菌去离子水0.5μL。连接条件为16℃过夜。转化筛选重组克隆过程见《分子克隆实验指南》。

表3PCR反应体系

4、小麦印度腥黑穗病菌核糖体内转录间隔区片段扩增

根据表2中的引物ITS4-KpnI和ITS5-XbaI引物进行小麦印度腥黑穗病菌核糖体内转录间隔区扩增。扩增得到的序列如Seq ID No.2所示，扩增反应体系25μL(表4)，扩增条件为95℃预变性7min；然后进入35个循环：95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min；循环结束后72℃延伸7min。

表4PCR反应体系

5、标准分子pMD19-T-TIM的构建

将核糖体内转录间隔区PCR扩增产物和包含2.3kb的重组质粒分别进行Xba I和Kpn I双酶切处理，反应体系总体积20μL，各成分为：10×M buffer2μL，酶切模板10μL，Xba I和Kpn I各1μL，补充灭菌去离子水至20μL。37℃温浴3h。酶切完成后，分别切胶回收核糖体内转录间隔区扩增片段和包含2.3kb的重组质粒的大片段，并将两个片段进行16℃过夜(12h)连接。连接反应体系10μL，各成分为：Ligation Mix 5μL，核糖体转录间隔区切胶回收产物2.5μL，包含2.3kb的重组质粒切胶回收产物2.5μL。转化及筛选重组克隆过程见《分子克隆实验指南》。筛选得到的重组克隆通过M13F/R引物的常规PCR验证及XbaI和KpnI的酶切验证及测序验证，最终获得的重组子命名为pMD19-T-TIM，即本发明所述标准分子。

实施例2标准分子性能评价

一、实验试剂

Universal Real-time Master Mix购自ABI公司。

引物及探针由上海超世生物科技有限公司合成。

二、实验仪器

ABI 7700实时荧光PCR仪。

三、验证方法及结果

1、特异性验证

以小麦印度腥黑穗病菌DNA及其标准分子为阳性对照，黑麦草腥黑粉菌DNA及其克隆质粒为阴性对照，采用表5的引物和探针进行小麦印度腥黑穗病菌标准分子特异性实时荧光PCR检测，以验证其特异性。实时荧光PCR检测反应参考章桂明、章正等(2005)建立的黑麦草腥黑粉菌实时荧光PCR检测方法进行。反应体系10μL(表6)，反应条件为50℃预热2min；95℃预变性10min；然后进入40个循环：95℃变性15s，60℃退火及延伸1min。

表5供试引物及探针

表6实时荧光PCR反应体系

特异性测试结果

检测结果如图2所示。结果显示，小麦印度腥黑穗病菌标准分子和小麦印度腥黑穗病菌基因组DNA均有明显的检测信号，而黑麦草腥黑粉菌DNA及其克隆质粒均未有检测信号，所构建的标准分子具有很好特异性，能够替代小麦印度腥黑穗病菌DNA作为检测反应的阳性参考物质。

2、均匀性验证

对标准分子进行十倍梯度稀释(10^-2至10^-7)，采用表5中提供的引物和探针以稀释液为模板进行实时荧光PCR检测，反应体系及条件同特异性检测。绘制标准曲线，根据检测样品扩增效率及其相关系数分析标准分子的均匀性。

测试结果(图3和图4)

结果表明最低检测值均为达到10^-7稀释度，扩增效率为0.96。根据Ct值计算得出的标准曲线公式为y＝-3.664x+36.561，相关系数为0.999，所构建的标准分子具有较好的均匀性。

3、稳定性验证

将构建的标准分子置于室温条件下(平均室温25℃)，分别在放置24h、48h、72h、1周、2周、1月、2月，进行实时荧光PCR检测，检测反应体系及条件同特异性检测。对获得的Ct值进行统计分析标准分子的稳定性。

稳定性测试结果

对每次实时荧光测试每个反应2个重复的Ct值平均值进行相对标准偏差分析(RSD)结果见表7，结果表明7个放置不同时间的RSD均小于5％(标准偏差小于35％可以接受)。可见本试验研究的标准分子在室温下放置2个月仍然具有很好的稳定性。

表7标准分子实时荧光PCR检测Ct统计表

以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。

序列表

<110>深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心

深圳市检验检疫科学研究院

<120>小麦印度腥黑穗病菌检测标准分子及其构建方法

<130>DHC1010009

<160>9

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>2297

<212>DNA

<213>Tilletia indica

<400>1

tgggctgagt ctgagatgca gagcctgcac tcccgaaaac gtcgacgagt ttggccgaac    60

gaagcgtgtg cgacacccga atccgtggaa gaacaacgct gagtgatcct agctgagcta    120

acgccgtcct ggattgtgca ctcttcgtca ccgccgttgc gcgcttagcg tgaatgctcc    180

tggaagccac agactatcag caaatgactc gaacagtttt tgtttcatca cacaagactc    240

acttgagcgg ctcgccttct tcttctgcaa tagtacctgt gggctcccct agggaagggc    300

tgccaggctc tccttggctg gcaccagagt acagctgtcg ttcttcctgc ctcgttttca    360

ccagagacat gactttcatg atggcctcga taccaacgtt ggtctcggcc agttccacgc    420

cgacatggac cgcttcgcgt tgcctgatct gcatcgacgg tcccaacacg aagttgaccc    480

gaaaggcgct gagccctggc agggacatga gccgtgccga gtcaggaatc gttttcctca    540

aagtcctgct agccgagccg gcttcgccgt aatagccctg tgcagaagtt gcccaaccag    600

aatcagaaga gaatgtggag tcggcaatag gctcgagcgc ccaatccgcc caccgatccg    660

tgaatccgct caaagtgagc gtgttcatgg tgtttagctt gctcgtgctg cttgacctct    720

tcagtgttcg cccacccaga tgcgcattcg acgagctcgc gacacttgca tcccgagaca    780

ttgtggtcgg agagaggaaa gtgtccgcaa atccgacttt cttcgccgat gatggcccac    840

tagcccgttc caccgcagat gatggaaagt cagattcagc ccgaacgatc cgtctgaccg    900

gggacatgct ttgaagcaat gttggcgtgg cggcgctgaa agatctgact tgagcgctag    960

gatcatgcgg caagtctgag gtatcgctgt ccatagactg cagtgacgcc gaagccggga    1020

atgagccggt cataggcgga gaggccagaa gctcggccag aggaacttga ggcggagctc    1080

tgctgttttt cgcctcgaac caccgagccg tggtggtctg gtatggagaa tagatactac    1140

catcggcaga acccgaagtc ggcagcggac tgagagtgaa agagccgctg cccattgcag    1200

catcgctcga gccactccgt tggtggccac gcgatcggtg gcgagccggc gccgaaaata    1260

ggggttgctt cgccgcttcg tgagtgccat actcttcatg gccctcacta tcggagccat    1320

cactggagtt gtcatggttg acacgagaat cagtcgcctg acgtcgaggc cgaccgtatc    1380

ggtcttgtcc tcttaccggt ctcaaaggtg accttgctgg ggactgcgtg ttttcatggc    1440

cgtccctcga agaatggagg ccgggtgaag gtatttggaa gaagctgtcc ctcttgtttg    1500

cactgcgtga aggttgccga aacgcgtgcg gttcggaaaa ggggtccggt tcgcctgtca    1560

cgaaaagcgc ttcgaagacc tgaattgact caaaagtcag cttcaagctt ccattcgcgg    1620

cggggacgcc agccattacg aaggcggtgg cacctctcgc cccagaaccg attcgatttg    1680

gcattgcagc gagcatttca gtgatgctat tttgaacgcc tggtattctc gaagctcgag    1740

tggtagtccg cccgtgaagc cagtgagcca tgctatgact attcgctgcg gttctgttat    1800

tggaggaccg gccttcggac tgtatgggca tgtccttcat agctgaatcg gaagggagat    1860

tttgtccgag tccattcgct gaagacggcg gtgtgacctg tgctcgtcca cgatgctcta    1920

catgtctggc agagacgact ttcatcgaat aacgagctcc catacgcccg acacggaaga    1980

cagtctcagc ttcttgtaca tagacttcga gccgatgaat ctccacttcg aaaagagagc    2040

ttacgaccgg gatcgccgat gctagaagga aaagaccgac cctcgttccc ctcaagagcc    2100

aagactggat cgtgggtatg acagcgtcgc gaacgtatgc gtagatgagc catccggcgt    2160

agagtgggac ggtgcgaaac gacgaggcgg aagtttttgg aatcagagcg gagaatggtc    2220

gccttggaag ttgcggccgc gctggaggtg cactagccac tgacccgctt cccaggctat    2280

gagacgcagg tattact                                                   2297

<210>2

<211>710

<212>DNA

<213>Tilletia indica

<400>2

ggaagtaaaa gtcgtaacaa ggtttctgta ggtgaacctg cagaaggatc attagtgaat    60

tacggagctc ttcttcggaa gagtctcctt ctcttttatc ccaacaccaa actacggaag    120

gaacgaggcc ttgcgctgag tacctgtccg gatggaacag agttgctggt acttcggtat    180

tggcagcgct gctccaaccc ttttaaacac ttaagaatta aagaatgtta aaactattgt    240

cttcggacat aaactaatat acaacttttg acaacggatc tcttggttct cccatcgatg    300

aagaacgcag cgaaatgcga taagtaatgt gaattgcaga attcagtgaa tcatcgaatc    360

tttgaacgca ccttgcgccc ttgggtattc tcaagggcat gcctgtttga gtgtcataat    420

actctcaact ctcaatcttt ttgtaagaga agattgcttg gagttggtgg tgggcgcttg    480

ccagatgtaa cagtcttgct cgccttaaat taatcagtgg atctcttcga gtccggtctg    540

actatgtgtg ataatttgat cacatagaat gtgcttgtca caaccggatt ctgtatagag    600

gctctgcttc caacacggaa tgattcttcg gaatcatcga tagctttgta gcttgacctc    660

aaatcaggta ggactacccg ctgaacttaa gcatatcaat aagcggagga               710

<210>3

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

tgggctgagt ctgagatgc                                    19

<210>4

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<400>4

agtaatacct gcgtctcata gc                                22

<210>5

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<400>5

taggtacctc ctccgcttat tgatatgc               28

<210>6

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<400>6

gttctagagg aagtaaaagt cgtaacaagg             30

<210>7

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<400>7

agccatcact ggagttgtca tg                     22

<210>8

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>8

cccagcaagg tcacctttga                        20

<210>9

<211>16

<212>DNA

<213>人工序列

<400>9

ccgaccgtat cggtct                            16

Claims (7)

1.一种小麦印度腥黑穗病菌检测标准分子，其特征在于：所述标准分子为能够进行复制的质粒，且所述质粒含有以下序列A和序列B，

所述序列A为Seq ID No.1所示序列；

所述序列B为Seq ID No.2所示序列。

2.根据权利要求1所述的标准分子，其特征在于：所述序列A为Seq ID No.1所示序列与Genebank中编号为AF218059的小麦印度腥黑穗病菌2.3kb序列99.56%同源；所述序列B为Seq ID No.2所示序列与编号为AF399888的小麦印度腥黑穗病菌ITS序列99.85%同源。

3.根据权利要求1～2任意一项所述的标准分子，其特征在于：所述质粒为T载体。

4.根据权利要求3所述的标准分子，其特征在于：所述T载体为pMD19-T。

5.权利要求1～4任意一项所述的小麦印度腥黑穗病菌检测标准分子的制备方法，所述方法包括：以小麦印度腥黑穗病菌DNA为模板进行常规PCR扩增，所述PCR扩增的引物包括下述引物对a和引物对b中的至少一对，将扩增得到的DNA序列转化质粒，

引物对a：

Seq ID No.3：5'-TGGGCTGAGTCTGAGATGC-3'

Seq ID No.4：5'-AGTAATACCTGCGTCTCATAGC-3'

引物对b：

Seq ID No.5：5'-TAGGTACCTCCTCCGCTTATTGATATGC-3'

Seq ID No.6：5'-GTTCTAGAGGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3'。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：采用所述引物对a和引物对b分别进行PCR扩增，将引物对a扩增得到的片段与pMD19-T载体进行连接，将连接后得到的重组子以及引物对b扩增得到的片段分别用限制性内切酶XbaI和KpnI进行双酶切，分别回收酶切产物的大片段，将回收的片段进行连接。

7.权利要求1～4任意一项所述的小麦印度腥黑穗病菌检测标准分子的检测方法，所述方法包括，利用特异性检测引物和探针，以所述标准分子为模板进行实时荧光PCR反应，并且所述探针5'端和3'端分别标记有荧光报告基团和荧光淬灭基团;

所述特异性检测引物分别为Seq ID No.7和Seq ID No.8所示的序列，探针为Seq ID No.9所示的序列：

Seq ID No.7：5'-AGCCATCACTGGAGTTGTCATG-3'

Seq ID No.8：5'-CCCAGCAAGGTCACCTTTGA-3'

Seq ID No.9：5'-CCGACCGTATCGGTCT-3'。

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